DE69109243T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan und L-Threonine. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan und L-Threonine.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen unter Verwendung eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden und ein rekombinantes Plasmid tragenden Mikroorganismus. Zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörende Mikroorganismen werden häufig zur fermentativen Produktion von unterschiedlichen Aminosäuren verwendet.
  • Zur Verbesserung von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium durch DNA-Rekombinationsverfahren wurden Wirt-Vektor-Systeme für diese Gattungen getestet. In einen Wirtsmikroorganismus eingeführte rekombinante Plasmide sind jedoch häufig instabil und werden vom Wirt verloren. Daher ist die Instabilität eines rekombinanten Plasmids eines der wesentlichen Probleme, die gelöst werden müssen, damit die durch DNA-Rekombinationsverfahren konstruierten Mikroorganismen für die industrielle Produktion von Aminosäuren praktisch verwendet werden können.
  • Bisher sind mehrere Verfahren zur Stabilisierung von Plasmiden in Wirtszellen von zu anderen Gattungen als Corynebacterium und Brevibacterium gehörenden Mikroorganismen beschrieben worden. Es werden nach der Art der Stabilisierung zwei Verfahren unterschieden. Zunächst kann ein Plasmid genetisch stabilisiert werden. Im Bezug auf Escherichia coli ist beispielsweise bekannt, daß das par- Gen, das an der stabilen Verteilung des eine niedrige Kopienzahl aufweisenden Plasmids pSC101 beteiligt ist, in das Plasmid [Gene 23 (1983), 105) inseriert wird. Entsprechend ist von Stämmen der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium bekannt, daß ein Plasmid, das in coryneformen Bakterien der Gattung Brevibacterium autonom replizieren kann, durch Insertion eines Gens, das auf einem von Brevibacterium stationis (EP-A1-0 352 763) getragenen Plasmid vorhanden ist, stabilisiert werden kann. Derartige Verfahren verbessern die Stabilität eines Plasmids in einem gewissen Ausmaß, sind jedoch nicht für ein mehrere Impfkulturschritte einschließendes Verfahren zur industriellen Produktion von Aminosäuren geeignet, da es bekannt ist, daß Plasmide während der Züchtung durch wiederholte, mit der Proliferierung verbundene Zellteilungen von Wirtszellen verloren werden [Bio/Technology 4 (1986), 901]. Ferner sind Verfahren zur selektiven Züchtung von Plasmid tragenden Zellen bekannt, in denen das Wachstum von Zellen, die einen Plasmidverlust aufweisen, gehemmt wird. Beispielsweise werden bei einer Züchtung in kleinem Maßstab dem Kulturmedium üblicherweise Antibiotika zugesetzt. Dieser Antibiotikazusatz ist bei einer Züchtung in großem Maßstab jedoch kostspielig. Ferner ist ein Reinigungsschritt zur Entfernung der zugesetzten Antibiotika erforderlich, und daher kann dieses Verfahren zur industriellen Produktion nicht verwendet werden. Ein bekanntes Verfahren, das ohne einen Zusatz von bestimmten Substanzen auskommt, stabilisiert Plasmide in Wirtszellen, indem ein Wirtsstamm, der in einem für sein Wachstum essentiellen Gen defizient ist, und ein Plasmid, das ein die Defizienz komplementierendes Gen enthält, kombiniert werden. Bei Bacillus subtilis wird beispielsweise eine Kombination eines Alanin-Racemasegen-defizienten Wirtsstamms und eines das Alanin-Racemasegenenthaltenden Plasmids verwendet [Bio/Technology 3 (1985), 1003] und bei Escherichia coli eine Kombination eines Diaminopimelinsäure-benötigenden Wirtsstamms und eines Plasmids, das ein die Defizienz komplementierendes Gen enthält (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 233790/88). In beiden Verfahren werden Plasmidfreie Zellen aufgrund ihrer Unfähigkeit zur Synthese von D- Alanin oder Diaminopimelinsäure, die ein essentieller Bestandteil der Zellwände sind, lysiert und daher können nur die Plasmide-tragenden Zellen normal wachsen. Diese Verfahren eignen sich für Züchtungsverfahren unter Verwendung von Kulturmedien, die von Tieren, Pflanzen oder Hefen stammende Extrakte enthalten und üblicherweise in industriellen Fermentationsverfahren verwendet werden, da diese natürlichen Nährstoffe kein D-Alanin oder keine Diaminopimelinsäure enthalten.
  • Es ist jedoch schwierig, diese Verfahren auf Mikroorganismen anzuwenden, die Isoenzyme der Alanin-Racemase enthalten oder Diaminopimelinsäure über einen Nebenweg biologisch synthetisieren können, da D-Alanin- oder Diaminopimelinsäure-benötigende Mutanten derartiger Mikroorganismen nicht leicht zu erhalten sind.
  • WO 89/03427 beschreibt ebenfalls das Problem der Instabilität von Plasmiden in Wirtszellen. Das Problem wird durch Herstellung einer Bakterienmutante mit einer Deletion im asd-Gen gelöst, so daß das Bakterium seine Zellwand nur synthetisieren kann, wenn Diaininopimelinsäure (DAP) im Medium vorhanden ist. Die Mutante wird mit einem asd- und eine gewünschte Substanz codierenden Plasmid transformiert und in DAP-freiem Medium gezüchtet. Das Plasmid ist stabil, da Zellen, denen es fehlt, nicht lebensfähig sind.
