JPH04190794A - 物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、組換え体プラスミドを保有する微生物を
用いた物質の製造法に関する。コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物は、各種のア
ミノ酸の発酵生産に広く用いられている。

従来の技術 ］す不バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
の宿主・ベクター系を用いて、組換えＤＮＡ技術による
菌株改良が行われている。しかし、宿主微生物に導入し
た組換え体プラスミドは不安定で、脱落を起こすことが
あり、ＤＮＡ技術を用いて作成した菌株を用いて、アミ
ノ酸を工業的規模で生産する場合の問題点となっている
。

プラスミドを宿主微生物に安定に保持させる方法として
、他の菌種ではいくつかの方法が報告されている。たと
えばプラスミドそのものを遺伝的に安定に保持させる方
法として、大腸菌では低コピープラスミドρ５ＣＩＯＩ
の安定な分配に関する遺伝子ｐａｒをプラスミドに組み
込んで安定化を図る方法が知られている［ジーン（Ｇｅ
ｎｅ）、２３．１０５　（１９８３）　〕。

また、プラスミドの脱落株の生育を抑制することによっ
て、プラスミド保有株のみを優位に生育させる方法もあ
る。小規模の培養で通常用いられる抗生物質の培地への
添加は、その例である。さらに、生育に必須の形質を欠
損した宿主とその欠損形質を相補する遺伝子を有するプ
ラスミドとの組合せにより、プラスミドを安定に保持さ
せる方法もある。たとえば、枯草菌では、アラニンラセ
マーゼ遺伝子の欠損した宿主と野生型の同遺伝子を有す
るプラスミドとの組合せを用いる方法〔バイオテクノロ
ジー（日ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　、３．１０
０３（１９８５＞）　、また大腸菌では、ジアミノピメ
リン酸要求性宿主とその要求性を相補する遺伝子を有す
るプラスミドとの組合せを用いる方法（特開昭６３−２
３３７９０）があげられる。いずれの場合にも、プラス
ミド脱落株は細胞壁の成分として必須のＤ−アラニンま
たはジアミノピメリン酸を合成できないため溶菌してし
まい、プラスミド保有株のみが増殖することになる。こ
の両者の方法では、工業的規模での発酵において一般的
に用いられる動植物または酵母由来の抽出物を含む培地
で培養する場合にも、それら天然栄養物中にはＤ−アラ
ニン及びジアミノピメリン酸が含まれないため、プラス
ミド脱落株の増殖を抑制できる。

しかしながら、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種においては、組換え体プラスミドを宿主
細胞内に安定に保持させる方法は確立されていない。

発明が解決しようとする課題 組換え体プラスミドを保有するコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌種を用いて、工業的に大規
模なスケールで、物質たとえばアミノ酸などを製造する
場合、種培養から本培養まで多数回の分裂増殖が伴うた
め、組換え体プラスミド脱落株が多くなる。これは生産
性の低下につながるので、組換え体プラスミドを宿主微
生物の細胞内に安定に保持させることによって、物質を
工業的に安価に製造する方法の開発が望まれている。

課題を解決するた狛の手段 本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セリ
ン要求性を相補する遺伝子および所望の遺伝子を組み込
んだ＃ｌ換え体プラスミドを導入して得られる形質転換
株を培地に培養し、培養物中に該形質転換株が生産する
物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取するこ
とを特徴とする物質の製造法を提供する。

以下に、本発明の詳細な説明する。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物は、セリンの分解力が強く、培地中に含まれ
るセリンが培養の初期に速やかに分解消費されるため、
プラスミドの脱落したセリン要求性の宿主菌は増殖でき
ず、結果としてプラスミド保有株のみが継代培養される
ことになり、従来用いられていた形質転換株を用いた物
質の製造法よりも効率よく物質が製造できる。

本発明で用いられる宿主微生物としては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属し、セリン要
求性の菌株であればいずれでもよい。これらのセリン要
求株が、さらに他の性質、たとえば各種栄養要求性、薬
剤耐性、薬剤感受性等を併せて持っていてもよい。この
ような菌株を誘導する際の親株としては、次のような菌
株をあげることができる。

コリネバクテリウム・グルタミクム　ＡＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リリウム　　　　＾ＴＣＣ１５
９９０ブレビバクテリウム・フラブム　　　　ＡＴ［Ｃ
１４０６７プレヒハクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・ディバリカッム＾ＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２
４０本発閂におけるセリン要求性変異株は、通常の変異
処理法、たとえば紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸な
どの化学処理を施した後、最少培地では生育できないが
、セリンを含む最少培地では生育する変異株を分離する
ことによって取得することができる。

