CN117165505A - 基因工程菌生产二羟基丙酮和/或1，3丙二醇的方法、用于生产的基因工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基因工程菌生产二羟基丙酮和/或1，3丙二醇的方法，包括：(1)克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA、或克隆重组了3‑磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3‑磷酸甘油酯酶基因GPP2、或重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3‑丙二醇氧化还原酶dhaT1基因、或重组了甘油脱水酶基因dhaB2和1,3‑丙二醇氧化还原酶基因dhaT2；将表达载体或表达载体的组合转化到肺炎克雷伯菌或大肠杆菌中，发酵培养基因工程菌，生产目标产物。本发明实现了二羟基丙酮和1，3丙二醇的高收率的生产，为后续的聚合实验中省去了一步反应，简化工艺流程，且收率高。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏基因工程菌、大肠杆菌工程菌甘油法生产二羟基丙酮及1，3丙二醇的生产方法、用于生产的基因工程菌及应用。
背景技术
二羟基丙酮(DHA，二羟丙酮)和1，3丙二醇(1，3-PDO)是非常重要的化工原料，二羟基丙酮和1，3丙二醇广泛应用在化妆品工业、在医药中间体、化工领域中，二羟基丙酮和1，3丙二醇化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一种重要的化学合成的中间体，也是一个重要的多功能试剂。化学合成法制备二羟基丙酮和1，3丙二醇存在原料成本高、反应条件苛刻、设备要求高、产品收率低以及污染环境等问题，其应用受到一定限制。生物转化法的优势在于反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高。
随着生物柴油的快速发展，其副产物甘油产量猛增，导致甘油过剩，急需寻求甘油的新用途、加快其下游产品的开发。但因甘油成本略高于葡萄糖，因此同时考虑利用葡萄糖生产二羟基丙酮和1，3丙二醇，探究甘油或葡萄糖转化生成二羟基丙酮和1，3丙二醇，其中所涉及到的酶及相关微生物类群，生物法生产二羟基丙酮和1，3丙二醇的机理是微生物产生的甘油脱氢酶对甘油2位羟基进行脱氢反应生成酮基，生成二羟基丙酮。生物法生产二轻基丙酮具有显著的优点：产物浓度高，甘油转化率高，生产成本低。目前用于二轻基丙酮工业化生产的微生物菌种主要有葡糖杆菌属(Gluconobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、芽抱杆菌属(Bacillus)、假单孢菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)等。其中氧化葡糖杆菌(Gluconobacteloxydans)的研究报道最多，该菌种的生产性能稳定、产量高，是目前用于工业化生产的主要菌株。而目前研究的产1,3-丙二醇的发酵菌研究较多的为克雷伯是肺炎杆菌，利用肺炎克雷伯氏杆菌以甘油为底物生成1,3-丙二醇。在肺炎克雷伯氏杆菌代谢路径存在甘油脱氢酶但是其作用不是很强。而在氧化葡萄糖杆菌中存在的甘油脱氢酶表现出较强的活性。
在以往的研究中通过氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、弗托氏葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter frateurii)等天然菌以甘油为底物发酵生产二羟基丙酮，然而还没有使用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)发酵生产二羟基丙酮和1,3-丙二醇的报道。
发明内容
为了可以同时生产二羟基丙酮和1,3-丙二醇，利用生物工程技术构建肺炎克雷伯氏工程菌以及大肠杆菌工程菌。具体技术路线如下：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因工程菌表达生产二羟基丙酮及1，3丙二醇的方法，所述方法包括如下步骤：(1)克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA；优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA如SEQ ID No.1或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示；
和/或，克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2；优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ ID No.9所示；
和/或克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因；优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因源自肺炎克雷伯氏杆菌；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因如SEQ ID No.4或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因如SEQ ID No.5或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB1-dhaT1；进一步优选地，重组表达载体PSE-dhaB1-dhaT1全长序列如SEQ ID No.10所示；
和/或克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2；优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2源自肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2如SEQ ID No.6或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2如SEQ ID No.7或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB2-dhaT2；进一步优选地，重组表达载体PSE-dhaB2-dhaT2的全长序列如SEQ ID No.11所示；(2)转化重组表达载体获得工程菌，将克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA的表达载体转化到肺炎克雷伯菌感受态细胞，获得肺炎克雷伯菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或将克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因的表达载体、克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA的表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或将克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或将克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
其中，肺炎克雷伯菌和大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
(3)将步骤(2)获得的工程菌发酵培养，表达生产二羟基丙酮及1，3丙二醇。
同一种氨基酸具有两个或更多个密码子现象称为密码子的简并性，简并序列是指就叫简并序列。甘油脱氢酶基因gldA核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.1或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.2或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
3-磷酸甘油酯酶基因GPP2核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.3或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
甘油脱水酶dhaB1基因核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.4或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.5或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
甘油脱水酶基因dhaB2核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.6或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2核苷酸序列可以具有与SEQ ID No.7或其简并序列大于等于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同源性。
作为本发明的某些实施方案，步骤(3)中发酵培养所述肺炎克雷伯菌工程菌的种子培养液按照10％(v/v)接种到发酵培养基中，培养条件为甘油20-50g/L，在30-40℃、在常压条件下，持续通入氮气0.05-0.15vm、搅拌转速200-300r/min，调节维持发酵液pH为6.5-7.5的条件下进行间歇发酵。甘油含量选自20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50g/L。
反应温度选自30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃。
氮气压强选自0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15vm。
搅拌转速选自200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300r/min。
发酵液pH选自6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5。
间歇发酵又称为分批发酵，是指发酵过程中营养物和菌种一次加人进行培养，直到结束放出，中间除了空气进人和尾气排出，与外部没有物料交换。
作为本发明的某些实施方案，所述肺炎克雷伯菌工程菌在种子培养基进行培养，制备种子培养液，所述种子培养基1000mL中包含甘油10-30g，KH2PO4 1.0-1.5g，K2HPO4·7H2O 4-5g，(NH4)SO4 2.0-2.5g，MgSO4·7H2O 0.1-0.2g，CaCO3 2.0-3.0g，1mLFe2+溶液，1.0mLCa2+溶液，酵母粉1-2g，2.0mL微量元素A溶液；
其中，所述微量元素A溶液包含有下列组分：饱和盐酸0.5-1.5mL/L，CuCl2·2H2O20-30mg/L，ZnCl2 70-75mg/L，MnCl2·4H2O 100-105mg/L，H3BO3 50-65mg/L，CaCl2·6H2O180-220mg/L，NiCl2·6H2O 25-30mg/L，NaMoO4·2H2O 25-35mg/L；
Fe2+溶液：饱和盐酸4mL/L，FeSO4·7H2O 2-8g/L；
Ca2+溶液：10-30g/L的CaCl2。
