JPH04190794A - 物質の製造法 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
ウム属に属し、組換え体プラスミドを保有する微生物を
用いた物質の製造法に関する。コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物は、各種のア
ミノ酸の発酵生産に広く用いられている。
の宿主・ベクター系を用いて、組換えDNA技術による
菌株改良が行われている。しかし、宿主微生物に導入し
た組換え体プラスミドは不安定で、脱落を起こすことが
あり、DNA技術を用いて作成した菌株を用いて、アミ
ノ酸を工業的規模で生産する場合の問題点となっている
。
、他の菌種ではいくつかの方法が報告されている。たと
えばプラスミドそのものを遺伝的に安定に保持させる方
法として、大腸菌では低コピープラスミドρ5CIOI
の安定な分配に関する遺伝子parをプラスミドに組み
込んで安定化を図る方法が知られている[ジーン(Ge
ne)、23.105 (1983) 〕。
て、プラスミド保有株のみを優位に生育させる方法もあ
る。小規模の培養で通常用いられる抗生物質の培地への
添加は、その例である。さらに、生育に必須の形質を欠
損した宿主とその欠損形質を相補する遺伝子を有するプ
ラスミドとの組合せにより、プラスミドを安定に保持さ
せる方法もある。たとえば、枯草菌では、アラニンラセ
マーゼ遺伝子の欠損した宿主と野生型の同遺伝子を有す
るプラスミドとの組合せを用いる方法〔バイオテクノロ
ジー(日io/Technology ) 、3.10
03(1985>) 、また大腸菌では、ジアミノピメ
リン酸要求性宿主とその要求性を相補する遺伝子を有す
るプラスミドとの組合せを用いる方法(特開昭63−2
33790)があげられる。いずれの場合にも、プラス
ミド脱落株は細胞壁の成分として必須のD−アラニンま
たはジアミノピメリン酸を合成できないため溶菌してし
まい、プラスミド保有株のみが増殖することになる。こ
の両者の方法では、工業的規模での発酵において一般的
に用いられる動植物または酵母由来の抽出物を含む培地
で培養する場合にも、それら天然栄養物中にはD−アラ
ニン及びジアミノピメリン酸が含まれないため、プラス
ミド脱落株の増殖を抑制できる。
テリウム属菌種においては、組換え体プラスミドを宿主
細胞内に安定に保持させる方法は確立されていない。
たはブレビバクテリウム属菌種を用いて、工業的に大規
模なスケールで、物質たとえばアミノ酸などを製造する
場合、種培養から本培養まで多数回の分裂増殖が伴うた
め、組換え体プラスミド脱落株が多くなる。これは生産
性の低下につながるので、組換え体プラスミドを宿主微
生物の細胞内に安定に保持させることによって、物質を
工業的に安価に製造する方法の開発が望まれている。
ウム属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セリ
ン要求性を相補する遺伝子および所望の遺伝子を組み込
んだ#l換え体プラスミドを導入して得られる形質転換
株を培地に培養し、培養物中に該形質転換株が生産する
物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取するこ
とを特徴とする物質の製造法を提供する。
する微生物は、セリンの分解力が強く、培地中に含まれ
るセリンが培養の初期に速やかに分解消費されるため、
プラスミドの脱落したセリン要求性の宿主菌は増殖でき
ず、結果としてプラスミド保有株のみが継代培養される
ことになり、従来用いられていた形質転換株を用いた物
質の製造法よりも効率よく物質が製造できる。
リウム属またはブレビバクテリウム属に属し、セリン要
求性の菌株であればいずれでもよい。これらのセリン要
求株が、さらに他の性質、たとえば各種栄養要求性、薬
剤耐性、薬剤感受性等を併せて持っていてもよい。この
ような菌株を誘導する際の親株としては、次のような菌
株をあげることができる。
2コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムATCC
13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC1386
8コリネバクテリウム・リリウム ^TCC15
990ブレビバクテリウム・フラブム AT[C
14067プレヒハクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ディバリカッム^TCC1402
0ブレビバクテリウム・チオゲニタリスATCC192
40本発閂におけるセリン要求性変異株は、通常の変異
処理法、たとえば紫外線照射またはN−メチル−N’−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)や亜硝酸な
どの化学処理を施した後、最少培地では生育できないが
、セリンを含む最少培地では生育する変異株を分離する
ことによって取得することができる。
としては、いかなる微生物由来のものでもよい。そのよ
