JPH06277082A - アラニンの製造法 - Google Patents
アラニンの製造法Info
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- JPH06277082A JPH06277082A JP4342709A JP34270992A JPH06277082A JP H06277082 A JPH06277082 A JP H06277082A JP 4342709 A JP4342709 A JP 4342709A JP 34270992 A JP34270992 A JP 34270992A JP H06277082 A JPH06277082 A JP H06277082A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 工業的に効率よく安価にアラニンを製造す
る。 【構成】 エシェリヒア属、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼ活性を有し、かつアラニン生産能を有する微生
物を培地に培養し、培養物中にアラニンを生成蓄積さ
せ、該培養物からアラニンを採取することを特徴とする
アラニンの製造法に関する。
る。 【構成】 エシェリヒア属、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼ活性を有し、かつアラニン生産能を有する微生
物を培地に培養し、培養物中にアラニンを生成蓄積さ
せ、該培養物からアラニンを採取することを特徴とする
アラニンの製造法に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるＤＬ−、
Ｌ−またはＤ−アラニンの製造法に関する。ＤＬ−アラ
ニンは食品工業等において、Ｌ−アラニンは医薬、食品
工業において、Ｄ−アラニンは医薬品工業においてそれ
ぞれ利用される有用なアミノ酸である。
Ｌ−またはＤ−アラニンの製造法に関する。ＤＬ−アラ
ニンは食品工業等において、Ｌ−アラニンは医薬、食品
工業において、Ｄ−アラニンは医薬品工業においてそれ
ぞれ利用される有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】ＤＬ−アラニンの製造法としては、アセ
トアルデヒドと青酸、アンモニアを原料とするいわゆる
ストレッカー反応による合成法の他、ミクロバクテリウ
ム・アンモニアフィラムによる糖質からの発酵法による
生産方法（特開昭50-10028）などが知られている。Ｌ−
アラニンの製造法としては、Ｌ−アスパラギン酸を酵素
的に脱炭酸する方法（特公昭46-7560）、Ｄ−アラニン
要求性の大腸菌による乳酸とアンモニア供与体からの製
造法（特開昭62-36196）などの酵素的な方法、コリネバ
クテリウム・チュメセンス（特公昭36-14298）を用いた
発酵法による糖質からの製造法が知られている。また本
出願人はアースロバクター属細菌を用いた発酵法による
糖質からの製造法（国際出願JP91-01574）を出願してい
る。Ｄ−アラニンの製造法としては、アースロバクター
属細菌のＤ−アミダーゼを用いて、ＤＬ−アラニンアミ
ドを加水分解し、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンアミドを
生成させた後、該反応物よりＤ−アラニンを採取する方
法（特開平1-317387）やブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムより誘導したＤ−サイクロセリン耐性変異
株による糖質からの発酵生産方法（特開平1-187091）な
どが知られている。
トアルデヒドと青酸、アンモニアを原料とするいわゆる
ストレッカー反応による合成法の他、ミクロバクテリウ
ム・アンモニアフィラムによる糖質からの発酵法による
生産方法（特開昭50-10028）などが知られている。Ｌ−
アラニンの製造法としては、Ｌ−アスパラギン酸を酵素
的に脱炭酸する方法（特公昭46-7560）、Ｄ−アラニン
要求性の大腸菌による乳酸とアンモニア供与体からの製
造法（特開昭62-36196）などの酵素的な方法、コリネバ
クテリウム・チュメセンス（特公昭36-14298）を用いた
発酵法による糖質からの製造法が知られている。また本
出願人はアースロバクター属細菌を用いた発酵法による
糖質からの製造法（国際出願JP91-01574）を出願してい
る。Ｄ−アラニンの製造法としては、アースロバクター
属細菌のＤ−アミダーゼを用いて、ＤＬ−アラニンアミ
ドを加水分解し、Ｄ−アラニンとＬ−アラニンアミドを
生成させた後、該反応物よりＤ−アラニンを採取する方
法（特開平1-317387）やブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムより誘導したＤ−サイクロセリン耐性変異
株による糖質からの発酵生産方法（特開平1-187091）な
どが知られている。
【０００３】遺伝子組換え技術を用いた方法としては、
バチルス属細菌のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子
をザイモモナス属菌に導入して少量のアラニンを生産し
た報告がある〔アプライド・エンヴィロンメンタル・ミ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol. ), 57,
1360(1991) 〕。
バチルス属細菌のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子
をザイモモナス属菌に導入して少量のアラニンを生産し
た報告がある〔アプライド・エンヴィロンメンタル・ミ
クロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol. ), 57,
1360(1991) 〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】食品添加物として有用
なＤＬ−アラニン、食品添加物やアミノ酸輸液の成分と
して有用なＬ−アラニン、医薬品工業ににおいて有用な
Ｄ−アラニンを工業的により安価に製造する方法の開発
が求められている。ＤＬ−アラニンの安価な化学合成法
であるストレッカー反応は、有害なシアンを原料として
用いており、食品添加物としての用途の面からは必ずし
も望ましい生産方法とはいえない。
なＤＬ−アラニン、食品添加物やアミノ酸輸液の成分と
して有用なＬ−アラニン、医薬品工業ににおいて有用な
Ｄ−アラニンを工業的により安価に製造する方法の開発
が求められている。ＤＬ−アラニンの安価な化学合成法
であるストレッカー反応は、有害なシアンを原料として
用いており、食品添加物としての用途の面からは必ずし
も望ましい生産方法とはいえない。
【０００５】光学活性なＬ−あるいはＤ−アラニンを製
造するには、煩雑な光学分割操作を必要とする化学合成
法に比べ、光学分割操作を必要としない酵素法や発酵法
が経済的に有利である。とりわけ発酵法は、安価な糖質
を原料として使用できる点で工業的に有利な製法であ
る。従来、知られている発酵法によるアラニンの製造法
は収率が低く、培養液中での蓄積量が低い等の欠点を有
しており、工業的な製法ではない。本発明者らは先に、
アースロバクター属に属しアラニンラセマーゼ活性が低
下または欠失した微生物が、糖質から著量のＬ−アラニ
ンを生成蓄積することを見いだした（国際出願JP91-015
74）。この発明におけるアラニン生産量は充分高いもの
であるが、発酵に長時間を要し、発酵時に生成する臭気
物質とアラニンの精製分離が難しいという問題点があ
る。
造するには、煩雑な光学分割操作を必要とする化学合成
法に比べ、光学分割操作を必要としない酵素法や発酵法
が経済的に有利である。とりわけ発酵法は、安価な糖質
を原料として使用できる点で工業的に有利な製法であ
る。従来、知られている発酵法によるアラニンの製造法
は収率が低く、培養液中での蓄積量が低い等の欠点を有
しており、工業的な製法ではない。本発明者らは先に、
アースロバクター属に属しアラニンラセマーゼ活性が低
下または欠失した微生物が、糖質から著量のＬ−アラニ
ンを生成蓄積することを見いだした（国際出願JP91-015
74）。この発明におけるアラニン生産量は充分高いもの
であるが、発酵に長時間を要し、発酵時に生成する臭気
物質とアラニンの精製分離が難しいという問題点があ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、エシェ
リヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有
し、かつアラニン生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物中にアラニンを生成蓄積させ、該培養物から
アラニンを採取することを特徴とするアラニンの製造法
を提供することができる。
リヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有
し、かつアラニン生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物中にアラニンを生成蓄積させ、該培養物から
アラニンを採取することを特徴とするアラニンの製造法
を提供することができる。
【０００７】さらに詳しくは、本発明は、アースロバク
ター属に属する微生物からクローン化したＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入
し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を保持させたエ
シェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を培地に培養し、該培養物中
にＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンを生成蓄積させ、該
培養物中からＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンを採取す
ることを特徴とするＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンの
製造法を提供する。
ター属に属する微生物からクローン化したＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入
し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を保持させたエ
シェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を培地に培養し、該培養物中
にＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンを生成蓄積させ、該
培養物中からＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンを採取す
ることを特徴とするＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンの
製造法を提供する。
【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
おけるＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する微生
物は組換えＤＮＡ技術を用いてＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子をクローニングし、それを含む組換え体プ
ラスミドを宿主微生物に導入することによって得られ
る。宿主微生物として用いるエシェリヒア属に属する微
生物としては、通常の大腸菌を用いることができるが、
好適にはＪＭ１０５株〔ジーン（GENE）,33 ,103(198
5)〕、ＭＭ２９４株〔クローニング・ベクター・ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Cloning Vectors, A Laborat
ory Manual ）1985年〕、ＨＢ１０１株、Ｗ３１１０株
〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）1982年；
以下、モレキュラー・クローニングという。〕などがあ
げられる。
おけるＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する微生
物は組換えＤＮＡ技術を用いてＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子をクローニングし、それを含む組換え体プ
ラスミドを宿主微生物に導入することによって得られ
る。宿主微生物として用いるエシェリヒア属に属する微
生物としては、通常の大腸菌を用いることができるが、
好適にはＪＭ１０５株〔ジーン（GENE）,33 ,103(198
5)〕、ＭＭ２９４株〔クローニング・ベクター・ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Cloning Vectors, A Laborat
ory Manual ）1985年〕、ＨＢ１０１株、Ｗ３１１０株
〔モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）1982年；
以下、モレキュラー・クローニングという。〕などがあ
げられる。
【０００９】また宿主微生物として用いるコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物と
しては、コリネ型グルタミン酸生産菌として知られてい
る微生物は全て用いることができるが、好適には下記の
菌株が用いられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０
３２ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣ
Ｃ１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８
６８ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９
６５ ブレビバクテリウム・ディバリカツム ＡＴＣＣ１４
０２０ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣ
Ｃ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９
