CN105925519A - 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用 - Google Patents

一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105925519A
CN105925519A CN201610296973.3A CN201610296973A CN105925519A CN 105925519 A CN105925519 A CN 105925519A CN 201610296973 A CN201610296973 A CN 201610296973A CN 105925519 A CN105925519 A CN 105925519A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ubiquinone
strain
product
fermentation
coenzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610296973.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105925519B (zh
Inventor
胡志浩
王庆军
范俊英
张瑞萍
韩祎君
王欣彤
施明雨
王绪州
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhou Biology & Technology Co Ltd
Biosynthetica Inc
Original Assignee
Shenzhou Biology & Technology Co Ltd
Biosynthetica Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhou Biology & Technology Co Ltd, Biosynthetica Inc filed Critical Shenzhou Biology & Technology Co Ltd
Priority to CN201610296973.3A priority Critical patent/CN105925519B/zh
Publication of CN105925519A publication Critical patent/CN105925519A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105925519B publication Critical patent/CN105925519B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种在辅酶Q10生产菌株SZ中降低或消除副产物D的方法，所述方法为在辅酶Q10生产菌株SZ中表达编码5‑脱甲氧基泛醇羟化酶的基因，从而降低或消除所述副产物D的积累，所述生产菌株SZ的分类命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO. 12177。本发明还公开了一种辅酶Q10高产菌株SF及其应用，所述高产菌株SF的分类命名为类球红细菌，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO. 12178。该高产菌株SF是在生产菌株SZ中表达编码5‑脱甲氧基泛醇羟化酶的基因而得，应用该高产菌株SF生产辅酶Q10产量达2g/L以上，具有广阔的应用前景。

Description

一种在辅酶Q10生产菌株SZ中降低或消除副产物D的方法、辅酶 Q10高产菌株及其应用
技术领域
本发明涉及现代生物学技术领域，具体地涉及一种在辅酶Q10生产菌株SZ中降低或消除副产物D的方法、辅酶Q10高产菌株及其应用。
背景技术
辅酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)，化学名称为：2，3-二甲氧基-5-甲基6-癸异戊烯基苯醌，分子式为C59H90O4，相对分子量为863，熔点为48-50℃，在室温下呈橙黄色结晶物，无臭无味。易溶于氯仿、苯、四氯化碳,溶于丙酮、石油醚及乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇。在光照下易分解成微红色，对温度和湿度较稳定。
辅酶Q10是一种脂溶性醌类化台物，最早于1957年被发现，由于在人体器官中的存在以及在生理等方面的重要功能，是人体细胞呼吸链的组成部分，参与细胞的能量代谢。同时它也是一种重要的抗氧化剂，保护线粒体膜蛋白以及DNA免受自由基的氧化损伤。长久以来它被用作营养保健品。同时它被认为可以用来治疗帕克森氏病和心血管疾病(Lieberman,A et al(2005)11:8)。
目前辅酶Q10的生产方法主要有3种：动植物组织提取法、化学合成法、微生物发酵法。三种方法各有优缺点，动植物组织提取法由于原料供应周期与来源受产地等问题而制约了辅酶Q10的规模化生产。目前研究较多的化学合成法是半合成法，但该方法生产程序复杂且产物为顺反异构体，不利于人体吸收。发酵法生产辅酶Q10生长周期短生物活性高，是近几年研究的热点。
