CN1261576C - 新型大肠杆菌菌株及其制备方法和它们在l－苏氨酸生产发酵方法中的应用 - Google Patents

新型大肠杆菌菌株及其制备方法和它们在l－苏氨酸生产发酵方法中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及大肠杆菌的新菌株和利用这些新菌株的发酵方法。本发明尤其涉及经基因修饰的大肠杆菌菌株和它们在氨基酸特别是天冬氨酸族氨基酸成员，如苏氨酸生产中的应用。本发明还涉及用于氨基酸发酵生产的大肠杆菌菌株的制备方法。

Description

新型大肠杆菌菌株及其制备方法和它们 在L-苏氨酸生产发酵方法中的应用
                       发明领域
本发明涉及新型大肠杆菌(Escherichia coli)菌株和利用这些微生物的发酵方法。本发明尤其涉及经基因改造的大肠杆菌菌株和它们在氨基酸，特别是天冬氨酸族氨基酸成员，如苏氨酸生产中的应用。本发明还涉及用于氨基酸发酵生产的大肠杆菌菌株的制备方法。
                     发明背景
在大肠杆菌中，氨基酸L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的全部或部分碳原子通过下面的共同生物合成途径由天冬氨酸衍生而来(G.N.Cohen，“赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸合成的共同途径，(The common pathway to lysine，methionine and threonine，)”pp.147-171《氨基酸：生物合成及遗传调控》(Amino Acids：Biosynthesis andGenetic Regulation)，K.M.Herrmann和R.L.Somerville编，Addison--Welesley出版有限公司，Reading，Mass.(1983))：天冬氨酸→天冬氨酰磷酸→天冬氨酸半醛→高丝氨酸→甲硫氨酸/苏氨酸/异亮氨酸
                         ↓
                       赖氨酸
这个共同途径的第一步反应是由三种不同的天冬氨酸激酶(AKI、II或III)中的一种催化的，每一种天冬氨酸激酶由各自的基因编码并且其活性和合成的调控方式与其它的天冬氨酸激酶不同。例如，天冬氨酸激酶I由thrA编码，其活性受苏氨酸抑制，其合成受苏氨酸和异亮氨酸的联合阻遏。而天冬氨酸激酶II是由metL编码的，并且它的合成受甲硫氨酸的阻遏(尽管它的活性不受甲硫氨酸抑制或甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸成对的联合抑制(F.Falcoz-Kelly等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)8：146-152(1969)；J.C.Patte等，Biochim.Biophys，Acta136：245-257(1967))。天冬氨酸激酶III由lysC编码，其活性和合成分别受到赖氨酸的抑制和阻遏。
天冬氨酸激酶中的两种，天冬氨酸激酶I和II并不是不同的蛋白质，而是一个复合酶的结构域，这个复合酶分别含有高丝氨酸脱氢酶I和II，每一种高丝氨酸脱氢酶催化天冬氨酸半醛还原为高丝氨酸(P.Truffa-Bachi等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)5：73-80(12968)]。因此高丝氨酸脱氢酶I也是由thrA编码的，它的合成受到苏氨酸和异亮氨酸的联合阻遏，并且它的活性受到苏氨酸的抑制。高丝氨酸脱氢酶II相似地也由metL编码并且它的合成受甲硫氨酸阻遏。
苏氨酸的生物合成包括下列附加反应：高丝氨酸→高丝氨酸磷酸→苏氨酸。高丝氨酸的磷酸化也是由高丝氨酸激酶催化的，该酶是一种由thrB编码的两个相同的29kDa的亚单位组成的蛋白质，并且该蛋白质的活性受苏氨酸抑制(B.Burr等，生物化学杂志(J.Biochem.)62：519-526(1976))。最后一步，由高丝氨酸磷酸到L-苏氨酸的复杂转化是由苏氨酸合酶催化的，该酶是由thrC编码的47kDa的蛋白质(C.Parsot等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)11：7331-7345(1983))。
thrA、thrB和thrC基因都属于thr操纵子，这是一个位于大肠杆菌基因图谱0分钟的单独操纵子(J.Theze和I.Saint-Girons，细菌学杂志(J.Bacteriol)118：990-998(1974)；J.Theze等，细菌学杂志，117：133-143(1974)))。这些基因分别编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶。这些酶的生物合成受到苏氨酸和异亮氨酸的多价阻遏(M.Freundlich，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun)10：277-282(1963))。
在thr操纵子的第一个结构基因的上游发现了一个调控区，其序列已经确定(J.F.Gardner，美国国家科学院院报(Proc.Natl，Acad.Sci.USA)76：1706-1710(1979))。thr弱化子位于转录起始位点下游，包含一段编码先导肽的序列，该序列包含8个苏氨酸密码子和4个异亮氨酸密码子。thr弱化子还包含典型的互斥型二级结构，其依赖于带电荷的苏氨酰-和异亮氨酰-tRNA的水平允许或阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。
因为关系到通过自然生物合成获得高水平氨基酸产量的问题(例如thr操纵子受目的产物的抑制)，构建了具有包含一个thr操纵子的质粒的细菌菌株，该操纵子带有编码抗反馈酶的thrA基因。利用这些质粒，已经在工业规模上通过利用多种微生物，例如，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和大肠杆菌发酵生产了L-苏氨酸。