２４０ これらの微生物から誘導された栄養要求性変異あるいは
薬剤耐性変異、さらにはそれらの変異を併せ持つ変異株
も宿主として用いることができる。
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物と
しては、コリネ型グルタミン酸生産菌として知られてい
る微生物は全て用いることができるが、好適には下記の
菌株が用いられる。 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０
３２ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣ
Ｃ１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８
６８ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９
６５ ブレビバクテリウム・ディバリカツム ＡＴＣＣ１４
０２０ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣ
Ｃ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９
２４０ これらの微生物から誘導された栄養要求性変異あるいは
薬剤耐性変異、さらにはそれらの変異を併せ持つ変異株
も宿主として用いることができる。
【００１０】本発明におけるＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子の供与源となる微生物としては、Ｌ−アラニ
ンデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物ならばいかなる
微生物でもよい。とりわけ、原核生物である細菌、たと
えばアースロバクター属、バチルス属、または放線菌に
属する菌株の遺伝子が望ましい。具体的には、アースロ
バクター・エスピーHAP1株（国際出願JP91-01574;FERM
BP-3644 ）があげられる。
ーゼ遺伝子の供与源となる微生物としては、Ｌ−アラニ
ンデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物ならばいかなる
微生物でもよい。とりわけ、原核生物である細菌、たと
えばアースロバクター属、バチルス属、または放線菌に
属する菌株の遺伝子が望ましい。具体的には、アースロ
バクター・エスピーHAP1株（国際出願JP91-01574;FERM
BP-3644 ）があげられる。
【００１１】遺伝子ＤＮＡを組み込むためのベクターと
しては、宿主とする微生物の中で自律複製できるもので
あればとくに限定されない。例えば、大腸菌を宿主とす
る場合には、ｐＢＲ３２２〔ジーン（GENE）,2,95(197
7) 〕、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＡＣＹＣ１７
７〔クローニング・ベクター・ア・ラボラトリー・マニ
ュアル（Cloning Vectors, A Laboratory Manual ）198
5年〕などが、またコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属細菌を宿主とする場合には、ｐＣＧ１
（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開昭５８
−３５１９７）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（いずれも特開
昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、
ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、
ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもモレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol. G
en. Genet.),196,175(1984) 〕などのプラスミドを使用
することができる。
しては、宿主とする微生物の中で自律複製できるもので
あればとくに限定されない。例えば、大腸菌を宿主とす
る場合には、ｐＢＲ３２２〔ジーン（GENE）,2,95(197
7) 〕、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＡＣＹＣ１７
７〔クローニング・ベクター・ア・ラボラトリー・マニ
ュアル（Cloning Vectors, A Laboratory Manual ）198
5年〕などが、またコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属細菌を宿主とする場合には、ｐＣＧ１
（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２（特開昭５８
−３５１９７）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（いずれも特開
昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、
ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、
ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもモレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol. G
en. Genet.),196,175(1984) 〕などのプラスミドを使用
することができる。
【００１２】Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制限酵素で切断し
た後、ＤＮＡリガーゼで処理するか、またはその切断末
端をターミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラー
ゼなどで処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させて結合
する常法〔メソッズ・イン・エンザイモロジィ（Method
s in Enzymology ）,68,(1979) 〕により種々の組換え
体混成物とともに生成させることができる。この混成物
を用いて、大腸菌（例えばＭＭ２９４株）を形質転換
し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する形質転
換株を選択後、この形質転換株の有するプラスミドを単
離することによって、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得できる。
る遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制限酵素で切断し
た後、ＤＮＡリガーゼで処理するか、またはその切断末
端をターミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラー
ゼなどで処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させて結合
する常法〔メソッズ・イン・エンザイモロジィ（Method
s in Enzymology ）,68,(1979) 〕により種々の組換え
体混成物とともに生成させることができる。この混成物
を用いて、大腸菌（例えばＭＭ２９４株）を形質転換
し、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する形質転
換株を選択後、この形質転換株の有するプラスミドを単
離することによって、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得できる。
【００１３】大腸菌の形質転換は、塩化カルシウムを用
いる一般的な方法〔モレキュラー・クローニング〕によ
って実施することができる。コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属微生物の形質転換は、プロトプ
ラストを用いる方法（特開昭５７−１８６４９２および
特開昭５７−１８６４９）により実施することができ
る。
いる一般的な方法〔モレキュラー・クローニング〕によ
って実施することができる。コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属微生物の形質転換は、プロトプ
ラストを用いる方法（特開昭５７−１８６４９２および
特開昭５７−１８６４９）により実施することができ
る。
【００１４】Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを宿主微生物の染色体に組み込ませる
こともできる。そのような組み込みは、該組換え体ＤＮ
Ａから宿主微生物中で自律複製する機能に関する領域
（レプリコン）を削除した組換え体ＤＮＡを作製後、こ
れを用いて宿主微生物を形質転換する方法〔ジーン（Ge
ne),107,61(1991)〕や、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ
遺伝子を宿主微生物中で自律複製できないベクターに挿
入した組換え体ＤＮＡを作製して、これを接合伝達によ
り他菌種、たとえば大腸菌から宿主として用いるコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に導
入する方法〔バイオテクノロジー（Bio/Technology),
9,84(1991)〕により実施することができる。
む組換え体ＤＮＡを宿主微生物の染色体に組み込ませる
こともできる。そのような組み込みは、該組換え体ＤＮ
Ａから宿主微生物中で自律複製する機能に関する領域
（レプリコン）を削除した組換え体ＤＮＡを作製後、こ
れを用いて宿主微生物を形質転換する方法〔ジーン（Ge
ne),107,61(1991)〕や、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ
遺伝子を宿主微生物中で自律複製できないベクターに挿
入した組換え体ＤＮＡを作製して、これを接合伝達によ
り他菌種、たとえば大腸菌から宿主として用いるコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に導
入する方法〔バイオテクノロジー（Bio/Technology),
9,84(1991)〕により実施することができる。
【００１５】宿主微生物中でプロモーター活性を有する
ＤＮＡ断片を該遺伝子上流域に組み込むことによってＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼを宿主微生物中で強く発現
させることができる。大腸菌を宿主とする場合は、この
目的にかなうプロモーターとしてラクトースオペロンの
プロモーターやトリプトファナーゼ遺伝子のプロモータ
ーなどを用いることができる。コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物を宿主とする
場合は、これらの菌株の染色体ＤＮＡまたはこれらの菌
株中で高発現することが既知である遺伝子を有するプラ
スミドＤＮＡを適当な制限酵素で切断して調製して得ら
れるプロモーター活性を有するＤＮＡ断片を、Ｌ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子上流域に挿入し、これを
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物に導入した後、Ｌ−アラニンデヒドロゲナー
ゼの発現が高まった形質転換体を選択することによっ
て、目的とするＤＮＡ断片を得ることができる。このよ
うな、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物中で高発現することが既知である遺伝
子を有するプラスミドとして、例えばコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＫ７５株（FERM BP-1874）が保有する
ｐＣｇｌｙＡ−１（特開平2-42994 ）をあげることがで
きる。
ＤＮＡ断片を該遺伝子上流域に組み込むことによってＬ
−アラニンデヒドロゲナーゼを宿主微生物中で強く発現
させることができる。大腸菌を宿主とする場合は、この
目的にかなうプロモーターとしてラクトースオペロンの
プロモーターやトリプトファナーゼ遺伝子のプロモータ
ーなどを用いることができる。コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物を宿主とする
場合は、これらの菌株の染色体ＤＮＡまたはこれらの菌
株中で高発現することが既知である遺伝子を有するプラ
スミドＤＮＡを適当な制限酵素で切断して調製して得ら
れるプロモーター活性を有するＤＮＡ断片を、Ｌ−アラ
ニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドのＬ−ア
ラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子上流域に挿入し、これを
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物に導入した後、Ｌ−アラニンデヒドロゲナー
ゼの発現が高まった形質転換体を選択することによっ
て、目的とするＤＮＡ断片を得ることができる。このよ
うな、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物中で高発現することが既知である遺伝
子を有するプラスミドとして、例えばコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＫ７５株（FERM BP-1874）が保有する
ｐＣｇｌｙＡ−１（特開平2-42994 ）をあげることがで
きる。
【００１６】以上のようにして得られた、Ｌ−アラニン
デヒドロゲナーゼ活性を有するエシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株による
ＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンの生産は、発酵法によ
るアミノ酸の製造に用いられる培養方法により行うこと
ができる。すなわち、形質転換株を炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気