本発胡における宿主のセリン要求形質を相補する遺伝子
としては、いかなる微生物由来のものでもよい。そのよ
うな遺伝子として、宿主がセリン生合成酵素の欠損変異
株である場合には、セリン生合成系遺伝子、具体的には
３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ホス
ホセリンアミノトランスフェラーゼ遺伝子あるいはホス
ホセリンホスファターゼ遺伝子をあげることができる。

該ＤＮＡを組み込むためのベクターとしては、コリネ型
グルタミン酸生産菌中で自律複製できるものであれば特
に限定されないが、例えばｐｃｃｌ（特開昭５７−１３
４５００）、ｐＣＧ２　（特開昭５８−３５１９７）、
ｐＣＧ４、ｐｃＧｌｌ　（いずれも特開昭５７−１８３
７９９）、ｐＣＥ５４、ｐｃＢｌｏｌ　（いずれも特開
昭５８−１０５９９９）、ｐｃ巳５１、ｐＣＥ５２　、
ｐＣＥ５３　　［いずれもモレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジエネティクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、　＞１９６．１７５（１９８４）　Ｅなどのプラ
スミドを使用することができる。

宿主のセリン要求形質を相補する遺伝子は、次のように
して得ることができる。すなわち、染色体ＤＮＡとベク
ターＤＮＡとの組換え体混成物を用いて、上記セリン要
求性変異を有する宿主を形質転換し、セリン非要求性と
なった形質転換株から目的の遺伝子を含む組換え体ＤＮ
Ａとして取得できる。形質転換は、プロトプラストを用
いる方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７
−１８６４８９）により実施することができる。

上記のようにして得られたセリン要求性変異株と該セリ
ン要求性を相補する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを宿主
・ベクター系として用し１て、有用遺伝子を含むＤＮＡ
断片をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種に導入する。また、他の宿主・ベクター系を用い
て、有用遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む組換え体プラス
ミドを作成し、該組換え体プラスミドにセリン要求性を
相補する遺伝子をさらに組み込んだ組換え体プラスミド
を、セリン要求性変異株に導入してもよい。

有用遺伝子としては、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種に導入された場合に、該菌種に物
質の生産性を付与するものや、該菌種の生合成系を強め
るものなどがあげられる。

具体的には、アミノ酸の生合成経路上の律速ステップと
なっている酵素の遺伝子（特開平１−２６５８９２、特
開昭６３−１０５６８８、特開昭５９−１５６２９２、
特開昭６０−２４１９２、特開昭６０−３４１９７、特
開昭６３−９４９８５、特開昭５９−１５６２９４、特
開昭６０−３０６９３、特開昭６２−９１１９３、特開
昭６１−２０９５９７、特開昭６０−６６９８９、特開
昭６３−７９５９７、特開昭６３−１０２６９２、特開
昭６３−１１９６８８、特開昭６２−７９７８８、特開
昭６２−１８６７９５、特開昭６３−６８０９１など）
があげられる。

セリン要求性を相補する遺伝子および有用遺伝子を組み
込んだ組換え体プラスミドを、セリン要求性を有する微
生物に導入して得られる形質転換株の培養は、該形質転
換株を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンな
どを含有する培地中、好気的条件下、温度、ｐＨなどを
調節しつつ培養を行えばよい。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコーノ
ベピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物、蛸加水分解物などの窒素含有有機物など種々の
ものが使用できる。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。

ビタミン、アミノ酸としては、使用する培地の炭素源、
窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビオチン、
サイアミンなどを添加する。また使用する菌株が、要求
性を示す場合は、その要求物質を添加する。

培養は振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下
に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは、中性付近に維持することが望ましい。

培養期間は通常１〜５日間である。形質転換株による物
質の生産は、導入する組換え体プラスミドや宿主微生物
の住質により異なるが、好適には、アミノ酸の生合成系
の遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを導入するこ
とによりアミノ酸の生産性を高めた形質転換株によるア
ミノ酸の生産に用いられる。