目前，较成功的大规模辅酶Q10生产都是通过发酵法实现的。在中国，辅酶Q10的工业生产是经过类球红细菌发酵、提取和纯化得到的，所用的类球红细菌是经过长期的化学诱变等传统育种方法获得的。在工业生产中，现有的类球红细菌菌种在产生大量的辅酶Q10的同时，还产生一定量(占3％左右)的副产物D，而商品化的辅酶Q10产品的纯度要求在99％以上，因此副产物D必须从最终的辅酶Q10产品中除去。然而，在辅酶Q10的提取和纯化过程中，因为辅酶Q10和副产物D的物理性质很相似，将副产物D和辅酶Q10分离开来很难。需要较高的生产成本来制备纯度在99％以上辅酶Q10产品。
其中，辅酶Q10的结构式为
副产物D的结构式为
现代生物学技术，如合成生物学，基因工程，蛋白质工程，代谢工程等等已被应用于育种工作来改良微生物来满足人类的需求，例如(1)提高微生物发酵产品的产量(Leja,K,et al BioTechnologia 92(2011)345-351)，(2)除去发酵产品中的杂质，如多拉克丁生产菌中去除副产品CHC-B2(Stuuzman-Engwall et al Metabolic engineering 7(2005)27-37)，(3)开发合成新的产品，如在重组的大肠杆菌中生产脂肪醇(US8999686)和生物燃油(EP2157170)等等。
对目标微生物菌株建立一套DNA转化技术是对该微生物菌实施现代生物学育种该微生物的先决条件。在对经过传统育种得来的、用于工业发酵的微生物进行现代生物学育种时，常常遇到的问题之一就是常规的、针对野生型菌种的DNA转化技术对那些传统育种(如化学、辐射诱变)获得的高产菌种没有效应，因而不能对相应的微生物实施基因工程操作，例如基因表达、基因铐除等等。产辅酶Q10的类球红细菌野生型菌株一般可以通过接合和电击的方法来进行DNA转化(Piekarski,T.et al BMC Microbiology(2009)9:265)，然而在实践中从大肠杆菌中提取的DNA用上述两种方法辅酶Q10生产菌株不能获得任何转化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种在辅酶Q10生产菌株SZ中降低或消除副产物D的方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种在辅酶Q10生产菌株SZ中降低或消除副产物D的方法，其中，
所述辅酶Q10的结构式为
所述副产物D的结构式为
所述方法为在辅酶Q10生产菌株SZ中表达编码5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因，从而降低或消除所述副产物D的积累，所述生产菌株SZ的分类命名为类球红细菌Rhodobactersphaeroides，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO.12177。
进一步地，所述5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因来自大肠杆菌或类球红细菌。
更进一步地，所述5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因经过蛋白酶工程改造，含有一个氨基酸以上的突变。
本发明同时还提供一种辅酶Q10高产菌株SF及应用该高产菌株SF生产辅酶Q10的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种辅酶Q10高产菌株SF，所述高产菌株SF的分类命名为类球红细菌Rhodobactersphaeroides，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO.12178。
本发明采用的另一技术方案是：一种如上述辅酶Q10高产菌株SF的制备方法，所述制备方法为在所述辅酶Q10生产菌株SZ中表达编码5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因，获得所述辅酶Q10高产菌株SF。
本发明采用的另一技术方案是：如上述高产菌株SF用于生产辅酶Q10的应用。
本发明采用的又一技术方案是：一种辅酶Q10的生产方法，所述方法为通过发酵如上述高产菌株SF获得辅酶Q10。
进一步地，所述方法为：所述高产菌株SF在种子培养基培养后，以1～20％的接种量接种发酵培养基，在28～35℃下，发酵培养90h后得到含有辅酶Q10的发酵液。
为了进一步提高辅酶Q10的产率，对发酵过程进行优化，发酵24h后，添加0.1～1mmol/L的诱导剂IPTG。优选地，诱导剂IPTG的浓度为0.1-0.5mmol/L。
更进一步地，所述种子培养基为酵母粉1.0-10.0g/L，磷酸氢二钾0.1-2.5g/L，磷酸二氢钾0.1-2.5g/L，硫酸镁1.0-5.0g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，氯化钠0-5.0g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，谷氨酸钠0.5-3.0g/L，玉米浆干粉0.5-3.0g/L，葡萄糖5-20g/L，调节pH至6.50-7.30。
更进一步地，所述发酵培养基为玉米浆干粉1.0-15g/L，谷氨酸钠1.0-15g/L，硫酸铵1.0-15g/L，氯化钠1-10g/L，磷酸二氢钾0.5-6.0g/L，硫酸镁5-60g/L，碳酸钙0-5g/L，葡萄糖0-40g/L，七水硫酸亚铁0-5g/L，氯化钙0-1.0g/L，硫酸锰0-1.0g/L，调节pH至7.10-7.20。
