CN106635945A

CN106635945A - 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN106635945A
Application number: CN201611250306.8A
Authority: CN
Inventors: 张捧; 程江红; 刁刘洋; 毛贤军
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN106635945B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L‑苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。本发明得到重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达12.4g/L，糖酸转化率可达16.2％，且在发酵培养过程中无副产物乙酸形成。

Description

重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸(Thr)是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素-单酰胺菌素的原料。

目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。2016年梅花集团申请的中国专利201610119758.6中，通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。本发明提供的重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达12.4g/L，糖酸转化率可达16.2％。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组菌株，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。

作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。本领域技术人员认为可行的其它可强化pntAB基因的方法同样在本发明的保护范围之内。

作为优选，pyc基因的来源为谷氨酸棒状杆菌。本领域技术人员认为可行的其它来源的pyc基因同样在本发明的保护范围之内。

在本发明提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。

在本发明提供的一实施例中，重组菌株的保藏编号为CGMCC No.13403。

本发明还提供了一种重组菌株的构建方法，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。

作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。

作为优选，pyc基因的来源为谷氨酸棒状杆菌。

在本发明提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。

作为优选，改造采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。

本发明还提供了一种生产L-苏氨酸的方法，采用本发明的重组菌株或本发明构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。

作为优选，生产L-苏氨酸的方法为：将重组菌株进行活化，接种到种子培养基进行种子培养，然后接种到发酵培养基进行发酵培养。

作为优选，种子培养基包括：

作为优选，发酵培养基包括：

作为优选，活化的温度为37℃，时间为18～24h。

作为优选，种子培养的温度为37℃，转速为90rpm，时间为4.5～5.5h，OD₆₅₀控制在2。

作为优选，发酵培养的温度为37℃。

本发明提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。本发明至少具有如下有益效果之一：

1、本发明将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子，异源引入pyc基因，得到重组菌株，经发酵培养，产苏氨酸的量可达12.4g/L，糖酸转化率可达16.2％。

2、本发明构建得到的重组菌株在发酵培养过程中无副产物乙酸形成。

生物保藏说明

分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13403。

具体实施方式

本发明公开了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢路径，本发明以MHZ-0213-3为出发菌株(梅花集团专利申请公开号105543156A)，在其基因组上进行相关改造，对苏氨酸代谢路径中关键基因进行相应的强化和异源引入，如：将基因pntAB的天然启动子更换为trc(Ptac)强启动子以增加细胞内还原力的供应；异源引入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因pyc(丙酮酸羧化酶基因)以增加苏氨酸合成前体草酰乙酸，并能够有效提高丙酮酸的利用率。

大肠杆菌的基因组编辑，主要借鉴了Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)

以下实施例中，所述卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，所述壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/ml。

以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为MHZ-0213-3，属于W3110(埃希氏菌属(Escherichia))。实施例中所使用引物序列见下表1。

表1引物序列

本发明中涉及的基因名称解释如下：

thrA：天冬氨酸激酶及Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶；

thrB：高丝氨酸激酶；

thrC：苏氨酸合成酶；

tdh：L-苏氨酸脱氢酶；

pps：磷酸烯醇式丙酮酸合酶；

pntAB：吡啶核苷酸转氢酶；

pyc：丙酮酸羧化酶；

IS：转座子(插入序列)；

SgRNA(singleguideRNA简称)：是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guideRNA，由两部分组成—tracRNA和crRNA，两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切；

Trc(Ptac)启动子：是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：制备强化pntAB基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)

(1)构建pTargetT-Ptac-pntAB质粒

Step 1:以pTargetT质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，利用引物对gRNApntABup-f1/gRNApntABdn-r1(所有引物序列见表1)扩增得到pntAB的sgRNA片段①；