例如，大肠杆菌菌株BKIIM B-3996(Debabov等，美国专利第5,175,107号)含有质粒pVIC40，在36小时产生苏氨酸约85g/L。该宿主是一种苏氨酸需求型菌株，因为它的苏氨酸合酶是缺陷的。在BKIIMB-3996中，重组质粒pVIC40提供了苏氨酸生物合成必需的关键酶活性，即抗反馈天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶。该质粒还互补了宿主的苏氨酸缺陷。
大肠杆菌菌株29-4(E.Shimizu等，Biosci.Biotech.Biochem.59：1095-1098(1995))是重组大肠杆菌苏氨酸产生菌的另一个例子。菌株29-4的构建是通过将一个苏氨酸过量产生突变株，大肠杆菌K-12(βIM-4)(来自大肠杆菌ATCC 21277)的thr操纵子克隆至质粒pBR322，再将该质粒引入亲株(K.Wiwa等，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)47：2329-2334(1983))。菌株29-4在72小时内产生约65g/L苏氨酸。
利用其它微生物构建了相似的重组菌株。例如粘质沙雷氏菌菌株T2000含有编码抗反馈的thrA基因产物的thr操纵子的质粒，且在96小时内产生约100g/L苏氨酸(M.Masuda等，应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)37：255-262(1992))。所有这些菌株都含有带多拷贝编码苏氨酸生物合成酶的基因的质粒。该质粒允许过量表达这些酶。这种来自质粒的编码苏氨酸生物合成酶的基因的过量表达，尤其是编码抗反馈天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，使得这些菌株产生大量的苏氨酸。其它的含有质粒的微生物的例子也已被描述，如美国专利第4,321,325；4,347,318；4,371,615；4,601,983；4,757,009；4,945,058；4,946,781；4,980,285；5,153,123；和5,236,831号。
然而这些含质粒的菌株还存在限制它们在商业化发酵生产氨基酸上的应用的问题。例如这些菌株的一个显著的问题是必须确保在整个发酵过程中维持包含质粒的菌株的完整性。因为在细胞生长和分化过程中质粒可能丢失。要避免这个问题，就有必要在培养过程中选择性地淘汰不含质粒的细胞，例如通过在质粒上加上抗生素抗性基因。然而这种需要向发酵培养基中添加一种或多种抗生素的方法对大规模的发酵在商业上是不实用的。
包含质粒的菌株的另一个显著的问题是质粒的稳定性。基因编码在质粒上的酶的高表达是对商业化实用性的发酵方法而言所必要的，但却经常引起质粒的不稳定性(E.Shimizu等.Biosci.Biotech.Biochem.59：1095-1098(1995))。质粒的稳定性还依赖于诸如培养温度和培养基中的溶解氧水平等因素。例如，包含质粒的菌株29-4在较低的培养温度(30℃比37℃)和较高的溶解氧水平时更稳定(E.Shimizu等，Biosci.Biotech.Biochem.59：1095-1098(1995))。
不含质粒的微生物尽管不如上述那些菌株有效，也已用作苏氨酸产生菌。大肠杆菌如菌株H-8460是通过一系列常规诱变和对几种代谢类似物的抗性筛选获得的，它在70小时内产生大约75g/L的L-苏氨酸(Kino等，美国专利第5,474,918号)。菌株H-8460没有携带重组质粒，在染色体上有一个苏氨酸生物合成基因的拷贝。这个菌株的产量与含有质粒的菌株如BKIIM B-3996相比较低，据信是由于酶活性较低的缘故(尤其是那些由thr操纵子编码的酶)，因为这些不含质粒的菌株仅仅含有一个拷贝的苏氨酸生物合成基因。其它适合的不含质粒的微生物的例子也有描述，如美国专利第5,376,538；5,342,766；5,264,353；5,217,883；5,188,949；5,164,307；5,098,835；5,087,556；5,077,207；5,019,503；5,017,483；4,996,147；4,463,094；4,452,890；3,732,144；3,711,375；3,684,654；3,684,653；3,647,628；3,622,453；3,582,471；3,580,810；3,984,830；和3,375,173。
无论是不含质粒还是含有质粒的大肠杆菌菌株，其thr操纵子都是由该菌株自身的苏氨酸启动子所调控的。如前面所述，自身启动子的表达受到由一段DNA区域控制的弱化机制的调节，这段DNA编码一个先导肽并含有大量的苏氨酸和异亮氨酸密码子。这段DNA区域由一个能感受苏氨酰-tRNA和异亮氨酰-tRNA水平的核糖体所翻译，当这两种氨酰-tRNA的水平足够使先导肽翻译时，转录被过早地终止。但是当其水平不足以使先导肽翻译时，转录不被终止而整个操纵子被转录，随后进行翻译，导致苏氨酸生物合成酶产量增加。于是当苏氨酰-tRNA和/或异亮氨酰-tRNA水平低时，thr操纵子被最大程度地转录并且苏氨酸生物合成酶产量最大。
在大肠杆菌苏氨酸产生菌株BKIIMB-3996中，质粒上的苏氨酸操纵子被其自身的启动子所调控。因此，只有当菌株缺乏苏氨酸和/或异亮氨酸时，thr操纵子才能被最大程度地表达。因为在产苏氨酸菌株中不可能存在苏氨酸饥饿，这些菌株被赋予异亮氨酸缺陷型来获得较高水平的酶活性。
克服弱化控制的另一条途径是降低细胞中苏氨酰-tRNA和/或异亮氨酰-tRNA水平。例如，一个带苏氨酰-tRNA合酶的thrS突变株，该酶对苏氨酸的表观亲和力降低了200倍，结果使thr操纵子过量表达，原因可能是苏氨酰-tRNA的水平较低(E.J.Johnson等.细菌学杂志(J.Bacteriol.)129：66-70(1977))。
然而在利用这些菌株的发酵方法中，必须在生长期补加异亮氨酸，因为细胞的异亮氨酸生物合成不足。随后在生产期细胞缺乏诱导苏氨酸生物合成酶表达的异亮氨酸。所以，利用自身苏氨酸启动子控制苏氨酸生物合成酶表达的一个主要缺点是必须为细胞补加异亮氨酸。
已知抗生素疏螺旋体素(borrelidin)能降低苏氨酰-tRNA合酶的酶学活性，并因而抑制大肠杆菌生长(G.Nass等。生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)34：84(1969))。鉴于这种降低的酶活，某些大肠杆菌的疏螺旋体素敏感菌株被用于生产高水平的苏氨酸(日本公开专利申请第6752/76号；美国专利第5，264，353号)。发现向培养物中添加疏螺旋体素可以增加L-苏氨酸的产量。短杆菌属(Brevibacterium)和棒杆菌属(Corynebacterium)的菌株也已被用于生产高水平的苏氨酸(日本专利第53-101591号)。