根据本发明的一个具体实施方式，所述方法为：所述高产菌株SF在种子培养基培养后，以1～20％的接种量接种摇瓶发酵培养基，在28～35℃下，发酵培养96h后得到含有辅酶Q10的发酵液。
进一步地，所述种子培养基为酵母粉1.0-10.0g/L，磷酸氢二钾0.1-2.5g/L，磷酸二氢钾0.1-2.5g/L，硫酸镁1.0-5.0g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，氯化钠1.5-5.0g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，谷氨酸钠0.5-3.0g/L，玉米浆干粉0.5-3.0g/L，葡萄糖5-20g/L，调节pH至6.50-7.30。
进一步地，所述摇瓶发酵培养基为玉米浆干粉1.0-6.0g/L，谷氨酸钠1.0-6.0g/L，硫酸铵1.0-6.0g/L，氯化钠1-3.5g/L，磷酸二氢钾0.5-3.0g/L，硫酸镁5-10g/L，碳酸钙1-5g/L，葡萄糖20-40g/L，调节pH至7.10-7.20。
根据本发明的另一个具体实施方式，所述方法为：所述高产菌株SF在种子培养基培养后，以1～20％的接种量接种种子培养基，再以1～20％的接种量接种5L罐发酵培养基，在28～35℃下，发酵培养90h后得到含有辅酶Q10的发酵液。
进一步地，所述种子培养基为酵母粉1.0-10.0g/L，磷酸氢二钾0.1-2.5g/L，磷酸二氢钾0.1-2.5g/L，硫酸镁1.0-5.0g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，谷氨酸钠0.5-3.0g/L，玉米浆干粉0.5-3.0g/L，葡萄糖5-20g/L，调节pH至6.50-7.30。
进一步地，所述5L罐发酵培养基基础料为:玉米浆干粉2-15g/L，谷氨酸钠2-15g/L，硫酸铵2-15g/L，氯化钠1-10g/L，磷酸二氢钾1.0-6.0g/L，七水硫酸亚铁1-5g/L，七水硫酸镁20-60g/L，氯化钙0.1-1.0g/L，硫酸锰0.1-1.0g/L，调节pH至7.10-7.20；控制搅拌转速100-1000rpm，温度28～35℃，空气控制3.0L-6.0L/min。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用在辅酶Q10生产菌株SZ中表达编码5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因，副产物D得到了显著地降低，同时生产辅酶Q10的能力增强。
本发明提供的高产菌株SF，其副产物低、产量高且遗传性状稳定。使用该高产菌株SF发酵生产辅酶Q10，辅酶Q10的产量达到2g/L以上，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为辅酶Q10和副产物D的HPLC图谱；
图2为菌株SF和对照菌株SZ在5升发酵罐中产辅酶Q10的效价对比；
图3为菌株SF和对照菌株SZ在5升发酵罐中副产物D的百分比对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
表达质粒的构建
(a)以本实验室保藏pCL1920_pTrc(www.synthesisgene.com)及pMG160(Inui,M,et al AEM 69(2003)725-733)为模板，构建Rhodobacter sphaeroides表达载体pBM03；
(b)以E.coli W3110为模板，引物UbiF-F和UbiF-R扩增UbiF(Genbank:NC_000913.3)片段；以辅酶Q10生产菌株-类球红细菌SZ的基因组为模板，用引物UbiH1-F和UbiH1-R扩增获得UbiH1(Genbank:NC_007493，Rsp_1492)、用引物UbiH2-F和UbiH2-R扩增获得UbiH2(Genbank:NC_007493，Rsp_1869)，相应的引物系列如序列表中SEQ ID NO：1所示；
(c)构建的表达质粒分别为pBM03-UbiF、pBM03-UbiH1、pBM03-UbiH2。
步骤(a)、(c)均采用EZ fusion方法(Generay GR6086)获得，类球红细菌SZ已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO.12177。
实施例2
菌株fst△(Rhodobacter sphaeroides 2.4.1ΔrshI)的构建
(a)以本实验室保藏pK18mobSacB为载体，以辅酶Rhodobacter sphaeroides2.4.1基因组为模板，引物为rshI-5'-F/R、rshI-3'-F/R，构建质粒pK18mobSacB_rshI；
(b)将pK18mobSacB_rshI转化本实验室保藏E.coli S17-1宿主，获得E.coli S17-1/pK18mobSacB_rshI；
(c)将pK18mobSacB_rshI通过接合转移实验从E.coli S17-1/pK18mobSacB_rshI转移到类球红细菌，Fst菌中，通过萘啶酮酸+抗性标记筛选，获得单交换菌株Fst_rshI的接合子。详细的接合转移方法见Porter SL,et al Methods Enzymol 423:392-413(2007).
