DE69219775T3

DE69219775T3 - Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin

Info

Publication number: DE69219775T3
Application number: DE1992619775
Authority: DE
Inventors: Vladimir Georgievich Vnhgenetika Debabov; Uri Ivanovich Vnhgenetika Kozlov; Evgenyi Moiseevich Vnhgentika Khurges; Vytalyi Arkadievich Vnhgenetika Lifshits; Nelli Isaakovna Vnhgentika Zhdanova; Michail Markovich Vmhgenetika Gusyatiner; Alexander Konstantinovich Vnhgentik Sokolov; Tatiana Alexandrovna Vnhgenetika Bachina; Andrei Yurevich Vnhgenetika Chistoserdov; Uri Dmitrievich Vnhgenetika Tsigankov; Nikolai Kazimirovich Vnhgenetika Yankovsky; Sergei Vladimirovich Vnhgenetika Mashko; Alla Lvovna Vnhgenetika Lapidus; Oksana Fedorovna Vnhgenetika Gavrilova; Oleg Alexandrovich Vnhgenetika Rodionov
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-10-14
Filing date: 1992-10-14
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2012-10-15
Also published as: EP0593792A1; EP0593792B2; EP0593792B1; DE69219775T2; DE69219775D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus und ein neues mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Threonin. L-Threonin ist eine essentielle Aminosäure, die in verschiedenen Nahrungsmitteln und medizinischen Zusammensetzungen verwendet wird. Darüber hinaus ist Threonin ein wichtiges Additiv zu Tierfutter, ein wertvolles Reagenz, das in der pharmazeutischen und chemischen Industrie verwendet wird, und ein Wachstumsfaktor für Aminosäuren bildende Mikroorganismen, die für die Herstellung z. B. von Lysin und Homoserin verwendet werden.
Stand der Technik
Vor der vorliegenden Erfindung wurden natürliche Stämme von L-Threonin bildenden Mikroorganismen und künstliche Mutanten davon verwendet, um fermentativ L-Threonin herzustellen. Es sind L-Threonin bildende künstliche Mutanten bekannt, die zu den Gattungen Escherichia, Serratia, Brevibacterium und Corynebacterium gehören, und die meisten davon sind resistent gegenüber a-Amino-β-hydroxyvaleriansäure. Im Hinblick auf die Gattung Escherichia sind Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung eines Stammes, der mit rekombinanter Plasmid-DNA, die ein Threoninoperon umfaßt, transformiert ist, in den japanischen Offenlegungsschriften 55-131397, 59-31691 und 56-15696 sowie in der offengelegten PCT-Anmeldung 90-04636 angegeben.
Primäre Kohlenstoffquellen, die zu den Fermentationsmedien für diese L-Threonin bildenden Mikroorganismen gegeben werden, umfassen Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysat und Melasse. Bezogen auf (1) das Ausmaß der Threonin-Biosynthese und (2) den Aufwandskoeffizienten, definiert als der Wert (in g) an Zucker, der zur Herstellung von 1 g L-Threonin erforderlich ist, ist der E. coli-Stamm BKIIM B-3996 (nachstehend "Stamm B-3996" oder "B-3996") der beste der beschriebenen Stämme (offengelegte PCT-Anmeldung 90-04636). Der Stamm B-3996 kann bis zu 85 g/l Threonin bei einem Aufwandskoeffizienten von 2 g Zucker pro 1 g Threonin synthetisieren, sofern ein Zucker-Ammonium-Gemisch zu dem Nährmedium gegeben wird (und zwar in Abhängigkeit von einem Signal eines pH-Fühlers, der in einem Standardlaborfermenter während der Kultivierung verwendet wird).
Die meisten Stämme, die zur Herstellung von L-Threonin verwendet werden, wie E. coli BKIIM B-3996, sind jedoch L-Isoleucin-auxotroph. Es besteht also ein Defekt bei einem Enzym aus dem Stoffwechselweg von L-Threonin zu L-Isoleucin. Dementsprechend muß L-Isoleucin zu Kulturen von L-Threonin bildenden Stämmen gegeben werden. Die L-Isoleucin-Auxotrophie bei L-Threonin bildenden Stämmen verhindert (1) die Bildung von Isoleucin als Nebenprodukt, was die L-Threonin-Anreicherung verringert, und (2) die Überschußbildung von L-Isoleucin, was die Expression des/der Threoninoperons über den entsprechenden Attenuator supprimiert.
