CN104357497A - 一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法 - Google Patents

一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法，属于生物技术领域。本发明通过在培养基中添加乳酸、苹果酸、富马酸或琥珀酸，实现P.acidipropionici丙酸产量分别提高43％、11％、10％和9％，并通过同时添加105mM乳酸、20mM富马酸和30mM琥珀酸实现了丙酸产量的最大提高。本发明为促进产酸丙酸杆菌的丙酸发酵生产提供了有效的方法和新的思路。

Description

一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术
作为一种重要的C3平台化合物，丙酸及其衍生物的用途十分广泛，可应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除莠剂合成、有机合成中间体及香料、涂料、染料等方面。2006年世界丙酸总生产能力在35万吨/年左右，2008年达到50万吨/年。美国是世界上最大的丙酸生产及消费国。目前我国丙酸实际年产量只有200吨左右，远远不能满足实际的市场需求，每年仍需大量进口来弥补国内的空缺。
目前，丙酸的生产方法有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸，是现在工业上生产丙酸的主要方法。随着化石原料(如石油、煤炭)等不可再生资源、能源的日渐枯竭以及环境污染的日益加剧,以可再生生物资源为原料大规模生产丙酸的微生物发酵法为丙酸的合成提供了新的思路。用于丙酸发酵的菌种主要是丙酸杆菌属，是一类革兰氏阳性、不产芽孢、不运动、接触酶阳性的厌氧菌。其中产酸丙酸杆菌为目前国内外用于丙酸发酵研究的主要菌株之一，最适pH为6.5～7.5，最适生长的温度为28℃～37℃，具有较高的丙酸生产能力。然而，相对于日益增长的市场需求，微生物发酵法的发展仍然严重受制于过低的丙酸产量。大幅提高发酵的产量、生产强度和底物转化率，是实现发酵法替代化学合成法生产丙酸的必要途径。产酸丙酸杆菌中丙酸的代谢途径虽已知，但是制约丙酸产量的瓶颈仍未明确。
本发明通过添加中间代谢物控制丙酸代谢途径中关键代谢节点的通量，最终达到提高丙酸的产量的目的。应用该方法可显著提高产酸丙酸杆菌P.acidipropionici的丙酸产量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法，是在产酸丙酸杆菌的发酵培养基中添加乳酸、苹果酸、富马酸或琥珀酸中的一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，乳酸、苹果酸、富马酸或琥珀酸中的一种或几种是在接种前添加到发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸添加量为45-130mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述乳酸添加量为70-105mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述乳酸添加量为70-90mM。
在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸添加量为10-60mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述苹果酸添加量为10-40mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述苹果酸添加量为40mM。
在本发明的一种实施方式中，所述富马酸添加量为2-50mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述富马酸添加量为20-40mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述富马酸添加量为30mM。
在本发明的一种实施方式中，所述琥珀酸添加量为10-50mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述琥珀酸添加量为10-30mM。
在本发明的另一种实施方式中，所述琥珀酸添加量为20-30mM。
在本发明的一种实施方式中，所述产酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)是为产酸丙酸杆菌CGMCC1.2230。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基组成为按g/L计：酵母粉，8-10；蛋白胨，3-5；KH2PO4，1.0-1.5；K2HPO4，2.0-2.5；甘油，20-25；CoCl2，0-0.01；CaCO3，25-30；pH6.8-7.2。
在本发明的另一种实施方式中，所述发酵培养基组成为(g/L H2O)：酵母粉，10；蛋白胨，5；KH2PO4，1.5；K2HPO4，2.5；甘油，25；CoCl2，0.01；CaCO3，30；pH7.0。
本发明的有益效果：本发明的特点是通过分别添加90mM乳酸、40mM苹果酸、30mM富马酸或20mM琥珀酸，实现P.acidipropionici丙酸产量分别提高43％、11％、10％和9％；并通过同时添加105mM乳酸、20mM富马酸和30mM琥珀酸实现了丙酸产量提高77％。这为提高产酸丙酸杆菌的丙酸发酵生产能力提供了新的思路。
附图说明
图1.外源添加乳酸、苹果酸、富马酸或琥珀酸对P.acidipropionici丙酸产量的影响。
具体实施方式
种子培养基(g/L H2O)：酵母粉，10；胰蛋白胨，5；KH2PO4，1.5；K2HPO4，2.5；pH7.0。
发酵培养基组成为(g/L H2O)：酵母粉，10；蛋白胨，5；KH2PO4，1.5；K2HPO4，2.5；甘油，25；CoCl2，0.01；CaCO3，30；pH7.0。