大肠杆菌的疏螺旋体素抗性突变株同样表现出苏氨酰-tRNA合酶活性的改变。更进一步说，疏螺旋体素抗性的大肠杆菌表现为具备下列特征之一：(i)组成型地增加野生型苏氨酰-tRNA合酶的水平；(ii)结构上改变了的苏氨酰-tRNA合酶；或(iii)一些未知的细胞变化，可能由于一种膜的改变(G.Nass和J.Thomale，FEBS Lett.39：182-186(1974))。然而这些突变株还没有一种被用于L-苏氨酸的发酵生产上。
鉴于上述讨论，在现有技术上尚存对这种微生物菌株的需求，它们可以有效地产生氨基酸，如苏氨酸，但不存在与现有技术有关的问题。
                        发明概述
本发明的一个目的在于提供能够有效地产生大量的L-苏氨酸，而不需要任何含有编码苏氨酸生物合成酶基因的重组质粒，并且优选地没有对氨基酸营养的需求的微生物。本发明其它的目的、特性和优点将在随后的优选实施方案的详细描述中给出，并且部分将通过说明书得到明确或从本发明的实践中学习到。本发明的这些目的和优点将通过在此次书面描述和权利要求中特别指出的方法得以实现。
这些目的和其它目的是通过本发明的方法完成的；在本发明第一实施方案中涉及一种用于生产氨基酸如苏氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养一种大肠杆菌菌株并从培养基中回收氨基酸的步骤。本方法中采用的大肠杆菌菌株具有下列特征：(i)它在染色体上含有一个处于非自身启动子控制之下的氨基酸生物合成遗传决定子，如苏氨酸操纵子(该操纵子编码苏氨酸生物合成酶)；且(ii)它不需要任何含有编码苏氨酸生物合成酶基因的重组质粒用于产生苏氨酸。
本发明的另一个实施方案涉及具有上述特征的大肠杆菌菌株的生物纯培养。
本发明的另外一个实施方案涉及一种用于生产氨基酸，如苏氨酸的方法，它包括在培养基中培养一种大肠杆菌菌株并从培养基中回收氨基酸的步骤，其中大肠杆菌菌株为疏螺旋体素抗性。
本发明的另一个实施方案涉及一种产生用于发酵生产氨基酸，如苏氨酸的大肠杆菌菌株的方法，它包括这样几个步骤：(a)将遗传物质从一种氨基酸产生菌引入到一种大肠杆菌缺陷型的染色体中，使得该大肠杆菌成为原养型；(b)在该氨基酸生物合成基因的染色体位置之前插入一个非自身启动子到染色体上以控制其表达；以及选择性地，(c)从该染色体上去除氨基酸生物合成对氨基酸的营养需求，和/或氨基酸生物合成的调控障碍。
需要理解的是，前面的一般性描述和后面的描述都仅仅意在举例和解释，目的在于提供根据权利要求的本发明的进一步解释。
                       附图简述
图1描绘的是由质粒Kohara′sλ676和质粒pUC19构建质粒pAD103的过程。
图2描绘的是由质粒pAD103和质粒pUC4k构建质粒pAD106的过程。
图3描绘的是由质粒pAD103和质粒pKK223-3构建质粒pAD115的过程。
图4描绘的是由质粒pAD115和质粒pAD106构建质粒pAD123的过程。
图5描绘的是将启动子区域从质粒pAD123整合到大肠杆菌染色体的过程。
                本发明优选实施方案的详述
在第一个实施方案中，本发明涉及可以用于氨基酸发酵生产方法的新细菌菌株。本发明的新细菌菌株具有以下特征：
(i)该菌株在染色体上至少含有一个处于非自身启动子的控制之下的thr操纵子，即至少一套编码苏氨酸生物合成酶的基因；以及
(ii)该菌株不需要任何编码苏氨酸生物合成酶的重组质粒用于产生苏氨酸。
优选地，这些创造性的菌株能够在约30小时内产生至少约50g/L左右的L-苏氨酸；更优选地在约30小时内产生至少约70g/L，甚至更优选地在约30小时内产生至少约80g/L，最优选地在约30小时内产生至少约90g/L L-苏氨酸。优选地，这些创造性的菌株能够在约48小时内产生至少约90g/L，更优选地在约48小时内产生至少约100g/L，最优选地在约48小时内产生至少约110g/L的苏氨酸。
优选地，这些创造性的菌株能够以至少2克/升/小时左右的速率产生L-苏氨酸，更优选地以至少2.5克/升/小时左右的速率，更优选地以至少3克/升/小时左右的速率，最优选地以至少3.6克/升/小时左右的速率产生L-苏氨酸。
在一个具体的优选实施方案中，用于发酵产生苏氨酸的新细菌菌株同样没有对氨基酸营养的需求，即不需要添加氨基酸用于细胞生长和产生苏氨酸。
根据本发明，创造性的细菌菌株不需要任何包含一种或多种编码用于产生苏氨酸的苏氨酸生物合成酶基因的重组质粒，即该菌株能够产生苏氨酸而不需要由重组质粒中所含的基因编码一种或多种苏氨酸生物合成酶。当然这些创造性的菌株根据需要可选择地含有一种或多种重组质粒。例如，尽管这样的质粒不是产生苏氨酸所要求的，这些创造性的菌株可以含有编码苏氨酸生物合成酶的重组质粒用于增加苏氨酸的产量。本发明的菌株同样可以含有编码参与苏氨酸生物合成的其它酶如天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的重组质粒。
优选地，这些创造性的菌株为大肠杆菌菌株。更优选地，这些创造性的菌株是对大环内酯类抗生素疏螺旋体素呈抗性的大肠杆菌菌株。这些创造性的细菌菌株的一个特别优选例子是大肠杆菌菌株kat-13，它于1996年6月28日被保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL)，1815NorthUniversity Street，Peoria，Illinois 61604，美国，保藏号为NRRL  B-21593。
位于这些创造性细菌菌株细胞染色体上的苏氨酸(thr)操纵子编码苏氨酸生物合成所必需的酶。优选地，苏氨酸操纵子包含AK-HD基因(thrA或metL)，高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。更优选地，thr操纵子包含thrA(AKI-HDI基因)、thrB和thrC。合适的thr操纵子可以从诸如大肠杆菌菌株ATCC21277和菌株ATCC21530中获得。特别优选来自菌株ATCC21277的thr操纵子。染色体上可能存在多拷贝的thr操纵子。