  • EP-A-0 401 735, die lediglich Teil des Stands der Technik nach Artikel 54(3) EPÜ darstellt, offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, das die in einem Kulturmedium durchgeführte Züchtung eines Mikroorganismus umfaßt, der zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehört und eine rekombinante DNA trägt, die aus einer Vektor-DNA und DNA-Fragmenten besteht, die alle genetischen Informationen tragen, die die Synthese der 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthase, Anthranilat-Synthase, Anthranilatphosphoribosyl-Transferase, N-5'-Phosphoribosylanthranilat-Isomerase, Indol-3-glycerinphosphat-Synthase, Tryptophan-Synthase und 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase betreffen, so daß L-Tryptophan im Kulturmedium akkumulieren und daraus gewonnen werden kann.
  • Bei der industriellen Großproduktion von Substanzen, beispielsweise Aminosäuren, unter Verwendung von rekombinante Plasmide tragenden Stämmen der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium proliferieren die Zellen durch wiederholte Teilungen in der Phase von der Animpfung bis zur Fermentation, wobei die rekombinanten Plasmide von den Zellen häufig verloren werden. Diese Instabilität der Plasmide reduziert die Produktivität, und daher ist ein Verfahren zur Stabilisierung von rekombinanten Plasmiden in Wirtszellen wünschenswert, mit dem Substanzen kostengünstig industriell produziert werden können.
  • Es gibt keinen Bericht über die Stabilisierung eines Plasmids in einem Wirtsstamm durch Verwendung eines mutierten Wirtsstamms, der eine Substanz (z. B. eine Aminosäure) benötigt, die in natürlichen Nährstoffen enthalten ist, die als Mediumbestandteile zusammen mit einem die Defizienz des Wirts komplementierenden Plasmid zugesetzt werden. Eine derartige Kombination wurde als Wirt-Vektor-System zur Stabilisierung eines Plasmids in einem Wirtsstamm für ungeeignet gehalten, da Zellen, die Plasmide verloren haben, ebenfalls wachsen können.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung einer gewünschten Substanz, das die Transformation eines Serin-benötigenden, zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus mit einem rekombinanten Plasmid, das ein Gen, das die Serin- Auxotrophie des Wirts komplementiert, und ein an der Biosynthese der gewünschten Substanz beteiligtes Gen enthält, die Züchtung der Transformante in einem Kulturmedium, die Akkumulation der von der Transformante produzierten gewünschten Substanz in der Kultur und die Gewinnung der gewünschten Substanz aus der Kultur umfaßt. Die gewünschte Substanz kann eine Aininosäure, beispielsweise L-Tryptophan oder L-Threonin, sein.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Figur 1 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pDTS9901 und die Schritte zur Konstruktion des Plasmids. Das 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthase (DS)-Gen liegt auf dem geschwärzt dargestellten chromosomalen DNA- Fragment, der Gencluster für die Tryptophan-Biosynthese liegt auf dem schräg schraffiert dargestellten chromosomalen DNA-Fragment und das 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (PGDH)- Gen liegt auf dem gestrichelt dargestellten chromosomalen DNA-Fragment.
  • Figur 2 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pCHS10 und die Schritte zur Konstruktion des Plasmids. Das Homoserin-Dehydrogenase (HD)-Gen und das Homoserin-Kinase (HK)-Gen liegen auf dem geschwärzt dargestellten chromosomalen DNA-Fragment und das PGDH-Gen auf dem gestrichelt dargestellten Fragment.
  • Die Größe der Plasmide wird in Kilobasen (kb) angegeben.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Da Mikroorganismen, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, Serin schnell abbauen können, wird in Kulturmedium enthaltenes Serin in einer frühen Wachstumsphase abgebaut. Daher zeigen Serin-benötigende Wirtszellen nach einem Verlust des Plasmids kein Wachstum, und nur mit Plasmid-tragenden Zellen kann eine Subkultivierung durchgeführt werden. Daher können im Vergleich zu üblichen Verfahren, in denen Transformanten verwendet werden, die Substanzen effizient produziert werden.
  • In der vorliegenden Erfindung kann jeder zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörende, Serinbenötigende Stamm als Wirtsmikroorganismus verwendet werden. Diese Serin-benötigenden Stämme können weitere Eigenschaften aufweisen, beispielsweise einen Bedarf an verschiedenen Nährstoffen und eine Chemikalienresistenz- oder -empfindlichkeit. Diese Stämme können von den nachstehend beschriebenen Stämmen abgeleitet werden.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
  • Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
  • Corynebacterium herculis ATCC 13868
  • Corynebacterium lilium ATCC 15990
  • Brevibacterium flavum ATCC 14067
  • Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
  • Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
  • Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Serinbenötigenden Mutanten können erhalten werden, indem bei den parenteralen Stämmen durch eine übliche Behandlung eine Mutation induziert wird, beispielsweise eine Bestrahlung mit ultraviolettem Licht und eine chemische Behandlung mit N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetriger Säure, und anschließend Mutanten, die nicht auf Minimalmedium, jedoch auf Serin-enthaltendem Minimalmedium wachsen können, selektiert werden.
