JP2000515763A - Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの新規株、その調製方法、およびＬ―トレオニン産生のための発酵プロセスにおけるその使用 - Google Patents
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの新規株、その調製方法、およびＬ―トレオニン産生のための発酵プロセスにおけるその使用Info
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- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
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-
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Escherichia coliの新規株、およびこれらの微生物を含む発酵プロセスに関する。より詳細には、本発明は、遺伝子改変したEscherichia coli株、およびアミノ酸、特にトレオニンのようなアスパラギン酸フアミリーのメンバーのアミノ酸の産生のためのその使用に関する。本発明はまた、アミノ酸の発酵産生における使用のためにE．coli株を調製する方法に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
Escherichia coliの新規株、その調製方法、および
L-トレオニン産生のための発酵プロセスにおけるその使用
発明の分野
本発明は、Escherichia coliの新規株、およびこれらの微生物を含む発酵プロ
セスに関する。より詳細には、本発明は、遺伝子改変したEscherichia coli株、
およびアミノ酸、特にトレオニンのようなアスパラギン酸フアミリーのメンバー
のアミノ酸の産生のためのその使用に関する。本発明はまた、アミノ酸の発酵産
生における使用のためにE．coli株を調製する方法に関する。
発明の背景
Escherichia coliにおいて、アミノ酸L-トレオニン、L-イソロイシン、L-リジ
ン、およびL-メチオニンは、以下の通常の生合成経路によって、すべてまたは一
部の炭素原子をアスパラギン酸塩（アスパラギン酸）から誘導する（G.N．Cohen
，「The common pathway to lysine，methionine and threonine」 147-171頁，Am
ino Acids:Biosynthesis and Genetic Regulation，K.M．HerrmannおよびR.L．S
omerville編，Addison-Welesley Publishing Co.，Inc.，Reading，Mass．(1983
)）：
この通常の経路の第１の反応は、３つの異なるアスパラギン酸キナーゼ（AK I
、II、またはIII）の１つによって触媒され、そのそれぞれは別々の遺伝子によ
ってコードされ、そしてその活性および合成が調節されるように他のものとは異
なる。例えば、アスパラギン酸キナーゼＩは、thrAによってコードされ、その活
性
はトレオニンによって阻害され、そしてその合成はトレオニンとイソロイシンの
組み合わせによって抑制される。しかし、AK IIは、metLによってコードされ、
そしてその合成はメチオニンによって抑制される（しかし、その活性は、メチオ
ニンによって、またはメチオニン、リジン、トレオニン、およびイソロイシンの
２つの組み合わせによって抑制されない（F.Falcoz-Kellyら，Eur．J．Biochem
．8:146-152(1969)；J.C.Patteら，Biochjm．Biophys．Acta 136:245-257(1967)
））。AK IIIはIysCによってコードされ、そしてその活性および合成は、リジン
によって、それぞれ阻害および抑制される。
２つのAK、ＩおよびIIは、異なるタンパク質ではなく、むしろそれぞれホモセ
リンデヒドロゲナーゼＩまたはIIを含む複合タンパク質のドメインであり、その
それぞれは、アスパラギン酸セミアルデヒドのホモセリンへの還元を触媒する(P
．Truffa-Bachiら，Eur．J．Biochem.5:73-80(12968)）。従って、ホモセリンデ
ヒドロゲナーゼIはまた、thrAによってコードされ、その合成はトレオニンおよ
びイソロイシンによって抑制され、そしてその活性はトレオニンによって阻害さ
れる。HD IIは同様にmetLによってコードされ、そしてその合成はメチオニンに
よって抑制される。
トレオニン生合成は、以下のさらなる反応を包含する：ホモセリン→ホモセリ
ンホスフェート→トレオニン。ホモセリンのリン酸化は、thrBによってコードさ
れる２つの同一の29kDaサブユニットからなるタンパク質であるホモセリンキナ
ーゼによって触媒され、そしてその活性はトレオニンによって阻害される（B．B
urrら，J．Biochem．62:519-526(1976)）。最終工程の、ホモセリンホスフェー
トのL-トレオニンへの複合変換は、thrCによってコードされる47kDaタンパク質
であるトレオニンシンターゼによって触媒される（C．Parsotら，Nucleic Acids
Res．11:7331-7345(1983)）。
thrA、thrB、およびthrC遺伝子はすべてE．coliの遺伝子マップの０分に位置
(1974)）。これらの遺伝子は、それぞれ、アスパラギン酸キナーゼＩ−ホモセリ
ンデヒドロゲナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、およびトレオニンシンターゼを
コードする。これらの酵素の生合成は、トレオニンおよびイソロイシンによる多
価抑制を受ける（M．Freundlich，Biochem．Biophys．Res．Commun．10:277-282
(1963)）。
調節領域は、thrオペロンの第１の構造遺伝子の上流に見られ、そしてその配
列は決定されている（J.F．Gardner，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:1706-171
0(1979)）。転写開始部位の下流のthrアテニュエーターは、リーダーペプチドを
コードする配列を含み；この配列は、８つのトレオニンコドンおよび４つのイソ
ロイシンコドンを含む。thrアテニュエーターはまた、古典的に相互排他的な二
次構造を含み、これは荷電したトレオニル-およびイソロイシル-tRNAのレベルに
依存して、thrオペロン中の構造遺伝子のRNAポリメラーゼ転写を可能にするかま
たは防止する。
天然の生合成による高レベルのアミノ酸産生を得ることに関する問題のため（
例えば、所望の産物によるthrオペロンの抑制）、フィードバック耐性酵素をコ
ードするthrA遺伝子とともにthrオペロンを含むプラスミドを有する細菌株が産
生されている。このようなプラスミドを用いて、L-トレオニンは、Brevibacteri
um flavum、Serratia marcescens、およびEscherichia coliのような広範な種々
の微生物を用いる発酵プロセスによって工業的な規模で産生されている。
例えば、E．coli BKIIM B-3996株（Debabovら，米国特許第5,175,107号）はプ
ラスミドpVIC40を含み、36時間で約85g/Lを生成する。宿主は欠損トレオニンシ
ンターゼのためにトレオニン要求株である。BKIIM B-3996では、トレオニン生合
成に必要とされる重要な酵素的活性、すなわち、フィードバック耐性AK I-HD I
、ホモセリンキナーゼ、およびトレオニンシンターゼを提供する組換えプラスミ
ドpVIC40である。このプラスミドはまた、宿主のトレオニン栄養要求性を補完す
る。
E．coli 29-4株（E．Shimizuら，Biosci．Biotech．Biochem．59:1095-1098(1
995)）は、組換えE．coliトレオニンプロデューサーの別の例である。29-4株を
、トレオニン-過剰産生変異株、E．coli K-12（βIM-4）（E．coli株ATCC 21277
に由来する）のthrオペロンを、プラスミドpBR322にクローニングすることによ
って構築し、次いで、これを親株に導入した（K．Wiwaら，Agric．Biol．Chem．