Bei Verwendung eines derartigen Isoleucin-abhängigen Stamms ist die strikte Kontrolle der Menge an Isoleucin, die in das Medium gegeben wird, erforderlich, da das Wachstum des Stamms und die Threoninproduktivität in ein ausgewogenes Verhältnis gebracht werden müssen. Je mehr Isoleucin zu dem Medium gegeben wird, um so stärker wächst der Stamm. Die Threoninproduktivität wird jedoch gleichzeitig auf inverse Weise reprimiert.
In dieser Hinsicht erfordert der Stamm B-3996 Isoleucin (bekannt als "undichter Typ"), und als Folge zeigt er eine geringe Produktivität für L-Threonin in Medien, die Melasse sowohl als Kohlenstoffquelle als auch als Energiequelle enthalten. Melasse ist ein Nichtnährstoff-Rohmaterial, das wesentlich billiger als Saccharose ist, das jedoch auch eine große Menge an Aminosäuren enthält (z. B. Isoleucin). Obwohl es also auf diesem Gebiet sehr günstig ist, Melasse sowohl als Kohlenstoffquelle als auch als Energiequelle zu verwenden, supprimiert das in der Melasse vorhandene Isoleucin die Bildung von L-Threonin bei L-Threonin bildenden Bakterien.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dementsprechend darin, einen neuen Mikroorganismus, der eine hohe Konzentration an Threonin bildet, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung dieses Mikroorganismus bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der beigefügten Patentansprüche gelöst. Als prokariotische Zellen werden Zellen, die zu den Gattungen Escherichia, Serratia, Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, bevorzugt. Zellen, die zur Gattung Escherichia coli gehören, sind am stärksten bevorzugt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren für die fermentative Herstellung von Threonin bereitzustellen, bei dem ein Mikroorganismus eine hohe Konzentration an Threonin in einem Medium, das Melasse als ein Rohmaterial enthält, bildet.
Diese und weitere Aufgaben sind aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich. Der bevorzugte Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia coli gehört, bildet eine große Anzahl an Genera tionen und eine große Menge an L-Threonin, wenn er in einem Medium, das Melasse als ein Rohmaterial enthält, kultiviert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ein vollständigere Würdigung der Erfindung und vieler damit verbundener Vorteile ist ohne weiteres möglich, wenn die Erfindung mit Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden wird, worin:
1 ein Schema ist, um das Plasmid pPR39 zu erhalten;
2 ein Schema ist, um das Plasmid pPRT610 zu erhalten;
3 ein Schema ist, um das Plasmid pPRT614 zu erhalten;
4 graphisch die Wachstumskurve und die Anreicherung von L-Threonin bei Kultivierung von B-3996 und B-5318 zeigt, wobei O die Wachstumskurve für B-5318 darstellt, die Anreicherung von L-Threonin bei Kultivieren von B-5318 darstellt, • die Wachstumskurve für B-3996 darstellt und ∎ die Anreicherung von L-Threonin bei Kultivieren von B-3996 darstellt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben die Ziele der vorliegenden Erfindung durch Bereitstellung des Stamms E. coli BKIIM B-5318, der bis zu 70 g/l Threonin während 32 Stunden Wachstum auf einem Melassemedium bildet, erreicht.
Darüber hinaus umfassen weitere geeignete Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, eukaryotische Zellen, die zur Gattung Saccharomyces und vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae gehören, und prokaryotische Zellen, die zu den Gattungen Escherichia, Serratia, Brevibacterium oder Corynebacterium gehören. (Der Aufwandskoeffizient für diesen Stamm beträgt 1,7 gemäß der vorstehenden Definition).