うな遺伝子として、宿主がセリン生合成酵素の欠損変異
株である場合には、セリン生合成系遺伝子、具体的には
3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ホス
ホセリンアミノトランスフェラーゼ遺伝子あるいはホス
ホセリンホスファターゼ遺伝子をあげることができる。
グルタミン酸生産菌中で自律複製できるものであれば特
に限定されないが、例えばpccl(特開昭57−13
4500)、pCG2 (特開昭58−35197)、
pCG4、pcGll (いずれも特開昭57−183
799)、pCE54、pcBlol (いずれも特開
昭58−105999)、pc巳51、pCE52 、
pCE53 [いずれもモレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジエネティクス(Mo1. Gen、 Gen
et、 >196.175(1984) Eなどのプラ
スミドを使用することができる。
して得ることができる。すなわち、染色体DNAとベク
ターDNAとの組換え体混成物を用いて、上記セリン要
求性変異を有する宿主を形質転換し、セリン非要求性と
なった形質転換株から目的の遺伝子を含む組換え体DN
Aとして取得できる。形質転換は、プロトプラストを用
いる方法(特開昭57−186492および特開昭57
−186489)により実施することができる。
ン要求性を相補する遺伝子を含む組換え体DNAを宿主
・ベクター系として用し1て、有用遺伝子を含むDNA
断片をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種に導入する。また、他の宿主・ベクター系を用い
て、有用遺伝子を含むDNA断片を含む組換え体プラス
ミドを作成し、該組換え体プラスミドにセリン要求性を
相補する遺伝子をさらに組み込んだ組換え体プラスミド
を、セリン要求性変異株に導入してもよい。
ビバクテリウム属菌種に導入された場合に、該菌種に物
質の生産性を付与するものや、該菌種の生合成系を強め
るものなどがあげられる。
なっている酵素の遺伝子(特開平1−265892、特
開昭63−105688、特開昭59−156292、
特開昭60−24192、特開昭60−34197、特
開昭63−94985、特開昭59−156294、特
開昭60−30693、特開昭62−91193、特開
昭61−209597、特開昭60−66989、特開
昭63−79597、特開昭63−102692、特開
昭63−119688、特開昭62−79788、特開
昭62−186795、特開昭63−68091など)
があげられる。
込んだ組換え体プラスミドを、セリン要求性を有する微
生物に導入して得られる形質転換株の培養は、該形質転
換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンな
どを含有する培地中、好気的条件下、温度、pHなどを
調節しつつ培養を行えばよい。
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコーノ
ベピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物、蛸加水分解物などの窒素含有有機物など種々の
ものが使用できる。
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。
窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビオチン、
サイアミンなどを添加する。また使用する菌株が、要求
性を示す場合は、その要求物質を添加する。
に行う。培養温度は、一般に20〜40℃が好適である
。培地のpHは、中性付近に維持することが望ましい。
質の生産は、導入する組換え体プラスミドや宿主微生物
の住質により異なるが、好適には、アミノ酸の生合成系
の遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを導入するこ
とによりアミノ酸の生産性を高めた形質転換株によるア
ミノ酸の生産に用いられる。
する3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(PGD
H)遺伝子を、トリプトファン合成系遺伝子含有プラス
ミドに組み込み、得られた組換え体プラスミドをPGD
H遺伝子欠損株コリネバクテリウム・グルタミクム5A
95に保有させ、L−)リプトファンの生産試験を行っ
たところ、プラスミド保有株のみを選択的に増殖させる
ことができた。
31833の染色体DNAおよび組換え体プラスミドp
cDtrp157とベクターpcG116の調製:NB
培地(粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを水1βに
含み、p H7,2に調整した培地)で増殖したコリネ
バクテリウム・グルタミクム^TCC3111133の
種培120−を、半合成培地55M〔グルコース20
gl(NHaLaSO410g1尿素3g、酵母エキス