以下に、実施例を示す。

実施例１ コリネバクテリウム・グルタミクムのセリン合成に関与
する３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ
Ｈ）遺伝子を、トリプトファン合成系遺伝子含有プラス
ミドに組み込み、得られた組換え体プラスミドをＰＧＤ
Ｈ遺伝子欠損株コリネバクテリウム・グルタミクム５Ａ
９５に保有させ、Ｌ−）リプトファンの生産試験を行っ
たところ、プラスミド保有株のみを選択的に増殖させる
ことができた。

（１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
３１８３３の染色体ＤＮＡおよび組換え体プラスミドｐ
ｃＤｔｒｐ１５７とベクターｐｃＧ１１６の調製：ＮＢ
培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１βに
含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で増殖したコリネ
バクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３１１１１３３の
種培１２０−を、半合成培地５５Ｍ〔グルコース２０　
ｇｌ（ＮＨａＬａＳＯ４１０ｇ１尿素３ｇ、酵母エキス
Ｉｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ。

ＭｇＣ！！２−６８２００．４ｇ、Ｆｅ５０．−７８，
０１０ｍｇ、　Ｍｎ　ＳＯ−・４〜６　Ｈ２Ｏ０，２ｍ
ｇ。

ＺｎＳＯ４７Ｈｚ○０．９ｍｇ、Ｃｕ５Ｏａ・５Ｈ２０
０，４ｍｇ、ＮａｚＢａＯｖ・１０Ｈ２００，０９ｍｇ
、（ＮＨ４）６ＭＯｑＯ２４・４　Ｈ２Ｏ０，０４ｍｇ
、ビオチン３０ｕｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水
ｌｌに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地１４００ｍ１
に接種して３０℃で振盪培養した。東京光電比色計で６
６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定（以下特記しな
いかぎり吸光度は６６０ｎｍで測定）し、ＯＤが０．２
になった時点で培養液へ０．５単位／ｍｌの濃度となる
ようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を継続し、
ＯＤが０．６になるまで生育させた。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液［０，０３Ｍ）
リス　（ヒドロキシメチル）アミノメタン（に１下トリ
スと略す）、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム（Ｊ：ｉ下、ＥＤＴＡと略す）、０．０５Ｍ　
　ＮａＣ１、ｐＨ８，０］で洗浄後、リゾチーム溶液（
２５％ショ糖、０．１Ｍ　　ＮａＣ１！、０．０５Ｍ）
リス、０．８＋ｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８，０）１０
ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応を行った。集菌した
菌体から斎藤−三浦の方法［５ａｉｔｏ、　Ｈ，ａｎｄ
　Ｍｉｕｒａ、に、：バイオキミ力・工・バイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃ
ｔａ）、７２．６１９＜１９６３）　Ｅに従って高分子
染色体ＤＮＡを単離した。

組換え体プラスミドｐｃＤｔｒｐ１５７は、特開平１−
２６５８９２に開示されたコリネバクテリウム・グルタ
ミクムの３−デオキシ−Ｄ−アラビノーヘブツロソネー
トー７−ホスフェートシンターゼ遺伝子およびトリプト
ファン合成系遺伝子群を含むプラスミドである（第１図
参照）。

ベクターとして用いるｐｃ０１１６は、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドｐＣＧ１１（特開昭５
７−１３４５００）上の５ｔｕｌおよびＰｓｔＩ切断部
位に、Ｍ１３　　ｍｐ１８ＲＦＤＮＡ（宝酒造社製）を
ＥｃｏＲＩで切断後、クレノー断片（宝酒造社製）で平
滑末端に修復し、さらにｐｓｔｌで切断して得たリンカ
−を両者の各々、平滑末端、接着末端を利用して結合さ
せたプラスミドである。ｐｃＧ１１６は分子長約６．５
　Ｋ　ｂのプラスミドで、単一の制限酵素切断部位とし
てＢｇｆＩＩ、Ｐｓｔｌ。

５ａｊ７Ｉ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ。

Ｋｐｎ　ｒおよび５ａｃｌを有し、ストレブトマイシン
および／またはスペクチノマイシン耐性の表現型を与え
る（第１図参照）。

ｐｃＤｔｒｐ１５７およびｐｃＧ１１６は各々を保有す
るコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３
３から次の方法でそれぞれ単離した。