优选地，thr操纵子含有至少一种非弱化的基因，即该基因的表达不受(胞外和/或胞内)一种或多种苏氨酸生物合成酶水平和/或其产物(如苏氨酸和异亮氨酸)水平的阻遏。创造性菌株还可能含有具有缺陷型thr弱化子(位于转录起始位点下游和第一个结构基因上游的调控区)或没有thr弱化子的一种thr操纵子。
在本发明的一个特定优选实施方案中，thr操纵子编码一种或数种抗反馈的苏氨酸生物合成酶，即酶的活性不受胞外和/或胞内的苏氨酸生物合成的中间产物和终产物水平的抑制。最优选地，thr操纵子含有一个编码抗反馈的AK-HD的基因，如抗反馈的AKI-HDI。抗反馈AK-HD的应用为苏氨酸生物合成提供了高水平的酶活性，即使在产生苏氨酸的状态下也是如此。
这些创造性菌株中苏氨酸操纵子的表达受非自身启动子的控制，即通常不控制自然界中大肠杆菌菌株中的thr操纵子表达的启动子。把苏氨酸生物合成酶自身启动子替换成一种非自身的强启动子来控制thr操纵子的表达，使得即使只有一个基因组拷贝的thr操纵子也能得到较高产量的苏氨酸。另外，既然用一种非自身的启动子来控制苏氨酸操纵子的表达，也就没有必要为了获得更高产量的苏氨酸而赋予菌株异亮氨酸缺陷型了。合适的启动子的示范性的例子包括，但并不局限于：lac启动子；trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；PR启动子；lpp启动子和tac启动子。特别优选用于这些创造的细菌菌株的是tac启动子。
除了苏氨酸操纵子以外，该创造性细菌菌株的细胞染色体上优选地还含有至少一种编码天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)的基因。最优选地，本发明中的细胞染色体含有至少一种asd基因，至少一种thrA基因，至少一种thrB基因和至少一种thrC基因。当然该染色体可以含有一种或多种这些基因的多个拷贝。
苏氨酸脱氢酶(tdh)催化L-苏氨酸氧化为α-氨基-β--丁酮酸。相应地，在一个特别优选实施方案中，该创造性的细胞的染色体还含有至少一种缺陷型苏氨酸脱氢酶(tdh)基因。该缺陷型tdh基因可能是一个苏氨酸脱氢酶表达水平降低的基因，或者是一个编码与自身苏氨酸脱氢酶相比活性降低的苏氨酸脱氢酶突变体的基因。优选地，在该创造性菌株中采用的缺陷型tdh基因不表达苏氨酸脱氢酶。不表达苏氨酸脱氢酶的合适的tdh基因的示范性例子包括一种具有插入到tdh基因中的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的tdh基因，或一种具有插入到tdh基因中的Tn5转座子的tdh基因，如在美国专利第5,175,107号中所述。
本发明的细菌菌株可以通过任何为本领域的技术人员所熟知和可行的方法和技术加以制备。构建该创造性的细菌菌株合适的方法的示范性例子包括：用合适的试剂如NTG进行诱变；通过转化线性DNA片段和同源重组所介导的基因整合技术；以及由噬菌体P1介导的转导作用。这些方法在本领域是众所周知的，也有文献描述，例如在J.H.Miller的《分子遗传学实验》(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLaboratory出版社，Cold Spring Harbor，纽约(1972))；J.H.Miller的《细菌遗传学简明教程》(A Short Course in Bacterial Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor，纽约(1992))；M.Singer和P.Berg的《基因与基因组》(Genes & Genomes，UniversityScience Books，Mill Valley，California(1991))；J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor，纽约(1989))；P.B.Kaufman等的《生物学和医学的分子和细胞学方法手册》(Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology and Medicine，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1995))；B.R.Glick和J.E.Thompson主编的《植物分子生物学和生物技术方法》(Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1993))以及P.F.Smith-Keary的《大肠杆菌的分子遗传学》(Molecular Genetics ofEscherichia coli，The Guilford出版社，纽约，NY(1989))。
在本发明的一个特定优选实施方案中，利用P1介导的转导作用引入苏氨酸操纵子到大肠杆菌菌株ATCC21277，使生长时需要苏氨酸的大肠杆菌菌株472T23转变成苏氨酸产生菌，大肠杆菌菌株ATCC21277可以从美国典型培养物保藏中心得到(American Type Culture Collection，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)。这个thr操纵子包含抗反馈的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶基因(thrA)，高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。
为了提高该创造性菌株的苏氨酸产量，可以通过P1转导作用引入来自大肠杆菌菌株CGSC6945(相关基因型：tdh-1：：cat1212；来自美国耶鲁大学的大肠杆菌基因储存中心(E.coli Genetic Stock Center，335Osborne Memorial Laboratory，生物系，耶鲁大学，New Haven，Connecticut 06520-8104，美国))的缺陷型的苏氨酸脱氢酶基因。所得到的苏氨酸产生菌可以通过NTG诱变和/或疏螺旋体素抗性筛选得到进一步改良。