细胞干重(DCW)的测定：取一定量的菌悬液，用稀盐酸溶液适当稀释后用UV7500型可见分光光度计，于600nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
丙酸的测定方法：高效液相色谱(HPLC)仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)；色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，5μm，4.6mm×250mm；流动相：0.138mol/L NaHPO4，1％(v/v)乙腈，用磷酸调至pH2.0；流速：0.8mL/min；柱温：35oC；进样量：10μL；紫外检测器波长：210nm。
实施例1发酵培养基中外源添加乳酸、苹果酸、富马酸或琥珀酸提高P.acidipropioniciCGMCC1.2230丙酸产量
将冷冻甘油管保藏的P.acidipropionici接种到种子培养基，接种量1％，装液量100/100mL厌氧瓶，30℃静置培养60h后，转接到新鲜的种子培养基中，接种量1％，同样条件培养40h，完成活化培养。
将经活化培养好的P.acidipropionici以接种量10％分别转接到分别添加了90mM乳酸、40mM苹果酸、30mM富马酸或20mM琥珀酸的发酵培养基中，装液量50/100mL厌氧瓶，30℃静置培养150h。
将发酵液于8000rpm离心5min与菌体分离，取1mL上清液用3.68mM稀硫酸定容至10mL，经0.22μm滤膜过滤后使用HPLC法测定有机酸含量。结果如图1所示。通过添加不同浓度的不同酸P.acidipropionici发酵产酸的变化可以看出，在添加90mM乳酸、40mM苹果酸、30mM富马酸或20mM琥珀酸的条件下，P.acidipropionici发酵丙酸的产量均有明显提高。未添加氨基酸时丙酸产量为9.6g/L，添加乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸后丙酸产量分别可达13.7g/L、10.7g/L、10.6g/L和10.5g/L。
实施例2发酵培养基中复合添加乳酸、富马酸和琥珀酸提高P.acidipropionici丙酸产量
取经活化培养好的P.Acidipropionici CGMCC1.2230以接种量10％转接到复合添加乳酸、富马酸和琥珀酸的发酵培养基中，装液量50/100mL厌氧瓶，30℃静置培养150h。
将发酵液于8000rpm离心5min与菌体分离，取1mL上清液用3.68mM稀硫酸定容至10mL，经0.22μm滤膜过滤后使用HPLC法测定有机酸含量。结果如表1所示，通过添加不同组合的酸时P.acidipropionici发酵产酸的变化可以看出，未添加氨基酸时丙酸产量为9.6g/L，同时添加乳酸、富马酸和琥珀酸后丙酸产量最高可达17.0g/L。
表1：外源添加不同组合的中间代谢物对P.acidipropionici丙酸产量的影响
实施例3发酵培养基中同时添加105mM乳酸、20mM富马酸和30mM琥珀酸提高P.acidipropionici丙酸产量
取经活化培养好的P.Acidipropionici CGMCC1.2230以接种量10％转接到发酵培养基，装液量50/100mL厌氧瓶，30℃静置培养150h。
将发酵液于8000rpm离心5min与菌体分离，取1mL上清液用3.68mM稀硫酸定容至10mL，经0.22μm滤膜过滤后使用HPLC法测定有机酸含量。结果如表1所示。通过添加不同浓度的乳酸、富马酸和琥珀酸时P.acidipropionici发酵产酸的变化可以看出，未添加氨基酸时丙酸产量为9.6g/L，同时添加105mM乳酸、20mM富马酸和30mM琥珀酸后丙酸产量可达17.6g/L。
表2：外源添加不同浓度的乳酸、富马酸和琥珀酸对P.acidipropionici丙酸产量的影响
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高产酸丙酸杆菌丙酸产量的方法，是向产丙酸发酵培养基中添加乳酸、苹果酸、富马酸或琥珀酸中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单独添加乳酸或与其他酸混合添加时，培养基中乳酸终浓度为45-130mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，乳酸终浓度为70-105mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单独添加苹果酸或与其他酸混合添加时，培养基中苹果酸终浓度为10-60mM。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，苹果酸终浓度为10-40mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，富马酸单独添加或与其他酸混合添加时，培养基中富马酸终浓度为2-50mM。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，富马酸终浓度为20-40mM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，琥珀酸单独添加或与其他酸混合添加时，培养基中琥珀酸终浓度为10-50mM。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，琥珀酸终浓度为10-30mM。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为按g/L计：酵母粉，8-10；蛋白胨，3-5；KH2PO4，1.0-1.5；K2HPO4，2.0-2.5；甘油，20-25；CoCl2，0-0.01；CaCO3，25-30；pH6.8-7.2。
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