Der neue Stamm E. coli BKIIM 8-5318 wurde durch Transformation eines neuen Rezipientenstamms E. coli VNIIGenetika TDH-7, transformiert mit dem Plasmid pPRT614, erhalten. Wie in 3 gezeigt ist, wurde das Plasmid pPRT614 durch Sub stitution der regulatorischen Region des Threoninoperons des Plasmids pVIC40 gegen den PR-Promotor und den temperatursensitiven cI-Repressor des lambda-Phagen erhalten. Das pVIC40-TagI-ClaI-Fragment wird in pPRT610 eingeführt, dem der stromaufwärtige Bereich des thrA-Gens, der während dessen Herstellung verlorengegangen ist, fehlt. Als Ergebnis wird pPRT614 mit einem vollständigen thrA-Gen bereitgestellt (3).
Das Plasmid pPR40 war der Donor für den Promotor und den Repressor (1, 2). 1 zeigt die Einführung der ClaI-Stelle (chemisch synthetisiert nach bekannten Verfahren) in die BglII-Stelle von pPR40 unter Bildung von pPR39. 2 zeigt den Verdau von sowohl pVIC40 als auch pPR39 mit sowohl PstI als auch ClaI. Durch Ligation der vorstehenden Fragmente zur Lokalisierung des lambda-Phagen-Promotors und -Repressors stromaufwärts vom Threoninoperon wurde pPRT610 hergestellt. Die ClaI-Stelle befindet sich jedoch in der kodierenden Region des thrA-Gens in pVIC40.
Der neue Rezipientenstamm E. coli VNIIGenetika TDH-7 ist Isoleucin-prototroph. Er wurde aus plasmidlosen Zellen des Stamms VNIIGenetika TDH-6 erhalten. E. coli VNIIGenetika TDH-6 ist beim Research Institute of Genetics and Industrial Microorganism Breeding in Rußland, 113545 Moskau, 1 Dorozhny Proezd., 1 (Registriernummer BKIIM B-3420) hinterlegt.
Zu diesem Zweck wurden plasmidlose Zellen des Stamms E. coli VNIIGenetika TDH-6 mit dem Phagen P1 infiziert, der zuvor in Zellen des Stamms E. coli c6000 vermehrt worden war. Anschließend wurden Transduktanten selektiert, die zum Wachstum auf Isoleucin-freiem Medium befähigt waren. Der selektierte Stamm wurde als E. coli VNIIGenetika TDH-7 bezeichnet. TDH-7 wurde dann mit dem Plasmid pPRT614 transformiert, was zur Einführung des Stamms E. coli BKIIM B-5318 führte.
Der neue Stamm E. coli BKIIM B-5318 unterscheidet sich von dem bekannten Stamm durch die Tatsache, daß er zum Wachstum auf angereichertem Nährmedium (z. B. auf Medium mit Melasse) befähigt ist, was zu einer effektiveren Herstellung von Threonin führt. Der Unterschied hinsichtlich der Threoninbildung ergibt sich aus zwei Modifikationen:

(1) ein temperatursensitiver lambda-Phage-cI-Repressor und -PR-Promotor ersetzt den regulatorischen Bereich des Threoninoperons im Plasmid pVIC40; und
(2) der Stamm B-5318 wird prototroph im Hinblick auf Isoleucin.

E. coli BKIIM B-5318 bildet mehr als 70 g/l Threonin während 32 Stunden der Fermentation auf Melasse unter Standardlaborbedingungen und bei Temperaturen von 38 bis 41°C.
Der neue Produzent von Threonin, E. coli BKIIM B-5318 wurde in der Sammlung von Mikroorganismuskulturen des All-Union Research Institute of Antibiotics (Registriernummer 2070) und auch beim Research Institute of Genetics and Industrial Microorganism Breeding in Rußland, 113545 Moskau, 1 Dorozhny Proezd., 1 (Registriernummer BKIIM B-5318) hinterlegt.
Der neue Stamm E. coli BKIIM B-5318 weist die folgenden morphologischen und biochemischen Eigenschaften auf:

(1) Zellmorphologie: Gram-negativ; Stäbchen mit runden Enden und geringer Mobilität mit einer Länge von 1,5–2,0 μm.
(2) Eigenschaften der Kulturen:
(A) Fleisch-Pepton-Agar: Nach 24 Stunden Wachstum bei 37°C bilden Kulturen abgerundete, weißliche, semitransparente Kolonien mit einem Durchmesser von 1,5–3,0 mm; die Oberflächen der Kolonien sind glatt, die Kanten sind gleichmäßig oder in geringem Maße wellenförmig, das Zentrum der Kolonie ist erhöht, die Struktur ist homogen, und die Konsistenz ist pastenartig und leicht zu emulgieren.