47:2329-2334(1983)）。29-4株は、72時間で約65g/LのL-トレオニンを産生す
る。
同様に構築された組換え株は、他の生物を使用して作成されている。例えば、
S．marcescens T2000株は、フィードバック耐性thrA遺伝子産物をコードするthr
オペロンを有するプラスミドを含み、そして96時間で約100g/Lのトレオニンを産
生する（M．Masudaら，Applied Biochemistry and Biotechnology 37:255-262(1
992)）。これらの株はすべて、トレオニン生合成酵素をコードする遺伝子の複数
コピーを有するプラスミドを含み、これはこれらの酵素の過剰発現を可能にする
。トレオニン生合成酵素をコードするプラスミド産生遺伝子、特にフィードバッ
ク耐性AK I-HD ＩをコードするthrA遺伝子の過剰発現は、これらの株が大量のト
レオニンを産生することを可能にする。プラスミド含有微生物の他の例は、例え
ば、米国特許第4,321,325号；第4,347,318号；第4,371,615号；第4,601,983号；
第4,757,009号；第4,945,058号；第4,946,781号；第4,980,285号；第5,153,123
号；および第5,236,831号に記載される。
しかし、これらのようなプラスミド含有株は、それらのアミノ酸の商業的発酵
産生のための有用性を限定するという問題を有する。例えば、これらの株での重
要な問題は、プラスミド含有株の統合性が、細胞増殖および分裂の間のプラスミ
ドの潜在的喪失のために、発酵プロセスを通して維持されることを確実にする。
この問題を避けるために、例えば、プラスミドにおける抗生物質耐性遺伝子を用
いることによって、培養中のプラスミドを含まない細胞を選択的に排除すること
が必要である。しかし、この溶液は、発酵培地に１つ以上の抗生物質の添加を必
要とし、これは大規模発酵のためには商業的に実際的ではない。
プラスミド含有株での別の重要な問題は、プラスミド安定性である。遺伝子が
プラスミド上にコードされる酵素の高発現は、商業的に実際的な発酵プロセスに
必要であり、しばしばプラスミド不安定性を引き起こす（E．Shimizuら，Biosci
．Biotech．Biochem．59:1095-1098(1995)）。プラスミド安定性はまた、培養温
度および培養培地中の溶存酸素のレベルのような因子に依存する。例えば、プラ
スミド含有29-4株は、より低い培養温度（30℃対37℃）およびより高いレベルの
溶存酸素でより安定であった（E．Shimizuら，Biosci．Biotech．Biochem．59:1
095-1098(1995)）。
上記の微生物より効果が少ないが、非プラスミド含有微生物はまた、トレオニ
ンプロデューサーとして使用されている。H-8460のようなE．coliの株は、一連
の従来の変異誘発およびいくつかの代謝アナログに対する耐性についての選択に
よって得られ、70時間で約75g/LのL-トレオニンを生成する（Kinoら，米国特許
第5,474,918号）。H-8460株は、組換えプラスミドを有さず、そして染色体上の
トレオニン生合成遺伝子の１つのコピーを有する。これらの非プラスミド含有株
がトレオニン生合成遺伝子の単一コピーのみを有するので、BKIIM B-3996のよう
なプラスミドを産生する株と比較して、この株のより低い生産性は、より低い酵
素活性（特にthrオペロンによってコードされるもの）によると考えられる。適
切な非プラスミド含有微生物の他の例は、例えば、米国特許第5,376,538号；第5
,342,766号；第5,264,353号：第5,217,883号；第5,188,949号；第5,164,307号；
第5,098,835号；第5,087,566号；第5,077,207号；第5,019,503号；第5,017,483
号；第4,996,147号；第4,463,094号；第4,452,890号；第3,732,144号；第3,711,
375号；第3,684,654号；第3,684,653号；第3,647,628号；第3,622,453号；第3,5
82,471号；第3,580,810号；第3,984,830号；および第3,375,173号に記載される
。
E．coliの非プラスミド含有およびプラスミド含有株の両方で、thrオペロンは
、特定の株のそれぞれの天然トレオニンプロモーターによって制御される。上記
のように、天然プロモーターの発現は、リーダーペプチドをコードし、そして多
くのトレオニンおよびイソロイシンコドンを含むDNAの領域によって制御される
アテニュエーション機構によって調製される。この領域は、トレオニニル-tRNA
およびイソロイシニル-tRNAのレベルを感知するリボソームによって翻訳される
。これらのレベルがリーダーペプチドが翻訳されるために十分である場合、転写
は早めに終結されるが、レベルがリーダーペプチドが翻訳されるために不十分で
ある場合、転写は終結されず、そしてオペロン全体が転写され、これは翻訳後、
トレオニン生合成酵素の産生の増加を生じる。従って、トレオニル-tRNAおよび
／またはイソロイシニル-tRNAレベルが低い場合、thrオペロンが最大に転写され
、そしてトレオニン生合成酵素が最大に生成される。
E．coliトレオニン産生株BKIIM B-3996では、プラスミド中のトレオニンオペ
ロンは、その天然プロモーターによって制御される。結果として、株がトレオニ
ンおよび／またはイソロイシンを枯渇される場合にのみ、thrオペロンは最大で
発現される。トレオニンの枯渇がトレオニン産生株で可能ではないので、これら
の株は、より高いレベルの酵素的活性を得るために、イソロイシンの栄養要求性
である。
アテニュエーション制御を克服する別の方法は、細胞中のトレオニル-tRNAお
よび／またはイソロイシニル-tRNAのレベルを低下させることである。例えば、
トレオニンに対して200倍減少した見かけの親和性を示すトレオニル-tRNAシンタ
ーゼを有するthrS変異体は、おそらく低レベルのトレオニル-tRNAにより、thrオ
ペロンの過剰発現を生じる（E.J．Johnsonら，J．Bacteriol．129:66-70(1977)
）。
しかし、これらの株を使用する発酵プロセスにおいて、細胞は、その欠失した
イソロイシン生合成のために、増殖期でイソロイシンを補充されなければならな
い。続いて、産生段階では、細胞は、トレオニン生合成酵素の発現を誘導するた
めにイソロイシンを取り除かれる。従って、トレオニン生合成酵素の発現を制御
するために天然トレオニンプロモーターを使用することの主な欠点は、細胞がイ
ソロイシンで補充されなければならないことである。
抗生物質ボレリジンはまた、トレオニルtRNA-シンセターゼの酵素的活性を減
少させ、そしてそれによってE．coliの増殖を阻害することが公知である（G．Na
ssら，Biochem．Biophys．Res．Commun．34:84(1969)）。この減少した活性を考
慮して、E．coliの特定のボレリジン感受性株は、高レベルのトレオニンを産生
するために用いられている（日本国特許出願公開第6752/76号；米国特許第5,264
,353号）。培養物へのボレリジンの添加は、L-トレオニンの収量を増加すること
が見出された。BrevibacteriumおよびCorynebacteriumのボレリジン感受性株も
また、高レベルのトレオニンを産生するために使用されている（日本国特許第53
-101591号）。
E．coliのボレリジン耐性変異体は、トレオニルtRNA-シンセターゼ活性の変化
を同様に示す。より詳細には、ボレリジン耐性E．coliは、以下の特徴の１つを
示すことが示されている：(i)構成的に増加したレベルの野生型トレオニルtRNA-
シンセターゼ；(ii)構造的に変化されたトレオニルtRNA-シンセターゼ；または
(iii)おそらく膜変化による、いくつかの未知の細胞変化（G．NassおよびJ．Tho
male，FEBS Lett．39:182-186(1974)）。しかし、これらの変異体株のいずれも
が、L-トレオニンの発酵産生のためには使用されていない。
上記の議論を考慮すると、トレオニンのようなアミノ酸を効率的に産生する微
生物株について当該技術分野での必要性が残ったままであるが、最先端に関連す
る問題はない。
発明の要旨