  • Das Gen, das den Serin-benötigenden Wirtsstamm komplementiert, kann von jedem Mikroorganismus stammen. Wenn der Wirt eine Mutante ist, die eine Defizienz in dem ein Enzym im biosynthetischen Stoffwechselweg von Serin codierenden Gen aufweist, können Gene, die an der Biosynthese von Serin beteiligt sind, beispielsweise das 3-Phosphoglycerat- Dehydrogenasegen, Phosphoserinamino-Transferasegen und Phosphoserin-Phosphatasegen, verwendet werden.
  • Als Vektor zur Insertion der DNA kann jeder Vektor, der in Glutaminsäure-produzierenden coryneformen Bakterien autonom replizieren kann, verwendet werden. Beispielsweise können die Plasmide pCG1 (japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 134500/82), pCG2 (japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 35197/83), pCG4 und pCG11 (japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 183799/82), pCE54 und pCB101 (japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 105999/83) und pCE51, pCE52 und pCE53 [Mol. Gen. Genet. 196 (1984), 175] verwendet werden.
  • Das den Serin-benötigenden Wirtsstamm komplementierende Gen kann durch das nachstehend beschriebene Verfahren erhalten werden. Der vorstehend beschriebene, für Serin auxotrophe Wirtsstamm kann mit einem Gemisch aus rekombinanten DNAs, die durch Rekombination der chromosomalen DNA und der Vektor-DNA erhalten werden, transformiert werden und die das Gen enthaltende rekombinante DNA aus einer Transformante, die Serin nicht benötigt, isoliert werden. Die Transformation kann durch das Protoplasten-Verfahren durchgeführt werden (japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldungen mit den Nrn. 186492/82 und 186489/82).
  • Die Serin-benötigende Mutante und das rekombinante Plasmid, das das Gen enthält, das den wie vorstehend beschrieben erhaltenen, Serin-benötigenden Wirt komplementiert, werden als Wirt-Vektor-System verwendet, da es ein DNA-Fragment mit einem gewünschten Gen, das in einem Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium stabil bleibt, enthält. In einer anderen Ausführungsform kann ein rekombinantes Plasmid, das ein ein gewünschtes Gen enthaltendes DNA-Fragment enthält, unter Verwendung eines anderen Wirt-Vektor-Systems konstruiert und anschließend zur Konstruktion eines rekombinanten Plasmids verwendet werden, das zusätzlich das den Serin-benötigenden Wirt komplementierende Gen enthält. Das erhaltene rekombinante Plasmid wird in die Serin-benötigende Mutante eingeführt, in der es stabil erhalten bleibt.
  • Der Begriff "gewünschtes Gen" betrifft ein Gen, das die Fähigkeit zur Produktion einer gewünschten Substanz auf einen Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium überträgt oder das Produktionsniveau der Substanz in einem derartigen Mikroorganismus, in den es eingeführt wurde, verbessert. Geeignete Beispiele sind Gene, die Enzyme codieren, die Geschwindigkeits-begrenzende Reaktionen auf den Biosynthesewegen der Aminosäuren katalysieren (japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldungen mit den Nrn. 265892/89, 105688/88, 156292/84, 24192/85, 34197/85, 94985/88, 156294/84, 30693/85, 91193/87, 209597/86, 66989/85, 79597/88, 102692/88, 119688/88, 79788/87, 186795/87 und 68091/88).
  • Die Transformante, die durch Einführung des rekombinanten Plasmids, das das den Serin-benötigenden Wirt komplementierende Gen und das gewünschte Gen enthält, in den Serin-benötigenden Mikroorganismus erhalten wird, kann unter Verwendung eines Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen, Aminosäuren, Vitamine etc. enthaltenden Mediums bei einer kontrollierten Temperatur und einem kontrollierten pH-Wert unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden.
  • Als Kohlenstoffquellen können Kohlehydrate, beispielsweise Glucose, Glycerin, Fruktose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse, Polyalkohole und verschiedene organische Säuren, beispielsweise Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden. Restmelasse ist besonders geeignet. Je nach Assimilierungsvermögen des verwendeten Stamms können auch Kohlenwasserstoffe und Alkohole verwendet werden.
  • Als Stickstoffquellen können Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff und andere Stickstoff-enthaltende Substanzen, und Stickstoff-enthaltende organische Substanzen, beispielsweise Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl und Spaltprodukte davon, und Chrysalidenhydrolysate verwendet werden.
  • Als anorganische Substanzen können Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat etc. verwendet werden. Je nach der Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle eines Kulturmediums können dem Kulturmedium gegebenenfalls Aminosäuren und Vitamine, beispielsweise Biotin und Thiamin, zugesetzt werden. Wenn der Stamm eine bestimmte Substanz für das Wachstum benötigt, muß dem Kulturmedium zusätzlich eine derartige Substanz zugesetzt werden. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise durch Schütteln der Kultur oder Rühren der Kultur unter Luftzufuhr, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40ºC, durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums wird während der Züchtung vorzugsweise etwa am Neutralpunkt gehalten. Der Züchtungszeitraum ist üblicherweise 1 bis 5 Tage.
  • Obwohl verschiedene Substanzen unter Verwendung eines geeigneten rekombinanten Plasmids und Wirtsmikroorganismus hergestellt werden können, wird das vorliegende Verfahren vorzugsweise zur Herstellung einer Aminosäure verwendet, wobei die Transformante, die aufgrund der Einführung eines rekombinanten Plasmids, das ein an der Biosynthese der Aminosäure beteiligtes Gen enthält, ein erhöhtes Produktionsniveau aufweist.