的もしくは嫌気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ
培養を行えば、培養物中にＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラ
ニンが生成蓄積するので、これを採取する。
デヒドロゲナーゼ活性を有するエシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株による
ＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンの生産は、発酵法によ
るアミノ酸の製造に用いられる培養方法により行うこと
ができる。すなわち、形質転換株を炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気
的もしくは嫌気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ
培養を行えば、培養物中にＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラ
ニンが生成蓄積するので、これを採取する。
【００１７】炭素源としては、宿主微生物が資化できる
ものならばとくに制限はないが、例えばグルコース、フ
ラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、
グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水
化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマール酸、乳
酸、酢酸などの各種有機酸をあげることができる。窒素
源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど
の各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿素お
よび他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−アミ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーン スチープ リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその
消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。
ものならばとくに制限はないが、例えばグルコース、フ
ラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、
グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水
化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマール酸、乳
酸、酢酸などの各種有機酸をあげることができる。窒素
源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど
の各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿素お
よび他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−アミ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーン スチープ リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその
消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。
【００１８】さらに無機物としては、リン酸第一水素カ
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どを使用する。ビタミン、アミノ酸は、使用する培地の
炭素源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビ
オチン、サイアミン、グルタミン酸などを添加する。ま
た、使用する菌株が生育に特定の物質を要求する場合
は、その要求物質を添加する。
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どを使用する。ビタミン、アミノ酸は、使用する培地の
炭素源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビ
オチン、サイアミン、グルタミン酸などを添加する。ま
た、使用する菌株が生育に特定の物質を要求する場合
は、その要求物質を添加する。
【００１９】培養は、宿主微生物の酸素要求性に応じ、
振とう培養または通気攪はん培養などの好気的条件下、
あるいは静置培養などの嫌気的条件下に行う。また、好
気的条件下で培養を開始し、菌が適度に生育した時点で
振とうや通気攪はん条件を変え、酸素供給を制限した条
件下で培養を継続することによってより高い生産性を得
ることができる。培養温度は一般に２０〜５０℃が好適
である。培地のｐＨは中性付近に維持することが望まし
い。培養期間は通常１〜５日間で培地中にＤＬ−、Ｌ−
またはＤ−アラニンが蓄積する。
振とう培養または通気攪はん培養などの好気的条件下、
あるいは静置培養などの嫌気的条件下に行う。また、好
気的条件下で培養を開始し、菌が適度に生育した時点で
振とうや通気攪はん条件を変え、酸素供給を制限した条
件下で培養を継続することによってより高い生産性を得
ることができる。培養温度は一般に２０〜５０℃が好適
である。培地のｐＨは中性付近に維持することが望まし
い。培養期間は通常１〜５日間で培地中にＤＬ−、Ｌ−
またはＤ−アラニンが蓄積する。
【００２０】培養終了後、培養液から菌体を除去し、得
られた清澄液から濃縮晶析、活性炭処理あるいはイオン
交換樹脂処理などの公知の精製方法を用いてＤＬ−、Ｌ
−またはＤ−アラニンを単離回収できる。このようにし
て、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するエシェ
リヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌株を用いることにより、短時間の培養によって
高い収率でＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンを生産する
ことができる。これらの菌株は臭気物質を生成しないた
め、アースロバクター属に属する微生物で認められた臭
気物質の精製アラニンへの混入を回避でき、良質の標品
を得ることができる。
られた清澄液から濃縮晶析、活性炭処理あるいはイオン
交換樹脂処理などの公知の精製方法を用いてＤＬ−、Ｌ
−またはＤ−アラニンを単離回収できる。このようにし
て、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するエシェ
リヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌株を用いることにより、短時間の培養によって
高い収率でＤＬ−、Ｌ−またはＤ−アラニンを生産する
ことができる。これらの菌株は臭気物質を生成しないた
め、アースロバクター属に属する微生物で認められた臭
気物質の精製アラニンへの混入を回避でき、良質の標品
を得ることができる。
【００２１】以下に、本発明の実施例を示す。
【００２２】
実施例 （１）アースロバクター・エスピーHAP1株の染色体ＤＮ
Ａの調製 ＮＢＧ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、グ
ルコース１０ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７. ２に調
整した培地）で増殖したアースロバクター・エスピーHA
P1株の種培養２０ｍｌをＮＢＧ培地４００ｍｌに接種し
て３０℃で１０時間振とう培養した。
Ａの調製 ＮＢＧ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、グ
ルコース１０ｇを水１リットルに含み、ｐＨ７. ２に調
整した培地）で増殖したアースロバクター・エスピーHA
P1株の種培養２０ｍｌをＮＢＧ培地４００ｍｌに接種し
て３０℃で１０時間振とう培養した。
【００２３】培養液から菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液
〔0.03Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（以下トリスと略す）、0.005 Ｍ エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、0.05Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ８.０〕で洗浄後、リゾチーム溶液（２
５％ショ糖、0.1 Ｍ ＮａＣｌ、0.05Ｍ トリス、0.4m
g/ml リゾチーム、ｐＨ８.０）１０ｍｌに懸濁し、３
０℃で３０分間反応を行った。集菌した菌体から斎藤−
三浦の方法〔バイオキミカ エ バイオフィジカアクタ
（Biochi. Biophys. Acta ）, 72, 619(1963) 〕に従っ
て染色体ＤＮＡを単離した。
〔0.03Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（以下トリスと略す）、0.005 Ｍ エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、0.05Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ８.０〕で洗浄後、リゾチーム溶液（２
５％ショ糖、0.1 Ｍ ＮａＣｌ、0.05Ｍ トリス、0.4m
g/ml リゾチーム、ｐＨ８.０）１０ｍｌに懸濁し、３
０℃で３０分間反応を行った。集菌した菌体から斎藤−
三浦の方法〔バイオキミカ エ バイオフィジカアクタ
（Biochi. Biophys. Acta ）, 72, 619(1963) 〕に従っ
て染色体ＤＮＡを単離した。
【００２４】（２）アースロバクター・エスピーHAP1株
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング 以下の実施例における試験管内での制限酵素によるＤＮ
Ａの消化、ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの連結はすべて
宝酒造社製の制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用
い、製品に添付の反応条件下で実施した。
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング 以下の実施例における試験管内での制限酵素によるＤＮ
Ａの消化、ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの連結はすべて
宝酒造社製の制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用
い、製品に添付の反応条件下で実施した。
【００２５】大腸菌を宿主とした場合にベクターとして
用いたｐＵＣ１１９は宝酒造（株）より購入した。これ
ら及びこれらの誘導体プラスミドを保有する大腸菌から
のプラスミドの単離は、マニティスらにより記述された
方法〔モレキュラー・クローニング〕に従って行った。
大腸菌への形質転換はモレキュラー・クローニングに記
載してある方法に依って行った。
用いたｐＵＣ１１９は宝酒造（株）より購入した。これ
ら及びこれらの誘導体プラスミドを保有する大腸菌から
のプラスミドの単離は、マニティスらにより記述された
方法〔モレキュラー・クローニング〕に従って行った。
大腸菌への形質転換はモレキュラー・クローニングに記
載してある方法に依って行った。
【００２６】上記実施例（１）に記載した方法で取得し
たアースロバクター・エスピーHAP1株の染色体ＤＮＡ３
μｇおよびｐＵＣ１１９プラスミド１μｇを各々Ｐｓｔ
Ｉで完全に切断後、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼと反応さ
せた。このリガーゼ反応混合物を用いて大腸菌ＭＭ２９
４株を形質転換した。Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺
伝子を有する形質転換体の選択は、バイオケミストリー
25巻（１９８６）3268〜3274ページ〔Biochem., 25,326
8-3274（1986）〕に記載してある方法を改変して行っ
た。
たアースロバクター・エスピーHAP1株の染色体ＤＮＡ３
μｇおよびｐＵＣ１１９プラスミド１μｇを各々Ｐｓｔ
Ｉで完全に切断後、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼと反応さ
せた。このリガーゼ反応混合物を用いて大腸菌ＭＭ２９
４株を形質転換した。Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺
伝子を有する形質転換体の選択は、バイオケミストリー
25巻（１９８６）3268〜3274ページ〔Biochem., 25,326
8-3274（1986）〕に記載してある方法を改変して行っ
た。
【００２７】即ち、上記のリガーゼ反応混合物を用いて
形質転換したＭＭ２９４株を、アンピシリン１００ｍｇ
／ｌを含むＬ寒天培地〔バクトペプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ
７に調整した培地（Ｌ培地）に寒天を１．５％になるよ
うに加えた培地〕に塗布し30℃で一晩培養した。寒天培
地上に生じたコロニーをナイロンメンブレンフィルター
（Gelman Sciences社製 Bio TraceTMNT 82mm）に塗沫
した。塗沫された寒天培地は、マスタープレートとして
保存した。このフィルターを新たなＬ寒天培地上に置
き、30℃で３時間保温した後、57℃に１０分間保温し
た。フィルターをＬ寒天培地から剥し、ガラスシャーレ
中でトルエン蒸気に１０分間さらした。次いで、このフ
ィルターを、前処理溶液〔50mM Gly/KOH/KClバッファー
(pH9.0),2.6mM NAD(β-NicotinamideAdenine Dinucleot
ide)〕を浸み込ませた濾紙の上に置き、30℃で１時間保
温した後、染色液〔50mM Gly/KOH/KClバッファー(pH9.