従って、本発明の目的は、高収量でL-トレオニンを効率的に産生するが、トレ
オニン生合成酵素をコードする遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要とせ
ずそして好ましくはアミノ酸栄養要求性を有さない微生物を提供することである
。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説
明に記載され、そして一部はその記載から明らかでありまたは本発明の実施によ
って学び得る。本発明のこれらの目的および利点は、本明細書の記載された説明
および請求の範囲で特に指摘された方法によって理解され達成される。
これらおよび他の目的は本発明の方法によって達成され、これは、第１の実施
態様では、L-トレオニンのようなアミノ酸を産生するためのプロセスに関し、こ
れは、培地中でE．coliの株を培養する工程、および培地からアミノ酸を回収す
る工程を包含する。このプロセスで使用されるE．coliの株は、以下の特徴を有
する：(i)非天然プロモーターの制御下の染色体上に、トレオニンオペロン（こ
れはトレオニン生合成酵素をコードする）のようなアミノ酸生合成の遺伝子決定
基を含む；および(ii)トレオニンを産生するためのトレオニン生合成酵素をコー
ドする遺伝子を含むいかなる組換えプラスミドも必要としない。
本発明の別の実施態様は、上記の特徴を有するE．coliの株の生物学的に純粋
な培養物に関する。
本発明のさらなる実施態様は、L-トレオニンのようなアミノ酸を産生するプロ
セスに関し、これは、培地中でE．coliの株を培養する工程、および培地からア
ミノ酸を回収する工程を包含し、ここでE．coliの株はボレリジンに耐性である
。
本発明のさらなる実施態様は、トレオニンのようなアミノ酸の発酵産生に有用
なE．coliの株を産生する方法に関し、これは、(a)E．coli原栄養性になるよう
にE．coli栄養要求性の染色体中にアミノ酸産生微生物からの遺伝物質を導入す
る工程；(b)その発現を制御するためにアミノ酸生合成遺伝子の染色体位置の前
の染色体に非天然プロモーターを挿入する工程；および、必要に応じて、(c)染
色体からアミノ酸生合成のためのアミノ酸栄養要求性を除去する工程および／ま
たは染色体からのアミノ酸生合成に対する妨害を調節する工程、を包含する。
上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が例示的および説明的のみで
あり、そして請求の範囲として発明のさらなる説明を提供することが意図される
ことが、理解されるべきである。
図面の簡単な説明
図１は、Koharaのλ676およびプラスミドpUC19からのプラスミドpAD103の構築
を示す。
図２は、プラスミドpAD103およびプラスミドpUC4kからのプラスミドpAD106の
構築を示す。
図３は、プラスミドpAD103およびプラスミドpkk223-3からのプラスミドpAD115
の構築を示す。
図４は、プラスミドpAD115およびプラスミドpAD106からのプラスミドpAD123の
構築を示す。
図５は、E．coliの染色体中へのプラスミドpAD123からのプロモーター領域の
組込みを示す。
発明の好ましい実施態様の詳細な説明
第１の実施態様では、本発明は、アミノ酸の産生のための発酵プロセスで使用
され得る新規細菌株に関する。本発明の新規細菌株は以下の特徴を有する：
(i)細胞は、非天然プロモーターの制御下で、染色体上に少なくとも１つのthr
オペロン（すなわち、トレオニン生合成酵素をコードする少なくとも１セットの
遺伝子）を含む；および
(ii)細胞は、トレオニンを産生するために、トレオニン生合成酵素をコードす
る任意の組換えプラスミドを必要としない。
好ましくは、本発明の株は、約30時間で少なくとも約50g/LのL-トレオニン、
より好ましくは約30時間で少なくとも約70g/L、さらにより好ましくは約30時間
で少なくとも約80g/L、および最も好ましくは約30時間で少なくとも約90g/Lを産
生し得る。好ましくは、本発明の株は、約48時間で少なくとも約90g/L、より好
ましくは約48時間で少なくとも約100g/L、および最も好ましくは約48時間で少な
くとも約110g/Lのトレオニンを産生し得る。
好ましくは、本発明の株は、少なくとも約2g/L/時間、より好ましくは少なく
とも約2.5g/L/時間、さらにより好ましくは少なくとも約3g/L/時間、および最も
好ましくは少なくとも約3.6g/L/時間の速度でL-トレオニンを産生し得る。
特に好ましい実施熊様では、新規細菌株はまた、トレオニンの発酵産生のため
のアミノ酸栄養要求性を有さない。すなわち、細胞は、増殖およびトレオニン産
生にアミノ酸補充を必要としない。
本発明に従って、本発明の細菌株は、トレオニン産生のためのトレオニン生合
成酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要とし
ない。すなわち、この株は、組換えプラスミドに含まれる遺伝子によつてコード
される１つ以上のトレオニン生合成酵素を必要とせずにトレオニンを産生し得る
。もちろん、本発明の株は、必要に応じて、所望の１つ以上の組換えプラスミド
を含み得る。例えば、このようなプラスミドはトレオニン産生に必要とされない
が、それにもかかわらず、本発明の株は、トレオニン産生を増加するために、ト
レオニン生合成酵素をコードする組換えプラスミドを含み得る。本発明の株は、
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）のような、トレオニン
生合成に関連する他の酵素をコードする組換えプラスミドを同様に含み得る。
好ましくは、本発明の細菌株は、Escherichia coliの株である。より好ましく
は、本発明の細菌株は、マクロライド抗生物質ボレリジンに対する耐性を示すE
．coliの株である。本発明の細菌株の特に好ましい例は、E．coli kat-13株であ
り、これは、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)，1815
North University Street，Peoria，Illinois 61604，USAに1996年6月28日に寄
託され、そして受託番号NRRL B-21593を与えられた。
本発明の細菌株の細胞の染色体上のトレオニン（thr）オペロンは、トレオニ
ン生合成に必要な酵素をコードする。好ましくは、トレオニンオペロンは、AK-H
D遺伝子（thrAまたはmetL）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、およびトレ
オニンシンターゼ遺伝子（thrC）からなる。より好ましくは、thrオペロンは、t
hrA（AK I-HD I遺伝子）、thrB、およびthrCからなる。適切なthrオペロンは、
例えば、E．coli ATCC 21277株およびATCC 21530株から得られ得る。ATCC 21277
株からのthrオペロンが特に好ましい。複数のコピーのthrオペロンが、染色体上
に存在し得る。
好ましくは、thrオペロンは、少なくとも１つのアテニュエートされない遺伝
子を含む。すなわち、遺伝子の発現は、１つ以上のトレオニン生合成酵素および
／またはその産物（例えば、トレオニンおよびイソロイシン）のレベル（細胞外
および／または細胞内）によって抑制されない。本発明の株はまた、欠損thrア
テニュエーターを含むthrオペロン（転写開始部位の下流および第１の構造遺伝
子の上流の調節領域）またはthrアテニュエーターを全く欠くthrオペロンを含み
得る。
本発明の特に好ましい実施態様では、thrオペロンは、１つ以上のフィードバ
ック耐性トレオニン生合成酵素をコードする。すなわち、酵素の活性は、トレオ
ニン生合成の中間体および産物の細胞外および／または細胞内レベルによって阻
害されない。最も好ましくは、thrオペロンは、フィードバック耐性AK I-HD Iの
ような、フィードバック耐性AK-HDをコードする遺伝子を含む。フィードバック
耐性AK-HDの使用は、産生されているL-トレオニンの存在下でさえも、トレオニ
ン生合成のためにより高いレベルの酵素的活性を提供する。
本発明の株における１つまたは複数のトレオニンオペロンの発現は、非天然プ
ロモーター、すなわち、天然で通常見られるE．coli細菌株においてthrオペロン