  • Einige erfindungsgemäße Ausführungsformen sind in den nachstehend beschriebenen Beispielen erläutert.
    • Beispiel 1
  • Das 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (PGDH)-Gen, das an der Biosynthese von Serin in Corynebacterium glutamicum beteiligt ist, wurde in ein Plasmid eingefügt, das die an der Biosynthese von Tryptophan beteiligten Gene enthielt. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde in das PGDH-Gendefiziente Corynebacterium glutamicum SA95 eingeführt, worauf getestet wurde, ob die Transformante L-Tryptophan produzierte.
    • (1) Herstellung der chromosomalen DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833, des rekombinanten Plasmids pCDtrp157 und des Vektorplasmids pCG116
  • Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 wurde in einem NB-Medium (20 g/l Bouillonpulver und 5 g/l Hefeextrakt, pH- Wert 7,2) gezüchtet. Die erhaltene Impfkultur wurde in 400 ml halbsynthetisches SSM-Medium [20 g/l Glucose, 10 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 3 g/l Harnstoff, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g/l MgCl&sub2; x 6H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,2 mg/l MnSO&sub4; x 4-6H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4; x 5H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7; x 10H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; x 4H&sub2;O, 30 ug/l Biotin und 1 mg/l Thiaminhydrochlorid, pH 7,2] inokuliert und bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Die optische Dichte (OD) bei 660 nm (hier nachstehend wird die optische Dichte, sofern nicht anders angegeben, bei 660 nm gemessen) wurde mit einem Tokyo Koden-Kolorimeter gemessen, und es wurde bei einer OD von 0,2 Penicillin G zu einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD von 0,6 fortgesetzt.
  • Die gezüchteten Zellen wurden aus der Kultur gewonnen und mit einer TES-Pufferlösung [0,03 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (hier nachstehend als "Tris" abgekürzt), 0,005 M Dinatriumethylendiamintetraacetat (hier nachstehend als EDTA abgekürzt) und 0,05 M NaCl, pH 8,0] gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 10 ml Lysozymlösung (25 % Saccharose, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris und 0,8 mg/ml Lysozym, pH 8,0) zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Hochmolekulare chromosomale DNAs wurden gemäß dem Verfahren von H. Saito und K. Miura [Biochim. Biophys. Acta 72 (1963), 619] aus den gewonnenen Zellen isoliert.
    • Konstruktion von pCG116
  • Das rekombinante Plasmid pCDtrp157 enthält das 3- Desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthasegen und den von Corynebacterium glutamicum stammenden Gencluster für die Biosynthese von Tryptophan (vgl. Fig. 1) und wurde in der japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldung Nr. 265892/89 offenbart.
  • Das als Vektor verwendete pCG116 wird durch Ligierung eines Linkers, der aus M13-mp18-RF-DNA (Takara Shuzo Co., Ltd.) erhalten wird, mit dem mit StuI-PstI gespaltenen DNA- Fragment von pCG11 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 134500/82), das in Corynebacterium glutamicum autonom replizieren kann, unter Verwendung ihrer glatten und überstehenden Enden konstruiert. Der Linker wird durch Spaltung von M13-mp18-RF-DNA mit EcoRI, Auffüllen der überstehenden zu glatten Enden mit dem Klenow-Fragment (Takara Shuzo Co., Ltd.) und einer erneuten PstI-Spaltung der DNA erhalten. Das Plasmid pCG116 weist eine Molekülgröße von etwa 6,5 kb und jeweils eine einzige Spaltstelle für BglII, PstI, SalI, XbaI, BamHI, SmaI, KpnI und SacI auf und liefert einen Streptomycin- und/oder Spectinomycin-resistenten Phänotyp (vgl. Figur 1).
  • pCDtrp157 und pCG116 wurden jeweils gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren aus gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 31833, die pCDtrp157 oder pCG116 tragen, isoliert.
  • Der pCDtrp157- oder pCG116-tragende Stamm von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 wurde bei 30ºC unter Schütteln in 400 ml SSM-Medium gezüchtet, mit Penicillin G gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren behandelt und die Züchtung bis zu einem OD von etwa 0,6 fortgesetzt. Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt, mit einer TES-Pufferlösung gewaschen und in 10 ml einer Lysozymlösung suspendiert. Die Suspension wurde zwei Stunden bei 37ºC reagieren gelassen. Dem Reaktionsgemisch wurden nacheinander 2,4 ml 5 M NaCl, 0,6 ml 0,5 M EDTA (pH 8,5) und 4,4 ml einer Lösung, die 4 % Natriumlaurylsulfat und 0,7 M NaCl enthielt, zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wurde vorsichtig gerührt und 15 Stunden auf Eis gegeben. Das so erhaltene Lysat wurde in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und zur Gewinnung eines Überstands 60 Minuten bei 4ºC mit 69 400 x g zentrifugiert. Anschließend wurde Polyethylenglycol (PEG) 6 000 (Nakarai Chemicals, Ltd.) in einer Menge von 10 Gew.-% zugesetzt. Das Gemisch wurde vorsichtig gerührt und anschließend auf Eis gegeben. Nach zehn Stunden wurde das Gemisch zur Gewinnung eines Pellets 10 Minuten mit 1 500 x g zentrifugiert. Anschließend wurden 5 ml TES-Pufferlösung zugesetzt, um das Pellet langsam zu lösen, und der Lösung 2,0 ml 1,5 mg/ml Ethidiumbromid zugesetzt. Durch Zugabe von Cäsiumchlorid wurde die Dichte der Lösung auf 1,580 eingestellt.