(d)20％蔗糖筛选得到无抗性的双交换菌株-类球红细菌Fst△。经过利用rshI-5'-F/rshI-3'R引物扩增Fst△的基因组得到了预期扩增片段(1084bp)，说明rshI敲除成功。
步骤(c)中Fst为野生型的类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1。
实施例3
Fst△及SZ感受态的制备
(a)从保有Fst△菌、SZ菌甘油管中分离取20ul，在LB平板划线，34℃避光培养过夜；
(b)挑取单菌至4ml LB的试管，34℃避光活化过夜，至菌体OD≤1.0；
(c)转移(b)中的4ml菌液，接种到含100ml LB培养基的500ml摇瓶中，34℃，220rpm，避光培养4-6h；
(d)但上述培养液的OD达到0.6，用6000rpm离心3min收菌体；
(e)随后用无菌水洗涤菌体3次，6000rpm离心，3min；
(f)加入0.5-1ml的E2制备液到制备的菌体中悬浮菌体，将每80ul菌体分装到eppendrof管中，置-80℃备用。
步骤(a)中类球红细菌SZ为辅酶Q10生产菌株，(f)中E2制备液成分为：0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，20g/L甘油。
实施例4
工程菌SF、SH1、SH2的构建
(a)先将pBM03-UbiF、pBM03-UbiH1、pBM03-UbiH2电击转化感受态Fst△，涂布抗性平板，分别获得工程菌：Fst△/pBM03-UbiF、Fst△/pBM03-UbiH1、Fst△/pBM03-UbiH2；
(b)从(a)得到的Fst△/pBM03-UbiF，Fst△/pBM03-UbiH1、Fst△/pBM03-UbiH2提质粒，分别电击转化SZ感受态，涂布硫酸卡那霉素抗性平板，获得基因工程菌SZ/pBM03-UbiF、SZ/pBM03-UbiH1、SZ/pBM03-UbiH2，命名为SF、SH1、SH2，其中，菌株SF已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO.12178。
步骤(a)、(b)中抗性平板配方为：5g/L酵母粉，0.5g/L磷酸氢二钾，0.5g/L磷酸二氢钾，1.5g/L七水硫酸镁，0.1g/L七水硫酸亚铁，2.5g/L氯化钠，2.5g/L硫酸铵，1g/L谷氨酸钠，2.5g/L玉米浆干粉，10g/L葡萄糖，17g/L琼脂粉，调节pH至7.16。添加硫酸卡那霉素至终浓度25ng/ml。
电击条件：1.8-3kV，5ms。
实施例5
HPLC测定类球红细菌发酵液中的辅酶Q10和相关的副产物D的方法
检测样品制备：碱皂化法提取，具体工艺为：10ml菌悬液在6000rpm下离心10min，蒸馏水洗涤2次，在湿菌体中加入1mL丙酮，冰浴条件下超声波破碎(功率400W，工作4s， 休息5s，工作60次)并移入圆底烧瓶中，加入pH3.0的酸性水2mL，搅拌均匀，90℃下回流1h，缓慢加入10％NaOH 3mL混匀，90℃回流1h，迅速冷却，加入5mL正己烷提取2次，合并萃取液，去离子水洗至中性，以无水硫酸钠脱水至澄清，真空旋转蒸发浓缩，再用2mL无水乙醇溶解，HPLC检测。
高效液相色谱法的参数：
色谱条件：反相C18分析柱，流动相为无水乙醇：甲醇＝35：65(V/V)，紫外检测器，检测波长275nm，流度1.2mL/min，进样量10μL，柱温50℃。辅酶Q10和副产物D的出峰时间分别为6.163和5.785分钟，辅酶Q10和副产物D的HPLC图谱如图1所示。
实施例6
摇瓶发酵SZ、SH1、SH2发酵生产辅酶Q10比较
(1)种子培养：
种子培养基：酵母粉5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.5g/L，硫酸铵2.5g/L，谷氨酸钠1g/L，玉米浆干粉2.5g/L，葡萄糖10g/L调节pH至7.16。将平板活化的单菌挑至种子培养基，220rpm，34℃培养20h。
(2)发酵培养：将上述种子按2％的接种量转接到摇瓶发酵培养基中后，置于摇床中，34℃，220rpm，发酵120h。分别在发酵的72，96及120h取样，将发酵液离心，抽提辅酶Q10，用HPLC测定发酵液中的辅酶Q10产量。摇瓶发酵培养基的配方为：玉米浆干粉2.0g g/L，谷氨酸钠2.5g g/L，硫酸铵3.0g g/L，氯化钠1.5g g/L，磷酸二氢钾0.5g g/L，硫酸镁5g/L，碳酸钙5g/L，葡萄糖20g/L，调节pH至7.10-7.20。
(3)SH1、SH2及SF的辅酶Q10的浓度、副产物D的浓度、及对SZ副产物D的比例如表1所示。发酵结果显示在基因工程菌中，5-脱甲氧基泛醇羟化酶基因可以降低副产物D的积累。表达来自大肠杆菌的ubiF对降低副产物D的浓度最有效果。在发酵120h，过表达ubiH1，ubiH2和ubiF所产生的副产物D为出发菌株SZ的36％，34％和22％。
表1为SH1、SH2及SF的辅酶Q10的浓度、副产物D的浓度及对SZ副产物D的比例
实施例7
摇瓶发酵SF在不同时间诱导表达生产辅酶Q10比较