携带抗生素抗性标记的质粒，如kan(编码卡那霉素抗性)，和强启动子，如PL或tac，可以被构建并用作将所需DNA片段引入染色体的载体，启动子优选地位于thrA上游DNA和野生型thrA基因的数百个碱基对(即不是整个thrA基因)之间。该质粒上的片段可以通过合适的限制性酶消化得到分离并加以纯化，再通过转化或电穿孔法引入到菌株中以去除苏氨酸操纵子的控制区，再通过同源重组替换成所需的片段，也就是位于thr基因开始处的抗生素抗性标记基因和强启动子。该片段可通过P1转导作用再次转移到疏螺旋体素抗性菌株中。
优选的宿主菌株472T23对异亮氨酸的需求可以消除掉，比如通过P1转导作用引入该标记基因的野生型等位基因。其它宿主不需要的营养需求可以通过类似的方式，或通过为本领域的技术人员周知的和可行的其它方法得到消除。
本发明的第二个实施方案涉及所述细菌菌株在生产天冬氨酸族氨基酸的发酵方法中的应用。例如，苏氨酸是通过在合成或天然培养基中培养该创造性的菌株而得到的，培养基中含有至少一种碳源、至少一种氮源以及合适的无机盐、生长因子等等。
适当的碳源的示范性例子包括，但并不局限于：碳水化合物类，如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉水解物、纤维素水解物和糖蜜；有机酸类，如乙酸、丙酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和延胡索酸，以及醇类，如甘油。
适当的氮源的示范性例子包括，但并不局限于：氨，包括氨气和液氨；无机或有机酸铵盐，如氯化铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；以及其它含氮物，包括肉浸出物、胨、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物和酵母浸出物。
经过培养后，培养液中积累的L-苏氨酸可以根据任何已知的方法分离出来，例如通过利用在美国专利第5,342,766号中描述的离子交换树脂法。该方法包括首先通过离心去除培养液中的菌体，然后用盐酸把培养液的pH调节至大约2。酸化液随后通过一种强酸型阳离子交换树脂，吸附物用稀释的液氨洗脱。氨通过真空蒸发除去，浓缩所得溶液。加入乙醇并随后冷却得到L-苏氨酸晶体。
天冬氨酸族的其它氨基酸可以通过与上面详细描述的方法相似的方法获得。例如异亮氨酸可以从该创造性的细菌菌株中得到，在该菌株的染色体上或质粒上有一个扩增(amplified)的ilvA基因或tdc基因，这两个基因都编码由苏氨酸到异亮氨酸的生物转化中的第一个酶：苏氨酸脱氨酶。对该基因的扩增，例如通过使用一种编码抗反馈酶的ilvA基因，导致异亮氨酸的生物合成增加。
相似地，甲硫氨酸可以通过如大肠杆菌等微生物得到，该菌株在染色体上至少含有一个met操纵子，即metL基因(编码AKII-HDII)、metA基因(编码高丝氨酸琥珀酰转移酶)、metB基因(胱硫醚-γ-合酶)、metC基因(编码胱硫醚-β-裂解酶)以及metE和metH基因(编码高丝氨酸甲基化酶)。这些基因，包括其抗反馈变株，以及任选地一种非自身的启动子，可以根据一种和多种以上讨论的一般方法和/或为本领域的技术人员所熟知的方法引入到宿主微生物的染色体上。赖氨酸可以同样地由微生物得到，该微生物含有编码赖氨酸生物合成酶的基因(优选地由lysC和/或dapA编码的抗反馈赖氨酸生物合成酶)以及任选地一种非自身启动子。
本发明的第三个实施方案涉及抗疏螺旋体素的细菌菌株在L-苏氨酸生产的发酵方法中的应用。优选地，该疏螺旋体素抗性菌株是大肠杆菌菌株的突变株。这样的突变株的特定优选实施方案是大肠杆菌菌株kat-13，它于1996年6月28日被保藏于农业研究机构保藏中心(NRRL)，1815North University Street，Peoria，Illinois 61604，美国，保藏号NRRL B-21593。
疏螺旋体素抗性可以用为本领域技术人员所熟知并公认的任何一种方法来测定。例如，按照文献G.Nass和J.Thomale，FEBS Lett，39：182-186(1974)中描述的方法，抗疏螺旋体素的菌株可以通过将候选菌株涂布到含大约139μM疏螺旋体素的最低培养基上分离得到。另外，特定菌株的疏螺旋体素抗性可以表现为一种或多种细胞表型特征的改变。例如，大肠杆菌菌株6-8的疏螺旋体素抗性突变株及其派生菌株呈圆形，而不是棒状。在这样的例子中，表型特征改变的证据足够用以鉴别疏螺旋体素抗性菌株。
在本发明的这一实施方案中有用的疏螺旋体素抗性突变株能够产生苏氨酸。编码苏氨酸生物合成酶的基因可能存在于染色体上或是在质粒中，亦或存在于二者之上。也可能存在这些基因的多重拷贝。优选地，编码苏氨酸生物合成酶的基因是抗弱化控制的和/或编码抗反馈酶。
正如上面所提到的，这些创造性的疏螺旋体素抗性菌株根据需要可以含有一种或多种重组质粒。例如，这些创造性的微生物可以含有编码苏氨酸生物合成酶的重组质粒。这些创造性的细菌菌株同样可以含有编码其它参与苏氨酸生物合成的酶，如天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)，或促生长的酶的重组质粒。
另外，疏螺旋体素抗性菌株也可以根据需要加以修饰，例如为了增加苏氨酸的产量、消除营养需求等等，可以使用为本领域技术人员周知并可行的方法和技术。用于修饰疏螺旋体素抗性大肠杆菌突变株及其变株的合适方法的示范性例子包括，但不局限于：利用紫外线或X-射线照射进行诱变；或用化学诱变剂处理，如亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)、甲基甲磺酸、氮芥等；基因整合技术，如由转化线性DNA片段和同源重组介导的技术；以及由噬菌体如P1介导的转导作用。这些方法为本领域技术人员周知并有文献描述，如J.H.Miller的《分子遗传学实验》；J.H.Miller的《细菌遗传学简明教程》；M.Singer和P.Berg，的《基因与基因组》；J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆实验室手册》；P.B.Kaufman等的《生物学和医学的分子和细胞学方法手册》；B.R.Glick和J.E.Thompson主编的《植物分子生物学和生物技术方法》以及P.F.Smith-Keary的《大肠杆菌的分子遗传学》。
优选地，本发明的疏螺旋体素抗性突变株经过修饰，使得位于编码苏氨酸生物合成酶的一种或多种基因的上游包括一种非自身的启动子，启动子与基因可操纵性地相连，而不论这些基因是在染色体上和/或是包含在质粒中。