  • Die so erhaltene Lösung wurde 48 Stunden bei 18ºC mit 105 000 x g ultrazentrifugiert und eine durch UV-Bestrahlung nachweisbare Bande mit hoher Dichte im unteren Teil des Zentrifugenröhrchens durch Punktierung der Seite des Zentrifugenröhrchens mit einer Injektionsnadel entnommen, wodurch die die pCDtrp157 oder pCG116 Plasmid-DNA enthaltende Fraktion erhalten wurde. Die Fraktion wurde zur Entfernung von Ethidiumbromid fünfmal mit einem äquivalenten Volumen einer mit Cäsiumchlorid gesättigten Isopropanollösung [90 % (Vol./Vol.) Isopropanol in TES-Pufferlösung] extrahiert. Die Lösung wurde anschließend gegen TES-Pufferlösung dialysiert.
    • (2) Clonierung eines das PGDH-Gen enthaltenden DNA-Fragments
  • Einem 60 ul Y-100-Reaktionsmedium (10 mM Tris, 6 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl, pH 7,5), das 3 4g pCG116-Plasmid-DNA enthielt, die aus, wie vorstehend in (1) beschrieben, pCG116 tragenden Zellen von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 isoliert wurde, wurden 6 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo Co., Ltd., wenn nicht anders angegeben, stammten die nachstehend verwendeten Restriktionsenzyme von Takara Shuzo Co., Ltd.) zugesetzt, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Getrennt davon wurden 6 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI zu 140 ul Y-100-Reaktionsmedium zugesetzt, das 3 ug chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 enthielt, die, wie vorstehend in (1) beschrieben, erhalten wurde, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die beiden Umsetzungen wurden durch zehnminütiges Erhitzen auf 65ºC beendet.
  • Die beiden so erhaltenen Reaktionsgemische wurden vermischt und 40 ul einer 10fach konzentrierten Pufferlösung für T4-Ligase (660 mM Tris, 66 mM MgCl&sub2; und 100 mM Dithiothreit, pH 7,6), 40 ul 5 mM ATP, 300 Einheiten T4- Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 120 ul Wasser zugesetzt. Anschließend wurde das Gemisch 16 Stunden bei 12ºC inkubiert.
  • Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von Corynebacterium glutamicum RS57 (eine Serin-benötigende Mutante, der das von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 stammende PGDH-Gen fehlt) verwendet. Eine Impfkultur dieses Stamms (4 ml) wurde in 40 ml SSM-Medium, das 100 ug/ml Serin enthielt, inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet. Bei einem OD von 0,2 wurde die Kultur gemäß dem vorstehend in (1) beschriebenen Verfahren mit Penicillin G behandelt und die Züchtung bis zu einem OD von 0,6 fortgesetzt. Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt und zu einer Konzentration von etwa 10&sup9; Zellen pro Milliliter in 10 ml RCGP- Medium [5 g/l Glucose, 5 g/l Casaminosäuren, 2,5 g/l Hefeextrakt, 3,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,41 g/l MgCl&sub2; x 6H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; x 7H&sub2;O, 2 mg/l MnSO&sub4; x 4-6H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; x 4H&sub2;O, 30 ug/l Biotin, 2 mg/l Thiaminhydrochlorid, 135 g/l Dinatriumsuccinat und 30 g/l Polyvinylpyrrolidon (MG: 10 000); pH 7,6], das 1 mg/ml Lysozym enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde in ein Teströhrchen vom L-Typ transferiert und zur Herstellung von Protoplasten 16 Stunden bei 30ºC vorsichtig geschüttelt.
  • Anschließend wurden 0,5 ml der Protoplastensuspension in ein kleines Teströhrchen transferiert und zur Abtrennung der Protoplasten fünf Minuten mit 2 500 x g zentrifugiert. Die Protoplasten wurden in 1 ml TSMC-Pufferlösung (10 mM MgCl&sub2;, 30 mM CaCl&sub2;, 50 mM Tris und 400 mM Saccharose, pH 7,5) suspendiert, und die Suspension wurde zum Waschen zentrifugiert. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. Anschließend wurden der Protoplastensuspension 100 ul Gemisch (1:1) aus der zweifach konzentrierten TSMC-Pufferlösung und dem vorstehend erhaltenen Ligierungsreaktionsgemisch zugesetzt. 0,8 ml TSMC- Pufferlösung, die 20 % PEG 6 000 enthielt, wurde dem erhaltenen Gemisch anschließend zugesetzt. Nach drei Minuten wurden 2 ml RCGP-Medium (pH 7,2) zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde zur Entfernung eines überstandes 5 Minuten mit 2 500 x g zentrifugiert. Die ausgefällten Protoplasten wurden in 1 ml RCGP-Medium suspendiert. 0,2 ml Suspension wurden auf 400 ug/ml Spectinomycin enthaltendem RCGP-Agarmedium (das durch Zugabe von 1,4 % Agar zum RCGP-Medium hergestellt worden war) verteilt und 7 Tage bei 30ºC gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die auf RCGP-Agarmedium gezüchteten Kolonien durch Schaben entfernt und zweimal durch Zentrifugation in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wurde auf dem 100 ug/ml Spectinomycin enthaltenden M1-Agarminimalmedium [10 g/l Glucose, 1 g/l (NH&sub4;)H&sub2;PO&sub4;, 0,2 g/l KCl, 0,2 g/l MgSO&sub4; x 7H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0, 2 mg/l MnSO&sub4; x 4-6H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4; x 5H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7; x 10H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; x 4H&sub2;O, 50 ug/l Biotin, 2,5 mg/l p-Aminobenzoesäure, 1 mg/l Thiaminhydrochlorid und 16 g/l Agar, pH 7,2] verteilt und zur Selektion der Spectinomycin-resistenten und Serin-unabhängigen Transformanten 3 Tage bei 30ºC gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde gemäß dem vorstehend in (1) beschriebenen Verfahren aus den selektierten Transformanten isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und die Restriktionsfragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, wobei festgestellt wurde, daß ein Plasmid, das die Bezeichnung pCser571 erhielt, ein SalI-gespaltenes 2,7 kb-DNA-Fragment in der SalI-Stelle von pCG116 (vgl. Fig. 1) enthielt.