Ig、KH2PO41g。
010mg、 Mn SO−・4〜6 H2O0,2m
g。
0,4mg、NazBaOv・10H200,09mg
、(NH4)6MOqO24・4 H2O0,04mg
、ビオチン30ugおよびサイアミン塩酸塩1mgを水
llに含み、p H7,2に調整した培地1400m1
に接種して30℃で振盪培養した。東京光電比色計で6
60nmにおける吸光度(OD)を測定(以下特記しな
いかぎり吸光度は660nmで測定)し、ODが0.2
になった時点で培養液へ0.5単位/mlの濃度となる
ようにペニシリンGを添加した。さらに培養を継続し、
ODが0.6になるまで生育させた。
リス (ヒドロキシメチル)アミノメタン(に1下トリ
スと略す)、0.005Mエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム(J:i下、EDTAと略す)、0.05M
NaC1、pH8,0]で洗浄後、リゾチーム溶液(
25%ショ糖、0.1M NaC1!、0.05M)
リス、0.8+g/mlリゾチーム、pH8,0)10
mlに懸濁し、37℃で2時間反応を行った。集菌した
菌体から斎藤−三浦の方法[5aito、 H,and
Miura、に、:バイオキミ力・工・バイオフィジ
カ・アクタ(Biochim、 Biophys、^c
ta)、72.619<1963) Eに従って高分子
染色体DNAを単離した。
265892に開示されたコリネバクテリウム・グルタ
ミクムの3−デオキシ−D−アラビノーヘブツロソネー
トー7−ホスフェートシンターゼ遺伝子およびトリプト
ファン合成系遺伝子群を含むプラスミドである(第1図
参照)。
ウム・グルタミクムのプラスミドpCG11(特開昭5
7−134500)上の5tulおよびPstI切断部
位に、M13 mp18RFDNA(宝酒造社製)を
EcoRIで切断後、クレノー断片(宝酒造社製)で平
滑末端に修復し、さらにpstlで切断して得たリンカ
−を両者の各々、平滑末端、接着末端を利用して結合さ
せたプラスミドである。pcG116は分子長約6.5
K bのプラスミドで、単一の制限酵素切断部位とし
てBgfII、Pstl。
および/またはスペクチノマイシン耐性の表現型を与え
る(第1図参照)。
るコリネバクテリウム・グルタミクムATCC3183
3から次の方法でそれぞれ単離した。
リネバクテリウム・グルタミクムATCC31833を
、400m1S 5M培地で、30℃にて振盪培養し、
上記と同様にしてペニシリンG処理後、ODが約0.6
になるまで生育させた。菌体を集菌しTES!l衝液で
洗浄後、リゾチーム溶液10m1に懸濁し、37℃で2
時間反応させた。反応液に5M NaC12,4ul、
0.5M EDTA (pH8,5)0.6ul、4
%ラウリル硫酸ナトリウムと0.7M NaC1から
なる溶液4.4ulを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水上に15時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、4
℃で60分間69.400 X ’gの遠心分離にかけ
上澄液を回収した。これに重量百分率10%相当のポリ
エチレングリフール(PEG)6.000(半井化学薬
品社製)を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置い
た。10時間後、1.500Xgで10分間遠心分離し
てペレットを回収した。TBS緩衝緩衝液5奎lえてペ
レットを静かに再溶解してから1.5■/mlエチジウ
ムブロマイド2.0ulを添加し、これに塩化セシウム
を加えて静かに溶解し、密度を1.580に合わせた。
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面か
ら注射器で抜きとることによって、pcDtrp157
およびpcG116ブラスミドDNAをそれぞれ分離し
た。この分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔
容量百分率90%イソプロピルアルコール、10%TE
Sil衝液(この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを
含む)〕で5回処理してエチジウムブロマイドを抽出除
去し、しかる後にTES緩衝液に対して透析した。
ローニング; 上記(1)で、コリネバクテリウム・グルタミクムAT
CC31833から調製したpcG1111iプラスミ
ドDNA3J1gを含む反応液Y−100(トリス10
mM5MgC126mM、NaCf100mM5pH7
,5)60ulに6単位のSaf■ (全酒造社製、以
下特記しない限り、制限酵素は全酒造社製)を添加し、
37℃で60分間反応させた。一方、コリネバテリウム
・グルタミクムATCC31833の染色体DNA3■
を含むY−100反応液140〃に6単位の5aIIを
添加し、37℃で60分間反応させた。いずれも65℃
で10分間加温して、反応を停止させた。
(トリス660 mM、 M g C1266mM、ジ