根据本发明这一实施方案的一个特定优选方式，L-苏氨酸是通过如上述在合成或天然培养基中培养至少一种疏螺旋体素抗性细菌菌株而得到的，该培养基含有至少一种碳源、至少一种氮源以及合适的无机盐、生长因子等。积累的苏氨酸可以用本领域技术人员知道的任何方法加以回收。
下面的例子仅仅是示范性的，并不意在限制由附加权利要求书规定的本发明的范围。本领域的技术人员将会很清楚，在不背离本发明的精神和范围的条件下，本发明的方法中可以进行不同的修饰和变化。因此，这意味着本发明涵盖了这些修饰和变化，只要它们是在附加权利要求书和与其相等的文件的范围之内。
此处提及的所有专利和出版物都明确地引入作为参考。
实施例1：大肠杆菌菌株kat-13的制备
A、将大肠杆菌菌株ATCC21277的苏氨酸操纵子转入大肠杆菌菌株472T23的染色体中
大肠杆菌菌株ATCC21277(美国专利第3,580,810号)可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，12301parklalon Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)得到，它是氨基-β-羟戊酸(AHV)抗性株，但在最低培养基中生长时需要脯氨酸、硫胺素、异亮氨酸和甲硫氨酸。据报道ATCC21277在发酵过程中积累6.20g/L苏氨酸。ATCC21277的苏氨酸操纵子包括一种编码抗反馈酶的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因(thrA)，一种高丝氨酸激酶基因(thrB)和一种苏氨酸合酶基因(thrC)。
大肠杆菌菌株472T23保藏于USSR抗生素研究所(USSR AntibioticsResearch Institute)的USSR商业微生物保藏中心(USSR Collection ofCommercial Microorganisms)，保藏号为BKIIMB-2307，据报道它在含葡萄糖、氨、维生素B1和矿物盐的最低培养基中生长时需要苏氨酸和异亮氨酸。该菌株不能产生苏氨酸，因为它带有缺陷的thrC基因，而该基因是苏氨酸生物合成的必需基因。菌株472T23还带有缺陷的苏氨酸脱氨酶基因ilvA，它编码异亮氨酸生物合成的第一个酶。
将噬菌体培养在ATCC21277上制备噬菌体P1的裂解产物。然后用该P1裂解产物感染菌株472T23，其中少量的噬菌体颗粒携带ATCC21277的苏氨酸操纵子。感染后，通过将细菌涂布在补充0.25g/L异亮氨酸的最低培养基E(葡萄糖0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，柠檬酸·H2O 2.0g/L，K2HPO410.0g/L，NaHNH4PO4·4H2O3.5g/L，琼脂15.0g/L)的琼脂平板上，筛选合成苏氨酸的细菌。数株带有ATCC21277苏氨酸操纵子的苏氨酸原养型转导子如今能够在仅添加异亮氨酸的最低培养基平板上生长。
这些转导子是按照下面实施例2的描述，通过摇瓶发酵产生苏氨酸筛选到的。其中一个产苏氨酸的转导子G9被选作进行进一步菌株培育。
B、将带有插入的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的缺陷型苏氨酸脱氢酶(tdh-)基因转入大肠杆菌菌株G9的染色体中
菌株CGSC6945带有缺陷型苏氨酸脱氢酶基因(tdh-)，获自美国耶鲁大学的大肠杆菌基因储存中心(E.coli Genetic Stock Center，335Osborne Memorial Laboratory，生物系，耶鲁大学，New Haven，Connecticut 06520-8104，美国))，该苏氨酸脱氢酶是缺陷的，因为其中插入了氯霉素乙酰转移酶(cat)基因。为了将这个缺陷基因转入G9，在CSCG6945上培养P1噬菌体，裂解产物用来感染G9。根据下面实施例2的描述，利用摇瓶发酵筛选到几株产生苏氨酸的氯霉素抗性转导子。其中一株G909的苏氨酸产量比G9高，被选作进行进一步培育。
C、将一个非自身的启动子插入到大肠杆菌菌株G909的染色体中
为了将tac启动子转至G909染色体中，采用了线性DNA片段与一株外切核酸酶V阴性的菌株(recD)的染色体之间的同源重组。
线性DNA片段含有1.5kb的苏氨酸操纵子上游序列(5′端)，一个卡那霉素抗性标记，tac启动子序列和大约480bp的thrA基因。这个提供5′端同源区、一个选择性标记(卡那霉素抗性)、一个对苏氨酸操纵子(tac)的强且可控制的启动子和3′端同源区的片段分别是按下述方法产生的。
利用λ克隆676的DNA，将野生型大肠杆菌W3110的苏氨酸操纵子克隆到质粒pUC19上的限制酶SphI位点上。λ克隆676来自日本的Yuji Kohar博士，分子生物学系，科学院，Nagoya大学，Chikusa-ku，Nagoya，日本)。然后用SphI消化λ克隆676的DNA和pUC19。pUC19片段随后用虾碱性磷酸酶(SAP)去磷酸化并用琼脂糖凝胶纯化。来自λ克隆的6.9kb苏氨酸操纵子片段也被纯化。这两个片段随后用T4DNA连接酶连接成为质粒pAD103。
然后构建了用于同源重组的上游侧翼区和卡那霉素抗性标记。将pAD103用限制性酶BstEII、XbaI消化并用Klenow片段处理形成平端。将只含有苏氨酸操纵子5′端(上游)的1.5kb片段(而不是thr操纵子本身或它的控制区)分离并连接到来自pUC4K(Pharmacia)的卡那霉素抗性基因片段上，pUC4K用限制性酶SalI消化并用Klenow片段处理填补3′端冗余而形成中间质粒pAD106。
pAD103也用限制性酶TaqI消化并用Klenow片段处理形成平端，分离含有自身核糖体结合位点以及约480bp的thrA基因编码序列的片段，然后连接到pKK233-3片段上(Pharmacia)(pKK233-3事先经限制性酶SmaI消化并用SAP去磷酸化)得到质粒pAD115，它含有tac启动子的DNA序列、核糖体结合位点和thr基因的数百碱基。
随后pAD115用限制性酶BamHI消化，将含有所需DNA序列的0.75kb DNA片段分离出来。pAD106也用BamHI消化并用SAP去磷酸化。然后将这两个片段连接起来形成质粒pAD123，它含有苏氨酸操纵子的上游DNA序列、卡那霉素抗性标记基因、tac启动子和thrA基因起始处大约480bp。