作为本发明的某些实施方案，所述发酵培养基1000mL中包含：甘油30-50g、KH2PO41-2g、(NH4)2SO4 5-10g、MgCl2·6H2O 0.1-0.5g、CaCl2 0.2-0.5g、柠檬酸0.3-0.5g、酵母粉1-2g、CaCO3 1-2g、5mL微量元素B；
其中，微量元素B溶液：ZnCl2 0.5-1.0g/L，MnCl2·4H2O 0.1-0.2g/L，H3BO3 50-60mg/L，CuCl2·2H20 0.3-0.5g/L，NaMoO4·2H2O 5-6mg/L，FeCl2·4H2O 3-4g/L，CoCl2·6H2O 0.3-0.5g/L，HCl 10-15mL/L。
作为本发明的某些实施方案，所述肺炎克雷伯菌工程菌在种子培养基进行培养，制备种子培养液，所述种子培养基1000mL中包含甘油20g，KH2PO4 1.3g，K2HPO4·7H2O4.4454g，(NH4)SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，1mLFe2+溶液，1mLCa2+溶液，酵母粉1g，2.0mL微量元素A溶液；其中，所述微量元素A溶液包含有下列组分：饱和盐酸0.9mL/L，CuCl2·2H2O 20mg/L，ZnCl2 70mg/L，MnCl2·4H2O 100mg/L，H3BO3 60mg/L，CaCl2·6H2O200mg/L，NiCl2·6H2O 25mg/L，NaMoO4·2H2O 35mg/L；Fe2+溶液含有饱和盐酸4mL/L，FeSO4·7H2O 5g/L；Ca2+溶液含有20g/L的CaCl2。
作为本发明的某些实施方案，所述发酵培养基1000mL中包含：甘油40g、KH2PO41.36g、(NH4)2SO4 6.61g、MgCl2·6H2O 0.26g、CaCl2 0.29g、柠檬酸0.42g、酵母粉2g、CaCO32.0g、5mL微量元素B溶液；其中，所述微量元素B溶液：ZnCl2 0.68g/L，MnCl2·4H2O 0.17g/L，H3BO3 60mg/L，CuCl2·2H20 0.47g/L，NaMoO4·2H2O 5mg/L，FeCl2·4H2O 3.97g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，HCl 10mL/L。
作为本发明的某些实施方案，所述步骤(3)中培养条件为甘油40g/L，37℃、氮气0.1vm、搅拌转速250r/min，调节维持发酵液pH为7.0。
作为本发明的某些实施方案，步骤(3)中发酵培养所述大肠杆菌工程菌的种子以1％的转接量转接到M9/SM培养基中，同时加入葡萄糖溶液，调节葡萄糖终浓度为1％w/w，在30℃培养到OD600值1.2，调节培养温度为42℃，进行诱导发酵培养。
作为本发明的某些实施方案，在发酵培养中每隔6h取样一次，检测发酵产物1，3-PDO和二羟基丙酮的含量，同时每24h补加葡萄糖溶液，调节葡萄糖终浓度为1％w/w，根据1，3PDO和二羟基丙酮的含量随时增加NaOH调整发酵液的pH值，pH控制在7.0，至发酵结束；优选地，发酵时间为54-60小时。
发酵时间选自54、55、56、57、58、59、60小时。
本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌工程菌，所述肺炎克雷伯菌工程菌包含有克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA，肺炎克雷伯菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活。
优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌。
更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380。
更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA如SEQ ID No.1或其简并序列所示。
更优选地，重组表达载体为PET-gldA。
进一步优选地，重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了一种大肠杆菌工程菌DH5ɑ，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因的表达载体、以及克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA的表达载体，其中，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活。
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ ID No.9所示。
优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因源自肺炎克雷伯氏杆菌；更优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因如SEQ ID No.4或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因如SEQ ID No.5或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB1-dhaT1；进一步优选地，重组表达载体PSE-dhaB1-dhaT1全长序列如SEQID No.10所示。
优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA如SEQ ID No.1或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供了一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活。
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ ID No.9所示。
优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2源自肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736；更优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2如SEQ ID No.6或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2如SEQ ID No.7或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB2-dhaT2；进一步优选地，重组表达载体PSE-dhaB2-dhaT2的全长序列如SEQ ID No.11所示。
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
本发明还提供了一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、以及克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活。
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ ID No.9所示。
优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA如SEQ ID No.1或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示。
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
本发明还提供了一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活。
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ ID No.9所示。
优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2源自肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736；更优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2如SEQ ID No.6或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2如SEQ ID No.7或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB2-dhaT2；进一步优选地，重组表达载体PSE-dhaB2-dhaT2的全长序列如SEQ ID No.11所示。
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
本发明还提供了所述的肺炎克雷伯菌工程菌和所述的大肠杆菌工程菌在生产二羟基丙酮和/或及1，3丙二醇中的应用。
作为本发明的某些实施方案，所述应用为在同时生产二羟基丙酮和1，3丙二醇中的应用。
如上所述，本发明的，具有以下有益效果：
本申请使用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)发酵甘油生产二羟基丙酮和1,3-丙二醇。以通过此方法可以高产二羟基丙酮和1,3-丙二醇。且两种产物属于两种不同物质，利于后续的分离纯化，大大提高了底物的利用率。
微生物细胞以甘油为底物生物合成二羟基丙酮的过程是一个复杂的生化反应过程。利用生物法生产二羟基丙酮时，甘油脱氢酶是二羟基丙酮生物合成的关键酶。由于微生物细胞内的酶系十分复杂，细胞内各种代谢活动、细胞结构、细胞生理活性对甘油脱氢酶的催化效率会产生很大的影响。这些因素相互关联，相互影响，需要全方面认真考虑这些问题：
(1)底物抑制
高浓度的底物甘油会影响菌株生长和甘油转化率。本实验以肺炎克雷伯氏菌为基础研究菌株，对其进行基因改造，因肺炎克雷伯氏菌可以发酵产生1，3丙二醇，消耗了一部分底物甘油，侧面发生了抑制。
(2)溶氧限制
在以往的研究中使用氧化葡萄糖酸杆菌是一种专性好氧微生物，通过有氧呼吸获取能量。因此生物转化过程中，溶氧影响着菌体的最终生物量和代谢产物的终浓度。因其发酵过程需要通氧，增加了生产成本，而本实验使用肺炎克雷伯氏菌属于兼性厌氧细菌，在发酵过程中不需要通氧，减少了其生产成本。
(3)不同来源的克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因和1,3-PDO氧化还原酶基因表达效果存在差异
在以往的研究实验中使用的克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶基因和1,3-PDO氧化还原酶基因构建的大肠杆菌工程菌发酵产1,3-BDO的产率略低。本申请所构建的大肠杆菌工程菌产率明显高于以往实验。
即在本申请中通过设计优化技术路线，调节发酵培养条件和参数，实现了同时表达生产二羟基丙酮和1,3-丙二醇。
通过使用甘油作为碳源，同时实现在工程菌中大量表达二羟基丙酮和1,3-丙二醇，在后续的聚合实验中省去了一步反应，因此简化了后续的工艺流程。同时在同一个菌株同时生产两种产物，相互之间表达不受影响，都能获得高收率。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中工程菌制备的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的及相关领域的常规技术。
实施例1构建在克雷伯氏属细菌中表达甘油脱氢酶的菌株