在发酵24h或48h添加终浓度0.2mmol/L的IPTG，SZ和SF为无诱导的对照菌株，结果如表2所示，结果表明SF菌株在添加IPTG、诱导表达ubiF的条件下比不诱导时的辅酶Q10产量要高，而且在发酵24h添加IPTG诱导比在48h是效果要好。在发酵的120h，对照菌SZ，没添加IPTG诱导的SF，和在发酵24h，48h添加IPTG诱导的SF的辅酶Q10的产量分别为187.61mg/L，100.84mg/L，216.20mg/L和148.53mg/L，副产物D的相应产量分别为12.66mg/L，1.77mg/L，1.78mg/L和0.94mg/L。在发酵24h添加IPTG诱导，基因工程菌SF和出发菌株SZ相比，不仅在辅酶Q10产量上提高了15.2％，而且副产物D的产量降低了7.2倍。
表2为SZ、SF和SF在IPTG不同时间诱导条件下辅酶Q10的浓度、副产物D的浓度及对SZ副产物D的比例比较
实施例8
在5L发酵罐利用基因工程菌株SF发酵生产辅酶Q10
种子培养基培养：从平板中选取数个
接种量：500mL
种子OD600：7-8
发酵罐：5L(上海保兴)
装液量：3L
温度：34℃
pH：用氨水调节pH为6.5
溶氧：前期溶氧不进行控制，后期溶氧控制在0-10％之间
转速：300-1000rpm，根据发酵过程中的溶氧指标进行控制
通气量：0-30h为3.5L/min；30-90h为4.0L/min
补全料：分别于24h、42h、55h补加全料
补料：550g/L葡萄糖，接种前补加初糖82mL(约12g/L)，发酵10h开始补糖，发酵过程糖浓度控制在5-10g/L
补磷：10g/150mL KH2PO4发酵4h开始补磷，42h全部补完。
诱导剂诱导：发酵24h添加IPTG进行诱导。
种子培养基：配方如表3所示
表3为种子培养基的配方组成
种子液 浓度
硫酸铵 2.5g/L
酵母粉 5.0g/L
谷氨酸钠 0.5g/L
玉米浆干粉 0.5g/L
葡萄糖 5.0g/L
磷酸氢二钾 0.5g/L
磷酸二氢钾 0.5g/L
硫酸亚铁 0.1g/L
硫酸镁 2.0g/L
pH 7.16
5L罐发酵培养基：配方如表4所示
表4为5L罐发酵培养基的配方组成
结果如图2和图3所示，发酵过程中，SF产量始终高于对照菌株SZ，且主峰辅酶Q10在副产物D和辅酶Q10中的占比亦是SF高于SZ，SF对副产物D消除效果明显。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在辅酶Q10生产菌株SZ中降低或消除副产物D的方法，
其中，所述辅酶Q10的结构式为
所述副产物D的结构式为
其特征在于：所述方法为在辅酶Q10生产菌株SZ中表达编码5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因，从而降低或消除所述副产物D的积累，所述生产菌株SZ的分类命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCC NO.12177。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因来自大肠杆菌或类球红细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因经过蛋白酶工程改造，含有一个氨基酸以上的突变。
4.一种辅酶Q10高产菌株SF，所述高产菌株SF的分类命名为类球红细菌，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年3月4日，保藏编号为CGMCCNO.12178。
5.一种如权利要求4所述辅酶Q10高产菌株SF的制备方法，其特征在于：所述制备方法为在所述辅酶Q10生产菌株SZ中表达编码5-脱甲氧基泛醇羟化酶的基因，获得所述辅酶Q10高产菌株SF。
6.如权利要求4所述的高产菌株SF用于生产辅酶Q10的应用。
7.一种辅酶Q10的生产方法，其特征在于：所述方法为通过发酵如权利要求4所述高产菌株SF获得辅酶Q10。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述高产菌株SF在种子培养基培养后，以1～20％的接种量接种发酵培养基，在28～35℃下，发酵培养90h后得到含有辅酶Q10的发酵液。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于：所述种子培养基为酵母粉1.0-10.0g/L，磷酸氢二钾0.1-2.5g/L，磷酸二氢钾0.1-2.5g/L，硫酸镁1.0-5.0g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，氯化钠0-5.0g/L，硫酸铵1.5-3.5g/L，谷氨酸钠0.5-3.0g/L，玉米浆干粉0.5-3.0g/L，葡萄糖5-20g/L，调节pH至6.50-7.30。
10.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基为玉米浆干粉1.0-15g/L，谷氨酸钠1.0-15g/L，硫酸铵1.0-15g/L，氯化钠1-10g/L，磷酸二氢钾0.5-6.0g/L，硫酸镁5-60g/L，碳酸钙0-5g/L，葡萄糖0-40g/L，七水硫酸亚铁0-5g/L，氯化钙0-1.0g/L，硫酸锰0-1.0g/L，调节pH至7.10-7.20。