(B) Luria-Agar: Nach 24 Stunden Wachstum bei 37°C bilden Kulturen weißliche, semitransparente Kolonien mit einem Durchmesser von 1,5–2,5 mm; die Oberfläche der Kolonien ist glatt, die Kanten sind gleichmäßig, die Struktur ist homogen, und die Konsistenz ist pastenartig und leicht zu emulgieren.
(C) Adams-Medium-Agar: Nach 40 bis 48 Stunden Wachstum bei 37°C bilden Kulturen Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5–1,5 mm; gräulich-weiß, semitransparent, geringfügig erhöht mit einer glänzenden Oberfläche.
(D) Wachstum in Fleisch-Pepton-Brühe: Die spezifische Wachstumsrate bei 37°C beträgt 1,3 h^–1; nach 24 Stunden Wachstum werden eine drastische homogene Trübung und ein charakteristischer Geruch wahrgenommen.
(3) Physiko-biochemische Eigenschaften: Das Wachstum entlang eines Einstichs in den Fleisch-Pepton-Agar ist gleichmäßig entlang des gesamten Einstichs. Der Mikroorganismus ist fakultativ anaerob. Er verflüssigt Gelatine nicht. Er wächst gut auf Milch und verursacht Milchgerinnung. Er bildet kein Indol. Er ist resistent gegenüber Streptomycin. Er ist resistent gegenüber den potentiellen Produktinhibitoren L-Threonin und L-Homoserin.

Temperaturempfindlichkeit: Wächst in Fleisch-Pepton-Brühe bei 43°C und darunter. Optimales Wachstum zeigt sich bei 37–38°C.
pH-Empfindlichkeit: Wächst auf Medien bei einem pH-Wert von 6,0–8,0; optimaler pH-Wert: 7,0.
Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen: Wächst gut auf Saccharose, Glucose, Lactose, Mannose, Galactose, Xylose, Glycerin und Mannit unter Bildung von Säure und Gas.
Wachstum auf verschiedenen Stickstoffquellen: Assimiliert Stickstoff in Form von Ammoniak, Nitraten und auch Stickstoff einiger organischer Verbindungen.
Plasmidgehalt: Die Zellen enthalten ein Mehrfachkopie-Hybridplasmid pPRT614 (Molmasse 10,2 MD), das Streptomycin-Resistenz verleiht und die Threoninoperongene, den lambda-Phagenpromotor und das temperatursensitive Repressor-cI-Gen trägt.
Das Plasmid ist im Stamm E. coli BKIIM B-5318 hochgradig stabil, und zwar selbst während des Wachstums in Abwesenheit von Selektionsdruck, um das Plasmid zu erhalten. Die Stabilität der Stammcharakteristika, die das Plasmid verleiht, wurden für den Stamm E. coli BKIIM B-5318 (Plasmid pPRT614) und für den Stamm-Prototyp E. coli BKIIM B-3996 (Plasmid pVIC40) bewertet. Die Zellen beider Stämme wurden in Gegenwart von Streptomycin bis zum Einsetzen des frühen stationären Stadiums gezüchtet. Die Zellen wurden dann in Luria-Medium ohne Antibiotika mit einem Ausgangstiter von 50 überimpft. Nach 48 Stunden Kultivierung bei 36,7–40°C wurden die erhaltenen Zellen erneut in Luria-Medium mit einem Ausgangstiter von 50 überimpft und wiederum für 48 Stunden bei der gleichen Temperatur kultiviert. Jede Passage entsprach 20 Generationen. Nach den angegebenen Passagen wurden die Zellen auf Luria-Agar überimpft, und die Kolonien wurden auf Streptomycinresistenz überprüft. Bei beiden Stämmen betrug der Anteil an plasmidlosen Zellen weniger als 1%.