1、工程菌来源：于上海浦东的园林中采集土壤样本，筛选肺炎克雷伯氏菌、氧化葡萄糖酸杆菌、酿酒酵母细胞、筛选肺炎克雷伯菌K1～K4，筛选氧化葡萄糖酸杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌感受态细胞、肺炎克雷伯氏杆菌、木醋杆菌、大肠杆菌感受态细胞、产气克雷伯氏杆菌、弗托氏葡萄糖酸杆菌。
1.1氧化葡萄糖酸杆菌种筛选与鉴定
对浦东菜园、林地土样利用特定培养基进行菌株的初筛和复筛。微生物菌种的分子生物学鉴定采用16S rDNA测序和系统发育分析方法。首先进行微生物总DNA的提取，将测序得到的16srDNA序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据库进行对比分析(http://wwwncbinlm.nih.gov/blast)。经序列比对鉴定均为氧化葡萄糖酸杆菌。
2.肺炎克雷伯氏菌筛选与鉴定
微生物菌群的筛选：在灭菌条件下，利用纯甘油和水筛选微生物菌群。将单菌落后送至大连宝生物工程有限公司进行16SDNA扩增及序列测定。将获得的菌株16SrDNA序列在NCBI中进行BLAST同源性比较，并获得同源性较高的16SrDNA基因序列。用于后续敲除实验。经序列比对鉴定为肺炎克雷伯氏杆菌。
进行了4组肺炎克雷伯氏杆菌平行实验命名为K1—K4。进行了4组筛选出的氧化葡萄糖酸杆菌平行实验命名Y1—Y4。其中氧化葡萄糖酸杆菌Y4中的甘油脱氢酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
肺炎克雷伯氏菌也可以商购获得，例如可以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC.21611)。
2、培养基、质粒和培养条件：
筛选培养基的组成包括：碳源20 30g/L，氮源2 7g/L，无机盐0.1 2g/L。
筛选的碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括葡萄糖、甘油等。
氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。
无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
筛选条件为：将菌株接种到筛选培养基，培养温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持培养过程中培养基的pH值在6.0-7.5之间。
载体质粒：PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380、pBR22、pUC18
3.基因工程研究实验方法
利用同源重组基因敲除的实验方法，将直接商购肺炎克雷伯氏CICC.21611菌中的2,3-丁二醇脱氢酶敲除。
(1)敲除片段的获得。
(2)构建中间载体。
(3)构建重组载体。
(4)2,3-丁二醇失活菌株的构建
(5)基因敲除菌株的鉴定利用构建表达质粒的方法构建了在克雷伯氏属细菌中表达甘油脱氢酶的菌株。克雷伯氏肺炎杆菌菌株D1—D4。该菌株是用于生产1，3-丙二醇，2，3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。
利用同源重组基因敲除的实验方法，将直接商购大肠杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶敲除。
(1)敲除片段的获得。使用通用引物为模板扩增出反转酶识别位点FRT。在获得FRT+抗性基因表达元件+FRT序列后，在上下游引物的两端加入2,3-丁二醇脱氢酶基因CDS两侧50bp左右的同源臂。
(2)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株。
(3)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。
(4)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂
(5)基因敲除菌株的鉴定
实施例2
(1)利用基因重组方法构建2,3-丁二醇脱氢酶基因失活的肺炎克雷伯氏杆菌菌株，来实现2,3-丁二醇脱氢酶活性的失活。
(2)扩增2,3-丁二醇脱氢酶基因片段。以1UF:5’-ATGAAGAAGGTCGCGTTGGTCACTGGTGCGGGGCAAGGAATAGGAAAGGC-3’2UF:5’-GCCTTTCCTATTCCTTGCCCCGCACCAGTGACCAACGCGACCTTCTTCAT-3’为特异性引物，以肺炎克雷伯氏杆菌CICC21611基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到2,3-丁二醇脱氢酶基因前后的DNA序列。
(3)pMD18-T-s:ATCGTCGACCTGCAGGCA和pMD18-T-aATCTCTAGAGGATCCCCGGGT为特异性引物,以质粒pMD-18T simple为模板进行PCR扩增,得到线性化的pMD18-T基因片段。
(4)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Clo ning Kit试剂盒中的操作方法。以HindⅢ和EcoRⅠ为酶切位点，将2,3-丁二酸脱氢酶基因与载体相连pUC18-bdh。
(5)以pBR22为模版，将tet片段扩增出来，以tet1F：ATCCGGTCCGAGATCCAGTTCGATGTAAC
tet1R：TGTCAATTGTCATTCAGGTCGAGGTG
tet2F：GCCGTGATCATTCTCATGTTTGACAGCTTATCA
Tet2R：TATTCAATTGTCAGGTCGAGGTGGCCCG为引物扩增片段
(6)以cpoⅠ和MunⅠ为酶切位点将tet片段与pUC18-bdh相连为pUC18-bdh-tet，之后将重组片段化转入肺炎克雷伯氏杆菌感受态细胞中,并用安卞霉素抗性平板进行筛选，筛选的阳性克隆。
实施例3
(1)表达质粒的线性化。在PET-32a(+)质粒上的HindⅢ以及EcoRⅠ限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。
(2)扩增过表达的目的基因。以氧化葡萄糖酸杆菌的基因组(Genebank：BA000036.3)为模板，以F1：AAGCTTTCAGACGGTTCCCCTCAGG以及R1：GAATTCATGCCGAATACTTATGGCAGC为引物进行PCR扩增，可获得氧化葡萄糖酸杆菌中的甘油脱氢酶的基因片段。氧化葡萄糖酸杆菌中的甘油脱氢酶基因序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
tcagacggttcccctcagggtacggcgggtttccatccggcgaagaaccgggatggtgagggcgacaaggatgcccagcagcgtcgggccgaaatcgcgcggcagaaggtcaacggggctgaagcccacttcccacagggaccagacccaggtgtaggccagcgcacctagatacaggaatgcgccaagcgtccgtcccatgagcatgaaaacaccgccggcaaccagcggaatgccacagatgacgtaatagacagagccgcccagcatcgcgaggtcggccccggcgatcacgaagaacagccccaccagaatgatgacaacccctaggaccagtgtgagccactcggtcagggttctgctgccataagtattcggcat
(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为PET gldA。PET gldA序列全长如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.8：
atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagctttcagacggttcccctcagggtacggcgggtttccatccggcgaagaaccgggatggtgagggcgacaaggatgcccagcagcgtcgggccgaaatcgcgcggcagaaggtcaacggggctgaagcccacttcccacagggaccagacccaggtgtaggccagcgcacctagatacaggaatgcgccaagcgtccgtcccatgagcatgaaaacaccgccggcaaccagcggaatgccacagatgacgtaatagacagagccgcccagcatcgcgaggtcggccccggcgatcacgaagaacagccccaccagaatgatgacaacccctaggaccagtgtgagccactcggtcagggttctgctgccataagtattcggcatgaattcggatccgatatcagccatggccttgtcgtcgtcgtcggtacccagatctgggctgtccatgtgctggcgttcgaatttagcagcagcggtttctttcataccagaaccgcgtggcaccagaccagaagaatgatgatgatgatggtgcatatggccagaaccagaaccggccaggttagcgtcgaggaactctttcaactgacctttagacagtgcacccactttggttgccgccacttcaccgtttttgaacagcagcagagtcgggataccacggatgccatatttcggcgcagtgccagggttttgatcgatgttcagttttgcaacggtcagtttgccctgatattcgtcagcgatttcatccagaatcggggcgatcattttgcacggaccgcaccactctgcccagaaatcgacgaggatcgccccgtccgctttgagtacatccgtgtcaaaactgtcgtcagtcaggtgaataattttatcgctcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatcgatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca
(4)质粒的转化。取50μL新鲜制作的电转克雷伯氏肺炎杆菌CICC.21611 2,3-丁二醇敲除菌株感受态细胞，加入质粒PET gldA进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。
进行了4组平行实验命名为D1—D4。
实施例4
(1)表达质粒的线性化。在pSE380质粒上的NheⅠ和HpaI限制性酶切位点以及StuⅠ和EagⅠ上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。
(2)扩增过表达的目的基因。以酿酒酵母的基因组为模板，设计引物
F2：GAGCTCATGTCTGCTGCTGCTGATAGA
R2：GGATCCCGCGCGTAGTTATGAGAAATGA
F3：GGTACCTGAGTCTTAAATTAATGAATAAAAGCAGCC
R3：AGTACTCAGTGGCAGTCAATATTGGGTCA
进行PCR扩增，可获得酿酒酵母中的3-磷酸甘油脱氢酶的基因片段GPD1和3-磷酸甘油酯酶的基因片段GPP2。3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1序列如SEQ ID No.2所示，3-磷酸甘油酯酶的基因GPP2序列如SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.2：
