CN105385712B - 一种发酵生产丙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域,具体涉及一种发酵生产丙酸的方法。本发明所述发酵生产丙酸的方法包括如下步骤:(1)将保藏编号为CGMCC1.2232的产酸丙酸杆菌活化,接种于含有丙酸的种子培养基,在无氧条件下,30~35℃,培养40~60h;(2)将所得菌液接种于发酵培养基中,在无氧条件下,30~35℃,搅拌转速50~150rpm,发酵至pH不再变化,发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在5.5‑7之间。本发明所述发酵生产丙酸的方法在种子培养基中加入丙酸对产酸丙酸杆菌进行诱导培养,进一步在发酵过程中对发酵pH进行分段控制,可以提高丙酸的含量,缩短丙酸发酵时间,明显提高丙酸的生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,具体涉及一种发酵生产丙酸的方法,特别是一种丙酸的发酵生产丙酸的方法。
背景技术
丙酸及其钙盐作为一种防腐保鲜剂,对于霉菌、酵母菌及细菌等具有广泛的抗菌作用,尤其是丙酸钙,在酸性条件下,产生游离丙酸,具有抗菌作用。丙酸钙其抑菌作用受环境pH值的影响,在pH值5.0时霉菌的抑制作用最佳;pH值6.0时抑菌能力明显降低,最小抑菌浓度为0.01%。在酸性介质(淀粉、含蛋白质和油脂物质)中丙酸及其钙盐对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌或好氧芽孢杆菌有较强的抑制作用,还可以抑制黄曲霉素的产生,而对酵母菌无害,对人畜无害,无毒副作用,并能给人畜提供必需的钙。因此丙酸及其钙盐是食品、酿造、饲料、中药制剂诸方面的一种新型、安全、高效的食品与饲料用防霉剂,被广泛的应用于食品、饲料、医药等方面。
丙酸还是种重要的精细化工原料及产品,在有机合成工业、涂料、油漆、染料、化妆品、医药、农药、香料、林产化学上业及其它一些部门有着广泛的应用。以丙酸作原料可制得DL-丙氨酸,进而可生产维生素B6;用丙酸、乙随和纤维素反应生成CAP,可生成一种生物可降解塑料;还用于生产农药除草剂的2-氯丙酸,用于工业、建筑等的粘着剂、防水剂的丙酸乙烯酯等,都是以丙酸作为原料;丙酸另外还可用作电镀助剂等。
现有丙酸及其钙盐生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。国际上主要采用化学合成法以石油为原料工业化生产丙酸及其钙盐,然而,化学合成法污染重、成本高、操作条件苛刻,不符合全球环保意识不断增强的潮流,因此,人们逐渐把注意力投向了微生物发酵法。
目前,国内工业发酵丙酸常使用以酵母粉和蛋白胨为有机氮源的发酵培养基发酵生产丙酸,所得丙酸与碱或盐进一步反应生成相应的丙酸盐,其总成本高于化学合成法,且发酵时间长,产量较低。所以提高丙酸产量降低成本已成为微生物法发酵生产丙酸及其钙盐研究的主要方向。
发明内容
有鉴于此,本发明目的是提供一种生产速率高的发酵生产丙酸的方法。
为实现本发明的目的,本发明采用如下技术方案:
一种发酵生产丙酸的方法,包括如下步骤:
(1)将保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌活化,接种于含有丙酸的种子培养基,在无氧条件下,30~35℃,培养40~60h;
(2)将步骤(1)所得菌液接种于发酵培养基中,在无氧条件下,30~35℃,搅拌转速50~150rpm,发酵至pH不再变化,发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在5.5-7之间。
本发明所述发酵生产丙酸的方法在种子培养基中加入丙酸对产酸丙酸杆菌进行诱导培养。
其中,所述种子培养基中丙酸的加入量,按重量体积百分比g/ml计,优选为0.1%~0.6%。
在一些实施方案中,所述种子培养基中所述丙酸按重量体积百分比g/ml计为0.1%。在一些实施方案中,所述种子培养基中所述丙酸按重量体积百分比g/ml计为0.6%。在一些实施方案中,所述种子培养基中所述丙酸按重量体积百分比g/ml计为0.3%。
进一步,本发明所述发酵生产丙酸的方法在发酵过程中对发酵pH进行分段控制。
其中,所述分段控制优选为分别对发酵前120小时的pH值和发酵120小时后的pH值进行分段控制。
优选的,步骤(2)发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在发酵前120小时为5.5~6.7,发酵120小时后为6.8~6.99。
本发明所述发酵生产丙酸的方法中发酵前120小时的pH值在一些实施方案中为5.5,在另一些实施方案中为6.2。而发酵120小时后的pH值在一些实施方案中为6.8,在另一些实施方案中为6.9。
在一些具体实例中,步骤(2)发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在发酵前120小时为5.5,发酵120小时后为6.8。
在另一些具体实例中,步骤(2)发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在发酵前120小时为6.2,发酵120小时后为6.9。
本发明所述发酵生产丙酸的方法,步骤(1)中活化的产酸丙酸杆菌的接种量为1v/v%~2v/v%。在一些实施方案中,活化的产酸丙酸杆菌的接种量为1v/v%。在一些实施方案中,活化的产酸丙酸杆菌的接种量为1.5v/v%。在一些实施方案中,活化的产酸丙酸杆菌的接种量为2v/v%