の発現を制御しないプロモーターによって制御される。トレオニン生合成酵素の
天然プロモーターを、thrオペロンの発現を制御するために強力な非天然プロモ
ーターに置換することは、thrオペロンの単一のゲノムコピーのみを用いても、
より高いトレオニン産生を生じる。さらに、非天然プロモーターがトレオニンオ
ペロンの発現を制御するために使用されるので、このより高いトレオニン産生を
達成するためにイソロイシンについて細菌株を栄養要求性にする必要がない。適
切なプロモーターの例示的な例として、lacプロモーター；trpプロモーター；λ
バクテリオファージのPLプロモーター；PRプロモーター；Ippプロモーター；お
よびtacプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の細菌株
における使用に特に好ましいものは、tacプロモーターである。
トレオニンオペロンに加えて、本発明の細菌株の細胞中の染色体はまた、好ま
しくはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）をコードする少
なくとも１つの遺伝子を含む。最も好ましくは、本発明の細胞中の染色体は、少
なくとも１つのas値伝子、少なくとも１つのthrA遺伝子、少なくとも１つのthrB
遺伝子、および少なくとも１つのthrC遺伝子を含む。染色体は、もちろん、１つ
以上のこれらの遺伝子の複数のコピーを含み得る。
トレオニンデヒドロゲナーゼ（tdh）は、L-トレオニンのα-アミノ-β-ケトブ
チレートへの酸化を触媒する。従って、特に好ましい実施態様では、本発明の細
胞の染色体は、少なくとも１つの欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ（tdh-）遺伝
子をさらに含む。欠損tdh遺伝子は、トレオニンデヒドロゲナーゼの減少した発
現レベルを有する遺伝子、または天然トレオニンデヒドロゲナーゼの活性と比較
して減少した酵素的活性を有するトレオニンデヒドロゲナーゼ変異体をコードす
る遺伝子であり得る。好ましくは、本発明の株で用いられる欠損tdh遺伝子は、
トレオニンデヒドロゲナーゼを発現しない。トレオニンデヒドロゲナーゼを発現
しない適切なtdh-遺伝子の例示的な例として、米国特許第5,175,107号に記載の
ように、それに挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
cat）遺伝子を有するtdh遺伝子またはそれに挿入されたトランスポゾンTn5を有
するtdh遺伝子が挙げられる。
本発明の細菌株は、当業者に公知および利用可能な方法および技術のいずれか
によって調製され得る。本発明の細菌株を構築するために適切な方法の例示的な
例として、NTGのような適切な薬剤を使用する変異誘発；直鎖状DNAフラグメント
を形質転換することおよび相同組換えによって媒介される、遺伝子組込み技術；
およびバクテリオファージP1によって媒介される形質導入が挙げられる。これら
の方法は、当該技術分野で周知であり、そして、例えば、J.H．Miller，Experim
ents in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Sp
ring Harbor，New York(1972)；J.H．Miller，A Short Course in Bacterial Ge
netics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yor
k(1992)；M．SingerおよびP．Berg，Genes & Genomes，University Science Boo
ks，Mill Valley，California(1991)；J．Sambrook，E.F．FritschおよびT．Man
iatis，Molecu1lar Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbo
r Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B．Kaufmanら，
Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine,CRC P
ress，Boca Raton，Florida(1995)；Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology，B.R．GlickおよびJ.E．Thompson編，CRC Press，Boca Raton，F
lorida(1993)；およびP.F．Smith-Keary，Molecular Genetics of Escherichia
coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)に記載される。
本発明の特に好ましい実施態様では、増殖のためにトレオニンを必要とするE
．coli 472T23株は、E．coli ATCC 21277株（アメリカンタイプカルチャーコレ
クション、12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USAから得られ
得る）のトレオニンオペロンを導入するためにP1-媒介形質導入を使用してトレ
オニンプロデューサーに変換され得る。このthrオペロンは、フィードバック耐
性アスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（thrA）、ホモ
セリンキナーゼ遺伝子（thrB）、およびトレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）か
らなる。
本発明の株におけるトレオニン産生を改良するために、E．coli CGSC6945株（
関連遺伝子型：tdh-1::cat1212；E．coli Genetic Stock Center，355 Osborne
Memorial Laboratory，Department of Biology，Yale University，New Haven，
Connecticut 06520-8104，USAから得られた）からの欠損トレオニンデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子は、P1形質導入によって導入され得る。得られるトレオニンプロデ
ューサーは、NTGで変異誘発することおよび／またはボレリジン耐性について選
択することによってさらに改良され得る。
kan（カナマイシン耐性をコードする）のような抗生物質耐性マーカー遺伝子
、およびPLまたはtacのような強力なプロモーター（好ましくは、thrAおよび野
生
型thrA遺伝子の数百塩基対（すなわち、thrA遺伝子全体ではない）の上流のDNA
に隣接する）を有するプラスミドが構築され、そして染色体に所望のDNAフラグ
メントを送達するためにビヒクルとして使用され得る。プラスミド上のフラグメ
ントは、適切な制限酵素での消化によって単離され、そして精製され、次いで形
質転換またはエレクトロポレーションによって株に導入され、トレオニンオペロ
ンの制御領域を除去して所望のフラグメント（すなわち、抗生物質耐性マーカー
遺伝子およびthrA遺伝子の始まりでの強力なプロモーター）での相同組換えによ
って置換され得る。次いで、このフラグメントは、P1形質導入によってボレリジ
ン耐性株に移入され得る。
好ましい宿主の株（472T23）のイソロイシン要求性は、例えば、P1形質導入を
介してマーカーの野生型対立遺伝子を導入することによって、排除され得る。他
の宿主の望ましくない栄養要求性は、類似の方法でまたは当業者に公知および利
用可能な他の方法に従って除去され得る。
本発明の第２の実施態様は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の産生のた
めの発酵プロセスにおける上記の細菌株の使用に関する。例えば、L-トレオニン
は、少なくとも１つの炭素供給源、少なくとも１つの窒素供給源、および適宜、
無機塩、増殖因子などを含む合成または天然の培地中で、本発明の細菌株を培養
することによって得られる。
適切な炭素供給源の例示的な例として、炭水化物（例えば、グルコース、フル
クトース、スクロース、スターチ加水分解物、セルロース加水分解物、および糖