  • Die PGDH-Aktivitäten von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 und der pCser571-tragenden Transformante wurden gemäß dem von E. Sugimoto und L. I. Pizer [J. Biol. Chem. 243 (1968), 2081] beschriebenen Verfahren ermittelt. Es konnte nachgewiesen werden, daß die pCser571-tragende Transformante im Vergleich zum ATCC 31833-Stamm eine um etwa das 13fache erhöhte PGDH-Aktivität aufwies. Dies zeigte, daß das clonierte DNA-Fragment das PGDH-Gen enthielt.
    • (3) Ligierung eines das PGDH-Gen enthaltenden DNA-Fragments an pCDtrp157
  • 100 ul eines Y-100-Reaktionsmediums, das 3 ug pCser571-Plasmid-DNA enthielt, wurden 6 Einheiten BamHI zugesetzt, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Spaltung wurde mit dem Gemisch eine Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt und das 1,4 kb-DNA-Fragment durch Schneiden aus dem Gel entfernt.
  • Getrennt davon wurden 6 Einheiten BamHI zu 100 ul Y- 100-Reaktionsmedium, das 3 ug pCDtrp157-Plasmid-DNA enthielt, zugesetzt und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 65ºC beendet. Beide so erhaltenen Reaktionsgemische wurden vermischt und dem Gemisch wurde das doppelte Volumen Ethanol zugesetzt. Nach der Ausfällung wurde die DNA gewonnen und in 200 ul Wasser suspendiert. Zu 200 ul DNA- Suspension wurden 40 ul der 10fach konzentrierten T4-Ligase- Pufferlösung, 40 ul 5 mM ATP, 300 Einheiten T4-Ligase und 120 ul Wasser zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 12ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde gemäß dem in (2) beschriebenen Verfahren zur Transformation von RS57 verwendet. Das Transformationsgemisch wurde auf 400 ug/ml Spectinomycin enthaltendem RCGP-Agarmedium verteilt und die Kolonien wurden auf der Platte gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die auf RCGP-Agarmedium gezüchteten, Spectinomycinresistenten Kolonien durch Abschaben entfernt und durch zweimalige Zentrifugation in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 1 ml physiologische Kochsalzlösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf 100 ug/ml Spectinomycin enthaltendem L1-Agarminimalmedium verteilt und zur Selektion der Spectinomycinresistenten und Serin-unabhängigen Transformanten 3 Tage bei 30ºC gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde gemäß dem vorstehend in (1) beschriebenen Verfahren aus diesen Transformanten isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und die Restriktionsfragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es wurde festgestellt, daß die Plasmide, die aus einer Transformante erhalten und als pDTS9901 bezeichnet wurden, ein BamHI-gespaltenes 1,4 kb-DNA-Fragment in der BamHI-Stelle von pCDtrp157 (vgl. Fig. 1) enthielten. Das wie vorstehend beschrieben erhaltene Plasmid pDTS9901 wurde zur Transformation von Corynebacterium glutamicum ATCC 21854, der ein Phenylalanin- und Tyrosin-benötigender Stamm ist und von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 stammt, gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet. Corynebacterium glutamicum ATCC 21854, der pDTS9901 trägt, wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages am 2. Juni 1989 als Corynebacterium glutamicum K82 beim Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-2444.
    • (4) Produktion von L-Tryptophan durch eine pCDtrp157 oder pDTS9901 tragende Transformante und Plasmidstabilität
  • Eine Impfkultur (4 ml) von Corynebacterium glutamicum ATCC 21854 bzw. Corynebacterium glutamicum SA95 wurde in 40 ml SSM-Medium, das jeweils 100 ug/ml Phenylalanin, Tyrosin und Serin enthielt, inokuliert und unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet.
  • Corynebacterium glutamicum SA95 ist ein Serin-benötigender Stamm, dem das PGDH-Gen fehlt und der von Corynebacterium glutamicum ATCC 21854 stammt, wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 21. September 1990 bei der FRI, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-3108.