0),1.3mM NAD,50mM Ｌ−アラニン,0.128mM PMS(Phenaz
ine Methosulfate),0.48mM NBT(Nitro Blue Tetrazoliu
m)〕を浸み込ませた濾紙の上に移した。室温で１０分間
放置後、青紫色に発色するコロニーに対応するマスター
プレート上のコロニーをＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
遺伝子を有する形質転換体として選択した（この手法を
以下、活性染色という。）。
形質転換したＭＭ２９４株を、アンピシリン１００ｍｇ
／ｌを含むＬ寒天培地〔バクトペプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１リットルに含み、ｐＨ
７に調整した培地（Ｌ培地）に寒天を１．５％になるよ
うに加えた培地〕に塗布し30℃で一晩培養した。寒天培
地上に生じたコロニーをナイロンメンブレンフィルター
（Gelman Sciences社製 Bio TraceTMNT 82mm）に塗沫
した。塗沫された寒天培地は、マスタープレートとして
保存した。このフィルターを新たなＬ寒天培地上に置
き、30℃で３時間保温した後、57℃に１０分間保温し
た。フィルターをＬ寒天培地から剥し、ガラスシャーレ
中でトルエン蒸気に１０分間さらした。次いで、このフ
ィルターを、前処理溶液〔50mM Gly/KOH/KClバッファー
(pH9.0),2.6mM NAD(β-NicotinamideAdenine Dinucleot
ide)〕を浸み込ませた濾紙の上に置き、30℃で１時間保
温した後、染色液〔50mM Gly/KOH/KClバッファー(pH9.
0),1.3mM NAD,50mM Ｌ−アラニン,0.128mM PMS(Phenaz
ine Methosulfate),0.48mM NBT(Nitro Blue Tetrazoliu
m)〕を浸み込ませた濾紙の上に移した。室温で１０分間
放置後、青紫色に発色するコロニーに対応するマスター
プレート上のコロニーをＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
遺伝子を有する形質転換体として選択した（この手法を
以下、活性染色という。）。
【００２８】選択した形質転換体がＬ−アラニンデヒド
ロゲナーゼ遺伝子を有することは、各形質転換体の細胞
抽出液中のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を以下の
ようにして測定することによって確かめた。即ち、選択
した形質転換体を１０ｍｌのＬ培地で１６時間培養した
後、菌体を遠心分離し５０ｍＭリン酸バッフアー（ｐＨ
７．５）１ｍｌに懸濁し、超音波破砕に供した。この超
音波破砕物を１０，０００rpm、４０分間遠心して得た
上清液をＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性測定に供し
た。Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼの活性測定は大島ら
の方法〔Eur.J.Biochem., 100, 29-39（1979）〕に従っ
て行った。
ロゲナーゼ遺伝子を有することは、各形質転換体の細胞
抽出液中のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性を以下の
ようにして測定することによって確かめた。即ち、選択
した形質転換体を１０ｍｌのＬ培地で１６時間培養した
後、菌体を遠心分離し５０ｍＭリン酸バッフアー（ｐＨ
７．５）１ｍｌに懸濁し、超音波破砕に供した。この超
音波破砕物を１０，０００rpm、４０分間遠心して得た
上清液をＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性測定に供し
た。Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼの活性測定は大島ら
の方法〔Eur.J.Biochem., 100, 29-39（1979）〕に従っ
て行った。
【００２９】Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ活性が確認
された１株よりプラスミドＤＮＡを単離した。得られた
プラスミドｐＯＢＰ１はベクターｐＵＣ１１９のＰｓｔ
Ｉサイトに約２．７キロベース（以下、ｋｂと略す）の
挿入断片を有していた（図１参照）。いくつかの制限酵
素について、この挿入ＤＮＡ断片上の切断部位を求め
た。こうして得られた挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
図２に示した。ｐＯＢＰ１の有する約２．７ｋｂのＰｓ
ｔＩ断片上におけるＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝
子の所在をより詳細に知るため、ｐＯＢＰ１から該遺伝
子含有ＤＮＡ断片のサブクローン化を行った。ＢａｍＨ
ＩとＨｐａＩで完全に消化したｐＯＢＰ１をアガロース
ゲル電気泳動にかけて、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を精
製した。このＤＮＡ断片０．５μｇとＢａｍＨＩとＳｍ
ａＩで完全に消化した０．５μｇのｐＵＣ１１９をＴ４
ＤＮＡリガーゼによる連結反応に供した。この反応混合
液を用いて大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換した。選択培
地としてはアンピシリン１００ｍｇ／ｌ、ＩＰＴＧ（is
opropyl-β-D-thiogalactopyranoside）０．１ｍＭ、Ｘ
−Ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactos
ide）４０ｍｇ／を含むＬ寒天培地を用いた。生じた白
色コロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを単離し、
ｐＯＢＰ３１１と名付けた。
された１株よりプラスミドＤＮＡを単離した。得られた
プラスミドｐＯＢＰ１はベクターｐＵＣ１１９のＰｓｔ
Ｉサイトに約２．７キロベース（以下、ｋｂと略す）の
挿入断片を有していた（図１参照）。いくつかの制限酵
素について、この挿入ＤＮＡ断片上の切断部位を求め
た。こうして得られた挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
図２に示した。ｐＯＢＰ１の有する約２．７ｋｂのＰｓ
ｔＩ断片上におけるＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝
子の所在をより詳細に知るため、ｐＯＢＰ１から該遺伝
子含有ＤＮＡ断片のサブクローン化を行った。ＢａｍＨ
ＩとＨｐａＩで完全に消化したｐＯＢＰ１をアガロース
ゲル電気泳動にかけて、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を精
製した。このＤＮＡ断片０．５μｇとＢａｍＨＩとＳｍ
ａＩで完全に消化した０．５μｇのｐＵＣ１１９をＴ４
ＤＮＡリガーゼによる連結反応に供した。この反応混合
液を用いて大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換した。選択培
地としてはアンピシリン１００ｍｇ／ｌ、ＩＰＴＧ（is
opropyl-β-D-thiogalactopyranoside）０．１ｍＭ、Ｘ
−Ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactos
ide）４０ｍｇ／を含むＬ寒天培地を用いた。生じた白
色コロニーの培養菌体からプラスミドＤＮＡを単離し、
ｐＯＢＰ３１１と名付けた。
【００３０】ｐＯＢＰ３１１を有するＪＭ１０５株を１
０ｍｌのＬ培地およびＩＰＴＧ 0.1Ｍを含むＬ培地で１
６時間培養した後、菌体を遠心分離し５０ｍＭリン酸バ
ッフアー（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁し、超音波破砕に
供した。この超音波破砕物を１０，０００rpm、４０分
間遠心して得た上清液を上記同様Ｌ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼ活性測定に供したところ、ＩＰＴＧを加えて培
養した細胞の抽出液にはＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
活性が検出されたが、ＩＰＴＧを加えずに培養した細胞
の抽出液には該酵素活性は検出されなかった。この結果
より、ｐＯＢＰ３１１の有する約１．４ｋｂのＤＮＡ断
片上、即ちｐＯＢＰ１の有する約２．７ｋｂのＰｓｔＩ
断片中のＢａｍＨＩ切断部位とＨｐａＩ切断部位の間約
１．４ｋｂのＤＮＡ断片上にＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子が存在すること、該遺伝子の発現がＩＰＴＧ
に依存していることから、該遺伝子はＢａｍＨＩ切断部
位からＨｐａＩ切断部位に向かって転写されることが明
らかである。
０ｍｌのＬ培地およびＩＰＴＧ 0.1Ｍを含むＬ培地で１
６時間培養した後、菌体を遠心分離し５０ｍＭリン酸バ
ッフアー（ｐＨ７．５）１ｍｌに懸濁し、超音波破砕に
供した。この超音波破砕物を１０，０００rpm、４０分
間遠心して得た上清液を上記同様Ｌ−アラニンデヒドロ
ゲナーゼ活性測定に供したところ、ＩＰＴＧを加えて培
養した細胞の抽出液にはＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ
活性が検出されたが、ＩＰＴＧを加えずに培養した細胞
の抽出液には該酵素活性は検出されなかった。この結果
より、ｐＯＢＰ３１１の有する約１．４ｋｂのＤＮＡ断
片上、即ちｐＯＢＰ１の有する約２．７ｋｂのＰｓｔＩ
断片中のＢａｍＨＩ切断部位とＨｐａＩ切断部位の間約
１．４ｋｂのＤＮＡ断片上にＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子が存在すること、該遺伝子の発現がＩＰＴＧ
に依存していることから、該遺伝子はＢａｍＨＩ切断部
位からＨｐａＩ切断部位に向かって転写されることが明
らかである。
【００３１】（３）大腸菌を宿主としたＤＬ−アラニン
の生産 上記のごとく作製したｐＯＢＰ１、ｐＯＢＰ３１１およ
びｐＵＣ１１９を用いて大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、形質転換株として各々、ＡＬ１株、ＡＬ３１１株お
よびＪＭ１０５／ｐＵＣ１１９を得た。このうちＡＬ１
株は、ブダぺスト条約に基づき、平成４年１２月１５日
付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ８８株（FERM B
P-4121）として寄託されている。
の生産 上記のごとく作製したｐＯＢＰ１、ｐＯＢＰ３１１およ
びｐＵＣ１１９を用いて大腸菌ＪＭ１０５を形質転換
し、形質転換株として各々、ＡＬ１株、ＡＬ３１１株お
よびＪＭ１０５／ｐＵＣ１１９を得た。このうちＡＬ１
株は、ブダぺスト条約に基づき、平成４年１２月１５日
付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）にエシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ８８株（FERM B
P-4121）として寄託されている。
【００３２】これらの株を各々、アンピシリン１００ｍ
ｇ／ｌを含む３ｍｌのＬ培地に３０℃、１２時間培養し
た後、その培養物０．１５ｍｌをアンピシリン１００ｍ
ｇ／ｌを含む１５ｍｌのＡ１培地〔グルコース３０ｇ、
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １０ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＣ
ｌ2・６Ｈ2Ｏ １ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｍｇ，Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｍｇ、サイアミン塩酸塩１０
０ｍｇを水１リットルに含み，ｐＨ７．４に調製した培
地〕およびアンピシリン１００ｍｇ／ｌとＩＰＴＧ
０．１ｍＭを含む１５ｍｌのＡ１培地の入った太型試験
管に各々植菌して３０℃で４５時間培養した。培養後、
遠心分離によって得た培養上清中のＤＬ−アラニンを高
速液体クロマトグラフィーを用いたＯＰＡポストカラム
誘導体化法〔アナリティカル・ケミストリー（Anal. Ch
em. ）,51, 1338(1979) 〕により定量した。結果を第１
表に示す。また同様に培養した菌体のＬ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼ活性を測定した結果も第１表に示した。Ｉ
ＰＴＧを添加して培養したＡＬ１株及びＡＬ３１１株で
のみＤＬ−アラニンの生成とＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼ活性が認められたことから、ＡＬ１株及びＡＬ３１
１株のＤＬ−アラニン生産性はＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼ活性によっていることが明らかである。
ｇ／ｌを含む３ｍｌのＬ培地に３０℃、１２時間培養し
た後、その培養物０．１５ｍｌをアンピシリン１００ｍ