本发明所述发酵生产丙酸的方法,步骤(2)所述菌液的接种量为5v/v%~20v/v%。在一些实施方案中,菌液的接种量为10v/v%。在一些实施方案中,菌液的接种量为5v/v%。在一些实施方案中,菌液的接种量为20v/v%。
本发明所述种子培养基和发酵培养基为发酵生产丙酸时常用的种子培养基和发酵培养基。
在一些实施方案中,所述种子培养基按重量体积百分比g/ml计为酵母浸粉1%、胰蛋白胨大豆肉汤0.5%、磷酸氢二钾0.25%、磷酸二氢钾0.15%、甘油4%,余量为水,pH7.0。
在一些实施方案中,所述发酵培养基按重量体积百分比g/ml计为酵母粉1%、蛋白胨0.5%、磷酸氢二钾0.25%、磷酸二氢钾0.15%、甘油4%,余量为水,pH7.0。
本领域技术人员可以采用常规的活化保藏菌种的方法对甘油保藏的本发明所述产酸丙酸杆菌进行活化。
在一些实施方案中,所述活化为将甘油保藏的保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌接种于种子培养基,在无氧条件下,30℃培养60h。
进一步的,所述用于活化的种子培养基,按重量体积百分比g/ml计,为酵母浸粉1%、胰蛋白胨大豆肉汤0.5%、磷酸氢二钾0.25%、磷酸二氢钾0.15%、甘油4%,余量为水,pH 7.0。
进一步的,所述活化中所述产酸丙酸杆菌接种于种子培养基的接种量为1v/v%。
由上述技术方案可知,本发明提供了一种发酵生产丙酸的方法。本发明所述发酵生产丙酸的方法在种子培养基中加入丙酸对产酸丙酸杆菌进行诱导培养,进一步在发酵过程中对发酵pH进行分段控制,可以提高丙酸的含量,缩短丙酸发酵时间,明显提高丙酸的生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1测量丙酸含量的色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为高度;
图2示实施例2测量丙酸含量的色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为高度;
图3示实施例3测量丙酸含量的色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为高度;
图4示实施例4测量丙酸含量的色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为高度;
图5示实施例5测量丙酸含量的色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为高度;
图6示实施例6测量丙酸含量的色谱图,其中横坐标为时间,纵坐标为高度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1、现有发酵工艺生产丙酸
一、预处理
将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1%的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中,向厌氧瓶中充氮气后,置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
二、种子液
将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1%的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基),充入无菌氮气,培养温度为30℃,时间为60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基,发酵培养基成分:按重量体积百分比计,酵母粉:1%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾:0.25%,磷酸二氢钾:0.15%,甘油:4%,余量为水,pH7.0。
2、将种子液按照5%的接种量接种于发酵罐中;
发酵生产:培养温度为30℃,搅拌速率50rpm,并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10%的Ca(OH)2溶液,将pH值维持在7.0。
3、发酵过程结束:
当pH值不再变化,发酵停止,离子色谱法测量丙酸含量。结果见图1及表1。
表1色谱测量结果
结果显示,样品稀释200倍,丙酸含量为33.7g/L,发酵所用时间为235h,发酵液终体积为7.0L,丙酸生产速率为0.143g/(L·h)。
实施例2、本发明发酵工艺生产丙酸
一、预处理
将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1%的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中,向厌氧瓶中充氮气后,置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
二、种子液
将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1.5%的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基),充入无菌氮气,培养温度为32℃,时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:3%、丙酸:0.6%,余量为水,pH7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基,发酵培养基成分:按重量百分比计,酵母粉:1%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾:0.25%,磷酸二氢钾:0.15%,甘油:4%,余量为水。