ｐｃＤｔｒｐ１５７またはｐＣｏ　１１６を保有するコ
リネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３を
、４００ｍ１Ｓ　５Ｍ培地で、３０℃にて振盪培養し、
上記と同様にしてペニシリンＧ処理後、ＯＤが約０．６
になるまで生育させた。菌体を集菌しＴＥＳ！ｌ衝液で
洗浄後、リゾチーム溶液１０ｍ１に懸濁し、３７℃で２
時間反応させた。反応液に５Ｍ　ＮａＣ１２，４ｕｌ、
０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，５）０．６ｕｌ、４
％ラウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ　　ＮａＣ１から
なる溶液４．４ｕｌを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水上に１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４
℃で６０分間６９．４００　Ｘ　’ｇの遠心分離にかけ
上澄液を回収した。これに重量百分率１０％相当のポリ
エチレングリフール（ＰＥＧ）６．０００（半井化学薬
品社製）を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置い
た。１０時間後、１．５００Ｘｇで１０分間遠心分離し
てペレットを回収した。ＴＢＳ緩衝緩衝液５奎ｌえてペ
レットを静かに再溶解してから１．５■／ｍｌエチジウ
ムブロマイド２．０ｕｌを添加し、これに塩化セシウム
を加えて静かに溶解し、密度を１．５８０に合わせた。

この溶液を１０５．０００Ｘｇ、１８℃で４８時間超遠
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面か
ら注射器で抜きとることによって、ｐｃＤｔｒｐ１５７
およびｐｃＧ１１６ブラスミドＤＮＡをそれぞれ分離し
た。この分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔
容量百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥ
Ｓｉｌ衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを
含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除
去し、しかる後にＴＥＳ緩衝液に対して透析した。

（２）　　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片のク
ローニング； 上記（１）で、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣ３１８３３から調製したｐｃＧ１１１１ｉプラスミ
ドＤＮＡ３Ｊ１ｇを含む反応液Ｙ−１００（トリス１０
ｍＭ５ＭｇＣ１２６ｍＭ、ＮａＣｆ１００ｍＭ５ｐＨ７
，５）６０ｕｌに６単位のＳａｆ■　（全酒造社製、以
下特記しない限り、制限酵素は全酒造社製）を添加し、
３７℃で６０分間反応させた。一方、コリネバテリウム
・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡ３■
を含むＹ−１００反応液１４０〃に６単位の５ａＩＩを
添加し、３７℃で６０分間反応させた。いずれも６５℃
で１０分間加温して、反応を停止させた。

両反応液を混合し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用緩衝液
（トリス６６０　ｍＭ、　Ｍ　ｇ　Ｃ１２６６ｍＭ、ジ
チオスレイトール１００ｍＭ。

ｐＨ７，６）４０ｍ、５ｍＭ　　ＡＴＰ、Ｔ４　リガー
ゼ（全酒造社製）３００単位および水１２０４を加え、
１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＲ９５７（コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ３１８３３よりセリン要求性変異株として誘導さ
れたＰＧＤＨ遺伝子欠損株）の形質転換に供した。Ｒ３
５７株の種培養４ｍｌを、セリン１００■／ｍｌを含む
８８Ｍ培地４０−に植菌して３０℃で振盪培養した。

ＯＤが０．２になった時点で上記（１）と同様な方法で
ペニシリンＧ処理後、ＯＤが０．６になるまで生育させ
た。菌体を集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース
５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５　ｇ、に２Ｈ
ＰＯｎ　３．５　ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ５ＭｇＣ１
ｚ・６ＨｗＯＯ，４１ｇ５ＦｅＳＯａ・７Ｈ２０ｌ　Ｑ
　ｍｇ、　Ｍｎ　Ｓ○、・４〜６Ｈ２０２■、Ｚｎ５Ｏ
＝７Ｈ２００，９■、（Ｎ　Ｈ、）。

Ｍｏ７（Ｌ４’４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン３０■
、サイアミン塩酸塩２■、コハク酸二ナトリウム１３５
ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０
ｇを水ＩＩｌに含む培地〕に１■／ｍｌのリゾチームを
含む溶液（ｐＨ７，６）１０１Ｔ１１に約１０’細胞／
ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で
１６時時間巾かに振盪反応してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液０．５ｍｌを小試験管にとり、
２，５００Ｘｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（
ＭｇＣ１２１０ｍＭ、ＣａＣｆａ３０ｍＭ、トリス５０
ｍＭ、　　ショ糖４００ｍＭ。