ｇ／ｌを含む１５ｍｌのＡ１培地〔グルコース３０ｇ、
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １０ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＣ
ｌ2・６Ｈ2Ｏ １ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｍｇ，Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｍｇ、サイアミン塩酸塩１０
０ｍｇを水１リットルに含み，ｐＨ７．４に調製した培
地〕およびアンピシリン１００ｍｇ／ｌとＩＰＴＧ
０．１ｍＭを含む１５ｍｌのＡ１培地の入った太型試験
管に各々植菌して３０℃で４５時間培養した。培養後、
遠心分離によって得た培養上清中のＤＬ−アラニンを高
速液体クロマトグラフィーを用いたＯＰＡポストカラム
誘導体化法〔アナリティカル・ケミストリー（Anal. Ch
em. ）,51, 1338(1979) 〕により定量した。結果を第１
表に示す。また同様に培養した菌体のＬ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼ活性を測定した結果も第１表に示した。Ｉ
ＰＴＧを添加して培養したＡＬ１株及びＡＬ３１１株で
のみＤＬ−アラニンの生成とＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼ活性が認められたことから、ＡＬ１株及びＡＬ３１
１株のＤＬ−アラニン生産性はＬ−アラニンデヒドロゲ
ナーゼ活性によっていることが明らかである。
【００３３】
【表１】
【００３４】（４）アースロバクター・エスピーHAP1株
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物へ
の導入 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主とした場合にベクターとして用いたｐ
ＣＧ１１６は、コリネバクテリウム・グルタミクムのプ
ラスミドｐＣＧ１１（特開昭５７−１８３７９９）上の
ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩの切断部位に、Ｍ１３ｍｐ１８
ＲＦ ＤＮＡ（宝酒造社製）をＥｃｏＲＩで切断後、
クレノーフラグメント（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ）（宝酒造社製）で平滑末端に修復し、さらにＰ
ｓｔＩで切断して得たリンカーを両者の各々、平滑末
端、接着末端を利用して結合させたプラスミドである。
ｐＣＧ１１６は分子長約６.５ｋｂのプラスミドで、単
一の制限酵素切断部位としてＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩお
よびＳａｃＩを有し、スペクチノマイシンおよび／また
はストレプトマイシン耐性の表現型を与える（図１参
照）。
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物へ
の導入 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主とした場合にベクターとして用いたｐ
ＣＧ１１６は、コリネバクテリウム・グルタミクムのプ
ラスミドｐＣＧ１１（特開昭５７−１８３７９９）上の
ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩの切断部位に、Ｍ１３ｍｐ１８
ＲＦ ＤＮＡ（宝酒造社製）をＥｃｏＲＩで切断後、
クレノーフラグメント（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ）（宝酒造社製）で平滑末端に修復し、さらにＰ
ｓｔＩで切断して得たリンカーを両者の各々、平滑末
端、接着末端を利用して結合させたプラスミドである。
ｐＣＧ１１６は分子長約６.５ｋｂのプラスミドで、単
一の制限酵素切断部位としてＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩお
よびＳａｃＩを有し、スペクチノマイシンおよび／また
はストレプトマイシン耐性の表現型を与える（図１参
照）。
【００３５】ｐＣＧ１１６を保有するコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物からの
プラスミドの単離は特開昭57-183799 に記載の方法に従
って行った。上記（２）で得られたｐＯＢＰ１をＰｓｔ
Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約
２．７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断
片１０μｇとＰｓｔＩで完全に消化した１０μｇのｐＣ
Ｇ１１６とをＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応に供し
た。この反応混合液を用いてコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換した。
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物からの
プラスミドの単離は特開昭57-183799 に記載の方法に従
って行った。上記（２）で得られたｐＯＢＰ１をＰｓｔ
Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約
２．７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断
片１０μｇとＰｓｔＩで完全に消化した１０μｇのｐＣ
Ｇ１１６とをＴ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応に供し
た。この反応混合液を用いてコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換した。
【００３６】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物の形質転換は、特開昭５７−１
８６４９２および特開昭５７−１８６４９に記載された
方法に従って行った。即ち、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物をＮＢ培地（粉
末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１リットルに含
み、ｐＨ７.２に調整した培地）で種培養し、この４ｍ
ｌをＳＳＭ培地〔グルコース２０ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4
１０ｇ，尿素３ｇ，酵母エキス１ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １
ｇ，ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．４ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ０．２ｍｇ，
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．９ｍｇ，ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ
０．４ｍｇ，Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０．０９ｍ
ｇ，（ＮＨ 4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０．０４ｍｇ、ビ
オチン３０μｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１リ
ットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕４０ｍｌに
植菌し、３０℃で振とう培養した。ＯＤ（東京光電社製
比色計で測定した６６０ｎｍの吸光度）が０.２になっ
た時点で培養液へ０．５単位／ｍｌになるようにペニシ
リンＧを添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０.６
になるまで生育させた。培養液から菌体を集菌し、該細
胞を１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むＲＣＧＰ培地〔グ
ルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ３.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １.５ｇ、ＭｇＣｌ
2・６Ｈ2Ｏ ０.４１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０.９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ
０.０４ｍｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２
ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロ
リドン（分子量１０、０００）３０ｇを水１リットルに
含む培地（ｐＨ７．６）〕１０ｍｌに約１０9細胞／ｍ
ｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１
６時間穏やかに振とう反応してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト菌液０.５ｍｌを小試験管にとり、
２,５００×ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液
（ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＣａＣｌ2 ３０ｍＭ、トリス
５０ｍＭ、ショ糖４００ｍＭ、ｐＨ７.５）１ｍｌに再
懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０.１ｍｌに再懸
濁した。この菌液に２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と形質転
換に用いるＤＮＡを含む液の１対１混合液１００μｌを
加えて混和した。ついでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％ＰＥ
Ｇ６,０００を含む液０.８ｍｌを添加して混合した。３
分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７.２）２ｍｌを添加し、２,
５００×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去
し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に
懸濁してから、この菌液０.２ｍｌをスペクチノマイシ
ン４００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ
培地に１.４％寒天を含む培地、ｐＨ７.２）に塗布し、
３０℃で７日間培養した。寒天培地上に生育したコロニ
ーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩
水１ｍｌに懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン１
００μｇ／ｍｌを含有するＮＢ寒天培地（ＮＢ培地に
１．５％寒天を含む培地）上に再塗布して３０℃で２日
間培養し、スペクチノマイシン耐性となった形質転換株
を選択した。
リウム属に属する微生物の形質転換は、特開昭５７−１
８６４９２および特開昭５７−１８６４９に記載された
方法に従って行った。即ち、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物をＮＢ培地（粉
末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１リットルに含
み、ｐＨ７.２に調整した培地）で種培養し、この４ｍ
ｌをＳＳＭ培地〔グルコース２０ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4
１０ｇ，尿素３ｇ，酵母エキス１ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １
ｇ，ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．４ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ０．２ｍｇ，
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．９ｍｇ，ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ
０．４ｍｇ，Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０．０９ｍ
ｇ，（ＮＨ 4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０．０４ｍｇ、ビ
オチン３０μｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１リ
ットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕４０ｍｌに
植菌し、３０℃で振とう培養した。ＯＤ（東京光電社製
比色計で測定した６６０ｎｍの吸光度）が０.２になっ
た時点で培養液へ０．５単位／ｍｌになるようにペニシ
リンＧを添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０.６
になるまで生育させた。培養液から菌体を集菌し、該細
胞を１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むＲＣＧＰ培地〔グ
ルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ３.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １.５ｇ、ＭｇＣｌ
2・６Ｈ2Ｏ ０.４１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０.９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ
０.０４ｍｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２
ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロ
リドン（分子量１０、０００）３０ｇを水１リットルに
含む培地（ｐＨ７．６）〕１０ｍｌに約１０9細胞／ｍ
ｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１
６時間穏やかに振とう反応してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト菌液０.５ｍｌを小試験管にとり、
２,５００×ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液
（ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、ＣａＣｌ2 ３０ｍＭ、トリス
５０ｍＭ、ショ糖４００ｍＭ、ｐＨ７.５）１ｍｌに再
懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０.１ｍｌに再懸
濁した。この菌液に２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と形質転
換に用いるＤＮＡを含む液の１対１混合液１００μｌを
加えて混和した。ついでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％ＰＥ
Ｇ６,０００を含む液０.８ｍｌを添加して混合した。３
分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７.２）２ｍｌを添加し、２,
５００×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去
し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に
懸濁してから、この菌液０.２ｍｌをスペクチノマイシ
ン４００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ
培地に１.４％寒天を含む培地、ｐＨ７.２）に塗布し、
３０℃で７日間培養した。寒天培地上に生育したコロニ
ーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩
水１ｍｌに懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン１
００μｇ／ｍｌを含有するＮＢ寒天培地（ＮＢ培地に
１．５％寒天を含む培地）上に再塗布して３０℃で２日
間培養し、スペクチノマイシン耐性となった形質転換株
を選択した。
【００３７】スペクチノマイシン耐性となった形質転換
株の培養菌体よりプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＯＢＰ
１０１を得た。各種制限酵素での消化とアガロースゲル
電気泳動による解析を行い、図１に示した構造を確認し
た。さらに、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物中でＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼを強く発現させるため、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物中で強いプロモ
ーター活性を有するＤＮＡ断片を該遺伝子上流域に組み
込んだプラスミドを作成した。上記（２）で示したよう
に、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｐＯＢＰ
１０１の有する約２．７ＫｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片上の
ＢａｍＨＩ切断部位からＨｐａＩ切断部位の間に存在
し、ＢａｍＨＩ切断部位からＨｐａＩ切断部位に向かっ
て転写される。従って、このＢａｍＨＩ切断部位は該遺
伝子上流に位置することになり、プロモーター活性を有
するＤＮＡ断片を組み込むために好適な部位と考えられ
る。組み込むべきプロモーター活性を有するＤＮＡ断片
は、プラスミドｐＣｇｌｙＡ−１（特開平2-42994 ）よ
り調製した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２株の形質転換株よりｐＯＢＰ
１０１を単離し、ＢａｍＨＩで完全に消化した。このＤ
ＮＡ消化物３μｇと、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＫ７５株（FERM BP-1874）より単離したｐＣｇｌｙＡ
−１をＳａｕ３ＡＩで部分分解して得たＤＮＡ消化物１
０μｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応に供し
た。この反応混合液を用いてコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換し、スペクチ
ノマイシン100mg/lを含むＮＢ寒天培地に塗布し、30℃
で２日間培養した。寒天培地上に生じたコロニーをナイ
ロンメンブレンフィルター（Gelman Sciences社製 Bio
TraceTMNT 82mm）に塗沫し、以下上記（２）の項に記
載した方法で活性染色を行った。最も強い染色応答を示
した１株よりプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＯＢＰ１０
７を得た。各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気
泳動による解析を行い、図１に示した構造を確認した。
株の培養菌体よりプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＯＢＰ
１０１を得た。各種制限酵素での消化とアガロースゲル
電気泳動による解析を行い、図１に示した構造を確認し
た。さらに、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物中でＬ−アラニンデヒドロゲナ
ーゼを強く発現させるため、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物中で強いプロモ
ーター活性を有するＤＮＡ断片を該遺伝子上流域に組み
込んだプラスミドを作成した。上記（２）で示したよう
に、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｐＯＢＰ
１０１の有する約２．７ＫｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片上の
ＢａｍＨＩ切断部位からＨｐａＩ切断部位の間に存在
し、ＢａｍＨＩ切断部位からＨｐａＩ切断部位に向かっ
て転写される。従って、このＢａｍＨＩ切断部位は該遺
伝子上流に位置することになり、プロモーター活性を有
するＤＮＡ断片を組み込むために好適な部位と考えられ
る。組み込むべきプロモーター活性を有するＤＮＡ断片
は、プラスミドｐＣｇｌｙＡ−１（特開平2-42994 ）よ
り調製した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２株の形質転換株よりｐＯＢＰ
１０１を単離し、ＢａｍＨＩで完全に消化した。このＤ
ＮＡ消化物３μｇと、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＫ７５株（FERM BP-1874）より単離したｐＣｇｌｙＡ
−１をＳａｕ３ＡＩで部分分解して得たＤＮＡ消化物１
０μｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応に供し
た。この反応混合液を用いてコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２株を形質転換し、スペクチ
ノマイシン100mg/lを含むＮＢ寒天培地に塗布し、30℃
で２日間培養した。寒天培地上に生じたコロニーをナイ
ロンメンブレンフィルター（Gelman Sciences社製 Bio
TraceTMNT 82mm）に塗沫し、以下上記（２）の項に記
載した方法で活性染色を行った。最も強い染色応答を示
した１株よりプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＯＢＰ１０
７を得た。各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気
泳動による解析を行い、図１に示した構造を確認した。
【００３８】（５）コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物を宿主としたＤＬ−また
はＬ−アラニンの生産 上記（４）の項で作製したｐＯＢＰ１０１、ｐＯＢＰ１
０７およびｐＣＧ１１６をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ２１３５２株およびブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株に形質転
換した。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２
１３５２株はコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２株より誘導されたＤ−アラニン要求性変異
株である。この要求性のため、本菌株への形質転換にお
いては、培養およびプロトプラスト再生培地にはＤ−ア
ラニンを１ｇ／ｌになるように添加した。コリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１３５２株にｐＯＢＰ
１０１、ｐＯＢＰ１０７およびｐＣＧ１１６を導入した
形質転換株としてＡＬ１０１株、ＡＬ１０７株およびＡ
ＴＣＣ２１３５２／ｐＣＧ１１６株を各々得た。またブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３
８６９株にｐＯＢＰ１０１、ｐＯＢＰ１０７およびｐＣ
Ｇ１１６を導入した形質転換株としてＢＬ１０１株、Ｂ
Ｌ１０７株およびＡＴＣＣ１３８６９／ｐＣＧ１１６株
を各々得た。これらの形質転換株の内、ＡＬ１０７株
は、ブダぺスト条約に基づき平成４年１２月１５日付で
コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）Ｋ８９株（FERM BP-4122）として微工研に
寄託されている。
バクテリウム属に属する微生物を宿主としたＤＬ−また
はＬ−アラニンの生産 上記（４）の項で作製したｐＯＢＰ１０１、ｐＯＢＰ１
０７およびｐＣＧ１１６をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ２１３５２株およびブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株に形質転
換した。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２
１３５２株はコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２株より誘導されたＤ−アラニン要求性変異
株である。この要求性のため、本菌株への形質転換にお
いては、培養およびプロトプラスト再生培地にはＤ−ア
ラニンを１ｇ／ｌになるように添加した。コリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１３５２株にｐＯＢＰ
１０１、ｐＯＢＰ１０７およびｐＣＧ１１６を導入した
形質転換株としてＡＬ１０１株、ＡＬ１０７株およびＡ
ＴＣＣ２１３５２／ｐＣＧ１１６株を各々得た。またブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３
８６９株にｐＯＢＰ１０１、ｐＯＢＰ１０７およびｐＣ
Ｇ１１６を導入した形質転換株としてＢＬ１０１株、Ｂ
Ｌ１０７株およびＡＴＣＣ１３８６９／ｐＣＧ１１６株
を各々得た。これらの形質転換株の内、ＡＬ１０７株
は、ブダぺスト条約に基づき平成４年１２月１５日付で
コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）Ｋ８９株（FERM BP-4122）として微工研に
寄託されている。
【００３９】このようにして得られた各々の形質転換株
をスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む３ｍｌのＮ
Ｂ培地で３０℃、１６時間培養し、その培養物の０．５
ｍｌをスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む１２．
５ｍｌのＡ２培地〔グルコース５０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ
4 ３０ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ
０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ５ｍｇビオチン３０μｇ、サイアミン
塩酸塩２００ｍｇを水１リットルに含み，ｐＨ７．２に
調整した培地〕の入った太型試験管に各々植菌して３０
℃で４５時間培養した。ＡＬ１０１株、ＡＬ１０７株お
よびＡＴＣＣ２１３５２／ｐＣＧ１１６株の培養は培地
にＤ−アラニンを０．５ｇ／ｌになるように加えておこ
なった。培養後、遠心分離によって得た培養上清中のＤ
Ｌ−アラニンの総量を高速液体クロマトグラフィーを用
いたＯＰＡポストカラム誘導体化法により、またＤ−お
よびＬ−アラニンはダイセル化学工業（株）社製のクラ
ウンパックを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り、各々定量した。結果を第２表に示す。
をスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む３ｍｌのＮ
Ｂ培地で３０℃、１６時間培養し、その培養物の０．５
ｍｌをスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む１２．
５ｍｌのＡ２培地〔グルコース５０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ
4 ３０ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ
０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ５ｍｇビオチン３０μｇ、サイアミン
塩酸塩２００ｍｇを水１リットルに含み，ｐＨ７．２に
調整した培地〕の入った太型試験管に各々植菌して３０
℃で４５時間培養した。ＡＬ１０１株、ＡＬ１０７株お
よびＡＴＣＣ２１３５２／ｐＣＧ１１６株の培養は培地
にＤ−アラニンを０．５ｇ／ｌになるように加えておこ
なった。培養後、遠心分離によって得た培養上清中のＤ
Ｌ−アラニンの総量を高速液体クロマトグラフィーを用
いたＯＰＡポストカラム誘導体化法により、またＤ−お
よびＬ−アラニンはダイセル化学工業（株）社製のクラ
ウンパックを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り、各々定量した。結果を第２表に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】（６）酸素供給制限培養でのＡＬ１株によ
るＤＬ−アラニン生産 ＡＬ１株を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む３ｍｌ
のＬ培地で８時間培養した培養物を、１００ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含みグルコース濃度を１％に減じたＡ１
培地４０ｍｌを入れた３００ｍｌ容三角フラスコ５本に
各々植菌し、３０℃で振とう培養した。１６時間後に各
々のフラスコにＩＰＴＧ、グルコース、（ＮＨ4）2ＳＯ
4を終濃度が各々０．１ｍＭ、２％、１％になるように
加えた。続いて５本のフラスコのうち１本はそのまま培
養を継続し、残りの４本は無菌的に１本のフラスコに集
めた後、培養を継続した。後者のフラスコにおいては、
培養液量が前者フラスコの４倍であるため酸素供給がよ
り制限された状態になっている。４０時間培養した後、
培養上清中のＤＬ−アラニン量を上記（３）項と同様に
定量した。その結果、４０ｍｌの液量で培養した場合
は、３．８ｇ／ｌのＤＬ−アラニンが生成していたのに
対し、１６０ｍｌの液量で培養した場合は、8.1ｇ／ｌ
のＤＬ−アラニンが生成していた。
るＤＬ−アラニン生産 ＡＬ１株を１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む３ｍｌ
のＬ培地で８時間培養した培養物を、１００ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含みグルコース濃度を１％に減じたＡ１
培地４０ｍｌを入れた３００ｍｌ容三角フラスコ５本に
各々植菌し、３０℃で振とう培養した。１６時間後に各
々のフラスコにＩＰＴＧ、グルコース、（ＮＨ4）2ＳＯ
4を終濃度が各々０．１ｍＭ、２％、１％になるように
加えた。続いて５本のフラスコのうち１本はそのまま培
養を継続し、残りの４本は無菌的に１本のフラスコに集
めた後、培養を継続した。後者のフラスコにおいては、
培養液量が前者フラスコの４倍であるため酸素供給がよ
り制限された状態になっている。４０時間培養した後、
培養上清中のＤＬ−アラニン量を上記（３）項と同様に
定量した。その結果、４０ｍｌの液量で培養した場合
は、３．８ｇ／ｌのＤＬ−アラニンが生成していたのに
対し、１６０ｍｌの液量で培養した場合は、8.1ｇ／ｌ
のＤＬ−アラニンが生成していた。
【００４２】（７）酸素供給制限培養でのＡＬ１０７株
によるＬ−アラニン生産 ＡＬ１０７株をＤ−アラニン ０．５ｇ／ｌ、スペクチ
ノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む２０ｍｌのＮＢ培地を
入れた３００ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で２４
時間振とう培養した。この培養液５ｍｌづつをスペクチ
ノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む２００ｍｌのＡ３培地
〔グルコース４０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4１０ｇ，ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
１０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチ
ン３０μｇ、コーンスチープリカー１０ｇ、アデニン２
００ｍｇ、ＤＬ−アラニン２ｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを
水１リットルに含み，ｐＨ７．２に調整した培地〕を入
れた２リットル容の三角フラスコ３本に植菌し、３０℃
で２４時間振とう培養した。この培養物の全量を、1650
ｍｌのＡ４培地〔グルコース ６５．６ｇ、（ＮＨ4）
Ｈ2ＰＯ4 ２．４ｇ 、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２．５ｇ、
ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＣｕＳＯ4・７Ｈ2Ｏ１０ｍｇ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ビオチン２５０μ
ｇ、サイアミン塩酸塩６００ｍｇ、βーアラニン２０ｍ
ｇ、コーンスチープリカー５ｇ、ＤＬ−アラニン４ｇを
水１リットルに含み，ｐＨ７．２に調整した培地〕を入
れ、滅菌した５リットル容ジャーファーメンター３本
〔（ａ）、（ｂ）、（ｃ）〕に各々植菌した。アンモニ
アでｐＨを６．８に保ち、２リットル／分の通気を供給
し、２本（ａ、ｂ）のジャーファーメンターは攪はん速
度６００ｒｐｍで、残りの一本（ｃ）は攪はん速度３０
０ｒｐｍで培養を行った。培養液中の残グルコース濃度
が１ｇ／ｌ以下になった時点で、ジャーファーメンター
（ｂ）の攪拌速度を３００ｒｐｍに低下させた。ジャー
ファーメンター（ａ）の攪拌速度は６００ｒｐｍに、ジ
ャーファーメンター（ｃ）は攪拌速度３００ｒｐｍに各
々保った。またこの時点から、各々のジャーファーメン
ターに対して、別途に殺菌したグルコース溶液を、投入
グルコース量が２０％になるまで連続的に流加し、培養
液中の残グルコース濃度が１ｇ／ｌ以下になるまで培養
を継続した。培養終了時の培養濾液中のＬ−アラニン量
を上記（５）の項と同様に測定し、培養終了までに要し
た時間とともに第３表に示した。ジャーファーメンター
（ｃ）においては、菌の生育レベルが低く、培養を９６
時間継続したが、所定のグルコース量を消費することが
できなかったため、培養を中止した。また、Ｄ−アラニ
ンはいずれの場合も０．５ｇ／ｌ以下だった。攪拌速度
が低いほど培養液中への酸素供給量は少なくなり、３０
０ｒｐｍでは菌が生育するには不十分な量の酸素供給し
か行えない〔ジャーファーメンター（ｃ）〕。しかし、
培養途中から、酸素供給量を、菌が生育するには不十分
な量に制限することによってアラニン生産性を向上させ
ることができた〔ジャーファーメンター（ｂ）〕。
によるＬ−アラニン生産 ＡＬ１０７株をＤ−アラニン ０．５ｇ／ｌ、スペクチ
ノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む２０ｍｌのＮＢ培地を
入れた３００ｍｌ容三角フラスコに接種し３０℃で２４
時間振とう培養した。この培養液５ｍｌづつをスペクチ
ノマイシン１００ｍｇ／ｌを含む２００ｍｌのＡ３培地
〔グルコース４０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4１０ｇ，ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
１０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチ
ン３０μｇ、コーンスチープリカー１０ｇ、アデニン２
００ｍｇ、ＤＬ−アラニン２ｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを
水１リットルに含み，ｐＨ７．２に調整した培地〕を入
れた２リットル容の三角フラスコ３本に植菌し、３０℃
で２４時間振とう培養した。この培養物の全量を、1650
ｍｌのＡ４培地〔グルコース ６５．６ｇ、（ＮＨ4）
Ｈ2ＰＯ4 ２．４ｇ 、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２．５ｇ、
ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＣｕＳＯ4・７Ｈ2Ｏ１０ｍｇ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ビオチン２５０μ
ｇ、サイアミン塩酸塩６００ｍｇ、βーアラニン２０ｍ
ｇ、コーンスチープリカー５ｇ、ＤＬ−アラニン４ｇを
水１リットルに含み，ｐＨ７．２に調整した培地〕を入
れ、滅菌した５リットル容ジャーファーメンター３本
〔（ａ）、（ｂ）、（ｃ）〕に各々植菌した。アンモニ
アでｐＨを６．８に保ち、２リットル／分の通気を供給
し、２本（ａ、ｂ）のジャーファーメンターは攪はん速
度６００ｒｐｍで、残りの一本（ｃ）は攪はん速度３０
０ｒｐｍで培養を行った。培養液中の残グルコース濃度
が１ｇ／ｌ以下になった時点で、ジャーファーメンター
（ｂ）の攪拌速度を３００ｒｐｍに低下させた。ジャー
ファーメンター（ａ）の攪拌速度は６００ｒｐｍに、ジ
ャーファーメンター（ｃ）は攪拌速度３００ｒｐｍに各
々保った。またこの時点から、各々のジャーファーメン
ターに対して、別途に殺菌したグルコース溶液を、投入
グルコース量が２０％になるまで連続的に流加し、培養
液中の残グルコース濃度が１ｇ／ｌ以下になるまで培養
を継続した。培養終了時の培養濾液中のＬ−アラニン量
を上記（５）の項と同様に測定し、培養終了までに要し
た時間とともに第３表に示した。ジャーファーメンター
（ｃ）においては、菌の生育レベルが低く、培養を９６
時間継続したが、所定のグルコース量を消費することが
できなかったため、培養を中止した。また、Ｄ−アラニ
ンはいずれの場合も０．５ｇ／ｌ以下だった。攪拌速度
が低いほど培養液中への酸素供給量は少なくなり、３０
０ｒｐｍでは菌が生育するには不十分な量の酸素供給し
か行えない〔ジャーファーメンター（ｃ）〕。しかし、
培養途中から、酸素供給量を、菌が生育するには不十分
な量に制限することによってアラニン生産性を向上させ
ることができた〔ジャーファーメンター（ｂ）〕。
【００４３】
【表３】
【００４４】（８）ＡＬ１０７株培養液からのＬ−アラ
ニンの精製 上記（７）項のジャーファーメンター（ｂ）の培養で得
られた培養液１リットルから、遠心分離により菌体を除
去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。この脱色炭処
理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ（Ｈ
+ 型）を充填したカラムに通し、Ｌ−アラニンを吸着さ
せ、水洗後２Ｎアンモニア水で溶出し、Ｌ−アラニン分
画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノールを加え、析
出する結晶を採取した。この結晶をエタノールにより再