Herstellung von L-Threonin
Eine Kultur des Stamms E. coli BKIIM B-5318, die hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurde auf Adam-Medium-Agar mit einem Gehalt an Streptomycin gezüchtet. Die Suspension der Zellen wurde dann in flüssiges Inokulum oder Fermentationsmedium, das Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, essentielle Mineralsalze und Nährstoffadditive in Form von Proteinhydrolysaten enthielt, überimpft. (Das Vorhandensein von L-Isoleucin im Fermentationsmedium ist nicht erforderlich). Das Wachstum des Inokulums erfolgte bei einem pH-Wert von 6,8–7,2 und bei einer Temperatur von 36–38°C unter kontinuierlicher Belüftung und Rühren. Das Inokulum oder eine Suspension von Zellen, die vom Agar gewaschen wurde, wurde zur Animpfung des Fermentationsmediums verwendet.
Die Fermentation wurde in Fermentern durchgeführt, die mit einem System zur pH-Stabilisierung bei einem pH-Wert von 6,8–7,2 ausgestattet waren und bei einer Temperatur von 38– 40°C unter kontinuierlicher Belüftung und Rühren durchgeführt. Wäßriges Ammoniak oder Kohlenstoff- und Stickstoffabgestimmtes Melasse-Ammoniak-Nährstoffadditiv wurden als pH-Stabilisierungsmittel verwendet. Die Dauer der Fermentation hängt von der Inokulumdosis und dem Grad der Wachstumsfaktoranreicherung des Fermentationsmediums ab; im allgemeinen variiert sie jedoch von 24 bis 60 Stunden.
Der spezifische Aufwand an Kohlenstoffquellen, der für die Synthese von 1 g L-Threonin erforderlich war (der Aufwandskoeffizient), beträgt 1,8 g. Es wurde keine Anreicherung von Aminoaceton im Kulturmedium beobachtet.
Weitere Merkmale der Erfindung sind im Verlauf der folgenden Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen ersichtlich, die zur Erläuterung der Erfindung vorgelegt werden und diese nicht beschränken sollen.
Beispiel 1
Kulturen der Stämme E. coli BKIIM B-3996 (Prototyp) und E. coli BKIIM B-5318 wurden getrennt auf Adams-Medium-Agar mit einem Gehalt an Saccharose (0,2%) und Streptomycin (100 mg/ml) für 2 Tage gezüchtet und dann in einer physiologischen Lösung suspendiert. Inokulummedium (500 ml) wurde mit einer Probe der Suspension (10 ml; Titer = 10⁸) angeimpft. Das Inokulummedium wies die folgende Zusammensetzung auf (Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht): Melasse – 3%, Ammoniumsulfat – 0,5%, Dikaliumphosphat (H₂HPO₄) – 0,2%, Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO₄·7H₂O) – 0,04%, Eisen(II)-Sulfat (FeSO₄·7H₂O) – 0,002%, Mangan (II)-sulfat (MnSO₄·5H₂O) – 0,002%, Hefeautolysat – 0,2%, Wasser – Rest.
Das Inokulum wurde für 20 Stunden in einem Laborfermenter (Volumen: 0,7 1) unter Belüftung (0,5 1/min) und Rühren (1200 U/min) bei einer Temperatur von 39°C gezüchtet. Der pH-Wert wurde im Bereich von 6,9–7,2 durch einen automatischen Einlaß, über den Melasse-Ammonium-Nährstoffadditiv (ein Gemisch aus Ammoniakwasser und Melasse in einem Molverhältnis von 2,92 : 1 bei einer Melassekonzentration im Gemisch von 300 g/l) bereitgestellt wurde, gehalten. Die Fermentation wurde für 32 Stunden durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Anmerkung: Anreicherung von Threonin und Aufwandskoeffizient für die Stämme BKIIM B-3996 und BKIIM B-5318 nach 32 Stunden Fermentation unter Verwendung von Melasse.
Nach 32 Stunden bildet E. coli BKIIM B-5318 70,4 g/l L-Threonin, während der Prototyp-Stamm B-3996 nur 46,7 g/l L-Threonin bildet. Die entsprechenden Aufwandskoeffizienten betragen 1,7 bzw. 2,5.
Der vorliegende Mikroorganismus erhöht also die Menge an L-Threonin im Fermentationsmedium, das Melasse enthält, im Vergleich zum Prototypstamm, während gleichzeitig der Aufwandskoeffizient verringert wird.