2、将种子液按照10%的接种量接种于发酵罐中;
发酵生产:培养温度为32℃,搅拌速率100rpm,并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10%的Ca(OH)2溶液,将pH值维持在6.5。
3、发酵过程结束:
pH值不再变化,发酵停止,离子色谱法测量丙酸含量,结果见图2及表2。
表2色谱测量结果
结果显示,样品稀释200倍,丙酸含量为35.5g/L,发酵所用时间为230h,发酵液终体积为7.4L,丙酸生产速率为0.154g/(L·h),生产率提高7.7%。
实施例3、本发明发酵工艺生产丙酸
一、预处理
将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1%的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中,向厌氧瓶中充氮气后,置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
二、种子液
将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1.5%的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基),充入无菌氮气,培养温度为32℃,时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:3%、丙酸:0.1%,余量为水,pH7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基,发酵培养基成分:按重量百分比计,酵母粉:1%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾:0.25%,磷酸二氢钾:0.15%,甘油:4%,余量为水。
2、将种子液按照10%的接种量接种于发酵罐中;
发酵生产:培养温度为32℃,搅拌速率100rpm,并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10%的Ca(OH)2溶液,发酵前120小时将pH值维持在5.5;发酵120小时后,将pH维持在6.8。
3、发酵过程结束:
pH值不再变化,发酵停止,离子色谱法测量丙酸含量,结果见图3及表3。
表3色谱测量结果
结果显示,样品稀释200倍,丙酸含量为37.6g/L,发酵所用时间为225h,发酵液终体积为6.8L,丙酸生产速率为0.167g/(L·h),生产率提高16.8%。
实施例4、本发明发酵工艺生产丙酸
一、预处理
将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1%的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中,向厌氧瓶中充氮气后,置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
二、种子液
将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1.5%的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基),充入无菌氮气,培养温度为32℃,时间为48h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:3%、丙酸:0.3%,余量为水,pH7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基,发酵培养基成分:按重量百分比计,酵母粉:1%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾:0.25%,磷酸二氢钾:0.15%,甘油:4%,余量为水。
2、将种子液按照10%的接种量接种于发酵罐中;
发酵生产:培养温度为32℃,搅拌速率100rpm,并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10%的Ca(OH)2溶液,发酵前120小时将pH值维持在6.2;发酵120小时后,将pH维持在6.9。
3、发酵过程结束:
pH值不再变化,发酵停止,离子色谱法测量丙酸含量,结果见图4及表4。
表4色谱测量结果
结果显示,样品稀释200倍,丙酸含量为44.8g/L,发酵所用时间为222h,发酵液终体积为7.1L,丙酸生产率为0.202g/(L·h),生产率提高41.3%。
实施例5、本发明发酵工艺生产丙酸
一、预处理
将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1%的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中,向厌氧瓶中充氮气后,置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
二、种子液