pAD123再用SpeI和BglI消化，将含有所需DNA序列的片段分离出来。
外切核酸酶V阴性的菌株(recD)是将P1噬菌体培养在大肠杆菌菌株KW251(相关基因型：argA81：：Tn10，recD1014；来自Pharmacia)上制备的，该菌株含有recD基因，在argA上插入有一个可共转导的转座子Tn10。来自噬菌体的裂解物再用于感染菌株G9，并将四环素抗性的转导子G9T7分离出来。
将来自质粒pAD123的DNA片段用电穿孔法转入大肠杆菌G9T7。分离到一株G9T7的抗卡那霉素菌株，将P1噬菌体在该菌株上生长获得裂解物。P1噬菌体裂解物随后用于转导G909。分离到G909的一株卡那霉素抗性转导子tac3，其在摇瓶研究中存在IPTG时tac3的苏氨酸产量更高。
随后再用菌株tac3制备P1噬菌体裂解物并用于感染菌株6-8(如下所述)。筛选出卡那霉素抗性转导子，并从中分离出一株在摇瓶中比tac3的苏氨酸产量更高的菌株6-8tac3。
D利用NTG诱变且从大肠杆菌菌株G909和6-8中分离疏螺旋体素抗性突变株
按传统的方法将菌株G909细胞用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理进行诱变(50mg/L，30分钟，36℃)。将所得细胞涂布在含0.25g/L异亮氨酸和0.1％(v/v)疏螺旋体素的最低培养基E琼脂平板上。在36℃培养3-5天后，挑选平板上形成的包括菌株6-8的大菌落进行疏螺旋体素抗性和L-苏氨酸产生试验。
为试验疏螺旋体素抗性，每个菌株培养在20mL的种子培养基SM中(含32.5g/L葡萄糖；1g/L MgSO4·7H2O，24.36g/L K2HPO4，9.52g/LKH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，15g/L酵母提取物；pH7.2)36℃振荡培养17小时。收获细胞并用最低培养基E洗涤。细胞悬液再接种到含3mL最低培养基E的无菌试管中，管中分别含0、0.1、0.5或1mM疏螺旋体素。36℃振荡培养24小时后，在660nm测量光密度值以检测细胞的生长。结果以相对于不含疏螺旋体素的生长量示于下表。
  疏螺旋体素(mM)   G909   6-8
  0   100   100
  0.1   24.2   134.5
  0.5   2.9   141.0
  1   0.9   184.5
E、去除异亮氨酸需求和乳糖阻遏基因(lacI)
通过引入非自身的tac启动子和抗反馈thrA基因，thr操纵子(thrA、thrB、thrC)的表达不再受到弱化机理的控制。结果，苏氨酸生产不再需要异亮氨酸饥饿和/或ilvA-营养缺陷型标记的存在。
因此，野生型ilvA标记由转导引入6-8tac3以补偿菌株对异亮氨酸的需求，即消除细胞生长对补加异亮氨酸培养基的需求。来自CGSC7334(相关基因型：lacI42：：Tn10，lacZU118；来自E.coli Genetic StockCenter.355Osborne Memorial Laboratory，生物系，耶鲁大学，NewHaven，Connecticut 06520-8104，美国)的P1噬菌体裂解物用于感染6-8tac3，筛选出异亮氨酸生物合成阳性的转导子。在摇瓶试验中，这些转导子产生和菌株6-8tac3大约相同数量的L-苏氨酸。这些转导子中的一株，即6-8tac3ile+被选作进一步培育。
因为6-8tac3ile的苏氨酸操纵子处于tac启动子的控制之下，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对于诱导细胞完全表达thr操纵子是必需的。然而根据本发明的方法利用IPTG诱导thr操纵子的表达不是优选的。
因此，为了消除这个不必要的调节障碍，通过来自CGSC7334的P1噬菌体感染6-8tac3ile+引入了缺陷型lac阻遏基因(lacI)。产生的转导子(6-8tac3lacI-)进行了四环素抗性试验，并筛选出四环素抗性克隆。
实施例2：苏氨酸产生的摇瓶发酵研究
根据不同的大肠杆菌菌株在摇瓶发酵时的表现，测定了它们在苏氨酸产生上的差异。供试菌株生长在LB琼脂培养基上(10g/L胰蛋白胨、5g/L提取物、15g/L琼脂)。生长1-2天后，将细胞悬浮在5mL种子培养基中(葡萄糖32.5g/L、K2HPO424.35g/L、KH2PO49.5g/L、酵母提取物15g/L、(NH4)2SO425g/L、MgSO4·7H2O 1g/L)，pH7.2。种子以250转/分钟的搅拌速度，37℃培养24小时。将15mL发酵培养基(含葡萄糖40g/L、酵母提取物2g/L、柠檬酸2g/L、(NH4)2SO425g/L、MgSO4·7H2O 2.8g/L、CaCO320g/L、微量金属溶液2mL)加到种子中，37℃、搅拌速度250转/分钟继续发酵。培养后，积累在培养液中的L-苏氨酸的量用HPLC分析(ISCO和2353型泵，Rainin RI-1型分光指数检测仪，和aminex HP87-CA柱)。
每个试验菌株产生的苏氨酸的量示于下表：
  菌株   产生的L-苏氨酸(g/L)
  G909   4.95
  6-8   11.45
  tac3   12.9(由IPTG诱导)
  10.6(非诱导)
  6-8tac3ile+   12.7(由IPTG诱导)
  6-8tac3lacI-   13.9
  kat 13   14.0
例3：发酵研究
本发明的大肠杆菌菌株和它们的前体菌株通过发酵测定L-苏氨酸产量。
G909按下述条件测试。2L带挡板摇瓶中装0.5L液体培养基，其中含30g/L胰蛋白酶水解大豆液和5g/L酵母提取物，接种1.5mLG909并在摇瓶机上200转/分钟，35℃培养8.5小时。0.9mL(0.03％)成熟的种子加到含3.0L种子培养基的玻璃发酵罐中(培养基含10g/L d.s.玉米浆，0.4g/LL-异亮氨酸，2.5g/L KH2PO4，2.0g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L(NH4)2SO4，0.192g/L无水柠檬酸，0.03g/L FeSO4·7H2O，0.021MnSO4·H2O和80g/L葡萄糖)。培养按如下条件进行：前18小时温度39℃，然后调至37℃；pH6.9(通过补加NH4OH维持)；空气流量3.5升/分；开始搅拌速度500转/分钟，随后增加搅拌速度维持溶解氧(DO)在20％；反压1-2psi。以葡萄糖耗尽作为种子罐发酵完成的指示。315mL(15％)种子罐中的成熟种子加到含相同培养基(主发酵罐培养基)的玻璃发酵罐中，培养基与上述相同，除了体积为2.1L并加入0.34g/LL-苏氨酸。在下列条件下培养48小时：温度37℃，pH6.9(用NH4OH维持)，空气流量在前20小时为3.5升/分然后增加至4.0升/分，搅拌速度开始为500转/分钟，然后增加以维持DO在20％，反压1-2psi，葡萄糖水平10g/L(通过补加50％w/w葡萄糖溶液维持)。发酵在48小时后结束。G909产生下列结果：苏氨酸终浓度62.3g/L、总产量为274g，得率为23.2％。