Beispiel 2
Die Stämme E. coli BKIIM B-3996 (Prototyp) und E. coli BKIIM B-5318 wurden getrennt auf M9-Medium-Agar mit einem Gehalt an 0,2% Saccharose und 100 mg/ml Streptomycin für 1 Tag gezüchtet und dann in einem Inokulummedium gemäß der Angabe in Tabelle 2 suspendiert. Eine Probe der Suspension mit einem Titer von 108 (1 ml) wurde verwendet, um 250 ml Inokulummedium, das durch Lösen der in Tabelle 2 angegebenen Bestandteile in 1 1 Wasser erhalten wurde, anzuimpfen.
Tabelle 2
Das Inokulum wurde für 12 Stunden in einem Laborfermenter (Volumen = 1,0 1) unter Belüftung (0,25 1/min) und Rühren (zunächst 700 U/min und dann so eingestellt, daß der Sauerstoffdruck bei einem Wert von nicht mehr als 2% gehalten wurde) bei einer Temperatur von 39°C gezüchtet. Der pH-Wert wurde im Bereich von 6,7–7,1 mit einem automatischen Einlaß, über den Ammoniakgas bereitgestellt wurde, gehalten. Nach Fermentation wurden 25 ml der Kultur zu 250 ml eines Fermentationsmediums gegeben. Der Inhalt des Fermentationsmediums ist in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Das Inokulum im Fermentationsmedium wurde für 28 Stunden in einem Laborfermenter (Volumen = 1,0 l) unter Belüftung (0,25 1/min) und Rühren (zunächst 700 U/min und dann so eingestellt, daß der Sauerstoffdruck bei einem Wert von nicht mehr als 2% gehalten wurde) bei einer Temperatur von 39°C gezüchtet. Der pH-Wert wurde im Bereich von 6,7–7,1 mit einem automatischen Einlaß, über den Ammoniakgas bereitgestellt wurde, gehalten. Die Saccharosekonzentration des Mediums wurde unter 20 g/l durch Zugabe von 600 g/l (60%) einer wäßrigen Saccharoselösung gehalten. Die Wachstumskurve und die L-Threonin-Anreicherung sind in 4 gezeigt, und die Fermentationsergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, ist B-5318 hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit B-3996 überlegen. Die Kulturzeit kann also verkürzt werden, und eine Kontaminierung kann verhindert werden.

Claims

Prokaryotische Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die (a) eine erste induzierbare Operatorsequenz und (b) eine zweite DNA-Sequenz umfaßt, die unmittelbar stromabwärts von der ersten DNA-Sequenz liegt und ein Threoninoperon umfaßt, welches einen in der Attenuation fehlerhaften Bereich enthält, wobei die zu transformierende Zelle eine Isoleucinprototrophe Zelle ist.
Zelle gemäß Anspruch 1, wobei die erste induzierbare Operatorsequenz einen temperatursensitiven Repressor cI des Phagen λ und einen Promotor umfaßt.
Zelle, die eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 umfaßt und zur Expression der DNA-Sequenz befähigt ist.
Zelle gemäß Anspruch 3, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
Zelle gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei der Vektor einen Replikator RSF 1010 umfaßt.
Zelle gemäß Anspruch 3, 4 oder 5, wobei der Vektor ein selektierbares Merkergen umfaßt.
Zelle gemäß Anspruch 6, wobei das selektierbare Merkergen ein Streptomycin-Resistenz verleihendes Gen ist.
Zelle gemäß Anspruch 4, wobei das Plasmid pPRT614 ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zelle zur Gattung Escherichia, Serratia, Brevibacterium oder Corynebacterium gehört.
Zelle gemäß Anspruch 9, wobei die zu transformierende Zelle Escherichia coli VNIIGenetika TDH-7 ist.
Zelle gemäß Anspruch 9, wobei die Zelle Escherichia coli BKIIM B-5318 ist.
Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, das folgende Schritte umfaßt: (a) Kultivieren einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem Medium; (b) Anreichern des L-Threonins in dem Medium und der Zelle; (c) Gewinnen des L-Threonins aus dem Medium und der Zelle.