チオスレイトール100mM。
ゼ(全酒造社製)300単位および水1204を加え、
12℃で16時間反応させた。
ミクムR957(コリネバクテリウム・グルタミクムA
TCC31833よりセリン要求性変異株として誘導さ
れたPGDH遺伝子欠損株)の形質転換に供した。R3
57株の種培養4mlを、セリン100■/mlを含む
88M培地40−に植菌して30℃で振盪培養した。
ペニシリンG処理後、ODが0.6になるまで生育させ
た。菌体を集菌し、該細胞をRCGP培地〔グルコース
5g、カザミノ酸5g、酵母エキス2.5 g、に2H
POn 3.5 g、KH2PO41,5g5MgC1
z・6HwOO,41g5FeSOa・7H20l Q
mg、 Mn S○、・4〜6H202■、Zn5O
=7H200,9■、(N H、)。
、サイアミン塩酸塩2■、コハク酸二ナトリウム135
g、ポリビニルピロリドン(分子量10.000)30
gを水IIlに含む培地〕に1■/mlのリゾチームを
含む溶液(pH7,6)101T11に約10’細胞/
mlとなるように懸濁し、L型試験管に移して30℃で
16時時間巾かに振盪反応してプロトプラスト化した。
2,500Xgで5分間遠心分離し、73MC緩衝液(
MgC1210mM、CaCfa30mM、トリス50
mM、 ショ糖400mM。
!l!f液0.1mlに再懸濁した。コノ菌液に2倍高
濃度の73MC緩衝液と上記リガーゼ反応液の1対1混
合液100威を加えて混和し、次いでTSMC緩衝液中
に20%PEG6,000を含む液0.8mlを添加し
て混合した。3分後、RCGP培地(pH7,2)2m
lを添加し、2.500xgで5分間遠心分離にかけて
上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを1mlのR
CGP培地に懸濁してから、この菌液0.2mlをスペ
クチノマイシン400■/mlを含むRCGP寒天培地
(RCGP培地に1.4%寒天を含む培地、pH7,2
)に塗布し、30℃で7日間培養した。
で2回遠心洗浄後、生理食塩水1mlに懸濁した。この
菌液をスペクチノマインン1100AL/dを含有する
最少寒天培地M1〔グルコース10g、 (NH,)
H2PO41g。
H,0072mg、Zn5O+・”、8200.9mg
。
0H200,09mg、 (NH<)6Mo702<−
4)(、OO,04mg、ビオチン50q、p−アミノ
安息香酸2.5mg、サイアミン塩酸塩1mgおよび寒
天16gを水11中に含み、pH7,2に調整した培地
〕上に再塗布して30℃で3日間培養し、スペクチノマ
イシン耐性で、セリン非要求性となった形質転換株を選
択した。これろの形質転換株から上記(1)と同様な方
法によりプラスミドDNAを単離した。形質転換株の一
株がら得られ、pcser571と命名したプラスミド
は、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気
泳動で解析した結果、pcG116のSaj’ I切断
部位に2.7 kbの5ail DNA断片が挿入さ
れた構造を有していることがわかった(第1図参照)。
およびpcser571を保有する形質転換株につL)
て、PGDH活性をE、 Sugimot。
バイオロジカル・ケミストリー(J、 8io1. C
hem、 >243.2081 (1968)に従って
測定した。^TCC31833株のPGDH活性を1と
したときのpcser571を保有する形質転換株のP
GDH活性は約13倍に増加していたことから、pcs
er571に挿入されている2、 7 kbのDNA断
片上に、PGDH遺伝子が存在することを確認した。
CDtrp157への連結: pcser571プラスミドDNA3Mを含むY−10
0反応液100頭に6単位の)3amHIを添加し、3
7℃で60分間反応後、アガロースゲルから1.4 k
bのDNA断片を分画した。
Y−100反応液100μgに6単位のBamHIを加
え、37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温し
て反応を停止させた。
Aを沈澱回収後、水200μQに溶解した。
ゼ用緩衝液4L+!!、5mM ATP404、T4
リガーゼ300単位および水1204を加え、12℃で
16時間反応させた。
2)と同様な方法により形質転換した。
天培地上に生育したスペクチノマイシン耐性コ〇ニーを
かき集め、生理食塩水で2回遠心洗浄後、生理食塩水1
−に懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン100g
/−を含有する最生寒天培地M1上に再塗布して30℃
で3日間培養し、スペクチノマイシン耐性で、セリン非
要求性となった形質転換株を選択した。これらの形質転
換株から上記(1)と同様な方法によりプラスミドDN
Aを単離した。形質転換株の一株から得られ、pDTS
9901と命名したプラスミドは、各種制限酵素による
切断産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、p
