CN111100802A - 一株粪肠球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株产L‑乳酸的粪肠球菌及其应用，其分类命名为Enterococcus faecalis，已经于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15821。该菌株是一株高产L‑乳酸的菌株，能够利用多种碳源，产物抑制作用较小，乳酸浓度高，特别是L‑乳酸的光学纯度可以达到99%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产L-乳酸的粪肠球菌及其应用。
背景技术
乳酸，是世界上公认的三大有机酸之一，具有旋光异构体，分为D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸，其中L-乳酸为左旋型乳酸，是人体唯一可以分解利用的乳酸类型。L-乳酸在食品、医药、农业、化妆品等众多领域有着广泛的应用，特别是高光学纯度的L-乳酸，因其可作为生物降解材料L-聚乳酸的前体，市场需求量巨大。据估计，食品级L-乳酸的需求量以每年5%-8%的速率增长，远远超出了目前的供给能力。此外，目前可降解塑料的年产量达到了2亿吨，其原料聚乳酸的年生产量仅为45万吨，这很大程度上是由于乳酸的生产能力欠缺所致。因此，提高L-乳酸市场供应能力及降低L-乳酸的生产成本是当前亟需解决的关键问题之一。
目前，大部分乳酸的生产是通过微生物发酵制备的，乳酸合成的关键是同型发酵细菌。发酵法生产乳酸常用的菌种为米根霉、乳酸菌、乳杆菌等。米根霉在氧气充足的条件下，直接利用淀粉质原料生产L-乳酸，但其理论转化率较低，生产速率下降较快。大部分乳酸菌发酵产物为L-乳酸和D-乳酸的混合物，对糖和乳酸的耐受性较差。乳杆菌发酵的产物L-乳酸中往往会含有较多的D型或DL型乳酸，造成乳酸的光学纯度较低，给后续分离带来困难。通过对发酵工艺的改进可以提高乳酸的产量，降低发酵成本。李秀康等（产高光学纯度L-乳酸菌株HY-38发酵培养基优化,中国酿造, 2017, 36(02)）以粪肠球菌HY-38为出发菌株进行培养基的优化，L-乳酸的产量提高了24.3%。姜旭等（基因工程菌发酵生产L-乳酸研究进展,生物工程学报, 2013, 29(10)）综述了基因工程菌在L-乳酸发酵生产中的应用。虽然基因工程在微生物菌种改造方面取得了很多成功，但是目前很多微生物菌种在工业环境下的适应能力、胁迫抗性和代谢能力方面还远不能满足实际应用。目前已知的粪肠球菌产乳酸的浓度相对较低，并且产物光学纯度不高，给后续分离带来困难。
CN106167785A公开了一种粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CTB，其保藏编号为CGMCC 12734，该菌株可以利用廉价原料玉米秸秆、沙柳和生物柴油行业副产物甘油等直接生产L-乳酸和乙醇，降低了原料成本，减少原料预处理成本，为大宗化学品L-乳酸和乙醇的廉价生产、青贮饲料和微生物饲料的开发和生产提供了优良菌种。然而，该菌种在以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸时，发酵的终浓度为49.8g/L，乳酸的浓度较低；在以纤维素为底物发酵生产L-乳酸时，发酵周期较长，生产强度较低，L-乳酸的终浓度仅有10-12g/L。
CN101701201A涉及保藏号为CGMCC No. 3164的一株粪肠球菌，菌落在MRS琼脂培养基上，37℃培养24h富集，为乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，在普通显微镜下椭圆形。该菌株产酪胺能力强，虽然也能产乳酸，但L-乳酸产量不高。
杨霞等（“乳酸粪肠球菌的分离鉴定与系统进化分析”，中国农学通报, 2009, 25(10):1-5）公开了一株粪肠球菌， 通过对表型特性包括培养特性、形态学观察、生化试验等鉴定，同时结合16SrDNA系统进化分析；该株革兰氏阳性菌能在10℃和45℃生长，接触酶阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，可生长于6.5%NaCl和pH9.6的环境等。该粪肠球菌主要用于动物微生态制剂，乳酸产量不高。
刘占英等（“紫外诱变提高一株粪肠球菌产L-乳酸的能力”，内蒙古农业大学学报,2013, 34(6):5-8）分离鉴定了一株能降解纤维素的粪肠球菌，即Enterococcus faecalisCTB374-1，该菌株能以纤维素为底物通过CBP方案(Consolidated bioprocessing)一步合成L-乳酸，但合成L-乳酸的浓度不高。因此，该发明采用紫外线对Enterococcus faecalis CTB374-1进行诱变，以提高其利用纤维素合成L-乳酸的能力。试验结果获得了一株高产菌株CTB374-1-8。诱变后菌株利用葡萄糖合成L-乳酸的浓度为15.22g/L；利用微晶纤维素合成L-乳酸的浓度为0.75g/L；利用玉米秸秆合成L-乳酸的浓度为0.63 g/L。该菌株虽然经紫外诱变提高了菌株产乳酸能力，但菌株发酵产乳酸的终浓度仍然较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产L-乳酸的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）DLY-LFYC，该菌株发酵产L乳酸的浓度较高，并且是一株产高光学纯度L-乳酸的菌株。
本发明提供的产L-乳酸的粪肠球菌DLY-LFYC，其分类命名为Enterococcus faecalis，已经于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15821。