  • Bei einer OD von 0,2 wurde eine Behandlung gemäß dem vorstehend in (1) beschriebenen Verfahren mit Penicillin G durchgeführt und die Züchtung bis zu einer OD von 0,6 fortgesetzt. Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt und gemäß dem vorstehend in (2) beschriebenen Verfahren mit Lysozym behandelt. Die so erhaltenen Protoplasten wurden gemäß dem vorstehend in (2) beschriebenen Verfahren mit pCDtrp157 oder pDTS9901 transformiert. Die Plasmid-DNAs wurden durch das gleiche, vorstehend in (1) beschriebene Verfahren aus so erhaltenen, Spectinomycin-resistenten Transformanten isoliert. Restriktionsanalysen der Plasmide bestätigten, daß diese Transformanten pCDtrp157 oder pDTS9901 enthielten. Ein Test der Transformanten auf die Produktion von L-Tryptophan wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt. Jede Transformante wurde unter Schütteln 24 Stunden bei 30ºC in 3 ml S1-Medium [20 g/l Glucose, 15 g/l Polypepton, 15 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l NaCl, 1 g/l Harnstoff, 200 mg/l L- Tyrosin und 200 mg/l L-Phenylalanin, pH 7,2] gezüchtet. 0,5 ml Kultur wurden in einem großen Teströhrchen in 5 ml P1- Produktionsmedium [60 g/l Glucose, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 1 g/l MgSO&sub4; x 7H&sub2;O, 20 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 g/l Maisquellwasser, 10 mg/l MnSO&sub4;, 30 ug/l Biotin und 20 g/l CaCO&sub3;, pH 7,2] inokuliert und unter Schütteln 72 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Kultur filtriert und das L-Tryptophan im Filtrat durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie quantitativ bestimmt, indem es nach der Säulenpassage mit o-Phthalaldehyd/2-Mercaptoethanol derivatisiert wurde.
  • Die Stabilität der Plasmide in der Wirtszelle wurde durch Züchtung von Kolonien auf 100 ug/ml Spectinomycin enthaltendem NB-Agarmedium getestet:
  • Die gezüchtete Kultur wurde verdünnt und danach auf einem NB-Agarmedium verteilt. Die auf NB-Agarmedium gezüchteten Kolonien wurden auf ein 100 ug/ml Spectinomycin enthaltendes NB-Agarmedium transferiert.
  • Es wurde festgestellt, daß in pDTS9901-tragenden Zellen von Corynebacterium glutamicum SA95 das Plasmid stabil beibehalten wurde (vgl. Tabelle 1). Tabelle 1 Stamm L-Tryptophan (mg/ml) Plasmidstabilität (%)
    • Beispiel 2
  • Das PGDH-Gen, das an der Biosynthese von Serin in Corynebacterium glutamicum beteiligt ist, wurde in ein die Gene für die Biosynthese von Threonin enthaltendes Plasmid inseriert. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde in den PGDH-defizienten Corynebacterium glutamicum SA24 eingeführt, wonach ein Test der Transformante auf die Produktion von L- Threonin durchgeführt wurde.
    • (1) Herstellung des rekombinanten Plasmids pChom10 und des Vektors pCG115
  • pChom10 wurde durch Insertion eines das Homoserin- Dehydrogenase (HD)-Gen und die Homoserin-Kinase (HK)-Gene von Corynebacterium glutamicum enthaltenden 3,6 kb-DNA- Fragments (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 91193/87) in die SalI-Stelle des Vektors pCE54 (japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 105999/83) konstruiert (vgl. Fig. 2).
  • Das als Vektor verwendete pCG115 wird durch Ligierung eines aus M13-mp18-RF-DNA erhaltenen Linkers mit dem BglII- PstI-gespaltenen DNA-Fragment von pCG11 unter Verwendung der gleichen überstehenden Enden konstruiert. Der Linker wird durch Spaltung der M13-mp18-RF-DNA mit BamHI und PstI erhalten.
  • Plasmid pCG115 weist eine Molekülgröße von etwa 6,4 kb und jeweils eine einzige Spaltstelle für XbaI, SalI und PstI auf und verleiht einen Streptomycin- und/oder Spectinomycin-resistenten Phänotyp (vgl. Fig. 2).
  • pChom10 und pCG115 wurden einzeln aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 durch das gleiche, vorstehend in Beispiel 1 (1) beschriebene Verfahren isoliert.
    • (2) Ligierung eines die HD- und HK-Gene enthaltenden DNA- Fragments mit pCG115
  • Zu 200 ul eines Y-100-Reaktionsmediums, die jeweils 3 ug pChom10-Plasmid-DNA und pCG115-Plasmid-DNA enthielten, wurden 6 Einheiten BamHI zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert und die Reaktion durch 10-minütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 65ºC beendet. Zu 200 ul DNA-Suspension wurden eine 10fach-konzentrierte T4-Ligase-Pufferlösung, 40 ul 5 mM ATP, 300 Einheiten T4-Ligase und 120 ul Wasser zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 12ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde gemäß dem in Beispiel 1 (2) beschriebenen Verfahren zur Transformation von Corynebacterium glutamicum K54 (FERM P-8258), einer Threonin-benötigenden Mutante, die bezüglich des von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 stammenden HK-Gens defizient ist, verwendet. Das Transformationsgemisch wurde auf 400 ug/ml Spectinomycin enthaltendem RCGP-Agarmedium verteilt. Die auf RCGP-Agarmedium gezüchteten, Spectinomycin-resistenten Kolonien wurden durch Abschaben entfernt und durch zweimalige Zentrifugation in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf 100 ug/ml Spectinomycin enthaltendem M1-Agarminimalmedium verteilt und zur Selektion der Spectinomycin-resistenten und Threoninunabhängigen Transformanten 3 Tage bei 30ºC gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde gemäß dem vorstehend in Beispiel 1 (1) beschriebenen Verfahren aus diesen Transformanten isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und die Restriktionsfragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es wurde festgestellt, daß das Plasmid, das aus einer der Transformanten erhalten und als pCG115 bezeichnet wurde, ein SalI-gespaltenes 3,6 kb-DNA-Fragment in der SalI-Stelle von pCG115 (vgl. Fig. 2) enthielt.