cDtrp157のBamHI切断部位に1.4 kb
のBamHI断片が挿入された構造を有していることが
わかった(第1図参照)。このようにして作製したpD
Ts9901を保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC21854(コリネバクテリウム・グルタ
ミクムA T CC13032から誘導されたフェニル
アラニンおよびチロシンの要求株)株は、平成1年6月
2日付で、コリネバクテリウム・グルタミクムK 82
(FERMBP−2444)として工業技術院微生物
工業技術研究所(微工研)に、ブダペスト条約に基づい
て寄託されている。
s9901を保有する菌株によるL−)リブトファンの
生産およびプラスミドの安定性: コリネバクテリウム・グルタミクムATCC21854
(コリネバクテリウム・グルタミクムATCC1303
2から誘導されたフェニルアラニンおよびチロシンの要
求株)およびコリネノ゛くクテリウム・グルタミクム5
A95(コリネバクテリウム・グルタミクムA T C
C21854より、セリン要求性変異株として誘導され
たPGDH遺伝子欠損株)(平成2年9月21日付で微
工研にFERM BP−3108として寄託)の種培養
4ゴをフェニルアラニン、チロシンおよびセリン各10
0■/−を含むSSM培地40m1に植菌して、30℃
で振盪培養した。ODが0.2になった時点で上記(1
)と同様な方法でペニシリンG処理後、ODが0.6に
なるまで生育させた。
リゾチーム処理して、プロトプラスト化した。このプロ
トプラストをpcDtrp157およびpDTs990
1を用いて、上記(2)と同様な方法により形質転換し
た。スペクチノマイシン耐性となった形質転換株から、
上記(1)と同様な方法によりプラスミドDNAを単離
した。
、形質転換株が、pcDtrp157またはpDTs9
901を保有することを確認した。
試験管により次のように行った。
#母エキス15g、NaCj!2.5g。
ン200■を水l!に含み、p H7,2に調整した培
地:・3ゴ中で30℃、24時間振盪培養した種培養0
.5mlを生産培地P1 〔グルコース60 g、KH
2PO41g1KaHPO41g、Mg5Oa・7Hz
OIg。
10 g、 Mn 80410mg、ヒ゛才チン30■
、Ca COs 20 gを水1βに含み、p H7,
2に調整した培地〕5mlの入った大型試験管に接種し
、30℃で72時間振盪培養した。培養後、培養p液を
高速液体クロマトグラフィーを用いた○PAポストカラ
ム誘導体化法により定量して、L−)!Iブトファンの
生成量を測定した。
後、NB寒天培地上に塗布してコロニー分離し、得られ
たコロニーをスペクチノマイシン100■/−を含むN
B寒天培地に移植して、同培地上での生育の有無を観察
することによって行った。
る5A95株は、プラスミドが培養終了時まで安定に保
持されている。
.3 68実施例2 コリネバクテリウム・グルタミクムのセリン合成に関与
するPGDH遺伝子をスレオニン合成系遺伝子含有プラ
スミドに組み込み、得られた組換え体プラスミドPGD
I(遺伝子欠損株コリネバクテリウム・グルタミクム5
A24に保有させ、L−スレオニンの生産試験を行った
ところ、プラスミド保有株のみを選択的に増殖させるこ
とができた。
クターpcG115の調製: p Ch o m 10は、特開昭62−91193に
開示されたコリネバクテリウム・グルタミクムのホモセ
リンデヒドロゲナーゼ(HD)遺伝子とホモセリンキナ
ーゼ(HK)遺伝子を含む3゜6kbのDNA断片が、
ベクターpCE54(特開昭58−105999)のS
ad I切断部位に挿入されたプラスミドである(第2
図参照)。
G11(特開昭57−134500)上のBgl■およ
びPstI切断部位に、M13 mp18RF D
NAをBamHIおよびPstIで切断したリンカ−を
、両者の同一接着末端を利用して結合させたプラスミド
である。pcG115は分子長駒6.4 kbのプラス
ミドで、単一の制限酵素切断部位としてXba l5S
a11およびPstIを有し、ストレプトマイシンおよ
び/またはスペクチノマイシン耐性の表現型を与える(
第2図参照)。
るコリネバクテリウム・グルタミクムATCC3183
3の培養菌体から、実施例1(1〕と同様な方法により
単離した。
G115への連結: 上記(1)で調製したpchomlOプラスミドDNA
およびpcG115プラスミドDNAを各々3g含むY
−100反応液200誠に、6単位の5aIlIを添加
し、37℃で60分間反応後、65℃で10分間加熱し
て反応を停止させた。
緩衝液404.5mM ATP 40頭、T4リガー
ゼ300単位および水120〃を加え、12℃で16時
間反応させた。
・グルタミクムに54 (コリネバクテリウム・グルタ
ミクムATCC31833よ 1リスレオエン要求性
変異株として誘導されたHK遺伝子欠損株) (FE
RM P−8258)を実施例1(2)と同様な方法に
より形質転換した。スペクチノマイシン400ug/−
を含むRCGP寒天培地上に生育したスベクチノマイシ