本发明所述的粪肠球菌DLY-LFYC的主要形态特征为：菌落颜色为白色，菌株个体呈球状。生理生化特征主要表现为：革兰氏染色为阳性，接触酶阴性，氧化酶阴性，能利用多种碳源。
本发明所述的粪肠球菌DLY-LFYC的16SrRNA基因序列见序列表。
本发明所述的粪肠球菌DLY-LFYC在发酵产L-乳酸中的应用。该菌株为兼性厌氧菌，能在微氧条件下生长，发酵过程中不通气培养；发酵温度为10～50℃，pH为4.5～9.5，发酵产L-乳酸的光学纯度高于99%。
本发明所述粪肠球菌DLY-LFYC在发酵产L-乳酸的应用中，能够利用的碳源为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、纤维二糖、蔗糖等中的至少一种，优选葡萄糖，糖的转化率可达90%以上，副产物少。发酵终产物中L-乳酸浓度高于50g/L，L-乳酸的光学纯度高于99%。
本发明所述粪肠球菌DLY-LFYC在发酵生产L-乳酸的应用中，能够以甘油为底物发酵生产L-乳酸，甘油的转化率为98%以上，发酵终产物中L-乳酸浓度高于 45g/L，L-乳酸的光学纯度高于99%。
本发明提供的粪肠球菌DLY-LFYC是一株高产L-乳酸的菌株，能够利用多种碳源，包括相对廉价的甘油和纤维素水解产物纤维二糖等；产物抑制作用较小，乳酸浓度高，特别是L-乳酸的光学纯度可以达到99%以上。通常乳酸发酵过程需要通氮气培养，该菌株可在微氧条件下生长，因此可以不通气培养，有利于降低发酵成本。该菌株在分类学上属肠球菌属，是人和动物肠道微生物群落中的主要细菌，无危害，因此有利于工业化应用。
生物材料保藏说明
本发明提供的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）DLY-LFYC菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 15821；保藏日期：2018年5月28日。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明菌株及其应用作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
本发明实施例采用HPLC测定L-乳酸和D-乳酸浓度，采用色谱柱Chirex 3126(D)-penicillamine (250mm×4.6mm)，流动相：V(异丙醇):V(2mM硫酸铜溶液)=5:95，紫外检测器。色谱条件为：流速0.7mL/min，柱温40℃，紫外检测波长254nm，进样量5μL。L-乳酸的光学纯度计算公式为：L-乳酸光学纯度=（L-乳酸浓度-D-乳酸浓度）/（L-乳酸浓度+D-乳酸浓度）×100%。
本发明实施例采用HPLC测定残糖的含量，采用色谱柱Aminex HPX-87H，流动相为5mM硫酸溶液，示差折光检测器。色谱条件为：流速0.5mL/min，柱温40℃。计算糖酸转化率公式如下：转化率=L-乳酸的浓度/总糖浓度×100%。
本发明的粪肠球菌DLY-LFYC菌株是从辽宁省抚顺市李石中试基地乳酸发酵液中筛选得到出发菌株，通过诱变筛选得到。
出发菌株的获得：以溴甲酚紫平板为筛选平板，用接种环挑取少量发酵液在溴甲酚紫平板上划线，在40℃的恒温培养箱中培养，长出菌落，且菌落的颜色变为白色，菌落周围有黄色透明圈即可认为筛选出能够产乳酸的菌株。挑选菌落中的黄色透明圈较大的进行划线培养，并用MRS培养基进行培养，用生物传感分析仪SBA-40C进行检测，有L-乳酸显示，说明此菌落生产L-乳酸，再利用液相色谱检测L-乳酸的光学纯度，重复多次筛选，得到生产L-乳酸且光学纯度较高的出发菌株。
目标菌株的获得：对筛选得到的出发菌种采用不同的糖浓度、不同的温度进行培养，同时进行紫外诱变和ARTP诱变筛选，最终获得目标菌株DLY-LFYC。其细胞形态和理化实验结果见表1。
表1 DLY-LFYC的细胞形态和理化实验结果
*表中：“+”代表阳性；“-”代表阴性。
该菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。
实施例1
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）DLY-LFYC遗传稳定性试验。
采用MRS培养基，将所得菌株在平板上连续接种五代，用接种环分别挑取每代平板上的菌落转至种子培养液中进行摇瓶培养，培养条件为：温度45℃，转速150r/min，培养时间为12h，然后每一代以10%接种量，在内装有2L液体发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，发酵条件为：温度45℃，转速150r/min，pH设定为7.0，用氢氧化钠作为中和剂，发酵时间为36h，发酵过程中流加葡萄糖，使发酵培养基中葡萄糖总浓度达到170g/L，发酵结果如表2所示。
表2 菌种遗传稳定性发酵实验结果
实施例2 不同碳源的乳糖浓度及光学纯度
采用MRS培养基，不同在于将葡萄糖更换为其他种类碳源。结果如表3所示。
表3 不同碳源的发酵结果
实施例3 纤维素水解产物纤维二糖为发酵底物
采用MRS培养基，不同在于以纤维素水解产物纤维二糖为底物发酵生产L-乳酸，L-乳酸的浓度高于50g/L，L-乳酸的光学纯度高于99.6%，85%以上的纤维二糖转化为乳酸。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院
<120> 一株粪肠球菌及其应用
<130> 新专利申请
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> Enterococcus faecalis
<400> 1
acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact agcgattccg gcttcatgca 120
ggcgagttgc agcctgcaat ccgaactgag agaagcttta agagatttgc atgacctcgc 180
ggtctagcga ctcgttgtac ttcccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 240
atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcgctagagt 300
gcccaactaa atgatggcaa ctaacaataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactttgtc cccgaaggga 420
aagctctatc tctagagtgg tcaaaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 480
tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 540
accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt ttgctgcagc actgaagggc 600
ggaaaccctc caacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgtttgctc cccacgcttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaga gccgccttcg 720
ccactggtgt tcctccatat atctacgcat ttcaccgcta cacatggaat tccactctcc 780
tcttctgcac tcaagtctcc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc 840
acatcagact taagaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg gacaacgctt 900
gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttagata 960
ccgtcagggg acgttcagtt actaacgtcc ttgttcttct ctaacaacag agttttacga 1020
tccgaaaacc ttcttcactc acgcggcgtt gctcggtcag actttcgtcc attgccgaag 1080
attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccgat 1140
caccctctca ggtcggctat gcatcgtggc cttggtgagc cgttacctca ccaactagct 1200
aatgcaccgc gggtccatcc atcagcgaca cccgaaagcg cctttcactc ttatgccatg 1260
cggcataaac tgttatgcgg tattagcacc tgtttccaag tgttatcccc ctctgatggg 1320
taggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccactcctct ttccaattga gtgcaagcac 1380
tcgggaggaa agaagcgttc g 1401
Claims (9)
1.一株粪肠球菌，该菌株为粪肠球菌DLY-LFYC，其分类命名为Enterococcus faecalis，已经于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 15821。
2.根据权利要求1所述的粪肠球菌，其特征在于：所述的粪肠球菌DLY-LFYC的主要形态特征为：菌落颜色为白色，菌株个体呈球状。
3.根据权利要求1所述的粪肠球菌，其特征在于：所述的粪肠球菌DLY-LFYC的生理生化特征主要表现为：革兰氏染色为阳性，接触酶阴性，氧化酶阴性，能利用多种碳源。
4.根据权利要求1所述的粪肠球菌在发酵产L-乳酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：该菌株为兼性厌氧菌，能在微氧条件下生长，发酵过程中不通气培养。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：发酵温度为10～50℃，pH为4.5～9.5，发酵产L-乳酸的光学纯度高于99%。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：该菌株能够利用的碳源为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、纤维二糖、蔗糖等中的至少一种，优选葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：糖的转化率达90%以上，发酵终产物中L-乳酸浓度高于50g/L，L-乳酸的光学纯度高于99%。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：该菌株能够以甘油为底物发酵生产L-乳酸，甘油的转化率为98%以上，发酵终产物中L-乳酸浓度高于 45g/L，L-乳酸的光学纯度高于99%。
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