atgactgcaagcacaccatccaatgtcatgacattgttcttgttaaggcatggacaaagtgaattgaatcacgagaatatattctgtggttggattgacgctaagctaaccgaaaaaggtaaagaacaagctcgtcattctgccgagctaatcgaacaatattgtaaagctaataatttgagattaccccagattggttacacctcacgtttaattaggacccaacagaccatagaaacgatgtgtgaagaatttaagttaaagccacaactgcaggttgtttacgactttaataaaatcaaacttggagacgaatttggcagtgatgacaaggataatatgaaaatcccgattcttcaaacttggaggctaaatgaacgtcattacggttcctggcagggccagaggaaaccgaatgttttaaaagaatatggtaaggataaatatatgttcattaggagagattacgagggtaagccaccacctgtagatcttgaccgtgagatgattcaacaagaaaatgagaagggctcttctactgggtacgaattcaaggagccaaacagacaaataaaatatgaattggaatgcagcaatcatgacattgtattaccggattccgaatctcttcgtgaagtggtttatagattgaatccttttctacaaaatgtcatattaaaattagccaatcaatatgatgaatcttcatgcctgattgtgggccatggaagttcagtgagatcgctactgaaaattctggagggtatatcagatgatgacatcaagaatgttgatattccaaatggtatccccttagtcgttgaattagataagaataatggtcttaagtttatcagaaaattctacctagatcctgaatctgctaagatcaatgctgagaaagtccgtaatgagggtttcataaaaaatccttaa
SEQ ID No.3：
aataataaaaatacatgtatctttttggttggttaatttatctaaacagttttatatatatatgtatatatatatatatatatacacagtattaatattctttccttgagattactctctataaaaaaaaaaaaaaaaaagcttttaaaaaaaaaaaaactcaaaaaaagaaagaatattcaaagaaagtttcatcttgtcagttgaaatgaatagtttattgtggaaattataacaataaaagttagctaaaagcgaaagtgtcgatgaaactgggcaagtgcacttgagctcttgatatggacggtagtattggttacaacaatgactggtaaaagaatgaagtggtttgagataattttagagaaacaaaaagaaataacaaagtgatagtaataaaaacggtgcgcaaatgaggataaaaaaatcagcacagaaactagagaaaacggataaaaaaataaaaaagcagagacaaaaattaaattacgactgattcttgttcaaaatcaatagtaaaagtatggttacaaagtaatgtaattcacaatggagatttgaaaaaagataaaaataatcgacgattagatcacaaaaaaagcgtatctcaccacagtagttattttttcttagatattctttaatactggggttgtgactgaccaggtggcatcgccatgaaatgttcctgctgtggaggatacccctgctgcgatggcatttgcggtggaggatacgcctgttgttgctgatgcgaaggaggaaccatgaattgtggatgatgttgctgcggaggaatagcaaattgttgctgagatggtaattgttgctgaggtatcgcttgttgatgatagctctgttgctctatcgggaatgggacaggtaccgtttcgtcattttcagccacatacaatgacttatcgatagtggccggaatagccgcaatttcagtgcccagttcttgttcgattttataaaggttaaaccgatcattccagttaatcaaattgattgctaaacccaagtggccaaacctaccggatctaccaatacgatgtaaatatgtttctgccgttttggggaaatcgaaattgataacgacattaacggcttgaatatcgataccacgggtcaataaatcggagcagaccaatgtacgaaccttaccttgacgaaattcgtggaaaactttatttctttcttgttgcttcattcttgcatgagagtaataacaggaatagcctaaatcagtgattttcttggctagtaattcgacacggttagtagaattacaaaaaataatggcttgattaatttgaagcttagagaataaagtatttaaacaatgtagcttttgtctttcttcaacaaaggcgtagtattgag
(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段GPD1和CPP2与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pSE-GPD1-GPP2。质粒pSE-GPD1-GPP2全长序列如SEQ IDNo.9所示。SEQ ID No.9：
aattctcatgtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatggctggtgaccacgtcgtggaatgccttcgaattcagcacctgcacatgggacgtcgacctgaggtaattataacccgggccctatatatggatccaattgcaatgatcatcatgacagatctgcgcgcgatcgatatcagcgctttaaatttgcgcatgctagcatgactgcaagcacaccatccaatgtcatgacattgttcttgttaaggcatggacaaagtgaattgaatcacgagaatatattctgtggttggattgacgctaagctaaccgaaaaaggtaaagaacaagctcgtcattctgccgagctaatcgaacaatattgtaaagctaataatttgagattaccccagattggttacacctcacgtttaattaggacccaacagaccatagaaacgatgtgtgaagaatttaagttaaagccacaactgcaggttgtttacgactttaataaaatcaaacttggagacgaatttggcagtgatgacaaggataatatgaaaatcccgattcttcaaacttggaggctaaatgaacgtcattacggttcctggcagggccagaggaaaccgaatgttttaaaagaatatggtaaggataaatatatgttcattaggagagattacgagggtaagccaccacctgtagatcttgaccgtgagatgattcaacaagaaaatgagaagggctcttctactgggtacgaattcaaggagccaaacagacaaataaaatatgaattggaatgcagcaatcatgacattgtattaccggattccgaatctcttcgtgaagtggtttatagattgaatccttttctacaaaatgtcatattaaaattagccaatcaatatgatgaatcttcatgcctgattgtgggccatggaagttcagtgagatcgctactgaaaattctggagggtatatcagatgatgacatcaagaatgttgatattccaaatggtatccccttagtcgttgaattagataagaataatggtcttaagtttatcagaaaattctacctagatcctgaatctgctaagatcaatgctgagaaagtccgtaatgagggtttcataaaaaatccttaagttaacgttagccggctacgtatactccggaatattaataggcctgcacgaataaaggtaatctaagagatttcatgaacgtttattatgccagatatcacaacatttccacaccctggaacggcgatattgaatccggcatcgaacggttaacaaagatgctagtactagttgaagagtctctcgccaataagaaacagggctttagtgttgacgatgtcgcacaatccttgaattgttctcgcgaagaattcacaagagactacttaacaacatctccagtgagatttcaagtcttaaagctatatcagagggctaagcatgtgtattctgaatctttaagagtcttgaaggctgtgaaattaatgactacagcgagctttactgccgacgaagactttttcaagcaatttggtgccttgatgaacgagtctcaagcttcttgcgataaactttacgaatgttcttgtccagagattgacaaaatttgttccattgctttgtcaaatggatcatatggttcccgtttgaccggagctggctggggtggttgtactgttcacttggttccagggggcccaaatggcaacatagaaaaggtaaaagaagcccttgccaatgagttctacaaggtcaagtaccctaagatcactgatgctgagctagaaaatgctatcatcgtctctaaaccagcattgggcagctgtctatatgaattataagtatacttcttttttttactttgttcagaacaacttctcatttttttctactcataactttagcatcacaaaatacggccgcctgcagctggcgccatcgatacgcgtacgtcgcgaccgcggacatgtacagagctcgagaagtactagtggccacgtgggccgtgcaccttaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctt
实施例5
(1)表达质粒的线性化。在pSE380质粒上的EcoRⅠ和XbaI限制性酶切位点AfIⅠ以及HindⅢ上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。
(2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯是肺炎杆菌的基因组为模板，设计引物
F4：GAATTCTTAGCTTCCTTTACGCAGCT
R4：TCTAGAGAGCGAGAAAACCATGCG
F5：GTYRACATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGGTG
R5：AAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT
进行PCR扩增，可获得肺炎克雷伯氏杆菌中甘油脱水酶dhaB1基因片段和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1的基因片段。甘油脱水酶基因dhaB1序列如SEQ ID No.4所示，1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT1序列如SEQ ID No.5所示。SEQ ID No.4：