tac3在与上述G909相同的条件下测试，除了在主发酵罐期的开始加入1mg/L的IPTG。通过添加IPTG，tac3产生终浓度为85.7g/L的苏氨酸，总产量为355g，得率为28.8％。
6-8在与上述G909相同的条件下测试。6-8产生下列结果：苏氨酸终浓度为74.1g/L，总产量为290g，得率为28.3％。
6-8tac3在与上述tac3相同的条件下测试，包括添加IPTG。6-8tac3产生下列结果：苏氨酸终浓度为99.3g/L，总产量为421g，得率为35.1％
6-8tac3ile+在与上述6-8tac3相同的条件下测试，除了在种子罐期或主发酵罐期都不需要L-异亮氨酸。由于在22.5小时时搅拌失败，只记录了在22小时的浓度(62g/L苏氨酸)。
Kat-13在与上述6-8tac3相同的条件测试，除了不加IPTG。在这些条件下，kat-13产生终浓度102g/L苏氨酸，总产量445g，得率33.1％。
所构建的菌株的相关基因型、苏氨酸发酵产生所需的添加物和记录的浓度值示干下表：
 菌株   相关的基因型 添加物   30小时的浓度   48小时的浓度   得率
 G9   ilvA- Ile   ND   ND   ND
 G909   ilvA-，tdh：：Cm Ile   53   62.3   23.2
 tac3   ilvA-，tdh：：Cm，ptacthrABC Ile，IPTG   86   85.7   28.8
 6-8   ilvA-，tdh：：Cm，Bor-R Ile   70   74.1   28.3
 6-8tac3   lvA-，tdh：：Cm，ptacthrABC，Bor-R Ile，IPTG   75   99.3   35.1
 6-8tac3ile+   tdh：：Cm，Bor-R，ptacthrABC   IPTG   62(22小时)   NA   NA
  kat 13   tdh：：Cm，Bor-R，ptacthrABC，lacI-   无   92.1   102   33.1
Bor-R：疏螺旋体素抗性
ND：未进行
NA：失败
ptacthrABC：处于tac启动子控制之下的thrA、thrB和thrC基因

Claims (23)

1、一种用于产生L-苏氨酸的方法，包括下列步骤：
(a)在培养基中培养大肠杆菌菌株，以及
(b)回收由所述大肠杆菌产生的L-苏氨酸；
其中所述大肠杆菌：
(i)在染色体上含有至少一种苏氨酸操纵子，它与至少一种非自身启动子可操纵地相连；以及
(ii)不需要任何含有一种或多种编码一种或多种苏氨酸生物合成酶基因的重组质粒用于产生苏氨酸。
2、权利要求1的方法，其中所述大肠杆菌能够在约30小时产生至少50g/L的L-苏氨酸。
3、权利要求1的方法，其中所述非自身启动子选自tac启动子、lac启动子、trp启动子、lpp启动子、PL启动子和PR启动子。
4、权利要求1的方法，其中所述的苏氨酸操纵子含有一种编码抗反馈的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶的基因。
5、根据权利要求1的方法，其中所述的大肠杆菌为菌株NRRL B-21593。
6、根据权利要求3的方法，其中所述的非自身启动子为tac启动子。
7、根据权利要求1的方法，其中所述的大肠杆菌在染色体上含有一种缺陷型苏氨酸脱氢酶基因。
8、权利要求1的方法，其中所述的苏氨酸操纵子获自ATCC 21277。
9、权利要求1的方法，其中所述的大肠杆菌为疏螺旋体素抗性。
10、权利要求1的方法，其还包括步骤：
(c)从所述染色体上去除氨基酸生物合成的调控障碍和/或营养需求。
11、一种微生物大肠杆菌的菌株，具有下列特征：
(i)它的染色体含有至少一种苏氨酸操纵子，其与至少一种非自身启动子可操纵地相连，以及
(ii)不需要任何含有一种或多种编码一种或多种苏氨酸生物合成酶基因的重组质粒用于产生苏氨酸。
12、权利要求11的菌株，其中所述的苏氨酸操纵子含有一种抗反馈的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I基因、一种高丝氨酸激酶基因、一种苏氨酸合酶基因。
13、权利要求11的菌株，其中所述的大肠杆菌为菌株NRRL B-21593。
14、根据权利要求11的菌株，其中所述的非自身启动子为tac启动子。
15、权利要求11的菌株，其中所述的大肠杆菌在染色体上含有一种缺陷型苏氨酸脱氢酶基因。
16、权利要求11的菌株，其中所述的苏氨酸操纵子来自ATCC 21277。
17、权利要求11的菌株，其中所述的大肠杆菌为疏螺旋体素抗性。
18、权利要求9的方法，其中所述的大肠杆菌能够在约30小时产生至少50g/L的L-苏氨酸。
19、权利要求9的方法，其中所述的苏氨酸操纵子含有一种编码抗反馈的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶的基因。
20、根据权利要求9的方法，其中所述的大肠杆菌为菌株NRRL B-21593。
21、根据权利要求9的方法，其中所述的非自身启动子为tac启动子。
22、一种产生权利要求11的大肠杆菌L-苏氨酸产生菌株的方法，包括步骤：
a)将至少一种苏氨酸操纵子导入大肠杆菌的染色体，和
b)将非自身启动子插入所述染色体，位置在苏氨酸操纵子的染色体位置之前且与之可操作地连接以控制其表达。
23、权利要求22的方法，其还包括步骤：c)从所述染色体移除L-苏氨酸生物合成的调控障碍和/或营养需求。
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