CN107937314B - 一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌及其应用 - Google Patents

一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌，所述产酸丙酸杆菌分类命名为产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124，保藏编号CGMCC No.14869。本发明的菌株对氧、酸以及渗透压的耐受性强；并能够克服发酵过程中厌氧菌生长周期长，产量低的问题。

Description

一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型的产酸丙酸杆菌及其应用，及其在发酵工业中的应用，属于微生物领域。
背景技术
益生菌是一类能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌在防治消化道疾病、帮助消化吸收和刺激免疫系统等方面疗效显著，在食品、畜牧、医药等领域都被大量应用。目前，常用的益生菌菌种主要有双歧杆菌、乳酸杆菌、明串球菌属、芽孢杆菌属和丙酸杆菌属等，每一种益生菌都有着各自不同的“功效”。目前对于丙酸杆菌的益生作用逐渐被人们关注。美国FDA公布了42种可直接饲喂的安全益生菌，其中包括丙酸杆菌，我国《饲料添加剂品种目（2010）》中也明确提出丙酸杆菌是安全的微生物添加剂。目前由于丙酸杆菌具有耐酸、耐胆盐以及和乳酸菌类似的黏附于肠道上皮细胞的能力，以及丙酸杆菌特殊的代谢类型可以合成许多独特的代谢产物，如丙酸、细菌素及B族维生素等而受到广泛的关注，丙酸杆菌作为益生菌具有良好的应用前景。
在工业生产过程中，益生菌要经受一系列的环境压力，例如极端温度、pH、渗透压、氧等，都可能影响到菌体的生存和代谢活性。从工业观点出发，选择能抵抗生产过程中不利条件的菌种是至关重要的常用的一种筛选优良益生菌菌株的方法是通过基因工程手段，对益生菌染色体上内源基因进行遗传修饰，或利用食品级表达质粒将外源DNA导入宿主细胞。但是，目前的立法对于食品安全设置了较高的标准，而且消费者对于用基因修饰微生物的食品比较排斥，所以这种益生菌选育方法在未来可能会受到限制。为符合食品工业环境生产以及适应工业环境胁迫，还可通过进化工程方法获得表型鲁棒性的益生菌菌株。
目前的进化研究表明，非致死性选择条件可以诱导细胞发生不同程度的突变，其突变的主要来源于缓慢生长的细胞自身诱发的适应性突变。这种环境压力诱导的细胞突变率显著高于细胞DNA复制过程的出错频率，并逐渐形成一种压力诱导突变，通过实验室适应性驯化实验，能够在数周到数月的较短时间内传代数百到数千代，并伴随显著变化且能稳定维持的生长代谢表型，被广泛应用于进化生物学机制的研究；同时，亦被证明在扩大底物利用范围、增加代谢物产量、抵抗环境胁迫等微生物菌株改造方面有着重要的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌，能够克服工业化发酵中的环境压力，并缩短发酵周期。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌，其分类命名为产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124 ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 14869；保藏日期2017年11月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
形态特征：多形性杆菌，0.5～0.8μm×1～5μ m，常为圆端或尖端的棒状；有的细胞为类球状、分叉或分枝，但不成丝状。细胞单个、成对或短链，呈V或Y字形出现，或方形排列。
生理理化特征：革兰氏阳性，不运动，不生孢，厌氧，能利用葡萄糖、乳酸钠等碳源生成有机酸（丙酸、丁二酸、乙酸），生长温度为29-32℃。
本发明还提供了上述产酸丙酸杆菌在发酵生产丙酸中的应用。
本发明的菌株对氧、酸以及渗透压的耐受性强；并能够克服发酵过程中厌氧菌生长周期长，产量低的问题。
附图说明
图1~图4是本发明的产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌在pH值7.0、6.0、5.0、4.0的发酵培养基中于厌氧条件下30℃培养后菌体OD600值变化曲线；
图5~图8是本发明的产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌在葡萄糖浓度为30g/L、60g/L、90g/L、120g/L的发酵培养基中于厌氧条件下30℃培养后菌体OD600值变化曲线；
图9~图11是本发明的产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌在发酵培养基中于厌氧、缺氧、有氧条件下30℃培养后菌体OD600值变化曲线；
图12是本发明的产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌在发酵培养基中丙酸产量变化曲线；
本发明涉及的生物材料，其分类命名为产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 14869；保藏日期2017年11月8日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
实施例1 菌株的驯化
（1）将原始产酸丙酸杆菌以5%的比例接种于50 mL 种子培养基中，在30 ℃，pH7.0的条件下培养。所述原始产酸丙酸杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC 1.2232。
种子培养基的组成如下：
酵母提取物，5 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，5 g；0.05%刃天青指示剂，2 mL；蒸馏水定容至1000 mL。
所需的厌氧环境是由含量为99.999%高纯氮形成，一般注入达到1个大气压的量。
实验进行三次重复，菌体的OD600值达到2.5。
（2）将步骤（1）获取的菌液以5%的比例接种于2L 发酵培养基中，在30 ℃，pH 7.0，转速120 rpm的条件下培养。
发酵培养基的组成如下：
酵母提取物，10 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，30 g；蒸馏水定容至1000 mL。
所需的厌氧环境是由含量为99.999%高纯氮形成，一般保持连续注入维持厌氧环境。
（3）连续培养驯化菌株；
在驯化发酵培养基中进行连续培养驯化菌株，连续培养的过程中需不断往发酵罐里添加新鲜的发酵培养基，并按相同稀释率流出罐内发酵液，以维持正常的2L连续培养体系。