ttagcttcctttacgcagcttatgccgctgctgatacacttccgccgactcccggacaaaggcggcattcactgtcgcatgccaggtgtgctccagctcgtcggcgatcgccagcagctccgcctgcgaggagcggaacgggcgcagcgcgttatagatagccagaatgcgctcgtcaggaatggcgataagctccgccgcgcggcggaaattgcgcgccaccgcatggcgctgcatctgctcggcaatctgcgcctggtactcaagggtctgacgggagatccgcacatcctgcgggcccacctcgccagagagcaccttctcgagggtaatatcggtcaatggtttgccggtaggcgtcaggatatgctccgggcagcgggtggctaacggataatcctgcacgcgcatggttttctcgctc
SEQ ID No.5：
ttagcttcctttacgcagcttatgccgctgctgatacacttccgccgactcccggacaaaggcggcattcactgtcgcatgccaggtgtgctccagctcgtcggcgatcgccagcagctccgcctgcgaggagcggaacgggcgcagcgcgttatagatagccagaatgcgctcgtcaggaatggcgataagctccgccgcgcggcggaaattgcgcgccaccgcatggcgctgcatctgctcggcaatctgcgcctggtactcaagggtctgacgggagatccgcacatcctgcgggcccacctcgccagagagcaccttctcgagggtaatatcggtcaatggtttgccggtaggcgtcaggatatgctccgggcagcgggtggctaacggataatcctgcacgcgcatggttttctcgctc
(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段dhaB1、dhaT1依次与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pSE-dhaB1-dhaT1。质粒pSE-dhaB1-dhaT1全长序列如SEQ ID No.10所示。SEQ ID No.10：
aattctcatgtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatggctggtgaccacgtcgtggaatgccttcgaattcttagcttcctttacgcagcttatgccgctgctgatacacttccgccgactcccggacaaaggcggcattcactgtcgcatgccaggtgtgctccagctcgtcggcgatcgccagcagctccgcctgcgaggagcggaacgggcgcagcgcgttatagatagccagaatgcgctcgtcaggaatggcgataagctccgccgcgcggcggaaattgcgcgccaccgcatggcgctgcatctgctcggcaatctgcgcctggtactcaagggtctgacgggagatccgcacatcctgcgggcccacctcgccagagagcaccttctcgagggtaatatcggtcaatggtttgccggtaggcgtcaggatatgctccgggcagcgggtggctaacggataatcctgcacgcgcatggttttctcgctctctagaggtaccggttgttaacgttagccggctacgtatactccggaatattaataggcctaggatgcatatggcggccgcctgcagctggcgccatcgatacgcgtacgtcgcgaccgcggacatgtacagagctcgagaagtactagtggccacgtgatgagctatcgtatgtttgattatctggtgccaaacgttaacttttttggccccaacgccatttccgtagtcggcgaacgctgccagctgctgggggggaaaaaagccctgctggtcaccgacaaaggcctgcgggcaattaaagatggcgcggtggacaaaaccctgcattatctgcgggaggccgggatcgaggtggcgatctttgacggcgtcgagccgaacccgaaagacaccaacgtgcgcgacggcctcgccgtgtttcgccgcgaacagtgcgacatcatcgtcaccgtgggcggcggcagcccgcacgattgcggcaaaggcatcggcatcgccgccacccatgagggcgatctgtaccagtatgccggaatcgagaccctgaccaacccgctgccgcctatcgtcgcggtcaacaccaccgccggcaccgccagcgaggtcacccgccactgcgtcctgaccaacaccgaaaccaaagtgaagtttgtgatcgtcagctggcgcaacctgccgtcggtctctatcaacgatccgctgctgatgatcggtaaaccggccgccctgaccgcggcgaccgggatggatgccctgacccacgccgtagaggcctatatctccaaagacgctaacccggtgacggacgccgccgccatgcaggcgatccgcctcatcgcccgcaacctgcgccaggccgtggccctcggcagcaatctgcaggcgcgggaaaacatggcctatgcttctctgctggccgggatggctttcaataacgccaacctcggctacgtgcacgccatggcgcaccagctgggcggcctgtacgacatgccgcacggcgtggccaacgctgtcctgctgccgcatgtggcccgctacaacctgatcgccaacccggagaaattcgccgatattgctgaactgatgggcgaaaatatcaccggactgtccactctcgacgcggcggaaaaagccatcgccgctatcacgcgtctgtcgatggatatcggtattccgcagcatctgcgcgatctgggggtaaaagaggccgacttcccctacatggcggagatggctctgaaagacggcaatgcgttctcgaacccgcgtaaaggcaacgagcaggagattgccgcgattttccgccaggcattctgaaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctt
实施例6
(1)表达质粒的线性化。在PET-32a(+)质粒上限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。
(2)扩增过表达的目的基因。以氧化葡萄糖酸杆菌的基因组为模板，设计引物
F6：TCAGACGGTTCCCCTCAGG
R6：CTGCCATAAGTATTCGGCAT
进行PCR扩增，可获得氧化葡萄糖酸杆菌中甘油脱氢酶基因gldA片段。甘油脱氢酶基因gldA序列如SEQ ID No.1所示。
目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段gldA与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为PET-gldA。质粒PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示。
实施例7
(1)表达质粒的线性化。在pSE380质粒上的EcoRⅠ和ZraⅠ限制性酶切位点XbaⅠ和KpnⅠ上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。
(2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯是肺炎杆菌的基因组为模板，设计引物
F7：ATTGAATTCTTAAAGAGAGAGGCTGGCG
R7：CTCGAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGGCCC
F8：ATAGAATTCTTATGAGCTATCGTATGTTTGATTA
R8：ATAGTCGACTTAACACTCAGAATGCCTG
进行PCR扩增，可获得肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736中甘油脱水酶dhaB2基因片段和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2的基因片段。肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736中甘油脱水酶基因dhaB2序列如SEQ ID No.6所示，1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2如SEQ ID No.7所示。
SEQ ID No.6：
agcttgcttgcctgcaggtcgactctagaggatcccccggtaccgagctcgaattcttaaagagagaggcrggcgcgaccccccgtttaattcgccrgaccggccagtagcagccccgtggcgaccgcartgcgcgccccttctgttccccgaatattgcccrccccaccgaccacgccatagtgcgacaaggcttccgrgataagctgcgggatctcaaagtccagcgatgagccccccaccagcaccacaaaggcgatatcgcgaatggaaccgcccggtgagacctgccgcaccgcccgcaggcaattggtgacaaacactttctcrtrcgccrgcccccgcacgagacgaattttttccagcgggcrggcgttatcgatcggcaccagttcgcccrccttgatgtacaccactttggcgaacaccgccgggctgagggcttcccgaaagaactccacccccccattctcgtgacgaatactgaacaggctttccactttggccagcgggtatttttttatcgctrccgccagcgaaagatcctcgacccccagctcggttttaatcaacaggctgaccatattccccccccccccgagatggaccgccgttatctgccccrccgcgttgacgatcgccgcatccgtcgacccggcgccgagatcaaggatcgccagcggcgccgcacagccgggagtggttaacgccccggcgattgccatgttgggnctccaagcccccaacaacaactcggttttgaagtcttgggcgctcant
SEQ ID No.7:
atgcctgcaggtcgacttaacactcagaatgcctggccgaaaatcgcggcaatctccrgctcgttgcctttacgcgggttcgagaacgcattgccgtctttcagagccatctcccccatgtaggggaagtcggcctcttttactcccagatcgcgcagatgctgcggaataccgatatccatcgacagacgcgtgatagcggcgatggctttrtccgccccctcgagagtggacagrccggtgatattttcgcccatcagttcagcaatatcggcgaatttctccgggttggcgatcaggttgtagcgggccacatgcggcagcaggacagcgrtggccacgccgrgcggcatgtcgtacasgccccccagctggtccgccatggcgtgcacgtagcccaggttggcgttattgaaagccatccccgccagcagagaggcataggccatgtttrcccccccctgcagattgctgccgagggccacggcctggcgcaagttgccggcgatgaggcggatcgcctgcatggcgcccgcctccgrcaccgggttagcgtctttggagatataagcctctacggcgtgggtcagggcatccatcccccrccccgcggtcagggcccccggtttaccgatcatcagcagcggatcgttgatagagaacgacggcaggrtgcgccactgacgatcacaaacttcactttgctttcggtgttggtcaagacncaatggcgggtgaactcccttgcccrccccccggtngtgtttnc
