CN113969299B - 一种生物转化合成尿苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物转化合成尿苷的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶一步转化为尿苷。与其他工艺相比，本发明反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的尿苷易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9％，具有明显市场竞争力。

Description

一种生物转化合成尿苷的方法

技术领域

本发明属于医药合成中生物发酵技术领域，涉及尿苷的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成尿苷的方法。

背景技术

克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要包括肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。

具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。

尿苷，白色针状结晶或粉末，属于核苷类化合物，由尿嘧啶与核糖(呋喃核糖)环组成，两者由β-N1-配糖键相连。尿苷作为一种药物，如抗巨型红血球贫血，治疗肝、脑血管、心血管等疾病，也是制造氟尿嘧啶(S-FC)、脱氧核苷、碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)等药物的主要原料。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从肌苷和尿嘧啶直接转化为尿苷仍然没有突破性进展。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将肌苷和尿嘧啶直接转化为尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

本发明技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程见附图1。

微生物信息：本发明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiellamichiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.16111。

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。

一、菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

菌种：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)

菌株保藏号：CGMCC16111

活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH＝7.0；

培养条件：38℃，200rpm，12h；

菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH＝7.0；

培养条件：38℃，DO≥20％，12-24h；

1.2菌体收集

将菌体培养液离心处理(5000rpm离心10min)，然后湿菌体用pH＝7.0、20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。

二、生物转化反应

2.1反应体系配制

肌苷100-600mmol/L；尿嘧啶100-600mmoL/L；湿菌体5-20g/L；

反应体系：纯化水

2.2反应条件

待反应体系配制完成以后200rpm搅拌，45-65℃水浴反应24-48h，然后微滤得生物转化合成液，进行下一步提取工序。

三、产品提取

3.1粗品溶液制备

转化反应结束后，微滤得合成液，旋蒸浓缩后，根据尿苷含量加入适量无水乙醇热溶后抽滤得尿苷粗品溶液。

3.2浓缩结晶

将粗品溶液加入适量活性炭后抽滤、降温结晶，然后离心或抽滤得尿苷湿品。

3.3产品干燥

将离心或抽滤得到得尿苷湿品80-100℃干燥后得尿苷检验合格后，包装得尿苷成品。

进一步地，在上述技术方案中，该工艺反应体系为纯化水，以肌苷和尿嘧啶为底物一步合成目标产物尿苷，成本低廉环保易操作适合工业化。

进一步地，在上述技术方案中，提取工序中，该工艺中产物积累浓度最高达360mmol/L以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高。

发明有益效果

1菌种

该工艺首次利用Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)湿菌体细胞生物转化肌苷和尿嘧啶一步合成尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

2反应体系

该工艺使用的反应体系为纯化水，以肌苷和尿嘧啶为底物生物转化合成目的产物尿苷，成本低廉、环保、易操作适合工业化。

3生产效率高且环保

利用该工艺生产尿苷，底物转化率达到90％以上，底物肌苷浓度高达400mmol/L以上，产物积累浓度最高达360mmol/L以上，反应周期短，产物易分离，成本低且环保，易于产业化。

附图说明

图1为生物法合成尿苷工艺流程图；

图2为温度对菌体生长和菌体活性的影响；

图3为pH值对菌体生长和活力的影响；

图4为培养时间对菌体生长的影响；

图5为温度对底物转化率的影响；

图6为pH值对转化率的影响；

图7为不同底物配比对肌苷转化率的影响；

图8为底物浓度与转化率关系曲线；

图9为反应时间对底物转化率的影响；

图10为湿菌体量对底物转化率的影响。

具体实施例

实施例1

生物转化合成尿苷条件优化

1菌体培养条件优化

1.1最适培养温度的确定

将培养20h种子培养液按5％接种量接种于菌体发酵培养基中，DO≥20％条件下，分别在28-42℃温度范围不同温度条件下培养20h，测定菌体浓度和活力(图2)。结果显示，在28-38℃培养温度范围内菌体量和酶活性都随培养温度升高而增加，高于38℃菌体活力变化不明显或有所下降，但菌体生长量开始明显下降。因而最适菌体培养温度为38℃左右。

1.2最适培养pH值的确定

将培养20h种子培养液按5％接种量接种于菌体发酵培养基中，培养温度38℃，DO≥20％条件下，考察不同pH值条件下培养20h，检测菌体浓度和活力(图3)。结果显示，菌体生长的较适合pH值范围为7.0-7.5，低于或高于此范围对菌体生长量和转化活力影响都比较大，因而选择7.0为最适培养pH值。

1.3培养时间对菌体生长的影响

以接种量5％接种于发酵培养基中，培养温度38℃，pH＝7.0，定时取样测定培养过程中菌体浓度与活力的变化(如图4)。结果显示，发酵液菌体浓度在小于16h范围内增加迅速，培养16h以后变化不明显；在培养最初12h菌体活力随着培养时间延长而迅速提高，表现为与菌体生长呈平行关系，培养时间达到16h之后，菌体活力均达到最高，呈现一平台期。故此，适宜的培养时间为16h以上。