ン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で2回遠心洗浄
後、生理食塩水1mlに懸濁した。この菌液をスペクチ
ノマイシン100■/−を含有する最少寒天培地Ml上
に再塗布して30℃で3日間培養し、スペクチノマイシ
ン耐性で、スレオニン非要求性となった形質転換株を選
択した。これらの形質転換株から、実施例1(1)と同
様な方法により、プラスミドDNAを単離した。形質転
換株の一株から得られ、pcGhomlOと命名したプ
ラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、pCG115の5a11
切断部位に3.6 kbのSaf’1断片が挿入された
構造を有していることがわかった(第2図参照)。
cGhoml。
0反応液100頭に、6単位の5adIを添加し、37
℃で60分間反応後、アガロースゲルから2.7 kb
のDNA断片を分画した。
Y−100反応液100dに、0.5単位の5aIIを
加え、37℃で10分間部分消化後、アガロースゲルか
ら10.0 kbのDNA断片を分画した。両反応液を
混合し、2容のエタノールを加えてDNAを沈澱回収後
、水2004に溶解した。
用緩衝液40d、5mM ATP404、T4リガー
ゼ300単位および水1204を加え、12℃で16時
間反応させた。
1〔1)と同様な方法により形質転換し、スペクチノマ
イシン耐性でセリン非要求性となった形質転換株を選択
した。形質転換株の一株から得られ、pCH310と命
名したプラスミドは、各種制限酵素による切断産物をア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、pCGhom1
0上に2カ所ある5afI切断邪切断一方に、2、7
kbの3aJ I断片が挿入された構造を有しているこ
とがわかった(第2図参照)。
る菌株によるL−スレオニン生産およびプラスミドの安
定性: コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
およびコリネバクテリウム・グルタミクム5A24(コ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032よ
りセリン要求性変異株として誘導されたPGDH遺伝子
欠損株)を、pcGhoml OおよびpCH510を
用いて、実施例1(2)と同様な方法により形質転換し
た。スペクチノマイシンに耐性となった形質転換株から
、実施例1(1)と同様な方法によりプラスミドDNA
を単離した。これらのプラスミドの各種制限酵素による
切断解析の結果、形質転換株がpcGhomloまたは
pCH310を保有することを確認した。
り、次のように行った。
時間振盪培養した種培養0.5 rIJlを、生産培地
T〔廃糖蜜200 g、 KH2P Os 0.3 g
−Mg S O4・7H,00,4g、(NH,)23
0゜20g、Fe5Oa・7H2010■、Mn5O。
1サイアミン塩酸塩200■、ビオチン200ugSC
a CO340gを水11に含み、pH7,2に調整し
た培地〕5mlの入った大型試験管に接種し、30℃で
72時間振盪培養した。培養後、培養P液を高速液体ク
ロマトグラフィーを用いた○PAボストカラム誘導体化
法により定量して、L−スレオニンの生成量を測定した
。プラスミドの安定性試験は、実施例1(4)と同様な
方法により行った。
A24株は、プラスミドが培養終了時まで安定に保持さ
れている。
TCC13032/pcH5101,981発明の効果 本発明によれば、宿主にセリン要求性変異を付与し、そ
れを相補する遺伝子を組換え体プラスミドに保有させる
ことで、プラスミド保有株のみを安定に継代培養するこ
とができる。
製工程を示す。太い実線部分の染色体DNA断片上には
DS遺伝子が、斜線部分の染色体DNA断片上にはトリ
プトファン生合成遺伝子が、また破線部分の染色体DN
A断片上にはPGDH遺伝子が含まれている。 第2図はpCH510の制限酵素切断地図とその作製工
程を示す。太い実線部分の染色体DNA断片上にはHD
遺伝子とHK遺伝子が、また破線部分のDNA断片上に
はPCDH遺伝子が含まれている。 プラスミドの大きさはキロベース、(kb)で表示され
ている。 第1図
Claims (3)
- (1)コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セリン要
求性を相補する遺伝子および所望の遺伝子を組み込んだ
組換え体プラスミドを導入して得られる形質転換株を培
地に培養し、培養物中に該形質転換株が生産する物質を
生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特
徴とする物質の製造法。 - (2)所望の遺伝子が、物質の生合成に関与する遺伝子
である請求項1記載の製造法。 - (3)物質がアミノ酸である請求項1または2記載の製
造法。
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