(3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒中的操作步骤，将扩增出的目的基因片段dhaB2、dhaT2依次与双酶切开的线性片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pSE-dhaB2-dhaT2。质粒pSE-dhaB2-dhaT2全长序列如SEQ ID No.11所示。
SEQ ID No.11：
aattctcatgtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaccatggctggtgaccacgtcgtggaatgccttcgaattcttaaagagagaggcrggcgcgaccccccgtttaattcgccrgaccggccagtagcagccccgtggcgaccgcartgcgcgccccttctgttccccgaatattgcccrccccaccgaccacgccatagtgcgacaaggcttccgrgataagctgcgggatctcaaagtccagcgatgagccccccaccagcaccacaaaggcgatatcgcgaatggaaccgcccggtgagacctgccgcaccgcccgcaggcaattggtgacaaacactttctcrtrcgccrgcccccgcacgagacgaattttttccagcgggcrggcgttatcgatcggcaccagttcgcccrccttgatgtacaccactttggcgaacaccgccgggctgagggcttcccgaaagaactccacccccccattctcgtgacgaatactgaacaggctttccactttggccagcgggtatttttttatcgctrccgccagcgaaagatcctcgacccccagctcggttttaatcaacaggctgaccatattccccccccccccgagatggaccgccgttatctgccccrccgcgttgacgatcgccgcatccgtcgacccggcgccgagatcaaggatcgccagcggcgccgcacagccgggagtggttaacgccccggcgattgccatgttgggnctccaagcccccaacaacaactcggttttgaagtcttgggcgctcantgacgtcgacctgaggtaattataacccgggccctatatatggatccaattgcaatgatcatcatgacagatctgcgcgcgatcgatatcagcgctttaaatttgcgcatgctagctatagttctagaatgcctgcaggtcgacttaacactcagaatgcctggccgaaaatcgcggcaatctccrgctcgttgcctttacgcgggttcgagaacgcattgccgtctttcagagccatctcccccatgtaggggaagtcggcctcttttactcccagatcgcgcagatgctgcggaataccgatatccatcgacagacgcgtgatagcggcgatggctttrtccgccccctcgagagtggacagrccggtgatattttcgcccatcagttcagcaatatcggcgaatttctccgggttggcgatcaggttgtagcgggccacatgcggcagcaggacagcgrtggccacgccgrgcggcatgtcgtacasgccccccagctggtccgccatggcgtgcacgtagcccaggttggcgttattgaaagccatccccgccagcagagaggcataggccatgtttrcccccccctgcagattgctgccgagggccacggcctggcgcaagttgccggcgatgaggcggatcgcctgcatggcgcccgcctccgrcaccgggttagcgtctttggagatataagcctctacggcgtgggtcagggcatccatcccccrccccgcggtcagggcccccggtttaccgatcatcagcagcggatcgttgatagagaacgacggcaggrtgcgccactgacgatcacaaacttcactttgctttcggtgttggtcaagacncaatggcgggtgaactcccttgcccrccccccggtngtgtttncggtaccggttgttaacgttagccggctacgtatactccggaatattaataggcctaggatgcatatggcggccgcctgcagctggcgccatcgatacgcgtacgtcgcgaccgcggacatgtacagagctcgagaagtactagtggccacgtgggccgtgcaccttaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagcagatcaattcgcgcgcgaaggcgaagcggcatgcatttacgttgacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgtcaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctt
实施例8
(1)利用基因重组方法构建2,3-丁二醇脱氢酶基因失活的大肠杆菌菌株，来实现2,3-丁二醇脱氢酶活性的失活。
(2)扩增2,3-丁二醇脱氢酶基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以1UF:5’-ATGAAGAAGGTCGCGTTGGTCACTGGTGCGGGGCAAGGAATAGGAAAGGC-3’1DR:5’-ACTATATGACGGGTCAATCTCTGTTAATTGATGGGGGTATGGTATTTAAT-3’2UF:5’-GCCTTTCCTATTCCTTGCCCCGCACCAGTGACCAACGCGACCTTCTTCAT-3’2DR:5’-ATTAAATACCATACCCCCATCAATTAACAGAGATTGACCCGTCATATAGT-3’为特异性引物，以肺炎克雷伯氏杆菌CICC21611基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到2,3-丁二醇脱氢酶基因前后的DNA序列。以P1：5’-ATATGAATATCCTCCTTAG-3’P2:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’
为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。
(3)pMD18-T-s:ATCGTCGACCTGCAGGCA和pMD18-T-aATCTCTAGAGGATCCCCGGGT为特异性引物,以质粒pMD-18T simple为模板进行PCR扩增,得到线性化的pMD18-T基因片段。
(4)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Clo ning Kit试剂盒中的操作方法。之后将重组片段化转入肺炎克雷伯氏杆菌感受态细胞中,并用安卞霉素抗性平板进行筛选，筛选的阳性克隆。
(5)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株。使用热激发或者电转化法将基因敲除载体pKD46转化至待敲除的大肠杆菌中。
(6)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。
(7)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂将敲除片段和pKD46质粒混匀，诱导表达，完成基因敲除和抗性基因重组。
(8)基因敲除菌株的鉴定，消除敲除菌株的抗性基因。选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序。消除菌株的抗性基因，把pCP20转化至完成敲除的菌株，30℃培养过夜后转为42℃培养，消除pCP20。
质粒的转化1：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒pSE-GPD1-GPP2、PSE-dhaB1-dhaT1、PET-gldA进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E1—E4。
质粒的转化2：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒PSE-GPD1-GPP2、PSE-dhaB1-dhaT1进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E5—E8。
质粒的转化3：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒PSE-GPD1-GPP2、PET-gldA进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E9—E12。
质粒的转化4：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒PSE-GPD1-GPP2、PSE-dhaB2-dhaT2进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E13—E16。
实施例9、发酵工艺
1.所述克雷伯氏菌工程菌生产二羟基丙酮和1,3-丙二醇的方法，该方法为：将克雷伯氏菌工程菌接种到培养基中，进行发酵培养。
发酵培养基的组成包括：碳源20 200g/L，氮源5 50g/L，无机盐5 10g/L。
发酵的碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括甘油。
氮源选自酵母提取物、蛋白胨、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。
无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。
1.1.培养基：
种子培养基：甘油20g，KH2PO4 1.3g，K2HPO4·7H2O 4.4454g，(NH4)SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，1mLFe2+溶液，1mLCa2+溶液，酵母粉1g，2.0mL微量元素A溶液。
发酵培养基：甘油40g、KH2PO4 1.36g、(NH4)2SO4 6.61g、MgCl2·6H2O 0.26g、CaCl20.29g、柠檬酸0.42g、酵母粉2g、CaCO3 2.0g、5mL微量元素B。
固体培养基：在种子培养基加入1.5-2.0％琼脂粉。
LB培养基：酵母浸粉5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、甘油28g、海水、pH7.8.