ｐＨ７，５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ
！ｌ！ｆ液０．１ｍｌに再懸濁した。コノ菌液に２倍高
濃度の７３ＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混
合液１００威を加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中
に２０％ＰＥＧ６，０００を含む液０．８ｍｌを添加し
て混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍ
ｌを添加し、２．５００ｘｇで５分間遠心分離にかけて
上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲ
ＣＧＰ培地に懸濁してから、この菌液０．２ｍｌをスペ
クチノマイシン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地
（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２
）に塗布し、３０℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき築島、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この
菌液をスペクチノマインン１１００ＡＬ／ｄを含有する
最少寒天培地Ｍ１〔グルコース１０ｇ、　　（ＮＨ，）
Ｈ２ＰＯ４１ｇ。

ＫＣｌ　　０．２ｇ５Ｍｇ５Ｏ，・７８２００．２ｇ。

Ｆｅ５Ｏ＝７８−０１０ｍｇ、　Ｍｎ　ＳＯ２・４〜６
Ｈ，００７２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＋・”、８２００．９ｍｇ
。

Ｃｕ５Ｏａ・５ＨｚＯＯ，４ｍｇ、Ｎａ５Ｂ４０ｔ’１
０Ｈ２００，０９ｍｇ、　（ＮＨ＜）６Ｍｏ７０２＜−
４）（、ＯＯ，０４ｍｇ、ビオチン５０ｑ、ｐ−アミノ
安息香酸２．５ｍｇ、サイアミン塩酸塩１ｍｇおよび寒
天１６ｇを水１１中に含み、ｐＨ７，２に調整した培地
〕上に再塗布して３０℃で３日間培養し、スペクチノマ
イシン耐性で、セリン非要求性となった形質転換株を選
択した。これろの形質転換株から上記（１）と同様な方
法によりプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一
株がら得られ、ｐｃｓｅｒ５７１と命名したプラスミド
は、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気
泳動で解析した結果、ｐｃＧ１１６のＳａｊ’　Ｉ切断
部位に２．７　ｋｂの５ａｉｌ　　ＤＮＡ断片が挿入さ
れた構造を有していることがわかった（第１図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
およびｐｃｓｅｒ５７１を保有する形質転換株につＬ）
て、ＰＧＤＨ活性をＥ、　Ｓｕｇｉｍｏｔ。

とり、　１．　Ｐｉｚｅｒの方法ごジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　８ｉｏ１．　Ｃ
ｈｅｍ、　＞２４３．２０８１　（１９６８）に従って
測定した。＾ＴＣＣ３１８３３株のＰＧＤＨ活性を１と
したときのｐｃｓｅｒ５７１を保有する形質転換株のＰ
ＧＤＨ活性は約１３倍に増加していたことから、ｐｃｓ
ｅｒ５７１に挿入されている２、　７　ｋｂのＤＮＡ断
片上に、ＰＧＤＨ遺伝子が存在することを確認した。

（３）　　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片のｐ
ＣＤｔｒｐ１５７への連結： ｐｃｓｅｒ５７１プラスミドＤＮＡ３Ｍを含むＹ−１０
０反応液１００頭に６単位の）３ａｍＨＩを添加し、３
７℃で６０分間反応後、アガロースゲルから１．４　ｋ
ｂのＤＮＡ断片を分画した。

また、ｐｃＤｔｒｐ１５７プラスミドＤＮＡ３■を含む
Ｙ−１００反応液１００μｇに６単位のＢａｍＨＩを加
え、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温し
て反応を停止させた。

両反応液を混合し、２容のエタノールを加えてＤ　Ｎ　
Ａを沈澱回収後、水２００μＱに溶解した。

このＤ　Ｎ　Ａ溶液２００頭に１０倍濃度のＴ４リガー
ゼ用緩衝液４Ｌ＋！！、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０４、Ｔ４
リガーゼ３００単位および水１２０４を加え、１２℃で
１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、Ｒ５５７株を上記（
２）と同様な方法により形質転換した。

スペクチノマイシン４０ＯＡＬｇ／ｄを含むＲＣＧＰ寒
天培地上に生育したスペクチノマイシン耐性コ〇ニーを
かき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１
−に懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン１００ｇ
／−を含有する最生寒天培地Ｍ１上に再塗布して３０℃
で３日間培養し、スペクチノマイシン耐性で、セリン非
要求性となった形質転換株を選択した。これらの形質転
換株から上記（１）と同様な方法によりプラスミドＤＮ
Ａを単離した。形質転換株の一株から得られ、ｐＤＴＳ
９９０１と命名したプラスミドは、各種制限酵素による
切断産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐ
ｃＤｔｒｐ１５７のＢａｍＨＩ切断部位に１．４　ｋｂ
のＢａｍＨＩ断片が挿入された構造を有していることが
わかった（第１図参照）。このようにして作製したｐＤ
Ｔｓ９９０１を保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ２１８５４（コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡ　Ｔ　ＣＣ１３０３２から誘導されたフェニル
アラニンおよびチロシンの要求株）株は、平成１年６月
２日付で、コリネバクテリウム・グルタミクムＫ　８２
　（ＦＥＲＭＢＰ−２４４４）として工業技術院微生物
工業技術研究所（微工研）に、ブダペスト条約に基づい
て寄託されている。