CN201610296973.3A 2016-05-06 2016-05-06 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用 Active CN105925519B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610296973.3A CN105925519B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610296973.3A CN105925519B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105925519A true CN105925519A (zh) 2016-09-07
CN105925519B CN105925519B (zh) 2019-09-20

Family

ID=56834283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610296973.3A Active CN105925519B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105925519B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107793306A (zh) * 2017-10-30 2018-03-13 上虞新和成生物化工有限公司 一种5‑脱甲氧基辅酶q10合成辅酶q10方法
CN111286500A (zh) * 2020-03-23 2020-06-16 华东理工大学 一种等离子体作用结合氧限制生产辅酶q10的方法
CN113151368A (zh) * 2021-03-18 2021-07-23 上海辰山植物园 辅酶q合成途径苯环6位羟化酶及其应用
CN116286545A (zh) * 2023-04-14 2023-06-23 山东合成远景生物科技有限公司 一种类球红细菌诱变菌株hcyj-01及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101333509A (zh) * 2008-07-07 2008-12-31 天辰神舟实业有限公司 一株产辅酶q10的类球红细菌突变株及培养方法
CN103509729A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 一种生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN103509816A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN103509728A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法
US20140080176A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Uchicago Argonne, Llc Transformable rhodobacter strains, method for producing transformable rhodobacter strains

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101333509A (zh) * 2008-07-07 2008-12-31 天辰神舟实业有限公司 一株产辅酶q10的类球红细菌突变株及培养方法
CN103509729A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 一种生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN103509816A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN103509728A (zh) * 2012-06-15 2014-01-15 浙江新和成股份有限公司 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法
US20140080176A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Uchicago Argonne, Llc Transformable rhodobacter strains, method for producing transformable rhodobacter strains

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU W ET AL.: "Identification and elimination of metabolic bottlenecks in the quinone modification pathway for enhanced coenzyme Q10 production in Rhodobacter sphaeroides", 《METAB ENG》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107793306A (zh) * 2017-10-30 2018-03-13 上虞新和成生物化工有限公司 一种5‑脱甲氧基辅酶q10合成辅酶q10方法