发酵过程中，梯度改变发酵条件：a.连续培养驯化过程中逐渐增加碳源葡萄糖的浓度，依次为30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L；b.连续培养驯化过程中逐渐降低pH值，依次为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0；c.连续培养驯化过程中逐渐降低高纯氮的通入量，增加发酵体系中的溶氧。连续培养驯化期间，需及时检测菌体OD600值，更换发酵条件时，需在该条件下维持一段时间的发酵，以OD600值增加，菌株适应该发酵条件为标准。
驯化发酵培养基的组成如下：
酵母提取物，10 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，按驯化阶段而定；蒸馏水定容至1000 mL。
连续培养过程中所需pH值，通过泵入1 mol/L的NAOH溶液1 mol/L的HCL溶液调节。,
所需的厌氧环境是由含量为99.999%高纯氮形成，一般保持连续注入维持厌氧环境。
（4）产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124的获取
将步骤（3）的发酵培养过程持续56天，期间维持恒定的2L发酵体系，通过上述方法梯度改变发酵条件，最终筛选获得一株能够在葡萄糖的浓度120 g/L、 pH 4.0的有氧条件下维持生长的菌株，即所述产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124。
实施例2 菌种鉴定
产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124的16S rRNA基因的序列测定
（1）提取DNA（参照TAKARA提基因组试剂盒）
将产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124接种于发酵培养基进行培养；通过测OD值，取生长至对数晚期的发酵液，12,000转/分钟离心5分钟，去除上清液；加入500 μL的Buffer BS重悬细胞，加入50 μL的Lysozyme（20 mg/mL），充分吸打混匀，于37 ℃水浴温育1小时（每隔20分钟颠倒混匀一次）；12,000 rpm离心5分钟，弃上清；加入180 μL的Buffer GL、20 μL的Proteinase K（20 mg/mL）和10 μL的RNase A（10 mg/mL），充分吸打混匀，于56 ℃水浴温育10分钟；加入200 μL的Buffer GB和200 μL的100%乙醇，充分吸打混匀；将Spin Column安装在Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液；将500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；将700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液，重复一次；将Spin Column安置在Collection Tube上，12,000 rpm离心2分钟；将SpinColumn安置在新的1.5 mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入70 μL的65℃灭菌蒸馏水，室温静置5分钟；12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。
（2）16S rRNA基因的序列测定
将所提DNA送至铂尚生物公司完成16S rRNA基因序列的测定。
测序结果表明，产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124的16S rRNA基因序列长度为1000 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
将16S rRNA基因序列在GenBank中进行序列比对分析，结果表明，其序列与Propionibacterium acidipropionici菌株的16S rRNA基因序列的相似性为100%，鉴定为产酸丙酸杆菌。
实施例3 产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124的生长特性分析
（1）耐酸性能分析；
将产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌以5%的比例分别接种于50 mL 发酵培养基中，在30 ℃，葡萄糖浓度为30 g/L，pH 7.0、pH 6.0、pH 5.0、pH 4.0的厌氧条件下培养。
发酵培养基的组成如下：
酵母提取物，10 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，30 g；蒸馏水定容至1000 mL。
所需的厌氧环境是由含量为99.999%高纯氮形成，一般注入达到1个大气压的量。
实验设置三组平行试验，每隔8 h取样一次，绘制生长曲线。绘制的生长曲线如图1-图4所示，图1-图4依次为L1124和原始产酸丙酸杆菌在pH值7.0、6.0、5.0、4.0的发酵培养基中于厌氧条件下30℃培养后菌体OD600值变化曲线。
（2）耐高糖性能分析；
将产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌以5%的比例分别接种于50 mL 发酵培养基中，在30 ℃，pH 7.0，葡萄糖浓度为30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L的厌氧条件下培养。
发酵培养基的组成如下：
酵母提取物，10 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，根据实验所需浓度而定；蒸馏水定容至1000 mL。
所需的厌氧环境是由含量为99.999%高纯氮形成，一般注入达到1个大气压的量。
实验设置三组平行试验，每隔8 h取样一次，绘制生长曲线。绘制的生长曲线如图5~图8所示，图5~图8依次为L1124和原始产酸丙酸杆菌在葡萄糖浓度为30 g/L、60 g/L、90g/L、120 g/L的发酵培养基中于厌氧条件下30℃培养后菌体OD600值变化曲线。
（3）耐氧性能分析
将产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌以5%的比例分别接种于50 mL 发酵培养基中，在30 ℃，pH 7.0，葡萄糖浓度为30 g/L的条件下进行厌氧、缺氧以及有氧培养。