結晶することにより、Ｌ−アラニンの結晶５５ｇを得
た。
ニンの精製 上記（７）項のジャーファーメンター（ｂ）の培養で得
られた培養液１リットルから、遠心分離により菌体を除
去し、得られた上澄液を脱色炭処理した。この脱色炭処
理液を、カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ（Ｈ
+ 型）を充填したカラムに通し、Ｌ−アラニンを吸着さ
せ、水洗後２Ｎアンモニア水で溶出し、Ｌ−アラニン分
画を濃縮した。得られた濃縮液にエタノールを加え、析
出する結晶を採取した。この結晶をエタノールにより再
結晶することにより、Ｌ−アラニンの結晶５５ｇを得
た。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、微生物のＬ−アラニン
デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入
し、発現させることによって、大腸菌またはコリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属菌種におけるア
ラニンの生産性を著しく向上させることができる。さら
に、本発明は、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属細菌が、アースロバクター
・エスピーHAP1株の場合に問題になったような臭気物質
を生成しないため、生成したＤＬ−、Ｌ−またはＤ−ア
ラニンの精製が容易であるという利点をも有する。
デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入
し、発現させることによって、大腸菌またはコリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属菌種におけるア
ラニンの生産性を著しく向上させることができる。さら
に、本発明は、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属細菌が、アースロバクター
・エスピーHAP1株の場合に問題になったような臭気物質
を生成しないため、生成したＤＬ−、Ｌ−またはＤ−ア
ラニンの精製が容易であるという利点をも有する。
【図１】は、ｐＯＢＰ１、ｐＯＢＰ３１１、ｐＯＢＰ１
０１、ｐＯＢＰ１０７の制限酵素切断地図とその作製工
程を示す。
０１、ｐＯＢＰ１０７の制限酵素切断地図とその作製工
程を示す。
【図２】は、ｐＯＢＰ１にクローン化されたアースロバ
クター・エスピーHAP1株のＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地
図を示している。
クター・エスピーHAP1株のＬ−アラニンデヒドロゲナー
ゼ遺伝子を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地
図を示している。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:06）
Claims (7)
- 【請求項１】 エシェリヒア属、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−アラニンデヒ
ドロゲナーゼ活性を有し、かつアラニン生産能を有する
微生物を培地に培養し、培養物中にアラニンを生成蓄積
させ、該培養物からアラニンを採取することを特徴とす
るアラニンの製造法。 - 【請求項２】 微生物が、エシェリヒア属、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物
であって、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡで形質転換された、該酵素の生産能を有
することを特徴とする請求項１記載のアラニンの製造
法。 - 【請求項３】 Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子
が、アースロバクター・エスピーHAP1株由来の遺伝子で
あることを特徴とする請求項２記載のアラニンの製造
法。 - 【請求項４】 アラニンが、ＤＬ−アラニン、Ｌ−アラ
ニンまたはＤ−アラニンである請求項１記載のアラニン
の製造法。 - 【請求項５】 微生物を培養するに当たって、培養途中
から、酸素供給量を微生物が生育するのには不十分とな
るように制限して培養を継続することを特徴とする請求
項１記載のアラニンの製造法。 - 【請求項６】 アースロバクター・エスピーHAP1株由来
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するエシ
ェリヒア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物。 - 【請求項７】 アースロバクター・エスピーHAP1株由来
のＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34270992A JP3151075B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | アラニンの製造法 |
| US08/170,936 US5559016A (en) | 1992-12-22 | 1993-12-21 | Process for producing alanine |
| EP93120726A EP0603865B1 (en) | 1992-12-22 | 1993-12-22 | Process for producing alanine |
| DE69326223T DE69326223T2 (de) | 1992-12-22 | 1993-12-22 | Verfahren zur Herstellung von Alanine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34270992A JP3151075B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277082A true JPH06277082A (ja) | 1994-10-04 |
| JP3151075B2 JP3151075B2 (ja) | 2001-04-03 |
Family
ID=18355883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34270992A Expired - Fee Related JP3151075B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | アラニンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5559016A (ja) |
| EP (1) | EP0603865B1 (ja) |
| JP (1) | JP3151075B2 (ja) |
| DE (1) | DE69326223T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019207812A1 (ja) * | 2018-04-27 | 2019-10-31 | 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 | ヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5728555A (en) * | 1996-09-30 | 1998-03-17 | Monsanto Company | Preparation of d-amino acids by direct fermentative means |
| CA2234412C (en) | 1997-06-09 | 2008-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing optically active compound |
| NL1008054C2 (nl) | 1998-01-16 | 1999-07-19 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Werkwijze voor het produceren van alanine, alsmede hierbij toegepaste micro-organismen en recombinant DNA moleculen. |
| EP2348121A1 (en) | 2002-02-20 | 2011-07-27 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate |
| US8278076B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-10-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives |
| DE10312775B4 (de) * | 2003-03-21 | 2007-11-15 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren und Mikroorganismus zur mikrobiellen Herstellung von L-Alanin |
| EP2098597A1 (de) | 2008-03-04 | 2009-09-09 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| MY179341A (en) * | 2014-04-30 | 2020-11-04 | Evonik Operations Gmbh | Method for producing l-amino acids using an alkaliphilic bacteria |
| WO2018149818A1 (en) | 2017-02-16 | 2018-08-23 | Nestec S.A. | Natural flavor base and process for its preparation |
| EP3608409A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-12 | Evonik Operations GmbH | Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family |
| CN113462623B (zh) * | 2021-05-25 | 2022-11-29 | 天津科技大学 | 微生物发酵法制备d-丙氨酸的方法 |
| CN114921505B (zh) * | 2022-06-28 | 2024-04-16 | 烟台恒源生物股份有限公司 | 一种l-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60184393A (ja) * | 1984-03-02 | 1985-09-19 | Ajinomoto Co Inc | アラニンの製造法 |
| JPS6236196A (ja) * | 1985-04-15 | 1987-02-17 | Ajinomoto Co Inc | アラニンの製造法 |
-
1992
- 1992-12-22 JP JP34270992A patent/JP3151075B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-12-21 US US08/170,936 patent/US5559016A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-22 EP EP93120726A patent/EP0603865B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-22 DE DE69326223T patent/DE69326223T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019207812A1 (ja) * | 2018-04-27 | 2019-10-31 | 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 | ヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体 |
| US11697817B2 (en) | 2018-04-27 | 2023-07-11 | Utilization Of Carbon Dioxide Institute Co., Ltd. | Genus Hydrogenophilus bacterium transformant |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0603865B1 (en) | 1999-09-01 |
| US5559016A (en) | 1996-09-24 |
| EP0603865A2 (en) | 1994-06-29 |
| EP0603865A3 (en) | 1995-06-28 |
| DE69326223D1 (de) | 1999-10-07 |
| DE69326223T2 (de) | 2000-05-31 |
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