将上述厌氧瓶培养所得菌种按照1%的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基),充入无菌氮气,培养温度为30℃,时间为40h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:1%、丙酸:0.3%,余量为水,pH7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基,发酵培养基成分:按重量百分比计,酵母粉:1%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾:0.25%,磷酸二氢钾:0.15%,甘油:4%,余量为水。
2、将种子液按照5%的接种量接种于发酵罐中;
发酵生产:培养温度为30℃,搅拌速率50rpm,并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10%的Ca(OH)2溶液,发酵前120小时将pH值维持在6.2;发酵120小时后,将pH维持在6.9。
3、发酵过程结束:
pH值不再变化,发酵停止,离子色谱法测量丙酸含量,结果见图5及表5。
表5色谱测量结果
结果显示,样品稀释200倍,丙酸含量为41.0g/L,发酵所用时间为204h,发酵液终体积为7.1L,丙酸生产率为0.201g/(L·h),生产率提高40.6%。
实施例6、本发明发酵工艺生产丙酸
一、预处理
将常规甘油保藏的产酸丙酸杆菌按照1%的接种量接种于装有种子培养基的厌氧瓶(100ml厌氧瓶装100ml种子培养基)中,向厌氧瓶中充氮气后,置于30℃培养箱静置培养60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%,余量为水,pH 7.0。
二、种子液
将上述厌氧瓶培养所得菌种按照2%的接种量无菌转入装有种子培养基的厌氧瓶(250ml厌氧瓶装200ml种子培养基),充入无菌氮气,培养温度为35℃,时间为60h。按重量体积百分比(g/ml)计,种子培养基的成分为,酵母浸粉:1%、胰蛋白胨大豆肉汤:0.5%、磷酸氢二钾:0.25%、磷酸二氢钾:0.15%、甘油:4%、丙酸:0.3%,余量为水,pH7.0。
三、生产发酵
1、在10L发酵罐中投入6L发酵培养基,发酵培养基成分:按重量百分比计,酵母粉:1%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾:0.25%,磷酸二氢钾:0.15%,甘油:4%,余量为水。
2、将种子液按照20%的接种量接种于发酵罐中;
发酵生产:培养温度为35℃,搅拌速率150rpm,并保持氮气的持续充入。通过流加重量体积比(g/ml)为10%的Ca(OH)2溶液,发酵前120小时将pH值维持在6.2;发酵120小时后,将pH维持在6.9。
3、发酵过程结束:
pH值不再变化,发酵停止,离子色谱法测量丙酸含量,结果见图6及表6。
表6色谱测量结果
结果显示,样品稀释200倍,丙酸含量为40.2g/L,发酵所用时间为201h,发酵液终体积为7.0L,丙酸生产率为0.200g/(L·h),生产率提高40.0%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种发酵生产丙酸的方法,包括如下步骤:
(1)将保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)活化,接种于含有丙酸的种子培养基,在无氧条件下,30~35℃,培养40~60h;
(2)将步骤(1)所得菌液接种于发酵培养基中,在无氧条件下,30~35℃,搅拌转速50~150rpm,发酵至pH不再变化,发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在5.5-7之间;
其中,所述发酵培养基中按重量体积百分比g/ml计甘油为4%;所述发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在发酵前120小时为5.5~6.7,发酵120小时后为6.8~6.99。
2.根据权利要求1所述的方法,所述种子培养基中所述丙酸按重量体积百分比g/ml计为0.1%-0.6%。
3.根据权利要求2所述的方法,所述种子培养基中所述丙酸按重量体积百分比g/ml计为0.1%、0.6%或0.3%。
4.根据权利要求3所述的方法,步骤(2)发酵期间通过流加碱或盐溶液将pH值维持在发酵前120小时为5.5或6.2;发酵120小时后为6.8或6.9。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,步骤(1)中产酸丙酸杆菌的接种量为1%(v/v)~2%(v/v)。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,步骤(2)所述菌液的接种量为5%(v/v)~20%(v/v)。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,所述种子培养基按重量体积百分比g/ml计为酵母浸粉1%、胰蛋白胨大豆肉汤0.5%、磷酸氢二钾0.25%、磷酸二氢钾0.15%、甘油4%,余量为水,pH 7.0;所述发酵培养基按重量体积百分比g/ml计为酵母粉1%、蛋白胨0.5%、磷酸氢二钾0.25%、磷酸二氢钾0.15%、甘油4%,余量为水,pH7.0。
8.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,步骤(1)所述活化为将甘油保藏的保藏编号为CGMCC 1.2232的产酸丙酸杆菌接种于种子培养基,在无氧条件下,30℃培养60h。
9.根据权利要求8所述的方法,步骤(1)所述活化过程中所述产酸丙酸杆菌接种于种子培养基的接种量为1%(v/v)。
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