2生物转化反应条件的优化

在初始反应体系基础上对生物转化反应条件进行优化，主要包括对湿菌体量、底物浓度、配比、反应体系pH值、反应温度及时间等条件的优化，以期达到提高底物转化率以及降低生产成本的目的。

2.1酶促反应的最适温度

利用初始反应体系，在不同温度条件下进行转化反应48h，测定目的产物含量，计算底物转化率。结果表明(图5)，在30-50℃温度范围内，随温度升高转化效率不断提高，在50-60℃范围内转化率变化不明显，且达到最大值；进一步升高温度，高于60℃转化率出现明显下降趋势，表明过高的温度条件菌体失活严重，不利于转化反应。因而较适合转化反应温度范围为50-60℃。

2.2生物转化反应pH值的确定

在上述反应体系基础上，调整反应体系pH值，进行转化反应48h，测定目的产物含量，计算底物转化率(图6)，结果显示，底物转化率在pH＝7.0-7.5范围内达到最大值，pH值过高或过低转化率都迅速降低。因而选择生物转化反应较适pH值范围为7.0-7.5。

2.3底物摩尔配比的确定

在上述反应体系基础上，分别调整两种底物的摩尔配比进行转化反应48h，测定目的产物含量，计算底物转化率(图7)。结果显示，尿嘧啶/肌苷摩尔比值在0.25-1.25范围内，肌苷转化率随着底物配比的增加而快速增大，大于1.25后转化率变化不明显。因而选择较适底物摩尔比为1.25以上。

2.4最适底物浓度的确定

在上述反应体系中，分别调整底物的浓度，转化反应48h，测定目的产物含量，计算不同条件下底物转化率，绘制不同浓度条件下的转化率曲线(图8)。当肌苷浓度小于400mmol/L范围内时，底物转化率变化不大，而大于400mmol/L之后，转化率呈明显下降趋势，在底物转化率变化不明显的情况下增加底物浓度，可达到提高生产效率和降低成本的效果，因而确定肌苷较适浓度为400mmol/L以下。

2.5反应时间的确定

在上述优化的反应条件下，测定不同转化反应时间的产物浓度，计算底物转化率(图9)。结果显示，随着反应时间的延长，产物不断积累，底物转化率随反应时间的增加而快速增加，反应时间达到36小时之后产物浓度变化不明显。因而收获产物的适宜时间可选择为36小时以后。

2.6菌体量的确定

在上述最适反应条件下，菌体量在4-20g/L范围内进行转化反应，测定转化反应36h产物浓度，计算底物转化率。结果显示(图10)，菌体量在4-14％范围内，转化率随菌体量的增加而快速增加，之后变化不明显。因而可选择16g/L或略高如18g/L为较适菌体量。

实施例2

生物转化合成尿苷工艺放大(100L)

1菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

菌种：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)

保藏编号：CGMCC16111

活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH＝7.0；

培养条件：38℃，200rpm，12h；

菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH＝7.0；

培养条件：38℃，DO≥20％，12-24h；

1.2菌体收集

将菌体培养液离心处理(5000rpm离心10min)，然后湿菌体用pH＝7.0、20mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。

实施例3

转化反应

3.1反应体系

肌苷10Kg；尿嘧啶5.5Kg；湿菌体1.8Kg；纯化水100Kg；

3.2反应条件

待反应体系配制完成以后200rpm搅拌，55℃水浴反应42h，然后微滤或离心得生物转化合成液，进行下一步提取工序。

3.3产物提取

3.3.1粗品溶液制备

转化反应结束后，将反应液进行微滤或离心处理后得到合成液，然后旋蒸浓缩得浓缩液，根据浓缩液中尿苷含量加入5倍质量无水乙醇热溶后抽滤得粗品溶液。

3.3.2浓缩结晶

将粗品溶液加入0.01倍质量活性炭后抽滤、降温结晶，然后离心得尿苷湿品。

35.3.3成品制备

将湿品干燥后得尿苷检验合格，HPLC含量99.96％，包装得尿苷成品7.1Kg。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.利用密西根克雷伯氏菌合成尿苷的方法，其特征在于：以肌苷和尿嘧啶为原料，利用密 西根克雷伯氏菌转化合成尿苷；其中转化合成时，反应溶剂为水，反应温度为50-60℃，pH=7.0-7.5，尿嘧啶/肌苷摩尔比大于1.25，肌苷浓度400mmol/L以下，反应时间大于36小时，菌体量为16-20g/L；所述密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为Klebsiella michiganensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16111；转化合成过程包括：菌体制备、生物转化反应和产品提取；生物转化反应操作包括：将肌苷、尿嘧啶和湿菌体在纯化水反应体系中反应，抽滤得合成液，进行产品提取。

2.根据权利要求1所述合成尿苷的方法，其特征在于：菌体制备包括菌体活化、产菌培养和菌体收集。

3.根据权利要求1所述合成尿苷的方法，其特征在于：产品提取包括粗品溶液制备、浓缩结晶和产品干燥。