Step 2:以W3110基因组为模板，利用引物对pntABup-f1/Ptac-pntABup-r1扩增得到Ptac-pntAB左半段②；

Step 3:仍然以W3110基因组为模板，利用引物对Ptac-pntABdn-f1/pntABdn-r1扩增获得Ptac-pntAB右半段③；

Step 4:以①②③为模版，利用两端引物gRNApntABup-f1/pntABdn-r1进行OE-PCR扩增得到gRNA-Ptac-pntAB片段(全长0.9kb)；

Step 5:使用SpeI/PstI对获得的gRNA-Ptac-pntAB片段和pTargetT载体进行双酶切，利用T4DNA连接酶将目的片段与载体进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用以扩增和筛选，最终获得pTargetT-Ptac-pntAB质粒。

(2)感受态细胞制备及电转化pTargetT-Ptac-pntAB质粒

Step 1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,ChenB,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)电转入MHZ-0213-3感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；

Step 2：挑取MHZ-0213-3(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD₆₅₀为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)；

Step 3：将pTargetT-Ptac-pntAB质粒电转入MHZ-0213-3(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

(3)重组验证

Step 1：使用引物对pntAB-up/pntAB-dn对上述单菌落进行菌落PCR验证(阳性片段约0.9kb)；

Step2：菌落PCR验证正确的菌株，进一步测序验证。

(4)构建相关质粒丢失

Step 1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mMIPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

Step 2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetT-Ptac-pntAB质粒已丢失；

Step 3：挑取pTargetT-Ptac-pntAB质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

Step 4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)菌株。

实施例2：制备异源引入P1-pyc基因的菌株MHZ-0213-3(IS4::P1-pyc)

(1)构建pTargetT-P1-pyc质粒

Step 1：以pTargetT质粒为模板，利用引物对gRNAIS4 up-For/gRNAIS4 up-Rev扩增得到P1-pyc的sgRNA片段①；

Step 2:以W3110基因组为模板，利用引物对P1pyc up-For/P1pyc up-Rev扩增得到IS4-up片段②；

Step 3:以W3110基因组为模板，利用引物对P1pyc-For/P1pyc-Rev扩增获得P1pyc片段③；

Step 4:以W3110基因组为模板，利用引物对P1pyc down-For/P1pyc down-Rev扩增得到IS4-down片段④；

Step 5:以①②③④为模版，利用两端引物gRNAIS4 up-For/P1pyc down-Rev进行OE-PCR扩增得到gRNA-P1pyc片段(全长4.8kb)；

Step 6:使用SpeI/PstI对获得的gRNA-P1pyc片段和pTargetT载体进行双酶切，利用T4DNA连接酶将目的片段与载体进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用以扩增和筛选，最终获得pTargetT-P1pyc质粒。

(2)感受态细胞制备及电转pTargetT-P1-pyc质粒

Step 1：将pCas质粒电转入MHZ-0213-3感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；

Step 3：将pTargetT-P1pyc质粒电转入MHZ-0213-3(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

(3)重组验证

Step 1：使用引物对P1pyc up/P1pyc down对上述单菌落进行菌落PCR验证(阳性片段约4.8kb)；

Step2：菌落PCR验证正确的菌株，进一步测序验证。

(4)构建相关质粒丢失

pTargetT-P1-pyc、pCas质粒丢失方法同实施例1，得到MHZ-0213-3(IS4::P1-pyc)菌株。

实施例3：制备强化pntAB基因并同时异源引入P1-pyc基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，IS4::P1-pyc)

(1)构建pTargetT-P1-pyc质粒

使用实施例2中所构建完成的质粒。

(2)感受态细胞制备及电转pTargetT-P1-pyc质粒

Step 1：将pCas质粒电转入MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；

Step 2：挑取MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD₆₅₀为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)；

Step 3：将pTargetT-P1pyc质粒电转入MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

(3)重组验证

Step2：菌落PCR验证正确的菌株，进一步测序验证。

(4)构建相关质粒丢失

pTargetT-P1-pyc、pCas质粒丢失方法同实施例1，得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，IS4::P1-pyc)菌株。