所需的厌氧环境是由含量为99.999%高纯氮形成，一般注入达到1个大气压的量；所需缺氧环境是由79%N2、11%CO2以及10%O2组成；所需有氧环境是由79%N2和21%O2组成。
实验设置三组平行试验，每隔8 h取样一次，绘制生长曲线。
实验结果表明：
本发明通过发酵罐连续发酵培养的方法驯化产酸丙酸杆菌，获得一株新的产酸丙酸杆菌，有效改善了产酸丙酸杆菌的生理生化性能，增强了产酸丙酸杆菌对氧、酸以及渗透压的耐受性；克服发酵过程中厌氧菌生长周期长，产量低的问题。将产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124在pH值4.0的情况下，OD600值最高可达0.3223；在糖浓度为120g/l的情况下，OD600值最高可达0.367。此外产酸丙酸杆菌L1124与产酸丙酸杆菌先比相同的生长环境下，产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124的生长状态均优于产酸丙酸杆菌。
实施例4 丙酸产量的检测
将产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124和原始产酸丙酸杆菌在种子培养基中培养24 h后，以5%的比例分别接种于2 L发酵培养基中，在30 ℃，pH7.0，转速120 rpm的条件下培养。
种子培养基的组成如下：
酵母提取物，5 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，5 g；0.05%刃天青指示剂，2 mL；蒸馏水定容至1000 mL。
发酵培养基的组成如下：
酵母提取物，10 g；胰蛋白胨，5 g；磷酸氢二钾（K2HPO4），0.25 g；硫酸锰（MnSO4），0.05 g；葡萄糖，30 g；蒸馏水定容至1000 mL。
发酵体系所需的厌氧环境由连续通入含量为99.999%高纯氮形成，一般注入达到1个大气压的量。
实验设置三组平行试验，每隔8小时取样检测丙酸产量。56小时内菌株L1124和原始菌株丙酸产量变化如图12所示，可以看出，本发明的菌株相比原始菌株，丙酸产量提高接近一倍。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌及其应用
<130> xb17122102
<141> 2017-12-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgcttggcgt cacttcgaga ctccccacgc agaacgtgtt gggccaccgg cttcgggtgt 60
taccgacttt catgacttga cgggcggtgt gtacaagccc cgggaacgta ttcaccgcag 120
cgttgctgat ctgcgattac tagcgactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa 180
tccgaactga gaccggcttt ctgagattcg ctccacctca cgatgtcgcc actctttgta 240
ccggccattg tagcatgcgt gaagccctgg acataagggg catgatgact tgacgtcatc 300
cccaccttcc tccgagttga ccccggcggt ctccactgag tccccaacca aatgctggca 360
acagtggacg agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacagcca tgcaccacct gtgaaccggc ccacaagggg ggcggccatc tctgaccgtt 480
accaatccat gtcaaaccca ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa tccgcatgct 540
ccgccgcttg tgcggggccc cgtcaattcc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc 600
caggcggggt acttaatgcg ttagctacgg cacggaatcc gtggaatgga ccccacacct 660
agtacccacc gtttacagcg tggactacca gggtatctaa gcctgtttgc tccccacgct 720
ttcgctcctc agcgtcagga aaggtccaga gaaccgcctt cgccactggt gttcctcctg 780
atatctgcgc attccaccgc tccaccagga attccattct cccctacctt cctcaagtca 840
acccgtatcg aaagcacgct cagggttaag ccccaagttt tcacttccga cgcgatcaac 900
cgcctacgag ccctttacgc ccaataaatc ccggactacg cctcgcaccc tacgtatcac 960
gcggctgctg gcacgtagtt agcctgtgct ctctcagtac 1000

Claims (6)

1.一种耐氧耐酸耐高糖的产酸丙酸杆菌，其分类命名为产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）L1124，保藏编号CGMCC No. 14869。
2.权利要求1所述产酸丙酸杆菌在发酵生产丙酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其发酵体系为厌氧发酵；厌氧环境由连续通入含量为99.999%高纯氮形成。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，产酸丙酸杆菌L1124发酵生产丙酸步骤如下：将产酸丙酸杆菌L1124在种子培养基中培养24h后，以5%的比例接种于2L发酵培养基中，在30℃，pH 7.0，转速120 rpm的条件下培养。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，种子培养基的组成如下：酵母提取物5 g；胰蛋白胨5 g；磷酸氢二钾0.25 g；硫酸锰0.05 g；葡萄糖5 g；0.05%刃天青指示剂2 mL；蒸馏水定容至1000 mL。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基的组成如下：酵母提取物10 g；胰蛋白胨5 g；磷酸氢二钾0.25 g；硫酸锰0.05 g；葡萄糖30 g；蒸馏水定容至1000 mL。
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