蜜）；有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およ
びフマル酸）；およびアルコール（例えば、グリセロール）が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
適切な窒素源の例示的な例として、アンモニア（アンモニアガスおよびアンモ
ニア水溶液を含む）；無機または有機酸のアンモニウム塩（例えば、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム）；
および他の窒素含有物（肉エキス、ペプトン、コーン浸出液、カゼイン加水分解
物、ダイズケーキ加水分解物、および酵母エキスを含む）が挙げられるが、これ
らに限定されない。
培養後、培養ブロス中に蓄積されたL-トレオニンは、公知の方法のいずれかに
従って、例えば、米国特許第5,342,766号に記載されるようなイオン交換樹脂の
使用によって、分離され得る。この方法は、最初に遠心分離によって培養ブロス
から微生物を除去する工程、および次に塩酸を使用してブロスのpHを約２に調節
する工程を包含する。酸性化した溶液を、続いて強い酸性カチオン交換樹脂に通
し、そして吸着剤を希釈アンモニア水溶液を使用して溶出する。アンモニアを、
真空下でのエバポレーションによって除去し、そして得られる溶液を濃縮する。
アルコールの添加およびその後の冷却によってL-トレオニンの結晶を得る。
アスパラギン酸ファミリーの他のアミノ酸は、上の詳細に記載された方法と類
似の方法によって産生され得る。例えば、イソロイシンは、染色体上またはプラ
スミド上に、増幅されたilvA遺伝子またはtdc遺伝子（その両方とも、トレオニ
ンのイソロイシンへの生物変換に関連する最初の酵素であるトレオニンデアミナ
ーゼをコードする）を含む本発明の細菌株から調製され得る。例えば、フィード
バック耐性酵素をコードするilvA遺伝子の使用によるこの遺伝子の増幅は、イソ
ロイシンの生合成を増加させる。
同様に、メチオニンは、染色体上に少なくとも１つのmetオペロン（すなわち
、metL遺伝子（AK II-HD IIをコードする）、metA遺伝子（ホモセリンスクシニ
ルトランスフェラーゼ）、metB遺伝子（シスタチオニンγ-シンターゼ）、metC
遺伝子（シスタチオニンβ-リアーゼ）、ならびにmetEおよびmetH遺伝子（ホモ
システインメチラーゼ））を含むE．coliのような微生物によって調製され得る
。これらの遺伝子（そのフィードバック耐性改変体を含む）および必要に応じて
非天然プロモーターは、上記のおよび／または当業者に公知の１つ以上の一般的
な方法に従って宿主微生物の染色体に導入され得る。同様に、リジンは、リジン
生合成酵素（好ましくは、lysCおよび／またはdapAによってコードされるフィー
ドバック耐性リジン生合成酵素）、および必要に応じて非天然プロモーターをコ
ードする遺伝子を含む微生物によって調製され得る。
本発明の第３の実施態様は、L-トレオニンの産生のための発酵プロセスにおけ
るボレリジン耐性細菌株の使用に関する。好ましくは、ボレリジン耐性株は、E
．coli株の変異体である。このような変異体の特に好ましい実施態様は、E．col
i
kat-13株であり、これはAgricultural Research Service Culture Collection(N
RRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，USAに1996年6
月28日に寄託され、そして受託番号NRRL B-21593が与えられた。
ボレリジン耐性は、当業者に公知の任意の利用可能な方法によって決定され得
る。例えば、ボレリジン耐性株は、G．NassおよびJ．Thomale，FEBS Lett．39:1
82-186(1974)に記載のように、約139μＭボレリジンを含む最少培地に候補株を
プレーティングすることによって単離され得る。さらに、ある株におけるボレリ
ジン耐性は、細胞の１つ以上の表現型特徴の変化として現れる。例えば、E．col
i株6-8およびその誘導体のボレリジン耐性変異体は、桿状よりもむしろ円形のよ
うである。このような場合では、表現型特徴の変化の証拠は、ボレリジン耐性株
を適切に同定するために十分であり得る。
本発明のこの実施態様に有用なボレリジン耐性変異体は、トレオニンを産生し
得る。トレオニン生合成酵素をコードする遺伝子は、染色体上に存在し得るかま
たはプラスミドもしくはその混合物に含まれ得る。これらの遺伝子の複数コピー
もまた存在し得る。好ましくは、トレオニン生合成酵素をコードする遺伝子は、
アテニュエーション制御に耐性であり、および／またはフィードバック耐性酵素
をコードする。
上記のように、本発明のボレリジン耐性株は、所望のように１つ以上の組換え
プラスミドを含み得る。例えば、本発明の微生物は、トレオニン生合成酵素をコ
ードする組換えプラスミドを含み得る。本発明の細菌株は、同様に、アスパラギ
ン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）または増殖を増大させるための酵
素のような、トレオニン生合成に関連する他の酵素をコードする組換えプラスミ
ドを含み得る。
さらに、当業者に公知および利用可能な任意の方法および技術を使用して、例
えば、トレオニン産生を増加させる、栄養要求性を除去するなどのために、ボレ
リジン耐性株は所望のように改変され得る。ボレリジン耐性E．coli変異体およ
び改変体を改変するために適切な方法の例示的な例として：紫外線もしくはＸ線
での照射による、またはニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソ
グアニジン）、メチルメタンスルホネート、ナイトロジェンマスタードなどのよ
うな化学的変異原での処理による変異誘発；直鎖状DNAフラグメントおよび相同
組換えを形質転換することによって媒介されるような遺伝子組込み技術；および
P1のようなバクテリオファージによって媒介される形質導入が挙げられるが、こ
れらに限定されない。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、そして、例
えば、J.H．Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1972)；J.H．Miller，A Sho
rt Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Co
ld Spring Harbor，New York(1992)；M．SingerおよびP．Berg，Genes & Genome
s，University Science Books，Mill Valley，California(1991)；J．Sambrook
，E.F．FritschおよびT．Maniatis，Molecular Clonjng:A Laboratory Manual，
第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York
(1989)；P.B．Kaufmanら，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Bi
ology and Medicine，CRC Press，Baca Raton，Florida(1995)；Methods in Pla
nt Molecular Biology and Biotechnology，B.R．GlickおよびJ.E．Thompson編
，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)；およびP.F．Smith-Keary，Molecula
r Genetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)に
記載される。
好ましくは、本発明のボレリジン耐性変異体は、これらの遺伝子が染色体上に
あるかおよび／またはプラスミドに含まれるかどうかにかかわりなく、トレオニ
ン生合成酵素をコードする１つ以上の遺伝子の上流に、およびその遺伝子への作
動可能な連結で、非天然プロモーターを含むように改変される。
本発明のこの実施態様の特に好ましい態様に従って、L-トレオニンは、上記の