生理盐水：1.5％NaCl溶液。
Fe2+溶液：饱和盐酸4mL/L，FeSO4·7H2O 5g/L。Ca2+溶液：20g/L的CaCl2。
微量元素A溶液：饱和盐酸0.9mL/L，CuCl2·2H2O 20mg/L，ZnCl2 70mg/L，MnCl2·4H2O 100mg/L，H3BO3 60mg/L，CaCl2·6H2O 200mg/L，NiCl2·6H2O 25mg/L，NaMoO4·2H2O35mg/L。
微量元素B溶液：ZnCl2 0.68g/L，MnCl2·4H2O 0.17g/L，H3BO3 60mg/L，CuCl2·2H20 0.47g/L，NaMoO4·2H2O 5mg/L，FeCl2·4H2O 3.97g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，HCl10mL/L。
1.2.克雷伯氏工程菌发酵
在灭菌条件下，利用纯甘油进行间歇发酵。将种子培养液按照10％(v/v)接种到已灭菌的含有2L发酵培养基的发酵罐(工作体积5L)中，甘油40g/L，在37℃、氮气0.1vm、搅拌转速250r/min流加SMNaOH维持发酵液pH为7.0的条件下进行间歇发酵。发酵过程中，每隔2h取发酵液进行生物量、底物及代谢产物的测定。
2.培养发酵工艺：所述大肠杆菌工程菌生产二羟基丙酮和1,3-丙二醇的方法，该方法为：将大肠杆菌工程菌接种到培养基中，进行发酵培养。
发酵培养基的组成包括：碳源10 200g/L，氮源1 50g/L，无机盐0 10g/L。
发酵的碳源选自一些可以进入细胞代谢的糖类物质，包括葡萄糖。
氮源选自酵母提取物、蛋白胨、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。
无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。
2.1.大肠杆菌工程发酵
在灭菌条件下，利用葡萄糖进行间歇发酵。活化培养：将重组菌株Ecoli单菌落接种到LB培养基中(Amp：100ug/ml)，30℃摇床内过夜培养。转接：以1％的转接量转接到装液量为100mL M9/SM培养基(Amp：100ug/ml)的300ml三角瓶中，同时加入50％葡萄糖2mL(即葡萄糖终浓度为1％)。诱导：30℃摇床内培养到合适的菌体浓度(OD600值在1.2左右)，改为42℃，进行诱导发酵培养。取样：发酵培养每隔6h样一次，取样量1mL，同时每24h补加1mL50％葡萄糖，至发酵结束。样品处理及检测：1ml发酵液12000rpm离心，上清液沸水浴10分钟12000rpm离心半小时，上清液经用0.22μm的膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)分析甘油以分析纯的甘油标定发酵液中甘油的含量。
实施例10、工程菌检测
1)发液中生物量的测定
将发酵液稀释至一定范围，以纯净水为对照，采用可见光分光光度计测定650nm波长下的吸光光度值OD650来表征菌体生物量。发酵液一般稀释至OD650mm示数为0.2-0.6为宜。
2)甘油浓度的测定
用高碘酸钠氧化法粗略测定发酵液中的甘油浓度，之后再用液相色谱法校对，高碘酸钠氧化法反应原理：过量的高碘酸钠会将甘油氧化成甲酸，再用标准NaOH溶液滴定计算出甲酸的含量，用乙二醇还原未反应的高碘酸钠。
3)1,3-丙二醇测定
流动相的制备：配制0.005mol/L的硫酸溶液，用0.22μm滤膜进行真空抽滤，除去杂质的溶液再用超声仪脱气30min，备用。
标准品的配置：根据发酵液中各产物的产量精确称取相应的样品于纯水中配置标准混合液。
发酵液样品预处理：将发酵液利用小型离心机10000r/min离心10min去除菌体取上清液，用纯水稀释样品至其浓度在用标准品绘制的标准曲线浓度范围内，将稀释后的上清液与氯仿按体积比1:1合，10,000r/min再离心10min去除蛋白，再取上清用0.22μm滤膜去除杂质后即为液相色谱待检测样品。
仪器参数：液相色谱柱为AminexHPX-87H柱，柱温65C，流动相为5mmolIHS04，流速为0.6mL/min；测器为CTO-10vp型折光示差测器，进样量为20L，发酵液各组分含量通过标准曲线计算得到。
4)二羟基丙酮检测
二羟基丙酮分析方法采用薄层层析法与气相色谱分析方法。薄板层析法测定二轻基丙酮的步骤如下：发酵液离心(10000rpm，5min)得到上清液，稀释若干倍。用微量进样器吸取1.0样品和标准样品进行点样点样基线距薄板底边约2.0cm，在展开剂为丙酮溶液的层析缸中进行薄层层析待展开至适宜距离，取出薄层板，冷风吹干。在晾干的薄层板上均匀喷上显色剂中，在110C加热10min，显色，用薄层扫描仪检测品的二轻基丙酮含量。薄板层析显色液：1％对甲氧基苯胺·HC1，99％的正丁醇。具体配法是：等摩尔的对甲氧基苯胺和浓盐酸混合，然后用正丁醇按质量分数1％溶解。
上述各菌株发酵产物的检测结果见表1～表3。
表1克雷伯氏工程菌表达产物的检测
表2克雷伯氏工程菌表达产物的检测
表3大肠杆菌基因工程菌表达产物的检测
*CK(Y)为现有技术中生产二羟基丙酮的工程菌
**CK(K)为现有技术中生产1,3-丙二醇的工程菌
综上，本申请通过对肺炎克雷伯氏属细菌进行改造，并进一步在菌体中表达氧化葡萄糖酸杆菌中的甘油脱氢酶，获得克雷伯氏菌工程菌。改造后的克雷伯氏菌工程菌利用甘油等碳源进行发酵培养时，碳源转化形成二羟基丙酮和1,3-丙二醇，并在发酵液中积累。
本申请通过对大肠杆菌细菌进行改造，并进一步在菌体中表达氧化葡萄糖酸杆菌中的甘油脱氢酶，酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油脱脂酶以及肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶和1,3-PDO氧化还原酶获得大肠杆菌工程菌。改造后的大肠杆菌工程菌利用葡萄糖等碳源进行发酵培养时，碳源转化形成二羟基丙酮和1,3-丙二醇，并在发酵液中积累。
通过使用甘油作为碳源，同时实现在工程菌中大量表达二羟基丙酮和1,3-丙二醇，在后续的聚合实验中省去了一步反应，因此简化了后续的工艺流程。同时在同一个菌株同时生产两种产物，相互之间表达不受影响，都能获得高收率。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种基因工程菌生产二羟基丙酮和/或1，3丙二醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA；优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA序列如SEQ ID No.1或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，所述重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示；
和/或，克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2；优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1序列如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2序列如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，所述重组表达载体pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ ID No.9所示；
和/或克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因；优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因源自肺炎克雷伯氏杆菌；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因序列如SEQ ID No.4或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因序列如SEQ ID No.5或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB1-dhaT1；进一步优选地，所述重组表达载体PSE-dhaB1-dhaT1全长序列如SEQ ID No.10所示；
和/或克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2；优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2源自肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736；更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；更优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2序列如SEQ IDNo.6或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2序列如SEQ ID No.7或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB2-dhaT2；进一步优选地，所述重组表达载体PSE-dhaB2-dhaT2的全长序列如SEQ ID No.11所示；
(2)转化重组表达载体获得工程菌，将克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA的表达载体转化到肺炎克雷伯菌感受态细胞，获得肺炎克雷伯菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或将克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因的表达载体、克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA的表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或将克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
或将克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体转化到大肠杆菌受态细胞，获得大肠杆菌工程菌；优选地，转化方式为电转化；
其中，肺炎克雷伯菌和大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
(3)将步骤(2)获得的工程菌发酵培养，表达生产二羟基丙酮及1，3丙二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵培养所述肺炎克雷伯菌工程菌的种子培养液按照10％(v/v)接种到发酵培养基中，培养条件为甘油20-50g/L，在30-40℃、在常压条件下，持续通入氮气0.05-0.15vm、搅拌转速200-300r/min，调节维持发酵液pH为6.5-7.5的条件下进行间歇发酵；