（４）　　ｐ　ＣＤ　ｔ　ｒ　ｐ　１５７またはｐＤＴ
ｓ９９０１を保有する菌株によるＬ−）リブトファンの
生産およびプラスミドの安定性： コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１８５４
（コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２から誘導されたフェニルアラニンおよびチロシンの要
求株）およびコリネノ゛くクテリウム・グルタミクム５
Ａ９５（コリネバクテリウム・グルタミクムＡ　Ｔ　Ｃ
Ｃ２１８５４より、セリン要求性変異株として誘導され
たＰＧＤＨ遺伝子欠損株）（平成２年９月２１日付で微
工研にＦＥＲＭ　ＢＰ−３１０８として寄託）の種培養
４ゴをフェニルアラニン、チロシンおよびセリン各１０
０■／−を含むＳＳＭ培地４０ｍ１に植菌して、３０℃
で振盪培養した。ＯＤが０．２になった時点で上記（１
）と同様な方法でペニシリンＧ処理後、ＯＤが０．６に
なるまで生育させた。

菌体を集菌し、該細胞を上記（２）と同様な方法により
リゾチーム処理して、プロトプラスト化した。このプロ
トプラストをｐｃＤｔｒｐ１５７およびｐＤＴｓ９９０
１を用いて、上記（２）と同様な方法により形質転換し
た。スペクチノマイシン耐性となった形質転換株から、
上記（１）と同様な方法によりプラスミドＤＮＡを単離
した。

これらのプラスミドの各種制限酵素での切断解析により
、形質転換株が、ｐｃＤｔｒｐ１５７またはｐＤＴｓ９
９０１を保有することを確認した。

形質転換株のＬ　−）　Ｕブトファン生産試験を、大型
試験管により次のように行った。

種培地ＳＩＣグルコース２０ｇ、ポリペプトン１５ｇ、
＃母エキス１５ｇ、ＮａＣｊ！２．５ｇ。

尿素１ｇ５Ｌ−チロシン２００■、Ｌ−フェニルアラニ
ン２００■を水ｌ！に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培
地：・３ゴ中で３０℃、２４時間振盪培養した種培養０
．５ｍｌを生産培地Ｐ１　〔グルコース６０　ｇ、ＫＨ
２ＰＯ４１ｇ１ＫａＨＰＯ４１ｇ、Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈｚ
ＯＩｇ。

（ＮＨ，）２Ｓ○＜２０ｇ、コーン・スチープ・リカー
１０　ｇ、　Ｍｎ　８０４１０ｍｇ、ヒ゛才チン３０■
、Ｃａ　ＣＯｓ　２０　ｇを水１βに含み、ｐ　Ｈ７，
２に調整した培地〕５ｍｌの入った大型試験管に接種し
、３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養ｐ液を
高速液体クロマトグラフィーを用いた○ＰＡポストカラ
ム誘導体化法により定量して、Ｌ−）！Ｉブトファンの
生成量を測定した。

プラスミドの安定性試験は、培養終了時の培養液を希釈
後、ＮＢ寒天培地上に塗布してコロニー分離し、得られ
たコロニーをスペクチノマイシン１００■／−を含むＮ
Ｂ寒天培地に移植して、同培地上での生育の有無を観察
することによって行った。

第１表から明らかなように、ｐＤＴｓ９９０１を保有す
る５Ａ９５株は、プラスミドが培養終了時まで安定に保
持されている。

第　　　１　　　表 ＡＴＣＣ２１８５４／ｐｃＤｔｒｐ１５７　　　　　４
．３　　　　　６８実施例２ コリネバクテリウム・グルタミクムのセリン合成に関与
するＰＧＤＨ遺伝子をスレオニン合成系遺伝子含有プラ
スミドに組み込み、得られた組換え体プラスミドＰＧＤ
Ｉ（遺伝子欠損株コリネバクテリウム・グルタミクム５
Ａ２４に保有させ、Ｌ−スレオニンの生産試験を行った
ところ、プラスミド保有株のみを選択的に増殖させるこ
とができた。