ように、少なくとも１つの炭素供給源、少なくとも１つの窒素供給源、および適
宜、無機塩、増殖因子などを含む合成または天然の培地中で、少なくとも１つの
ボレリジン耐性細菌株を培養することによって得られる。蓄積されたトレオニン
は、当業者に公知の任意の方法によって回収され得る。
以下の実施例は、例示するのみであって、添付の請求の範囲に定義されるよう
に本発明の範囲を限定することを意図しない。種々の改変および変更が、本発明
の精神および範囲から逸脱することなく本発明の方法で作成され得ることは、当
業者に明らかである。従って、本発明が、添付の請求の範囲およびその等価物の
範囲内であるならば、本発明の改変および変更を網羅することが意図される。
本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、特に、参考として援用
される。
実施例１：E．coli kat-13株の調製
Ａ．E．coli 472T23株の染色体へのE．coli ATCC 21277株のトレオニンオペロ
ンの転移
アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Drive，Rockvill
e，Maryland 20852，USAから入手可能なE．coli ATCC 21277株（米国特許第3,58
0,810号）は、アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸（AHV）耐性であるが、最少培地中で
増殖するためにプロリン、チアミン、イソロイシン、メチオニンを必要とする。
ATCC 21277は、発酵プロセスにおいて6.20g/Lのトレオニンを蓄積すると報告さ
れている。ATCC 21277のトレオニンオペロンは、フィードバック耐性酵素をコー
ドするアスパラギン酸キナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ遺伝子（thrA
）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、およびトレオニンシンターゼ遺伝子（
thrC）からなる。
登録番号BKIIM B-2307としてUSSR Antibiotics Research InstituteでのUSSR
Collection of Commercial Microorganismsに寄託される、E．coli 472T23株は
、グルコース、アンモニア、ビタミンBl、およびミネラル塩を含む最少培地中で
増殖するためにトレオニンおよびイソロイシンを必要とすると報告される。この
株は、トレオニン生合成に必須な遺伝子である欠損thrC遺伝子を有するので、ト
レオニンを産生し得ない。472T23株はまた、イソロイシン生合成における最初の
酵素をコードする欠損トレオニンデアミナーゼ遺伝子ilvAを有する。
バクテリオファージP1溶解物を、ATCC 21277でファージを増殖することによっ
て調製した。次いで、472T23株を、その中に少数のファージ粒子がATCC 21277の
トレオニンオペロンを有するこのP1溶解物で感染させた。感染後、トレオニンを
合成する細菌を、0.25g/Lのイソロイシンを補充した最少培地Ｅ［グルコース0.0
5g/L；MgSO4・7H2O 0.2g/L；クエン酸・H2O 2.0g/L；K2HPO4 10.0g/L；NaHNH4PO
4・
4H2O 3.5g/L；寒天15.0g/L］寒天プレート上に播種することによって選択した
。ATCC 21277のトレオニンオペロンを有するいくつかのトレオニン原栄養性形質
導入体は、現在、イソロイシンのみを補充した最少プレート中で増殖し得た。
これらの形質導入体を、以下の実施例２に記載されるように、トレオニン産生
のために振盪フラスコ発酵によってスクリーニングした。トレオニンを産生する
これらの１つであるG9を、さらなる株の開発のために選択した。
Ｂ．E．coli G9株の染色体へのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（cat）遺伝子とともに挿入された欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ（tdh-
）遺伝子の導入
欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子（tdh-）を有するCGSC6945株を、E．c
oli Genetic Stock Center，355 Osborne Memorial Laboratory，Department of
Biology,Yale University，New Haven，Connecticut 06520-8104,USAから得た
。トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（cat）遺伝子がこれに挿入されるので、欠損性である。この欠損
遺伝子をG9に転移するために、P1ファージをCSCG6945で増殖し、そして溶解物を
G9を感染させるために使用した。G9のいくつかのクロラムフェニコール耐性形質
導入体を選択し、そして以下の実施例２に記載されるように振盪フラスコ発酵で
トレオニン産生について選択およびスクリーニングした。G9よりも高いトレオニ
ンカ価を有するこれらの１つであるG909を、さらなる開発のために選択した。
Ｃ．E．coli G909株の染色体への非天然プロモーターの挿入
G909の染色体へtacプロモーターを送達するために、線状DNAフラグメントとエ
キソヌクレアーゼＶマイナス株（recD）の染色体との間の相同組換えを用いた。
線状DNAフラグメントは、トレオニンオペロンの上流（5'末端）の1.5kbの配列
、カナマイシン耐性マーカー、tacプロモーター配列、および約480bpのthrA遺伝
子を含んだ。それぞれ、5'末端相同性、選択マーカー（カナマイシン耐性）、ト
レオニンオペロン（tac）への強力および制御可能なプロモーター、ならびに3'
末端相同性を提供するこのフラグメントを、以下のように生成した。
野生型E．coli W3110のトレオニンオペロンを、Dr．Yuju Kohara，Department
of Molecular Biology，School of Sclence，Nagoya University，Chikusa-ku
，
Nagoya，Japanからのλクローン676のDNAを使用することによって、プラスミドp
UC19の制限酵素SphI部位へクローニングした。次いで、λクローン676およびpUC
19のDNAを、SphIで消化した。続いて、pUC19フラグメントを、エビアルカリホス
ファターゼ（SAP）で脱リン酸化し、そしてアガロースゲル精製した。λクロー
ンからのトレオニンオペロンの6.9kbフラグメントもまた精製した。続いて、こ
れらの２つのフラグメントを、T4 DNAリガーゼによって連結し、プラスミドpAD1
03を生成した。
次いで、相同組換えおよびカナマイシン耐性マーカーについての上流隣接領域
を構築した。pAD103を、制限酵素BstEII、XbaIで消化し、クレノウフラグメント
処理で平滑末端にした。トレオニンオペロンの5'末端（上流）のみ（しかしthr
オペロン自体でもその制御領域でもない）を含む1.5kbフラグメントを単離し、
そしてpUC4K（Pharmacia）からのカナマイシン耐性遺伝子のフラグメントに連結
し、これを、制限酵素SalIで消化し、そして3'突出を満たすようにクレノウフラ
グメント処理し、中間体プラスミドpAD106を生成した。
pAD103もまた制限酵素Taq1で消化し、そしてクレノウフラグメント処理で平滑
末端にした。天然リボソーム結合部位およびthrA遺伝子の約480bpのコード配列
を含むフラグメントを単離し、次いでpKK233-3（Pharmacia）のフラグメントに
連結した。これは、プラスミドpAD115を得るために制限酵素SmaIで消化およびSA
Pで脱リン酸化され、tacプロモーターのDNA配列、リボソーム結合部位、および
数百塩基のthrA遺伝子を含んでいる。
続いて、pAD115を制限酵素BamHiで消化し、そして所望のDNA配列を含む0.75kb
のDNAフラグメントを単離した。pAD106もまたBamHIで消化し、次いでSAPで脱リ
ン酸化した。次いで、２つのフラグメントを連結してプラスミドpAD123を提供し