或，所述肺炎克雷伯菌工程菌在种子培养基进行培养，制备种子培养液，所述种子培养基1000mL中包含甘油10-30g，KH2PO4 1.0-1.5g，K2HPO4·7H2O 4-5g，(NH4)SO4 2.0-2.5g，MgSO4·7H2O 0.1-0.2g，CaCO3 2.0-3.0g，1mLFe2+溶液，1.0mLCa2+溶液，酵母粉1-2g，2.0mL微量元素A溶液；
其中，所述微量元素A溶液包含有下列组分：饱和盐酸0.5-1.5mL/L，CuCl2·2H2O 20-30mg/L，ZnCl2 70-75mg/L，MnCl2·4H2O 100-105mg/L，H3BO3 50-65mg/L，CaCl2·6H2O180-220mg/L，NiCl2·6H2O 25-30mg/L，NaMoO4·2H2O 25-35mg/L；
Fe2+溶液：饱和盐酸4mL/L，FeSO4·7H2O 2-8g/L；
Ca2+溶液：10-30g/L的CaCl2；
或，所述发酵培养基1000mL中包含：甘油30-50g、KH2PO4 1-2g、(NH4)2SO4 5-10g、MgCl2·6H2O 0.1-0.5g、CaCl2 0.2-0.5g、柠檬酸0.3-0.5g、酵母粉1-2g、CaCO3 1-2g、5mL微量元素B；
其中，微量元素B溶液：ZnCl2 0.5-1.0g/L，MnCl2·4H2O 0.1-0.2g/L，H3BO3 50-60mg/L，CuCl2·2H20 0.3-0.5g/L，NaMoO4·2H2O 5-6mg/L，FeCl2·4H2O 3-4g/L，CoCl2·6H2O 0.3-0.5g/L，HCl 10-15mL/L；优选地，所述肺炎克雷伯菌工程菌在种子培养基进行培养，制备种子培养液，所述种子培养基1000mL中包含甘油20g，KH2PO4 1.3g，K2HPO4·7H2O 4.4454g，(NH4)SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，1mL Fe2+溶液，1mLCa2+溶液，酵母粉1g，2.0mL微量元素A溶液；
其中，所述微量元素A溶液包含有下列组分：饱和盐酸0.9mL/L，CuCl2·2H2O20mg/L，ZnCl2 70mg/L，MnCl2·4H2O 100mg/L，H3BO3 60mg/L，CaCl2·6H2O 200mg/L，NiCl2·6H2O25mg/L，NaMoO4·2H2O 35mg/L；
Fe2+溶液：饱和盐酸4mL/L，FeSO4·7H2O 5g/L；
Ca2+溶液：20g/L的CaCl2；
优选地，所述发酵培养基1000mL中包含：甘油40g、KH2PO4 1.36g、(NH4)2SO46.61g、MgCl2·6H2O 0.26g、CaCl2 0.29g、柠檬酸0.42g、酵母粉2g、CaCO3 2.0g、5mL微量元素B溶液；
其中，所述微量元素B溶液：ZnCl2 0.68g/L，MnCl2·4H2O 0.17g/L，H3BO3 60mg/L，CuCl2·2H20 0.47g/L，NaMoO4·2H2O 5mg/L，FeCl2·4H2O 3.97g/L，CoCl2·6H2O0.47g/L，HCl 10mL/L；
优选地，所述步骤(3)中培养条件为甘油40g/L，37℃、氮气0.1vm、搅拌转速250r/min，调节维持发酵液pH为7.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵培养所述大肠杆菌工程菌的种子以1％的转接量转接到M9/SM培养基中，同时加入葡萄糖溶液，调节葡萄糖终浓度为1％w/w，
在30℃培养到OD600值达1.2，调节培养温度为42℃，进行诱导发酵培养；
优选地，在发酵培养中每隔6h取样一次，检测发酵产物1，3-PDO和二羟基丙酮的含量，同时每24h补加葡萄糖溶液，调节葡萄糖终浓度为1％w/w，根据1，3PDO和二羟基丙酮夫人含量随时增加NAOH调整发酵液的PH值控制在7.0，至发酵结束；优选地，发酵时间为54-60小时。
4.一种肺炎克雷伯菌工程菌，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌工程菌包含有克隆重组表达载体，表达载体克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA，肺炎克雷伯菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；
更优选地，所述表达载体为PUCm-T、PET-32a(+)、PGEM-32f(+)、pSE380；
更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA序列如SEQ ID No.1或其简并序列所示；
更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，重组表达载体PET-gldA全长序列如SEQ ID No.8所示。
5.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因的表达载体、以及克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA的表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ IDNo.9所示；
优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因源自肺炎克雷伯氏杆菌；更优选地，所述甘油脱水酶dhaB1基因如SEQ ID No.4或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT1基因如SEQ ID No.5或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB1-dhaT1；进一步优选地，所述重组表达载体PSE-dhaB1-dhaT1全长序列如SEQID No.10所示；
优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA如SEQ ID No.1所示；更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示；
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
6.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ IDNo.9所示；
优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2源自肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736；更优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2如SEQ ID No.6或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2如SEQ ID No.7或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB2-dhaT2；进一步优选地，所述重组表达载体PSE-dhaB2-dhaT2的全长序列如SEQ ID No.11所示；
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
7.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、以及克隆重组了甘油脱氢酶基因gldA表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ IDNo.9所示；
优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA源自氧化葡萄糖酸杆菌；更优选地，所述甘油脱氢酶基因gldA如SEQ ID No.1或其其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PET-gldA；进一步优选地，重组表达载体PET-gldA的全长序列如SEQ ID No.8所示；
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
8.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌重组有克隆重组了3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2的表达载体、克隆重组了甘油脱水酶dhaB2基因和1,3-丙二醇氧化还原酶dhaT2基因的表达载体，大肠杆菌为敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因或2,3-丁二醇脱氢酶基因失活；
优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1和3-磷酸甘油酯酶基因GPP2源自酿酒酵母；更优选地，所述3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1如SEQ ID No.2或其简并序列所示，所述3-磷酸甘油酯酶基因GPP2如SEQ ID No.3或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为pSE-GPD1-GPP2；进一步优选地，重组表达载体pSE-GPD1-GPP2的全长序列如SEQ IDNo.9所示；
优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2源自肺炎克雷伯氏杆菌AS1.1736；更优选地，所述甘油脱水酶基因dhaB2如SEQ ID No.6或其简并序列所示，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT2如SEQ ID No.,7或其简并序列所示；更优选地，重组表达载体为PSE-dhaB2-dhaT2；；进一步优选地，所述重组表达载体PSE-dhaB2-dhaT2的全长序列如SEQ ID No.11所示；
优选地，大肠杆菌为DH5ɑ。
9.根据权利要求4所述的肺炎克雷伯菌工程菌和权利要求5～8任一项所述的大肠杆菌工程菌在生产二羟基丙酮和/或1，3丙二醇中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在同时生产二羟基丙酮和1，3丙二醇中的应用。
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| CN202311131944.8A CN117165505A (zh) | 2023-09-04 | 2023-09-04 | 基因工程菌生产二羟基丙酮和/或1，3丙二醇的方法、用于生产的基因工程菌及应用 |
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