〔１〕　　組換え体プラスミドｐｃｈｏｍｌｏおよびベ
クターｐｃＧ１１５の調製： ｐ　Ｃｈ　ｏ　ｍ　１０は、特開昭６２−９１１９３に
開示されたコリネバクテリウム・グルタミクムのホモセ
リンデヒドロゲナーゼ（ＨＤ）遺伝子とホモセリンキナ
ーゼ（ＨＫ）遺伝子を含む３゜６ｋｂのＤＮＡ断片が、
ベクターｐＣＥ５４（特開昭５８−１０５９９９）のＳ
ａｄ　Ｉ切断部位に挿入されたプラスミドである（第２
図参照）。

ベクターとして用いるｐｃＧ１１５は、プラスミドｐｃ
Ｇ１１（特開昭５７−１３４５００）上のＢｇｌ■およ
びＰｓｔＩ切断部位に、Ｍ１３　　ｍｐ１８ＲＦ　　Ｄ
ＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断したリンカ−を
、両者の同一接着末端を利用して結合させたプラスミド
である。ｐｃＧ１１５は分子長駒６．４　ｋｂのプラス
ミドで、単一の制限酵素切断部位としてＸｂａ　ｌ５Ｓ
ａ１１およびＰｓｔＩを有し、ストレプトマイシンおよ
び／またはスペクチノマイシン耐性の表現型を与える（
第２図参照）。

ｐｃｈｏｍｌＯおよびｐｃＧｌ　１５は、各々を保有す
るコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３
３の培養菌体から、実施例１（１〕と同様な方法により
単離した。

（２）ＨＤ遺伝子とＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片のｐｃ
Ｇ１１５への連結： 上記（１）で調製したｐｃｈｏｍｌＯプラスミドＤＮＡ
およびｐｃＧ１１５プラスミドＤＮＡを各々３ｇ含むＹ
−１００反応液２００誠に、６単位の５ａＩｌＩを添加
し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加熱し
て反応を停止させた。

このＤＮＡ溶液２００ｍに１０倍濃度のＴ４リガーゼ用
緩衝液４０４．５ｍＭ　ＡＴＰ　　４０頭、Ｔ４リガー
ゼ３００単位および水１２０〃を加え、１２℃で１６時
間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、コリネバクテリウム
・グルタミクムに５４　（コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ３１８３３よ　　１リスレオエン要求性
変異株として誘導されたＨＫ遺伝子欠損株）　　（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−８２５８）を実施例１（２）と同様な方法に
より形質転換した。スペクチノマイシン４００ｕｇ／−
を含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したスベクチノマイシ
ン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄
後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この菌液をスペクチ
ノマイシン１００■／−を含有する最少寒天培地Ｍｌ上
に再塗布して３０℃で３日間培養し、スペクチノマイシ
ン耐性で、スレオニン非要求性となった形質転換株を選
択した。これらの形質転換株から、実施例１（１）と同
様な方法により、プラスミドＤＮＡを単離した。形質転
換株の一株から得られ、ｐｃＧｈｏｍｌＯと命名したプ
ラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＧ１１５の５ａ１１
切断部位に３．６　ｋｂのＳａｆ’１断片が挿入された
構造を有していることがわかった（第２図参照）。

Ｆ３）　　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片のｐ
ｃＧｈｏｍｌ。

への連結： ｐｃｓｅｒ５７１プラスミドＤＮＡ３．を含むＹ−１０
０反応液１００頭に、６単位の５ａｄＩを添加し、３７
℃で６０分間反応後、アガロースゲルから２．７　ｋｂ
のＤＮＡ断片を分画した。

また、ｐｃＧｈｏｍｌ　ＯプラスミドＤＮＡ３Ｍを含む
Ｙ−１００反応液１００ｄに、０．５単位の５ａＩＩを
加え、３７℃で１０分間部分消化後、アガロースゲルか
ら１０．０　ｋｂのＤＮＡ断片を分画した。両反応液を
混合し、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収後
、水２００４に溶解した。