    • (3) Ligierung eines das PGDH-Gen-enthaltenden DNA-Fragments mit pCGhom10
  • 100 ul Y-100-Reaktionsmedium, die 3 ug pCser571- Plasmid-DNA enthielten, wurden 6 Einheiten SalI zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Spaltung wurde mit dem Gemisch eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und das 2,7 kb-DNA-Fragment durch Schneiden aus dem Gel gewonnen. Getrennt davon wurden 0,5 Einheiten SalI zu 100 ul Y-100-Reaktionsmedium, das 3 ug pCGhom10-Plasmid-DNA enthielt, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Reaktion wurde mit dein Gemisch eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und das 10,0 kb-DNA-Fragment durch Schneiden aus dem Gel gewonnen. Beide so erhaltenen Reaktionsgemische wurden vermischt und das doppelte Volumen Ethanol wurde zugesetzt. Nach der Ausfällung wurde die DNA gewonnen und in 200 ul Wasser suspendiert. Der DNA-Suspension wurden 40 ul 10fach-konzentrierte T4-Ligase-Pufferlösung, 40 ul 5 mM ATP, 300 Einheiten T4-Ligase und 120 ul Wasser zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 Stunden bei 12ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäß dem in Beispiel 1 (1) beschriebenen Verfahren zur Transformation von Corynebacterium glutamicum RS 57 verwendet. Anschließend wurden die Spectinomycin-resistenten und Threonin-unabhängigen Transformanten selektiert. Die Plasmid-DNA wurde gemäß dem vorstehend in Beispiel 1 (1) beschriebenen Verfahren aus diesen Transformanten isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, und die Restriktionsfragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Es wurde festgestellt, daß das Plasmid, das aus einer der Transformanten erhalten und als pCHS10 bezeichnet wurde, ein SalI-gespaltenes 2,7 kb-DNA-Fragment in einer der beiden SalI-Stellen von pCGhom10 (vgl. Fig. 2) enthielt.
    • (4) L-Threonin-Produktion durch eine pCGhom10 oder pCHS10 tragende Transformante und Stabilität der Plasmide in Wirtszellen
  • Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 und Corynebacterium glutamicum SA 24, eine Serin-benötigende Mutante, die bezüglich des von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 stammenden PGDH-Gens defizient ist, wurden durch das gleiche, vorstehend in Beispiel 1 (2) beschriebene Verfahren mit pCGhom10 oder pCHS10 transformiert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA aus den erhaltenen Spectinomycin-resistenten Transformanten isoliert. Durch Restriktionsanalyse wurde festgestellt, daß die Transformanten pCGhom10 oder pCHS10 enthielten.
  • Die Transformanten wurden, wie nachstehend beschrieben, auf die Produktion von L-Threonin getestet. Jede Transformante wurde unter Schütteln 24 Stunden bei 30ºC in 3 ml NB-Medium gezüchtet. 0,5 ml der Kultur wurden in einem großen Teströhrchen in 5 ml T-Produktionsmedium [200 g/l Restmelasse, 0,3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g/l MgSO&sub4; x 7H&sub2;O, 20 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mg/l FeSO&sub4; x 7H&sub2;O, 10 mg/l MnSO&sub4; x 4-6H&sub2;O, 8 g/l Maisquellwasser, 200 ug/l Thiaminhydrochlorid, 200 ug/l Biotin und 40 g/l CaCO&sub3;, pH 7,2] inokuliert und unter Schütteln 72 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Kultur filtriert und das L-Treonin im Filtrat durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie quantitativ bestimmt, indem es nach der Säulenpassage mit o-Phthalaldehyd/2-Mercaptoethanol derivatisiert wurde.
  • Die Stabilität der Plasmide in der Wirtszelle wurde durch das gleiche, in Beispiel 1 (4) beschriebene Verfahren getestet.
  • Es wurde festgestellt, daß in pCHs10-tragenden Zellen von Corynebacterium glutamicum SA 24 das Plasmid stabil beibehalten wird (vgl. Tabelle 2). Tabelle 2 Stamm L-Threonin (mg/ml) Plasmidstabilität (%)

Claims (4)

1. Verfahren zur Produktion eines gewünschten Stoffes, umfassend die Transformation eines für Serin auxotrophen Wirtsorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium mit einem rekombinanten Plasmid, das ein Gen enthält, das die Serinauxotrophie des Wirtes komplementiert, und ein Gen, das an der Biosynthese des gewünschten Stoffes beteiligt ist, Züchtung der Transformante in einem Kulturmedium, Anreicherung des von der Transformante produzierten gewünschten Stoffes in der Kultur und Gewinnung des gewünschten Stoffes aus der Kultur.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der gewünschte Stoff eine Aminosäure ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Aminosäure L- Tryptophan oder L-Threonin ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Plasmid pDTS9901 ist, das von Corynebacterium glutamicum K82 (FERM BP-2444) getragen wird.
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