た。これは、トレオニンオペロンの上流のDNA配列、カナマイシン耐性マーカー
遺伝子、tacプロモーター、およびthrA遺伝子の始めの約480bpを含んだ。
次いで、pAD123をSpeＬBgllで消化し、そして所望のDNA配列を含むフラグメン
トを単離した。
エキソヌクレアーゼＶマイナス株（recD）を、argA中の同時形質導入可能なト
ランスポゾンTn10挿入とともにrec遺伝子を含むE．coli KW251株（関連遺伝子
型：argA81::Tn10,recD1014；Pharmaciaから得られた）でP1ファージを増殖する
ことによって調製した。次いで、ファージから調製された溶解物を使用して、G9
株を感染させ、そしてテトラサイクリン耐性形質導入体G9T7を単離した。
プラスミドpAD123からのDNAフラグメントを、エレクトロポレーションによっ
てE．coliG9T7株へ送達した。G9T7のカナマイシン耐性株を単離し、そしてP1フ
ァージ溶解物を、この株でファージを増殖することによって作成した。次いで、
P1ファージ溶解物を使用して、G909を形質導入した。G909のカナマイシン耐性形
質導入体の１つであるtac3は、振盪フラスコ研究においてIPTGの存在下でより高
いトレオニン力価を示し、これを単離した。
続いて、P1ファージ溶解物をtac3株で調製し、次いで6-8株を感染させるため
に使用した（以下に記載される）。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、そし
てそれらの１つである6-8tac3株（これは、振盪フラスコ研究でtac3よりもさら
に高い力価を生じた）を単離した。
Ｄ．E．coli G909株および6-8からのNTG変異誘発ならびにボレリジン耐性変異
体の単離
G909株の細胞を、従来の方法を使用してN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグア
ニジン（NTG）処理（50mg/L、30分、36℃）によって変異誘発した。次いで、得
られる細胞を、0.25g/LのL-イソロイシンおよび0.1％v/vのボレリジンを含む最
少培地Ｅ寒天プレート上に播種した。36℃にて3〜5日間のインキュベーション後
、6-8株を含む、プレート上に形成した大きなコロニーを、ボレリジン耐性およ
びL-トレオニン産生の試験のために選択した。
ボレリジン耐性について試験するために、各株を、20mlの種培地SM［32.5g/L
グルコース；1g/LMgSO4・7H2O；24.36g/L K2HPO4；9.52g/L KH2PO4；5g/L（NH4)2
SO4；15g/L酵母エキス；pH 7.2］中で36℃にて17時間振盪しながら培養した。
細胞を回収し、そして最少培地Ｅで洗浄した。次いで、細胞懸濁液を、3mlの最
少培地Ｅおよび0、0.1，0.5、または１mMボレリジンを含む滅菌管に接種した。
振盪しながら36℃にて24時間の培養後、増殖を660nmでの吸光度を測定すること
によって決定した。結果を、ボレリジンの非存在下での増殖と比較して以下に示
す。
Ｅ．イソロイシン要求性およびラクトースリプレッサー遺伝子（IacI）の除去
非天然tacプロモーターおよびフィードバック耐性thrA遺伝子を導入すること
によって、thrオペロン（thrA，thrB，thrC）の発現は、もはやアテニュエーシ
ョン機構によって制御されない。結果として、イソロイシンの枯渇および／また
はilvA-栄養要求性マーカーの存在は、もはやトレオニン産生を必要としない。
従って、野生型ilvAマーカーを、株のイソロイシン要求性を固定するために、
すなわち、細胞増殖のためのイソロイシン補充培地の必要性を排除するために、
6-8tac3への形質導入によって導入した。CGSC7334（関連遺伝子型：lacI42::Tn1
0，IacZU118；E．coli Genetic Stock Center，355 Osborne Memorial Laborato
ry，Department of Biology，Yale University，New Haven，Connecticut 06520
-8104，USAから得られた）から作成されたP1ファージ溶解物を使用して6-8tac3
を感染させ、そしてイソロイシン生合成にポジティブな形質導入体を選択した。
これらの形質導入体は、振盪フラスコ研究で、6-8tac3株とほぼ同じ量のL-トレ
オニンを産生した。これらの形質導入体の１つである6-8tac3ile＋を、さらなる
開発のために選択した。
6-8tac3ileのトレオニンオペロンがtacプロモーターの制御下にあるので、イ
ソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）は、thrオペロンを完全に発現する
ために細胞を誘導することが必要であった。しかし、thrオペロンの発現を誘導
するためのIPTGの使用は、本発明の方法ではあまり好ましくない。
従って、この不必要な調節障害を排除するために、欠損Iacリプレッサー（Iac
I）遺伝子を、CGSC7334から作成したPlファージでの6-8tac3ile＋の感染によっ
て導入する。得られた形質導入体(6-8tac3lacI-)を、テトラサイクリンに対する
耐性について試験し、そしてテトラサイクリン耐性コロニーを選択した。
実施例２：トレオニン産生の振盪フラスコ発酵研究
種々のE．coli株間のトレオニン産生の比較を、振盪フラスコ発酵におけるそ
れらの性能によって決定した。試験した株をLB寒天培地［10g/Lのトリプトン、5
g/Lのエキス、15g/L寒天］上で増殖した。１〜２日の増殖後、細胞をpH7.2での5
mlの種培地［デキストロース32.5g/L；K2HPO4 24.35g/L；KH2PO4 9.5g/L；酵母
エキス15g/L；(NH4)2SO4 5g/L；MgSO4・7H2O 1g/L］に懸濁した。種を、37℃に
て250rpmの撹拌速度で24時間増殖した。次いで、15mlの発酵培地［デキストロー
ス40g/L；酵母エキス2g/L；クエン酸2g/L；(NH4)2SO4 25g/L；MgSO4・7H2O 2.8g
/L；CaCO3 20g/L；微量金属溶液2mL］をpH7.2で種に添加し、そして発酵プロセ
スを250rpmの撹拌速度で37℃にて行った。培養後、培養ブロス中に蓄積したL-ト
レオニンの量をHPLC（ISCO Model 2353ボンプ、Rainin Model RI-1屈折インデッ
クス検出器、およびaminex Hp87-CAカラム）によって分析した。
試験した株のそれぞれによって産生されたL-トレオニンの量を以下に示す。
実施例３：発酵研究
本発明のE．coli株およびその前駆体株を、発酵によるL-トレオニン産生につ
いて試験した。
G909を、以下の条件下で試験した。2Lの遮断振盪フラスコ中の30g/Lのトリプ
シン処理ダイズブロスおよび5g/Lの酵母エキスを含む0.5Lの水性培養培地を1.5m
LのG909で接種し、そして35℃および200rpmにて8.5時間振盪器でインキュベート
した。0.9mL（0.03％）の成熟接種物を、3.0Lの種発酵培地［10g/Ld.s.のコーン
浸出液、0.4g/LのL-イソロイシン、2.5g/LのKH2PO4、2.0g/LのMgSO4・7H2O、0.5
g/Lの(NH4)2SO4、0.192g/Lの無水クエン酸、0.03g/LのFeSO4・7H2O、0.021g/Lの
MnSO4・H2O、および80g/Lのデキストロース］を含むガラス発酵槽に添加した。イ
ンキュベーションを、以下の条件下で行った：最初の18時間は39℃、次いで継続
中は37℃の温度；6.9のpH（NH4OHの添加によって維持した）；3.5LPMの空気流;
最初に500rpmの撹拌、次いでこれを20％でDOを維持するように増加した；ならび
に１〜２psiの逆圧。種発酵段階の完了を、デキストロースの枯渇によって決定
した。種発酵槽からの315mL（15％）の成熟接種物を、以下を除く上述と同じ培
地（主発酵培地）を含むガラス発酵槽に添加した：容量は2.1Lでありそして0.34
g/LのL-イソロイシンを添加した。インキュベーションを、以下の条件下で48時
間行った：37℃の温度；6.9のpH（NH4OHで維持した）；20時間まで3.5LPMの空気
流、次いで4.0LPMまで増加した；最初に500rpmの撹拌、次いでこれを20％でDOを