このＤＮＡ溶液２００城に、１０倍濃度のＴ４リガーゼ
用緩衝液４０ｄ、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０４、Ｔ４リガー
ゼ３００単位および水１２０４を加え、１２℃で１６時
間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、Ｒ５５７株を実施例
１〔１）と同様な方法により形質転換し、スペクチノマ
イシン耐性でセリン非要求性となった形質転換株を選択
した。形質転換株の一株から得られ、ｐＣＨ３１０と命
名したプラスミドは、各種制限酵素による切断産物をア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＧｈｏｍ１
０上に２カ所ある５ａｆＩ切断邪切断一方に、２、７　
ｋｂの３ａＪ　Ｉ断片が挿入された構造を有しているこ
とがわかった（第２図参照）。

（４）　ｐｃＧｈｏｍｌＯまたはｐＣＨ５１０を保有す
る菌株によるＬ−スレオニン生産およびプラスミドの安
定性： コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
およびコリネバクテリウム・グルタミクム５Ａ２４（コ
リネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２よ
りセリン要求性変異株として誘導されたＰＧＤＨ遺伝子
欠損株）を、ｐｃＧｈｏｍｌ　ＯおよびｐＣＨ５１０を
用いて、実施例１（２）と同様な方法により形質転換し
た。スペクチノマイシンに耐性となった形質転換株から
、実施例１（１）と同様な方法によりプラスミドＤＮＡ
を単離した。これらのプラスミドの各種制限酵素による
切断解析の結果、形質転換株がｐｃＧｈｏｍｌｏまたは
ｐＣＨ３１０を保有することを確認した。

形質転換株のし一スレオニン生産試験を大型試験管によ
り、次のように行った。

グルコース２％を含むＮＢ培地３ｍｌ中で３０℃、２４
時間振盪培養した種培養０．５　ｒＩＪｌを、生産培地
Ｔ〔廃糖蜜２００　ｇ、　ＫＨ２Ｐ　Ｏｓ　０．３　ｇ
−Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ，００，４ｇ、（ＮＨ，）２３
０゜２０ｇ、Ｆｅ５Ｏａ・７Ｈ２０１０■、Ｍｎ５Ｏ。

・４〜６Ｈ，０１０■、コーン・スチーブ・リカー８ｇ
１サイアミン塩酸塩２００■、ビオチン２００ｕｇＳＣ
ａ　ＣＯ３４０ｇを水１１に含み、ｐＨ７，２に調整し
た培地〕５ｍｌの入った大型試験管に接種し、３０℃で
７２時間振盪培養した。培養後、培養Ｐ液を高速液体ク
ロマトグラフィーを用いた○ＰＡボストカラム誘導体化
法により定量して、Ｌ−スレオニンの生成量を測定した
。プラスミドの安定性試験は、実施例１（４）と同様な
方法により行った。

第２表から明らかなように、ｐＣＨ３１０を保有する５
Ａ２４株は、プラスミドが培養終了時まで安定に保持さ
れている。

第　　　２　　　表 ＾ＴＣＣ１３０３２／Ｉ］ＣＧｈｏｍｌＯ１，９８５＾
ＴＣＣ１３０３２／ｐｃＨ５１０１，９８１発明の効果 本発明によれば、宿主にセリン要求性変異を付与し、そ
れを相補する遺伝子を組換え体プラスミドに保有させる
ことで、プラスミド保有株のみを安定に継代培養するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＤＴ３９９０１の制限酵素切断地図とその作
製工程を示す。太い実線部分の染色体ＤＮＡ断片上には
ＤＳ遺伝子が、斜線部分の染色体ＤＮＡ断片上にはトリ
プトファン生合成遺伝子が、また破線部分の染色体ＤＮ
Ａ断片上にはＰＧＤＨ遺伝子が含まれている。 第２図はｐＣＨ５１０の制限酵素切断地図とその作製工
程を示す。太い実線部分の染色体ＤＮＡ断片上にはＨＤ
遺伝子とＨＫ遺伝子が、また破線部分のＤＮＡ断片上に
はＰＣＤＨ遺伝子が含まれている。 プラスミドの大きさはキロベース、（ｋｂ）で表示され
ている。 第１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属し、セリン要求性を有する微生物に、該セリン要
   求性を相補する遺伝子および所望の遺伝子を組み込んだ
   組換え体プラスミドを導入して得られる形質転換株を培
   地に培養し、培養物中に該形質転換株が生産する物質を
   生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特
   徴とする物質の製造法。
2. （２）所望の遺伝子が、物質の生合成に関与する遺伝子
   である請求項１記載の製造法。
3. （３）物質がアミノ酸である請求項１または２記載の製
   造法。