实施例1-3所获得的产苏氨酸基因改造菌株如表2所示。

表2本发明构建的基因工程菌

实施例4：产L-苏氨酸基因工程菌摇瓶发酵验证

Step 1:从冻存管中取MHZ-0213-3、MHZ-0213-4、MHZ-0215-1、MHZ-0215-2共4株，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；

Step 2:将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表3)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD₆₅₀控制在2以内；

Step 3:将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基(见表4)的摇瓶中，往复摇床37℃，100rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵结束后测定样品OD₆₅₀，并用使用HPLC测定L-苏氨酸含量，用生物传感仪方法测定残糖量。产酸及转化率结果见表5。

表3种子培养基(g/L)

成分	浓度
		葡萄糖	25
玉米浆	25
		豆粕水解液	7.7
酵母膏	2.5
		KH₂PO₄	1.4
七水硫酸镁	0.5
		FeSO₄、MnSO₄	20mg/L
pH	7.0

表4发酵培养基(g/L)

表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较

菌株编号	产酸(g/L)	转化率(％)
			MHZ-0213-3	4.5	8.8
MHZ-0213-4	5.1	9.5
			MHZ-0215-1	6.5	11.2
MHZ-0215-2	12.4	16.2

由表5可知，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量得到大幅提升：相比于出发菌株MHZ-0213-3，经过强化pntAB基因后转化率提高0.7个百分点；经过异源引入P1-pyc基因，增加了丙酮酸前体的利用效率，减少TCA带来的碳损失，使转化率提高了2.4个百分点；两种改造的叠加能够进一步有效地提升转化率，达到最好的16.2％，提升了7.4个百分点。因此，该菌株能够很好地提升工业发酵产L-苏氨酸量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法

<130> MP1623787

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatactagtg aagggaatat catgcgaatg ttttagagct agaaatagc 49

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgccccggca cgaatcacta ttcaaaaaaa gcaccgactc gg 42

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagtgattcg tgccggggcg 20

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgattaattg tcaacagctc gatattccct tccatcggtt tta 43

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaa 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagcgatg cgaattggca taccaagag 59

<210> 7

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<212> DNA

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<400> 7

aactgcagtc gccatcgagc ttagtgcg 28

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<211> 20

<212> DNA

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tatcacattc cttaagccaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccatacttt gaacttgttc 20

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<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

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aatactagta gctcttgctc cacaagctcg ttttagagct agaaatagc 49

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<212> DNA

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aaaaagagcc agtcagttgc ttaattcaaa aaaagcaccg actcgg 46

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<212> DNA

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cggtgctttt tttgaattaa gcaactgact ggctcttttt 40

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<212> DNA

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cgcggtataa ccaccagaag ccccggcttg tggagcaaga gctgtggggt 50

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

accccacagc tcttgctcca caagccgggg cttctggtgg ttataccgcg gcgcgcaaag 60

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<212> DNA

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gctgagaagt aaaaagccgg accaccgatg cgccagcatt cgcctga 47

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<211> 44

<212> DNA

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

taaaggttat tactcactgg gactgtt 27

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

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<400> 18

tttagatccg ctggcctgcg ggcatg 26

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<211> 27

<212> DNA

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<400> 19

tctgccagat ggaactgacc agccatc 27

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tccctttgat attgcatccc gcgtatataa tatgtc 36

Claims

1.一种重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述pyc基因的来源为谷氨酸棒状杆菌。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.13403。

6.一种重组菌株的构建方法，其特征在于，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和异源引入pyc基因。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述改造采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。

8.一种生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，采用如权利要求1至5中任一项所述的重组菌株或如权利要求6或7所述构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生产L-苏氨酸的方法为：将重组菌株进行活化，接种到种子培养基进行种子培养，然后接种到发酵培养基进行发酵培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括：

所述发酵培养基包括：