維持するように増加した；１〜２psiの逆圧；ならびに10g/Lのデキストロースレ
ベル（50％w/wデキストロース溶液を供給することによって維持した）。発酵を4
8時間後に終了した。G909は以下の結果を生じた：274gの総生産性および23.2％
の収率での62.3g/Lのトレオニンの最終力価。
tac3を、以下を除く上記のG909と同じ条件下で試験した：1mg/LのIPTGを主発
酵段階の開始で添加した。IPTGの添加で、tac3は、355gの総生産性および28.8％
の収率での85.7g/Lのトレオニンの最終力価を生じた。
6-8を、上記のG909と同じ条件下で試験した。6-8は以下の結果を生じた：290g
の総生産性および28.3％の収率での74.1g/Lのトレオニンの最終力価。
6-8tac3を、IPTGの添加を含む、上記のtac3と同じ条件下で試験した。6-8tac3
は以下の結果を生じた：421gの総生産性および35.1％の収率での99.3g/Lのトレ
オニンの最終力価。
6-8tac3ile＋を、以下を除く上記の6-8tac3と同じ条件下で試験した：種発酵
段階または主発酵段階のいずれかでL-イソロイシンを必要としなかった。22.5時
間では撹拌不足のため、22時間での力価のみを記録した（62g/Lトレオニン）。
kat-13を、以下を除く上記の6-8tac3と同じ条件下で試験した：IPTGを添加し
なかった。これらの条件下で、kat-13は、445gの総生産性および33.1％の収率で
の102g/Lのトレオニンの最終力価を生じた。
構築された株の関連遺伝子型、トレオニンの発酵的産生に必要とされる補充物
、および記録された力価を、以下の表に示す：
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｐ 13/08
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ
Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ
，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ
Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ
，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 スウィシャー，スタシア エル.
アメリカ合衆国 イリノイ 62526，デカ
ター，イー．ハインスデイル アベニュー
1643
(72)発明者 リウ，ハンミン ジェイムス
アメリカ合衆国 イリノイ 61821，シャ
ンパイン，ガレン ドライブ 1013
(72)発明者 ハンケ，ポール ディー.
アメリカ合衆国 イリノイ 61801，ウル
バナ，ノース アベイ 309
(72)発明者 ビンダー，トーマス ピー.
アメリカ合衆国 イリノイ 62522，デカ
ター，ウエスト パッカード 2323
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．L-トレオニンを産生するためのプロセスであって、以下の工程： (a)培地中でE．coliの株を培養する工程；および (b)該E．coliによって産生されるL-トレオニンを回収する工程； を包含し、 ここで、該E．coliの株が、 (i)少なくとも１つの非天然プロモーターと作動可能に連結される少なくと も１つのトレオニン（thr）オペロンを染色体上に含み；そして (ii)トレオニンを産生するために１つ以上のトレオニン生合成酵素をコード する１つ以上の遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要としない、プロセス 。 ２．前記E．coliが、約30時間で少なくとも約50g/LのL-トレオニンを産生し得 る、請求項１に記載のプロセス。 ３．前記非天然プロモーターが、tacプロモーター、Iacプロモーター、trpプ ロモーター、Ippプロモーター、PLプロモーター、およびPRプロモーターからな る群より選択される、請求項１に記載のプロセス。 ４．前記トレオニンオペロンが、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ −ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、請求項１に記載のプ ロセス。 ５．前記E．coliがkat-13株である、請求項１に記載のプロセス。 ６．前記非天然プロモーターがtacプロモーターである、請求項３に記載のプ ロセス。 ７．前記E．coliが、染色体上に欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含 む、請求項１に記載のプロセス。 ８．前記トレオニンオペロンが、ATCC 21277から得られる、請求項１に記載の プロセス。 ９．前記E．coliがボレリジン耐性である、請求項１に記載のプロセス。 １０．１つ以上のアミノ酸の生合成酵素をコードする組換えプラスミドを有さ ないE．coliのアミノ酸産生株を産生する方法であって、以下の工程： (a)E．coli株の染色体にアミノ酸産生微生物からの遺伝物質を導入する工程； (b)その発現を制御するために、アミノ酸生合成遺伝子の染色体配置の前にそ して該遺伝子と作動可能に連結して、該染色体に非天然プロモーターを挿入する 工程；および (c)必要に応じて、該染色体から、アミノ酸生合成に対する調節妨害物および ／またはアミノ酸生合成のための栄養必要物を除去する工程、 を包含する、方法。 １１．以下の特徴： (i)その染色体が、少なくとも１つの非天然プロモーターと作動可能に連結さ れる少なくとも１つのトレオニン（thr）オペロンを含み；そして (ii)トレオニンを産生するために、１つ以上のトレオニン生合成酵素をコード する１つ以上の遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要としない、 を有する微生物E．coliの株。 １２．前記トレオニンオペロンが、フィードバック耐性アスパラギン酸キナー ゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩ遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ（th rB）遺伝子、トレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）からなる、請求項１１に記載 の株。 １３．前記E．coliがkat-13株である、請求項１１に記載の株。 １４．前記非天然プロモーターがtacプロモーターである、請求項１１に記載 の株。 １５．前記E．coliが、染色体上に欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を 含む、請求項１１に記載の株。 １６．前記トレオニンオペロンが、ATCC 21277から得られる、請求項１１に記 載の株。 １７．前記E．coliがボレリジン耐性である、請求項１１に記載の株。 １８．前記E．coliがNRRL B-21593株の特徴を有する、請求項１１に記載の株 。 １９．L-トレオニンを産生するためのプロセスであって、以下の工程： (a)培地中でボレリジン耐性E．coliの株を培養する工程；および (b)該E．coliによって産生されるL-トレオニンを回収する工程、 を包含する、プロセス。 ２０．前記E．coliが、約30時間で少なくとも約50g/LのL-トレオニンを産生し 得る、請求項１９に記載のプロセス。 ２１．前記E．coliが、少なくとも１つの非天然プロモーターと作動可能に連 結される少なくとも１つのトレオニン（thr）オペロンを含む、請求項１９に記 載のプロセス。 ２２．前記トレオニンオペロンが、フィードバック耐性アスパラギン酸キナー ゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、請求項２１に記載 のプロセス。 ２３．前記E．coliがkat-13株である、請求項１９に記載のプロセス。 ２４．前記非天然プロモーターがtacプロモーターである、請求項２１に記載 のプロセス。
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