CN107793306B (zh) * 2017-10-30 2020-09-01 上虞新和成生物化工有限公司 一种5-脱甲氧基辅酶q10合成辅酶q10方法
CN111286500A (zh) * 2020-03-23 2020-06-16 华东理工大学 一种等离子体作用结合氧限制生产辅酶q10的方法
CN111286500B (zh) * 2020-03-23 2022-08-23 华东理工大学 一种等离子体作用结合氧限制生产辅酶q10的方法
CN113151368A (zh) * 2021-03-18 2021-07-23 上海辰山植物园 辅酶q合成途径苯环6位羟化酶及其应用
CN116286545A (zh) * 2023-04-14 2023-06-23 山东合成远景生物科技有限公司 一种类球红细菌诱变菌株hcyj-01及应用
CN116286545B (zh) * 2023-04-14 2023-07-21 山东合成远景生物科技有限公司 一种类球红细菌诱变菌株hcyj-01及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105925519B (zh) 2019-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9631211B2 (en) Bacterial strain and fermentative process for producing succinic acid
Zhang et al. Synergistic effects of oleaginous yeast Rhodotorula glutinis and microalga Chlorella vulgaris for enhancement of biomass and lipid yields
CN102120973B (zh) 一株盐单胞菌及其应用
CN102174449B (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用
EP3816293B1 (en) Strains and processes for single cell protein or biomass production
CN104946576B (zh) 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用
CN102643770B (zh) 利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌及其应用
CN105925519B (zh) 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用
CN106554931B (zh) 一株拜氏羧菌及其应用
CN104745513A (zh) 一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用
CN106434434B (zh) 一株产二甲苯单加氧酶的菌株Arthrobacter woluwensis及其应用
Lan et al. Isolation and characterization of a newly identified Clostridium butyricum strain SCUT343-4 for 1, 3-propanediol production
CN106434510A (zh) 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌
CN102703339A (zh) 高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产l-瓜氨酸的方法
CN103509816A (zh) 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
CN106167772B (zh) 一种高产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用
CN106635945A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法
CN111100802A (zh) 一株粪肠球菌及其应用
CN111100901B (zh) 一种甘油发酵生产1，3-丙二醇的方法
KR101173468B1 (ko) 엔터로박터속 균주 ｅｓ392 ｋａｃｃ 91568ｐ 및 이에 의한 수소 생산 방법
CN104561221B (zh) 一种利用两种或者两种以上的微生物菌种生产发酵产品的方法
CN108359629A (zh) 类球红细菌重组菌及其构建方法与应用
CN113337433B (zh) 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用
CN117165505A (zh) 基因工程菌生产二羟基丙酮和/或1，3丙二醇的方法、用于生产的基因工程菌及应用
CN113249281A (zh) 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant