JPH11266881A - 発酵法によるｌ−セリンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−セリンの製造法Info
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- JPH11266881A JPH11266881A JP10353513A JP35351398A JPH11266881A JP H11266881 A JPH11266881 A JP H11266881A JP 10353513 A JP10353513 A JP 10353513A JP 35351398 A JP35351398 A JP 35351398A JP H11266881 A JPH11266881 A JP H11266881A
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 糖をＬ−セリンに変換する微生物を提供し、
培養液中にＬ−セリンを蓄積させる方法を提供する。 【解決手段】 コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによ
るフィードバック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼ；アザセリンまたはβ−（２
−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン
生産能を有するコリネ型細菌から得られうる同Ｄ−３−
ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ。前記Ｄ−３−ホ
スホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮ
Ａ。前記ＤＮＡを含む組み換えＤＮＡを保持するコリネ
型細菌。前記細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリン
を蓄積させ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収すること
を特徴とするＬ−セリンの製造法。
培養液中にＬ−セリンを蓄積させる方法を提供する。 【解決手段】 コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによ
るフィードバック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼ；アザセリンまたはβ−（２
−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン
生産能を有するコリネ型細菌から得られうる同Ｄ−３−
ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ。前記Ｄ−３−ホ
スホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮ
Ａ。前記ＤＮＡを含む組み換えＤＮＡを保持するコリネ
型細菌。前記細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリン
を蓄積させ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収すること
を特徴とするＬ−セリンの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は医薬品・化学品・化
粧品分野で使用されるアミノ酸混合物を製造するために
用いられるＬ−セリンの製造法、同製造法を構成するコ
リネ型細菌、Ｄ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナ
ーゼ（Ｄ−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ Ｄ
ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下「３−ＰＧＤＨ」とい
うことがある）及び同３−ＰＧＤＨをコードするＤＮＡ
に関するものである。
粧品分野で使用されるアミノ酸混合物を製造するために
用いられるＬ−セリンの製造法、同製造法を構成するコ
リネ型細菌、Ｄ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナ
ーゼ（Ｄ−３−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ Ｄ
ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下「３−ＰＧＤＨ」とい
うことがある）及び同３−ＰＧＤＨをコードするＤＮＡ
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来の発酵法によるＬ−セリンの製造法
としては、グリシン及び糖からＬ−セリンに変換できる
菌株を使用して、３０ｇ／Ｌのグリシンを有する培地で
最高１４ｇ／ＬのＬ−セリンを製造したという報告があ
る。この方法におけるグリシンからＬ−セリンへの変換
収率は４６％に相当する（Ｋｕｂｏｔａ Ｋ． Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，４９，７〜１２，１９８５）。また、グ
リシンとメタノールからＬ−セリンに変換できる菌株を
使用して、１００ｇ／Ｌのグリシンから５３ｇ／ＬのＬ
−セリンが生産できる（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａ
ｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．
７９，Ｎｏ．２，１８１−１８３．１９９５）。また、
ノカルディア属細菌を使用する方法では、セリンハイド
ロキサメイトやアザセリン等の耐性菌を育種することに
よりＬ−セリン生産能が改善されることが知られている
（特公昭５７−１２３５号）。しかし、これらの方法は
Ｌ−セリンの前駆体であるグリシンを使用しなければな
らず、操作が煩雑でコスト的にも不利であった。
としては、グリシン及び糖からＬ−セリンに変換できる
菌株を使用して、３０ｇ／Ｌのグリシンを有する培地で
最高１４ｇ／ＬのＬ−セリンを製造したという報告があ
る。この方法におけるグリシンからＬ−セリンへの変換
収率は４６％に相当する（Ｋｕｂｏｔａ Ｋ． Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，４９，７〜１２，１９８５）。また、グ
リシンとメタノールからＬ−セリンに変換できる菌株を
使用して、１００ｇ／Ｌのグリシンから５３ｇ／ＬのＬ
−セリンが生産できる（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａ
ｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．
７９，Ｎｏ．２，１８１−１８３．１９９５）。また、
ノカルディア属細菌を使用する方法では、セリンハイド
ロキサメイトやアザセリン等の耐性菌を育種することに
よりＬ−セリン生産能が改善されることが知られている
（特公昭５７−１２３５号）。しかし、これらの方法は
Ｌ−セリンの前駆体であるグリシンを使用しなければな
らず、操作が煩雑でコスト的にも不利であった。
【０００３】Ｌ−セリンを糖より直接発酵でき、かつ培
地にＬ−セリンの前駆体を添加する必要のない菌株とし
て、Ｄ−セリン、α−メチル−セリン、ｏ−メチルセリ
ン、イソセリン、セリンハイドロキサメイト、３−クロ
ロアラニンに耐性なコリネバクテリウム グルタミカム
が知られているが、そのＬ−セリン蓄積は０．８ｇ／Ｌ
と極めて低いものであり（農芸化学会誌、第４８巻、第
３号、ｐ２０１−２０８，１９７４）、工業的にＬ−セ
リンの直接発酵を行うには更なる菌株改良が望まれた。
地にＬ−セリンの前駆体を添加する必要のない菌株とし
て、Ｄ−セリン、α−メチル−セリン、ｏ−メチルセリ
ン、イソセリン、セリンハイドロキサメイト、３−クロ
ロアラニンに耐性なコリネバクテリウム グルタミカム
が知られているが、そのＬ−セリン蓄積は０．８ｇ／Ｌ
と極めて低いものであり（農芸化学会誌、第４８巻、第
３号、ｐ２０１−２０８，１９７４）、工業的にＬ−セ
リンの直接発酵を行うには更なる菌株改良が望まれた。
【０００４】一方、コリネ型細菌において、菌体内で自
律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベ
クタープラスミド（米国特許第４５１４５０２号参
照）、遺伝子の菌体への導入方法（特開平２−２０７７
９１号等）が開示されており、これらの技術を用いたＬ
−スレオニンまたはＬ−イソロイシン生産菌育成の可能
性が開示されている（米国特許第４４５２８９０号、及
び米国特許第４４４２２０８号参照）。また、Ｌ−リジ
ン生産菌育成に関しても、ベクタープラスミドにＬ−リ
ジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅
させる技術（特開昭５６−１６０９９７号などがある）
が知られている。
律増殖可能でかつ、薬剤耐性マーカー遺伝子を有するベ
クタープラスミド（米国特許第４５１４５０２号参
照）、遺伝子の菌体への導入方法（特開平２−２０７７
９１号等）が開示されており、これらの技術を用いたＬ
−スレオニンまたはＬ−イソロイシン生産菌育成の可能
性が開示されている（米国特許第４４５２８９０号、及
び米国特許第４４４２２０８号参照）。また、Ｌ−リジ
ン生産菌育成に関しても、ベクタープラスミドにＬ−リ
ジン生合成に関与する遺伝子を組み込み、菌体内で増幅
させる技術（特開昭５６−１６０９９７号などがある）
が知られている。
【０００５】エシェリヒア コリではＬ−セリン生合成
に関与する酵素のうち、野生型ではフィードバック阻害
を受ける酵素について、フィードバック阻害が解除され
た変異を有する酵素遺伝子を導入してＬ−セリン生産性
を向上させた例も知られている（特許２５８４４０９
号）。このような遺伝子として具体的には、３−ＰＧＤ
Ｈ遺伝子（以下、３−ＰＧＤＨタンパクをコードする遺
伝子を「ｓｅｒＡ」ともいう。）が知られている。
に関与する酵素のうち、野生型ではフィードバック阻害
を受ける酵素について、フィードバック阻害が解除され
た変異を有する酵素遺伝子を導入してＬ−セリン生産性
を向上させた例も知られている（特許２５８４４０９
号）。このような遺伝子として具体的には、３−ＰＧＤ
Ｈ遺伝子（以下、３−ＰＧＤＨタンパクをコードする遺
伝子を「ｓｅｒＡ」ともいう。）が知られている。
【０００６】また、コリネ型細菌においては３−ＰＧＤ
Ｈ遺伝子の増幅がＬ−トリプトファン生産性に影響を与
える例が知られている（特開平３−７５９１号）。
Ｈ遺伝子の増幅がＬ−トリプトファン生産性に影響を与
える例が知られている（特開平３−７５９１号）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、糖をＬ−セリンに変換する微生物を提供
し、同微生物が有するＬ−セリンへの変換能を利用して
培養液中にＬ−セリンを蓄積させる方法を提供すること
であり、すなわち、工業的に実施するのに有利なＬ−セ
リンの製造方法を提供することである。
する課題は、糖をＬ−セリンに変換する微生物を提供
し、同微生物が有するＬ−セリンへの変換能を利用して
培養液中にＬ−セリンを蓄積させる方法を提供すること
であり、すなわち、工業的に実施するのに有利なＬ−セ
リンの製造方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべくＬ−セリンの製造法について鋭意研究を
重ねた結果、Ｌ−セリン生産能を有するコリネ型細菌、
特に好ましくはさらにＬ−セリン分解能を欠失した同細
菌を親株としてアザセリンまたはβ−（２−チエニル）
−ＤＬ−アラニンに耐性を示す変異株を採取し、同株を
用いてＬ−セリン発酵を行い培養液中のＬ−セリン蓄積
が飛躍的に向上することを見いだし、この知見に基づい
て本発明を完成するに至った。
題を解決すべくＬ−セリンの製造法について鋭意研究を
重ねた結果、Ｌ−セリン生産能を有するコリネ型細菌、
特に好ましくはさらにＬ−セリン分解能を欠失した同細
菌を親株としてアザセリンまたはβ−（２−チエニル）
−ＤＬ−アラニンに耐性を示す変異株を採取し、同株を
用いてＬ−セリン発酵を行い培養液中のＬ−セリン蓄積
が飛躍的に向上することを見いだし、この知見に基づい
て本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、アザセリンまたはβ−
（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セ
リン生産能を有するコリネ型細菌である。さらに本発明
は、コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによるフィード
バック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリセレートデ
ヒドロゲナーゼ；アザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を
有するコリネ型細菌からえられうる同Ｄ−３−ホスホグ
リセレートデヒドロゲナーゼ；配列表配列番号１０に記
載されるアミノ酸配列に、１または複数のアミノ酸置
換、付加または欠失が生じたアミノ酸配列を有するＤ−
３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼにおいて、配
列番号１０に記載されるアミノ酸配列の３２５番目のグ
ルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸
残基に置換したことを特徴とする同Ｄ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼ；および、配列表配列番号１
１に記載されるアミノ酸配列を有する同Ｄ−３−ホスホ
グリセレートデヒドロゲナーゼである。
（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セ
リン生産能を有するコリネ型細菌である。さらに本発明
は、コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによるフィード
バック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリセレートデ
ヒドロゲナーゼ；アザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を
有するコリネ型細菌からえられうる同Ｄ−３−ホスホグ
リセレートデヒドロゲナーゼ；配列表配列番号１０に記
載されるアミノ酸配列に、１または複数のアミノ酸置
換、付加または欠失が生じたアミノ酸配列を有するＤ−
３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼにおいて、配
列番号１０に記載されるアミノ酸配列の３２５番目のグ
ルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸
残基に置換したことを特徴とする同Ｄ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼ；および、配列表配列番号１
１に記載されるアミノ酸配列を有する同Ｄ−３−ホスホ
グリセレートデヒドロゲナーゼである。
【００１０】さらに本発明は、前記Ｄ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、およ
び、配列表配列番号１１に記載される塩基配列を有する
同ＤＮＡである。さらに本発明は、前記ＤＮＡを含む組
み換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌である。さらに、
前記細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリンを蓄積さ
せ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収することを特徴と
するＬ−セリンの製造法である。
セレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、およ
び、配列表配列番号１１に記載される塩基配列を有する
同ＤＮＡである。さらに本発明は、前記ＤＮＡを含む組
み換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌である。さらに、
前記細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリンを蓄積さ
せ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収することを特徴と
するＬ−セリンの製造法である。
【００１１】上記アザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を
有するコリネ型細菌の具体例としては、ブレビバクテリ
ウムフラバムＡＪ１３３２４及びＡＪ１３３２７または
ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２５が挙げ
られる。
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を
有するコリネ型細菌の具体例としては、ブレビバクテリ
ウムフラバムＡＪ１３３２４及びＡＪ１３３２７または
ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２５が挙げ
られる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明においてコリネ型細菌と
は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗
酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテ
リウム属細菌、および従来ブレビバクテリウム属に分類
されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合
されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテ
リウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属及び
ミクロバクテリウム属細菌を含む。
は、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）第８版５９９頁（１９７４）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗
酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、コリネバクテ
リウム属細菌、および従来ブレビバクテリウム属に分類
されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合
されたブレビバクテリウム属細菌、さらにコリネバクテ
リウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属及び
ミクロバクテリウム属細菌を含む。
【００１３】本発明のアザセリンまたはβ−（２−チエ
ニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能
を有するコリネ型細菌、さらに好ましくは同細菌のうち
Ｌ−セリン分解能を欠失しているコリネ型細菌は、野生
型あるいはＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌を親
株として人工的に変異、誘導される。
ニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能
を有するコリネ型細菌、さらに好ましくは同細菌のうち
Ｌ−セリン分解能を欠失しているコリネ型細菌は、野生
型あるいはＬ−セリン生産能を有するコリネ型細菌を親
株として人工的に変異、誘導される。
【００１４】アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−
ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン分解能を欠失し
Ｌ−セリン生産能を有するコリネ型細菌の採取は、例え
ば次のようにして行うことができる。すなわち親株とし
てブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７
を通常の方法で変異処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジンへの接触等）に付して、Ｌ−セ
リン分解能を欠失した変異株を得、さらにこの変異株を
親株としてアザセリンまたはβ−（２−チエニル）−Ｄ
Ｌ−アラニン耐性菌を採取する。このような方法により
得られた変異株の中にＬ−セリンを高濃度で蓄積する菌
株が得られる。アザセリンまたはβ−（２−チエニル）
−ＤＬ−アラニンに耐性を有する菌株は、後述する変異
型ｓｅｒＡを親株またはＬ−セリン分解能を欠失した変
異株に導入することによっても、得られうる。
ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン分解能を欠失し
Ｌ−セリン生産能を有するコリネ型細菌の採取は、例え
ば次のようにして行うことができる。すなわち親株とし
てブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７
を通常の方法で変異処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジンへの接触等）に付して、Ｌ−セ
リン分解能を欠失した変異株を得、さらにこの変異株を
親株としてアザセリンまたはβ−（２−チエニル）−Ｄ
Ｌ−アラニン耐性菌を採取する。このような方法により
得られた変異株の中にＬ−セリンを高濃度で蓄積する菌
株が得られる。アザセリンまたはβ−（２−チエニル）
−ＤＬ−アラニンに耐性を有する菌株は、後述する変異
型ｓｅｒＡを親株またはＬ−セリン分解能を欠失した変
異株に導入することによっても、得られうる。
【００１５】アザセリン耐性とは、アザセリンを含有す
る培地において野生株よりも速い生育を示す性質をいう
が、例えば、０．２５ｇ／Ｌのアザセリンを含有する固
体培地上で、３０℃、４〜５日でコロニーを形成できる
株はアザセリン耐性を有する。
る培地において野生株よりも速い生育を示す性質をいう
が、例えば、０．２５ｇ／Ｌのアザセリンを含有する固
体培地上で、３０℃、４〜５日でコロニーを形成できる
株はアザセリン耐性を有する。
【００１６】同様にβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラ
ニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン
を含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性
質をいうが、例えば、β−（２−チエニル）−ＤＬ−ア
ラニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニ
ンを含有する培地において野生株よりも速い生育を示す
性質をいうが、例えば、０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チ
エニル）−ＤＬ−アラニンを含有する固体培地上で、３
０℃、４〜５日でコロニーを形成できる株はβ−（２−
チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性を有する。
ニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン
を含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性
質をいうが、例えば、β−（２−チエニル）−ＤＬ−ア
ラニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニ
ンを含有する培地において野生株よりも速い生育を示す
性質をいうが、例えば、０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チ
エニル）−ＤＬ−アラニンを含有する固体培地上で、３
０℃、４〜５日でコロニーを形成できる株はβ−（２−
チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性を有する。
【００１７】３−ＰＧＤＨは、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素として、３−ホスホ
グリセレートが３−ホスホヒドロキシピルビン酸に酸化
される反応を触媒する。
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素として、３−ホスホ
グリセレートが３−ホスホヒドロキシピルビン酸に酸化
される反応を触媒する。
【００１８】３−ＰＧＤＨの活性を測定するには、例え
ば、逆反応における補酵素ＮＡＤＨ 2の減少（Ｅ．Ｓｕ
ｇｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｌ．Ｉ．Ｐｉｚｅｒ，ＪＢＣ，
２４３，２０８１，１９６８）や、順反応における補酵
素ＮＡＤＨ2の生成（Ｓａｌａｃｈ Ｈ．Ｊ．Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖ９，２１６−２
２０，１９６６）を３４０ｎｍの吸光度で測定すること
によって行うことができる。
ば、逆反応における補酵素ＮＡＤＨ 2の減少（Ｅ．Ｓｕ
ｇｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｌ．Ｉ．Ｐｉｚｅｒ，ＪＢＣ，
２４３，２０８１，１９６８）や、順反応における補酵
素ＮＡＤＨ2の生成（Ｓａｌａｃｈ Ｈ．Ｊ．Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖ９，２１６−２
２０，１９６６）を３４０ｎｍの吸光度で測定すること
によって行うことができる。
【００１９】３−ＰＧＤＨは、、コリネ型細菌の培養液
から菌体を回収し、回収された菌体を超音波処理後超遠
心をかけて破砕し、遠心分離によって得られる上澄から
常法によって精製される。すなわち、硫安沈殿、ゲル濾
過、陽イオン樹脂クロマトグラフィー、陰イオン樹脂ク
ロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーなどによっ
て、３−ＰＧＤＨ活性を有する画分を濃縮していくこと
によって、３−ＰＧＤＨを精製できる。
から菌体を回収し、回収された菌体を超音波処理後超遠
心をかけて破砕し、遠心分離によって得られる上澄から
常法によって精製される。すなわち、硫安沈殿、ゲル濾
過、陽イオン樹脂クロマトグラフィー、陰イオン樹脂ク
ロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーなどによっ
て、３−ＰＧＤＨ活性を有する画分を濃縮していくこと
によって、３−ＰＧＤＨを精製できる。
【００２０】野生型のコリネ型細菌由来の３−ＰＧＤＨ
はＬ−セリンによるフィードバック阻害を受け、１０ｍ
ＭのＬ−セリン存在下ではその活性がほぼ完全に阻害さ
れる。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除され
た３−ＰＧＤＨとは、１０ｍＭのＬ−セリン存在下でも
Ｌ−セリン非存在下における活性の２０％以上、好まし
くは４０％以上、さらに好ましくは９０％以上の活性を
有する３−ＰＧＤＨをいう。後述の実施例に示されるブ
レビバクテリウム フラバムＡＪ１３３２７由来の３−
ＰＧＤＨは８０ｍＭのＬ−セリン存在下で活性をほぼ１
００％維持しており、最も好ましい３−ＰＧＤＨの一つ
である。
はＬ−セリンによるフィードバック阻害を受け、１０ｍ
ＭのＬ−セリン存在下ではその活性がほぼ完全に阻害さ
れる。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除され
た３−ＰＧＤＨとは、１０ｍＭのＬ−セリン存在下でも
Ｌ−セリン非存在下における活性の２０％以上、好まし
くは４０％以上、さらに好ましくは９０％以上の活性を
有する３−ＰＧＤＨをいう。後述の実施例に示されるブ
レビバクテリウム フラバムＡＪ１３３２７由来の３−
ＰＧＤＨは８０ｍＭのＬ−セリン存在下で活性をほぼ１
００％維持しており、最も好ましい３−ＰＧＤＨの一つ
である。
【００２１】野生型のコリネ型細菌由来の３−ＰＧＤＨ
（以下、これをコードするＤＮＡを「野生型ｓｅｒＡ」
ともいう）は配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列
を有する。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除
された３−ＰＧＤＨ（以下、これをコードするＤＮＡを
「変異型ｓｅｒＡ」ともいう）として具体的には、配列
表配列番号１１に記載されるアミノ酸配列、または同配
列に１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生
じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１１に記載される
アミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したことを特
徴とするＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
が挙げられる。同他のアミノ酸残基として最も好ましい
ものはリジン残基である。
（以下、これをコードするＤＮＡを「野生型ｓｅｒＡ」
ともいう）は配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列
を有する。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除
された３−ＰＧＤＨ（以下、これをコードするＤＮＡを
「変異型ｓｅｒＡ」ともいう）として具体的には、配列
表配列番号１１に記載されるアミノ酸配列、または同配
列に１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生
じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１１に記載される
アミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したことを特
徴とするＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
が挙げられる。同他のアミノ酸残基として最も好ましい
ものはリジン残基である。
【００２２】コリネ型細菌からｓｅｒＡ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法
（Ｈ．Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｕｒａ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， ７２，６１９，
（１９６３））等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメ
ラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； Ｗｈｉｔ
ｅ，Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａｌ ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅ
ｔ． ５，１８５（１９８９）参照）により、ｓｅｒＡ
遺伝子を増幅することによって行うことができる。例え
ば、配列表配列番号１１のＯＲＦ（１７２〜１７０５）
を含むＤＮＡ断片を増幅できるよう、配列表の１番目の
塩基からＡＴＧ直前の塩基の範囲から任意に２０〜３０
塩基を選択してプライマーの一つとする。また、終始コ
ドン直下流の塩基から配列表の最後の塩基に至る範囲か
ら任意に２０〜３０塩基を選択してプライマーのもう一
つとする。
ＮＡ断片を単離するには、例えば、斎藤、三浦の方法
（Ｈ．Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ．Ｍｉｕｒａ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， ７２，６１９，
（１９６３））等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメ
ラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； Ｗｈｉｔ
ｅ，Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａｌ ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅ
ｔ． ５，１８５（１９８９）参照）により、ｓｅｒＡ
遺伝子を増幅することによって行うことができる。例え
ば、配列表配列番号１１のＯＲＦ（１７２〜１７０５）
を含むＤＮＡ断片を増幅できるよう、配列表の１番目の
塩基からＡＴＧ直前の塩基の範囲から任意に２０〜３０
塩基を選択してプライマーの一つとする。また、終始コ
ドン直下流の塩基から配列表の最後の塩基に至る範囲か
ら任意に２０〜３０塩基を選択してプライマーのもう一
つとする。
【００２３】上記のようにして３−ＰＧＤＨ野生株から
ｓｅｒＡを単離すれば野生型ｓｅｒＡが得られ、Ｌ−セ
リンによるフィードバック阻害が解除された３−ＰＧＤ
Ｈを保持する変異株（３−ＰＧＤＨ変異株）からｓｅｒ
Ａを単離すれば変異型ｓｅｒＡが得られる。具体的に
は、野生型ｓｅｒＡは配列表の配列番号１１に記載され
る配列を有し、変異型ｓｅｒＡは配列番号１３に記載さ
れる配列を有する。
ｓｅｒＡを単離すれば野生型ｓｅｒＡが得られ、Ｌ−セ
リンによるフィードバック阻害が解除された３−ＰＧＤ
Ｈを保持する変異株（３−ＰＧＤＨ変異株）からｓｅｒ
Ａを単離すれば変異型ｓｅｒＡが得られる。具体的に
は、野生型ｓｅｒＡは配列表の配列番号１１に記載され
る配列を有し、変異型ｓｅｒＡは配列番号１３に記載さ
れる配列を有する。
【００２４】ＰＣＲ法により増幅されたｓｅｒＡを、エ
シェリヒア コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組み換え
ＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア コリ細胞に導入
しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア
コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、
プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自律複
製可能なものが好ましく、例えば ｐＵＣ１９、ｐＵＣ
１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９
９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０等が挙げられる。
シェリヒア コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組み換え
ＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア コリ細胞に導入
しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア
コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、
プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自律複
製可能なものが好ましく、例えば ｐＵＣ１９、ｐＵＣ
１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９
９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０等が挙げられる。
【００２５】組み換えＤＮＡの調製はトランスポゾン
（ＷＯ０２／０２６２７国際公開パンフレット、ＷＯ９
３／１８１５１国際公開パンフレット、欧州特許公開０
４４５３８５号、特開平６−４６８６７号、Ｖｅｒｔｅ
ｓ， Ａ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．， １１， ７３９−７４６ （１９９
４）、Ｂｏｎａｍｙ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏ
ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １４， ５７１−５８
１ （１９９４）、Ｖｅｒｔｅｓ， Ａ． Ａ．ｅｔ
ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２４
５， ３９７−４０５ （１９９４）、Ｊａｇａｒ，
Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １２６， １−６ （１９
９５）、特開平７−１０７９７６号、特開平７−３２７
６８０号等）やファージベクター、染色体組み換え（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ（１９７２）；Ｍ
ａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ． ａｎｄ Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１１９
６（１９８５））等を利用することによっても行うこと
ができる。
（ＷＯ０２／０２６２７国際公開パンフレット、ＷＯ９
３／１８１５１国際公開パンフレット、欧州特許公開０
４４５３８５号、特開平６−４６８６７号、Ｖｅｒｔｅ
ｓ， Ａ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．， １１， ７３９−７４６ （１９９
４）、Ｂｏｎａｍｙ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏ
ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １４， ５７１−５８
１ （１９９４）、Ｖｅｒｔｅｓ， Ａ． Ａ．ｅｔ
ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２４
５， ３９７−４０５ （１９９４）、Ｊａｇａｒ，
Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １２６， １−６ （１９
９５）、特開平７−１０７９７６号、特開平７−３２７
６８０号等）やファージベクター、染色体組み換え（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ（１９７２）；Ｍ
ａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ． ａｎｄ Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１１９
６（１９８５））等を利用することによっても行うこと
ができる。
【００２６】また、これらのベクターにコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断
片を挿入すると、エシェリヒア コリ及びコリネ型細菌
の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとし
て使用することができる。このようなシャトルベクター
としては、以下のものが挙げられる。なお、それぞれの
ベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号
をかっこ内に示した。 ｐＨＣ４ エシェリヒア コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５３ ２） ｐＡＪ６５５ エシェリヒア コリＡＪ１１８８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６ ） コリネバクテリウム グルタミカムＳＲ８２０１（ＡＴＣＣ３ ９１３５） ｐＡＪ１８４４ エシェリヒア コリＡＪ１１８８３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７ ） コリネバクテリウム グルタミカムＳＲ８２０２（ＡＴＣＣ３ ９１３６） ｐＡＪ６１１ エシェリヒア コリＡＪ１１８８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３８ ） ｐＡＪ３１４８ コリネバクテリウム グルタミカムＳＲ８２０３（ＡＴＣＣ３ ９１３７） ｐＡＪ４４０ バチルス ズブチリスＡＪ１１９０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４ ０）
でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断
片を挿入すると、エシェリヒア コリ及びコリネ型細菌
の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとし
て使用することができる。このようなシャトルベクター
としては、以下のものが挙げられる。なお、それぞれの
ベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号
をかっこ内に示した。 ｐＨＣ４ エシェリヒア コリＡＪ１２６１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５３ ２） ｐＡＪ６５５ エシェリヒア コリＡＪ１１８８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６ ） コリネバクテリウム グルタミカムＳＲ８２０１（ＡＴＣＣ３ ９１３５） ｐＡＪ１８４４ エシェリヒア コリＡＪ１１８８３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７ ） コリネバクテリウム グルタミカムＳＲ８２０２（ＡＴＣＣ３ ９１３６） ｐＡＪ６１１ エシェリヒア コリＡＪ１１８８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３８ ） ｐＡＪ３１４８ コリネバクテリウム グルタミカムＳＲ８２０３（ＡＴＣＣ３ ９１３７） ｐＡＪ４４０ バチルス ズブチリスＡＪ１１９０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４ ０）
【００２７】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２８】エシェリヒア コリにプラスミドを導入し
て形質転換するには Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ６
８，３２６， １９７９）あるいは受容菌細胞を塩化カ
ルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎ
ｄｅｌ，Ｍ． ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．，Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等によ
り行うことができる。
て形質転換するには Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ６
８，３２６， １９７９）あるいは受容菌細胞を塩化カ
ルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎ
ｄｅｌ，Ｍ． ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．，Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等によ
り行うことができる。
【００２９】コリネ型細菌にプラスミドを導入して形質
転換するには、電気パルス法（杉本ら、特開平２−２０
７７９１号 公報）によって行うことができる。
転換するには、電気パルス法（杉本ら、特開平２−２０
７７９１号 公報）によって行うことができる。
【００３０】上記ＤＮＡを導入するコリネ型細菌の例と
しては、例えば次のような野生株が挙げられる。 コリネバクテリウム アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ （ブレビバクテリウム ディバリカタム） ＡＴＣＣ１４０２０ （ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９ （コリネバクテリウム リリウム） ＡＴＣＣ１５９９０ （ブレビバクテリウム フラバム） ＡＴＣＣ１４０６７ コリネバクテリウム メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム サッカロリティクム ＡＴＣＣ１４０６６ ブレビバクテリウム インマリオフィルム ＡＴＣＣ１４０６８ ブレビバクテリウム ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ ミクロバクテリウム アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４ コリネバクテリウム サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ）
しては、例えば次のような野生株が挙げられる。 コリネバクテリウム アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ （ブレビバクテリウム ディバリカタム） ＡＴＣＣ１４０２０ （ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９ （コリネバクテリウム リリウム） ＡＴＣＣ１５９９０ （ブレビバクテリウム フラバム） ＡＴＣＣ１４０６７ コリネバクテリウム メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム サッカロリティクム ＡＴＣＣ１４０６６ ブレビバクテリウム インマリオフィルム ＡＴＣＣ１４０６８ ブレビバクテリウム ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ ミクロバクテリウム アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４ コリネバクテリウム サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ）
【００３１】上記のようなコリネ型細菌に、変異型ｓｅ
ｒＡを含む組換えＤＮＡを導入して得られる形質転換株
は、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された
３−ＰＧＤＨを産生する。また、同形質転換株は、アザ
セリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに
対する耐性を有する。
ｒＡを含む組換えＤＮＡを導入して得られる形質転換株
は、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除された
３−ＰＧＤＨを産生する。また、同形質転換株は、アザ
セリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに
対する耐性を有する。
【００３２】本発明の菌株を用いてＬ−セリンを生産す
るには次のような方法が用いられる。使用する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を適宜含有する通
常の液体培地が使用される。炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、フラクトース、ガラクトース等の
糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜
菜糖蜜、ハイテストモラセス、さらには酢酸等の有機
酸、エタノール等のアルコール類、グリセリン等も使用
される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的
に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解
液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、コーンスティ
ープリカー、酵母または酵母エキス、ペプトン等のペプ
チド類等が使用される。無機イオンとしてはリン酸イオ
ン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が適宜添加される。また本発明の
微生物にアミノ酸等の要求性物質がある場合には、その
要求物質を添加しなければならない。
るには次のような方法が用いられる。使用する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を適宜含有する通
常の液体培地が使用される。炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、フラクトース、ガラクトース等の
糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜
菜糖蜜、ハイテストモラセス、さらには酢酸等の有機
酸、エタノール等のアルコール類、グリセリン等も使用
される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的
に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解
液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、コーンスティ
ープリカー、酵母または酵母エキス、ペプトン等のペプ
チド類等が使用される。無機イオンとしてはリン酸イオ
ン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が適宜添加される。また本発明の
微生物にアミノ酸等の要求性物質がある場合には、その
要求物質を添加しなければならない。
【００３３】微生物の培養は通常ｐＨ５〜８、温度２５
〜４０℃の範囲で好気的条件下で行われる。培養液のｐ
Ｈは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらに
は尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって
上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
〜４０℃の範囲で好気的条件下で行われる。培養液のｐ
Ｈは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらに
は尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって
上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。
【００３４】発酵液からＬ−セリンを採取するには、例
えば菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理あるいは濃
縮冷却晶析法、膜分離法、その他公知の方法を組み合わ
せることにより行われる。不純物を除くためには常法の
活性炭吸着法及び再結晶法を用いて精製してもよい。
えば菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理あるいは濃
縮冷却晶析法、膜分離法、その他公知の方法を組み合わ
せることにより行われる。不純物を除くためには常法の
活性炭吸着法及び再結晶法を用いて精製してもよい。
【００３５】
【００３６】（実施例１）新規Ｌ−セリン生産菌ブレビ
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２４およびＡＪ１３
３２７の構築 ブレビバクテリウム フラバムＡＪ１３３２４およびＡ
Ｊ１３３２７は野生型株ブレビバクテリウム フラバム
ＡＴＣＣ １４０６７から得られたＬ−セリンの分解
能が欠失したブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３７７から構築された。
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２４およびＡＪ１３
３２７の構築 ブレビバクテリウム フラバムＡＪ１３３２４およびＡ
Ｊ１３３２７は野生型株ブレビバクテリウム フラバム
ＡＴＣＣ １４０６７から得られたＬ−セリンの分解
能が欠失したブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３７７から構築された。
【００３７】変異株を得るためには、ブイヨン培地（魚
肉エキス１ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５
ｇ、食塩０．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．０に調整した
培地）で一昼夜増殖させた菌体を、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し（１ｍｌ当たり１０9−１
０10個の菌体を含む）、これに２００μｇ／ｍｌ濃度と
なるようにＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン）を加えて３０℃で３０分間保持した。
このようにしてＮＧ処理した菌体を同緩衝液で十分洗浄
した。
肉エキス１ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５
ｇ、食塩０．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．０に調整した
培地）で一昼夜増殖させた菌体を、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し（１ｍｌ当たり１０9−１
０10個の菌体を含む）、これに２００μｇ／ｍｌ濃度と
なるようにＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン）を加えて３０℃で３０分間保持した。
このようにしてＮＧ処理した菌体を同緩衝液で十分洗浄
した。
【００３８】ＮＧ処理した菌体からＬ−セリン分解能の
ない菌株を選択するためには、洗浄したブレビバクテリ
ウム フラバム ＡＴＣＣ １４０６７のＮＧ菌体をブ
イヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養してコ
ロニーを形成させた。次にブイヨン寒天培地のコロニー
を原版にして、最少培地と選択用最少培地にレプリカを
行い、最少培地で生育し選択用最少培地で生育しない菌
株を探した。最少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０
ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１
ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４
ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガ
ン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、寒
天２．０ｇを含有する培地で、選択用最少培地は、純粋
１Ｌ当たり硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウ
ム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物
０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸
マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００
μｇ、Ｌ−セリン０．５ｇ、寒天２．０ｇを含有する培
地であった。このような方法で得られた変異株の中に
は、Ｌ−セリンの分解能がない菌株が多く見いだされ、
その１株としてブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１
３３７７を取得した。
ない菌株を選択するためには、洗浄したブレビバクテリ
ウム フラバム ＡＴＣＣ １４０６７のＮＧ菌体をブ
イヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養してコ
ロニーを形成させた。次にブイヨン寒天培地のコロニー
を原版にして、最少培地と選択用最少培地にレプリカを
行い、最少培地で生育し選択用最少培地で生育しない菌
株を探した。最少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０
ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１
ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４
ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガ
ン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、寒
天２．０ｇを含有する培地で、選択用最少培地は、純粋
１Ｌ当たり硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウ
ム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物
０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸
マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００
μｇ、Ｌ−セリン０．５ｇ、寒天２．０ｇを含有する培
地であった。このような方法で得られた変異株の中に
は、Ｌ−セリンの分解能がない菌株が多く見いだされ、
その１株としてブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１
３３７７を取得した。
【００３９】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３７７を親株にして、ＮＧ処理した菌株からアザセリン
耐性株を選択するため、洗浄したブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３７７のＮＧ処理菌体を選択用最少
培地に接種した。選択用最少培地は純水１Ｌ当たりグル
コース２０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カ
リウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和
物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫
酸マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００
μｇ、アザセリン２５０ｍｇを含有する培地である。Ｎ
Ｇ処理変異株を同培地上で３０℃で５〜１０日間培養し
た。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天培地に
塗布し、３０℃、２４時間培養しコロニーを形成させ
た。コロニーを形成する株の中からアザセリンに耐性な
菌株を取得した。得られた変異株の中には、高収率で著
量のＬ−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、それ
らよりブレビバクテリウムフラバム ＡＪ１３３２４お
よびＡＪ１３３２７の２株を取得した。本菌株らは０．
２５ｇ／Ｌのアザセリン存在下で生育可能であることを
確認した。
３７７を親株にして、ＮＧ処理した菌株からアザセリン
耐性株を選択するため、洗浄したブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３７７のＮＧ処理菌体を選択用最少
培地に接種した。選択用最少培地は純水１Ｌ当たりグル
コース２０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カ
リウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和
物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫
酸マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００
μｇ、アザセリン２５０ｍｇを含有する培地である。Ｎ
Ｇ処理変異株を同培地上で３０℃で５〜１０日間培養し
た。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天培地に
塗布し、３０℃、２４時間培養しコロニーを形成させ
た。コロニーを形成する株の中からアザセリンに耐性な
菌株を取得した。得られた変異株の中には、高収率で著
量のＬ−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、それ
らよりブレビバクテリウムフラバム ＡＪ１３３２４お
よびＡＪ１３３２７の２株を取得した。本菌株らは０．
２５ｇ／Ｌのアザセリン存在下で生育可能であることを
確認した。
【００４０】（実施例２）新規Ｌ−セリン生産菌ブレビ
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２５の構築 ブレビバクテリウム フラバムＡＪ１３３２５は野生型
株ブレビバクテリウムフラバム ＡＴＣＣ １４０６７
から得られたＬ−セリンの分解能が欠失したブレビバク
テリウム フラバム ＡＪ１３３７７から構築された。
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２５の構築 ブレビバクテリウム フラバムＡＪ１３３２５は野生型
株ブレビバクテリウムフラバム ＡＴＣＣ １４０６７
から得られたＬ−セリンの分解能が欠失したブレビバク
テリウム フラバム ＡＪ１３３７７から構築された。
【００４１】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３７７を親株にして、ＮＧ処理した菌株からβ−（２−
チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性株を選択するため、洗
浄したブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３７７
のＮＧ処理菌体を選択用最少培地に接種した。選択用最
少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモ
ニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（Ｉ
Ｉ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和
物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００
μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、β−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニン２５０ｍｇを含有する培地であ
る。ＮＧ処理変異株を同培地上で３０℃で５〜１０日間
培養した。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天
培地に塗布し、３０℃、２４時間培養しコロニーを形成
させた。コロニーを形成する株の中からβ−（２−チエ
ニル）−ＤＬ−アラニンに耐性な菌株を取得した。得ら
れた変異株の中には、高収率で著量のＬ−セリンを蓄積
する菌株が多く見いだされ、その１株としてブレビバク
テリウム フラバム ＡＪ１３３２５を取得した。本菌
株は０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チエニル）−ＤＬ−ア
ラニン存在下で生育可能であることを確認した。
３７７を親株にして、ＮＧ処理した菌株からβ−（２−
チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性株を選択するため、洗
浄したブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３７７
のＮＧ処理菌体を選択用最少培地に接種した。選択用最
少培地は純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモ
ニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（Ｉ
Ｉ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和
物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００
μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、β−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニン２５０ｍｇを含有する培地であ
る。ＮＧ処理変異株を同培地上で３０℃で５〜１０日間
培養した。このようにして得られた菌液をブイヨン寒天
培地に塗布し、３０℃、２４時間培養しコロニーを形成
させた。コロニーを形成する株の中からβ−（２−チエ
ニル）−ＤＬ−アラニンに耐性な菌株を取得した。得ら
れた変異株の中には、高収率で著量のＬ−セリンを蓄積
する菌株が多く見いだされ、その１株としてブレビバク
テリウム フラバム ＡＪ１３３２５を取得した。本菌
株は０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チエニル）−ＤＬ−ア
ラニン存在下で生育可能であることを確認した。
【００４２】（実施例３）新規Ｌ−セリン生産菌ブレビ
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２
５およびＡＪ１３３２７によるＬ−セリンの生産ブレビ
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２
５およびＡＪ１３３２７をブイヨン寒天培地で３０℃、
２４時間培養し、次いで表１の組成の発酵培地２０ｍｌ
を含有する５００ｍｌ振とうフラスコに白金耳で接種し
た。対照として親株であるブレビバクテリウム フラバ
ム ＡＴＣＣ１４０６７およびＡＪ１３３７７を同様に
接種した。培地は水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後
１１５℃、１５分間オートクレーブ殺菌した。殺菌冷却
後、１８０℃、３時間乾熱殺菌した炭酸カルシウム５ｇ
／Ｌ添加した。
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２
５およびＡＪ１３３２７によるＬ−セリンの生産ブレビ
バクテリウム フラバムＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２
５およびＡＪ１３３２７をブイヨン寒天培地で３０℃、
２４時間培養し、次いで表１の組成の発酵培地２０ｍｌ
を含有する５００ｍｌ振とうフラスコに白金耳で接種し
た。対照として親株であるブレビバクテリウム フラバ
ム ＡＴＣＣ１４０６７およびＡＪ１３３７７を同様に
接種した。培地は水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整後
１１５℃、１５分間オートクレーブ殺菌した。殺菌冷却
後、１８０℃、３時間乾熱殺菌した炭酸カルシウム５ｇ
／Ｌ添加した。
【００４３】
【表１】 表１ ────────────────────────── 成 分 １Ｌ当たりの含量 ────────────────────────── グルコース １１０．０ ｇ リン酸２水素カリウム ０．４ ｇ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．４ ｇ 硫酸鉄（II）・７水和物 ０．０１ｇ 硫酸マンガン・４〜５水和物 ０．０１ｇ 硫酸アンモニウム ２５．０ ｇ 塩酸チアミン １００ μｇ ビオチン １００ μｇ 大豆タンパク質塩酸加水分解物 ４０ ｍｌ （「味液」（登録商標）） ────────────────────────── ｐＨ ７．０ ──────────────────────────
【００４４】生産物であるＬ−セリンの測定は、高速液
体クロマトグラフィー（日立Ｌ−８５００アミノ酸分析
装置）によって行った。その結果、ブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２５およびＡ
Ｊ１３３２７はＬ−セリンをそれぞれ１５．２ｇ／Ｌ、
１４．３ｇ／Ｌ、１５．４ｇ／Ｌ 培地中に蓄積した。
一方、対照として培養したブレビバクテリウム フラバ
ム ＡＴＣＣ１４０６７およびＡＪ１３３７７のＬ−セ
リン蓄積量はそれぞれ０ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌであっ
た。
体クロマトグラフィー（日立Ｌ−８５００アミノ酸分析
装置）によって行った。その結果、ブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３２４、ＡＪ１３３２５およびＡ
Ｊ１３３２７はＬ−セリンをそれぞれ１５．２ｇ／Ｌ、
１４．３ｇ／Ｌ、１５．４ｇ／Ｌ 培地中に蓄積した。
一方、対照として培養したブレビバクテリウム フラバ
ム ＡＴＣＣ１４０６７およびＡＪ１３３７７のＬ−セ
リン蓄積量はそれぞれ０ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌであっ
た。
【００４５】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３２４の培養液は遠心分離後、定法によりカチオン交換
樹脂による脱塩処理を行い、その後カチオン交換樹脂及
びアニオン交換樹脂によるクロマト分離を用いて副生物
を除き、晶析処理による精製を行い、９９％以上の純度
のＬ−セリン結晶をブロスからの収率５５％で得た。
３２４の培養液は遠心分離後、定法によりカチオン交換
樹脂による脱塩処理を行い、その後カチオン交換樹脂及
びアニオン交換樹脂によるクロマト分離を用いて副生物
を除き、晶析処理による精製を行い、９９％以上の純度
のＬ−セリン結晶をブロスからの収率５５％で得た。
【００４６】（実施例４）３−ＰＧＤＨ活性の測定ブレ
ビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２４、ＡＪ１３
３２５およびＡＪ１３３２７をブイヨン寒天培地で３０
℃、２４時間培養し、次いで表２の組成の接種用培地５
０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコの中に白金
耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテリウ
ム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１３３７７を
同様に接種した。接種用培地は水酸化ナトリウムでｐＨ
５．５に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ殺
菌した後使用した。
ビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２４、ＡＪ１３
３２５およびＡＪ１３３２７をブイヨン寒天培地で３０
℃、２４時間培養し、次いで表２の組成の接種用培地５
０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコの中に白金
耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテリウ
ム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１３３７７を
同様に接種した。接種用培地は水酸化ナトリウムでｐＨ
５．５に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ殺
菌した後使用した。
【００４７】
【表２】 表２ ────────────────────────── 成 分 １Ｌ当たりの含量 ────────────────────────── グルコース ３０．０ ｇ リン酸二水素カリウム １．０ ｇ 硫酸マグネシウム・７水和物 ０．４ ｇ 硫酸第一鉄・７水和物 ０．０１ｇ 硫酸マンガン４〜５水和物 ０．０１ｇ 硫酸アンモニウム ３．０ ｇ 大豆タンパク質塩酸加水分解物 ３．０ｍｌ （「味液」（登録商標）） 塩酸チアミン ２００ μｇ ビオチン ５０ μｇ 尿素 ３．０ ｇ 酵母エキス ２．０ ｇ ────────────────────────── ｐＨ ５．５ ──────────────────────────
【００４８】各菌株を培養した培養液から菌体を回収し
た後、生理食塩水で２度洗浄し、２ｍＭのジチオスレイ
トールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐ
Ｈ７．０で懸濁した。氷冷後、超音波破砕機で菌体を破
砕し、破砕液を超遠心分離機にかけた。超遠心は４５，
０００ｒｐｍで１時間行い、粗酵素液を得た。
た後、生理食塩水で２度洗浄し、２ｍＭのジチオスレイ
トールを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐ
Ｈ７．０で懸濁した。氷冷後、超音波破砕機で菌体を破
砕し、破砕液を超遠心分離機にかけた。超遠心は４５，
０００ｒｐｍで１時間行い、粗酵素液を得た。
【００４９】３−ＰＧＤＨの酵素活性測定はＳａｌａｃ
ｈ Ｈ．Ｊ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ｖ９，２１６−２２０，１９６６）に従
った。
ｈ Ｈ．Ｊ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ ｖ９，２１６−２２０，１９６６）に従
った。
【００５０】あらかじめ２５℃に暖めておいた０．０１
５Ｍ ＮＡＤ ０．４ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ９ ＮａＯＨ）０．１２ｍｌ、０．０５Ｍ Ｇｌｕｔ
ａｔｈｉｏｎｅ（ｐＨ６ ＫＯＨ）０．１ｍｌ、１Ｍ
Ｈｙｄｒａｄｉｎｅ（ｐＨ９Ａｃｅｔａｔｅ）０．５ｍ
ｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９ ＨＣｌ）０．６ｍｌ、適
当な濃度のＬ−セリン（０〜４０ｍＭ）を加え、水を加
えて２．３ｍｌに調整し、その後粗酵素液を０．２ｍｌ
加え、５分間保温し、０．１Ｍ ３−ＰＧＡ（３−ホス
ホグリセリン酸二ナトリウム塩、ｐＨ７ ＮａＯＨ）を
０．５ｍｌ加え、撹拌後３４０ｎｍの吸光度を３０秒間
測定した。反応は２５℃で行った。
５Ｍ ＮＡＤ ０．４ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ９ ＮａＯＨ）０．１２ｍｌ、０．０５Ｍ Ｇｌｕｔ
ａｔｈｉｏｎｅ（ｐＨ６ ＫＯＨ）０．１ｍｌ、１Ｍ
Ｈｙｄｒａｄｉｎｅ（ｐＨ９Ａｃｅｔａｔｅ）０．５ｍ
ｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９ ＨＣｌ）０．６ｍｌ、適
当な濃度のＬ−セリン（０〜４０ｍＭ）を加え、水を加
えて２．３ｍｌに調整し、その後粗酵素液を０．２ｍｌ
加え、５分間保温し、０．１Ｍ ３−ＰＧＡ（３−ホス
ホグリセリン酸二ナトリウム塩、ｐＨ７ ＮａＯＨ）を
０．５ｍｌ加え、撹拌後３４０ｎｍの吸光度を３０秒間
測定した。反応は２５℃で行った。
【００５１】活性の測定には日立Ｕ−２０００Ａ Ｓｐ
ｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用した。
ｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用した。
【００５２】図１に測定結果を示す。野生株であるＡＴ
ＣＣ１４０６７に比べＡＪ１３３７７はＬ−セリンに対
する感受性が緩和されていた。ＡＪ１３３２４では更に
感受性が緩和されており、ＡＪ１３３２５もほぼ同等で
あった。ＡＪ１３３２７では感受性が大幅に緩和され８
０ｍＭのＬ−セリン存在下でも阻害は完全に解除されて
いた。
ＣＣ１４０６７に比べＡＪ１３３７７はＬ−セリンに対
する感受性が緩和されていた。ＡＪ１３３２４では更に
感受性が緩和されており、ＡＪ１３３２５もほぼ同等で
あった。ＡＪ１３３２７では感受性が大幅に緩和され８
０ｍＭのＬ−セリン存在下でも阻害は完全に解除されて
いた。
【００５３】Ｌ−セリンによる３−ＰＧＤＨの阻害の解
除についてはエシェリヒア コリの例（トサ（Ｔｏｓ
ａ）及びピッツア（Ｐｉｚｅｒ）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１０６：９７２〜９８２（１９７１）、又は特
表平６−５１０９１１）があるが、これほど高濃度のＬ
−セリンの存在下で阻害が完全解除されている例はな
い。
除についてはエシェリヒア コリの例（トサ（Ｔｏｓ
ａ）及びピッツア（Ｐｉｚｅｒ）、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１０６：９７２〜９８２（１９７１）、又は特
表平６−５１０９１１）があるが、これほど高濃度のＬ
−セリンの存在下で阻害が完全解除されている例はな
い。
【００５４】（実施例５）コリネ型細菌由来の野生型及
び変異型ｓｅｒＡのクローニング 実施例４で示されたように、ＡＪ１３３２７ではＬ−セ
リンによるフィードバック阻害が完全に解除されてい
た。そこで、ＡＴＣＣ１４０６７由来の野生型、及びＡ
Ｊ１３３２７由来の変異型３−ＰＧＤＨをコードするｓ
ｅｒＡ遺伝子をクローニングして、変異点を明らかに
し、また３−ＰＧＤＨの増幅効果を確認することとし
た。
び変異型ｓｅｒＡのクローニング 実施例４で示されたように、ＡＪ１３３２７ではＬ−セ
リンによるフィードバック阻害が完全に解除されてい
た。そこで、ＡＴＣＣ１４０６７由来の野生型、及びＡ
Ｊ１３３２７由来の変異型３−ＰＧＤＨをコードするｓ
ｅｒＡ遺伝子をクローニングして、変異点を明らかに
し、また３−ＰＧＤＨの増幅効果を確認することとし
た。
【００５５】ブレビバクテリウム フラバムの染色体よ
りＰＣＲ法を用いてｓｅｒＡを増幅するためには対応す
るプライマーを作製しなければならない。ブレビバクテ
リウムのｓｅｒＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列に
ついては報告されていないため、コリネバクテリウム由
来のｓｅｒＡの配列を利用することとした。コリネバク
テリウム由来のｓｅｒＡ断片がクローニングされている
菌株コリネバクテリウム グルタミカム Ｋ８２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２４４４、特開平３−７５９１号公報参
照）からＷｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社製）を使用してプラスミド ｐＤＴＳ９９０１を
抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）でｓｅ
ｒＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。
りＰＣＲ法を用いてｓｅｒＡを増幅するためには対応す
るプライマーを作製しなければならない。ブレビバクテ
リウムのｓｅｒＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列に
ついては報告されていないため、コリネバクテリウム由
来のｓｅｒＡの配列を利用することとした。コリネバク
テリウム由来のｓｅｒＡ断片がクローニングされている
菌株コリネバクテリウム グルタミカム Ｋ８２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２４４４、特開平３−７５９１号公報参
照）からＷｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社製）を使用してプラスミド ｐＤＴＳ９９０１を
抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）でｓｅ
ｒＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。
【００５６】遺伝子断片のクローン化用ベクターとして
は、新規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクタ
ーｐＶＫ７を用いた。ｐＶＫ７は、以下のようにして、
エシェリヒア コリ用ベクターであるｐＨＳＧ２９９
（Ｋｍｒ；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， Ｓ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｇｅｎｅ， ６１， ６３−７４， （１９８
７）、特開平１０−２１５８８３号参照）にブレビバク
テリウム ラクトファーメンタムのクリプティックプラ
スミドであるｐＡＭ３３０を結合することによって構築
した。ｐＨＳＧ２９９を一箇所切断酵素であるＡｖａＩ
Ｉ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼにて平滑末端化したのち、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造
（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平
滑末端化したｐＡＭ３３０と接続した。ｐＨＳＧ２９９
に対するｐＡＭ３３０の挿入方向により、生成した２種
類のプラスミドをｐＶＫ６、ｐＶＫ７と命名し、ｐＶＫ
７を以下の実験に用いた。ｐＶＫ７は、エシェリヒア
コリ及びブレビバクテリウム ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、ｐＨＳＧ２９９由
来のマルチプルクローニングサイトとｌａｃＺ’を保持
している。ｐＶＫ６及びｐＶＫ７の構築の過程を図２に
示す。
は、新規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクタ
ーｐＶＫ７を用いた。ｐＶＫ７は、以下のようにして、
エシェリヒア コリ用ベクターであるｐＨＳＧ２９９
（Ｋｍｒ；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ， Ｓ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｇｅｎｅ， ６１， ６３−７４， （１９８
７）、特開平１０−２１５８８３号参照）にブレビバク
テリウム ラクトファーメンタムのクリプティックプラ
スミドであるｐＡＭ３３０を結合することによって構築
した。ｐＨＳＧ２９９を一箇所切断酵素であるＡｖａＩ
Ｉ（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼにて平滑末端化したのち、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造
（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平
滑末端化したｐＡＭ３３０と接続した。ｐＨＳＧ２９９
に対するｐＡＭ３３０の挿入方向により、生成した２種
類のプラスミドをｐＶＫ６、ｐＶＫ７と命名し、ｐＶＫ
７を以下の実験に用いた。ｐＶＫ７は、エシェリヒア
コリ及びブレビバクテリウム ラクトファーメンタムの
細胞中で自律複製可能であり、かつ、ｐＨＳＧ２９９由
来のマルチプルクローニングサイトとｌａｃＺ’を保持
している。ｐＶＫ６及びｐＶＫ７の構築の過程を図２に
示す。
【００５７】構築したシャトルベクターｐＶＫ７にｓｅ
ｒＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を接続した。ｐＤ
ＴＳ９９０１を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）
にて切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩにて切断したｐ
ＶＫ７と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法に
て行った。
ｒＡを含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を接続した。ｐＤ
ＴＳ９９０１を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）
にて切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩにて切断したｐ
ＶＫ７と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法に
て行った。
【００５８】シークエンス反応にはＰＣＲ サーマルサ
イクラー ＭＰ型（宝酒造（株）製）を用い、Ｄｙｅ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐ
ＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を使用した。ＤＮＡプラ
イマーとしてはＭ１３（−２１）、ＲＶプライマー（宝
酒造（株）製）を使用した。得られた配列を配列表の配
列番号１に示す。この配列によってコードされ得るアミ
ノ酸配列を配列番号２に示す。
イクラー ＭＰ型（宝酒造（株）製）を用い、Ｄｙｅ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐ
ＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を使用した。ＤＮＡプラ
イマーとしてはＭ１３（−２１）、ＲＶプライマー（宝
酒造（株）製）を使用した。得られた配列を配列表の配
列番号１に示す。この配列によってコードされ得るアミ
ノ酸配列を配列番号２に示す。
【００５９】決定した塩基配列に基づいてプライマーを
合成し、ブレビバクテリウム フラバム変異株ＡＪ１３
３２７の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｅ
ｒＡを増幅した。ここで遺伝子増幅に用いるために合成
したＮ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番
号３に、Ｃ末側を配列番号４に示す。
合成し、ブレビバクテリウム フラバム変異株ＡＪ１３
３２７の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法によりｓｅ
ｒＡを増幅した。ここで遺伝子増幅に用いるために合成
したＮ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番
号３に、Ｃ末側を配列番号４に示す。
【００６０】ブレビバクテリウム フラバムの染色体Ｄ
ＮＡの調製にはＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ）（Ａｄｖ
ａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｃｏｒｐ．製）を使用し、調製方法は添付のプロト
コールに従った。
ＮＡの調製にはＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ）（Ａｄｖ
ａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｃｏｒｐ．製）を使用し、調製方法は添付のプロト
コールに従った。
【００６１】ＰＣＲ反応にはＰＣＲ サーマルサイクラ
ー ＭＰ型（宝酒造（株）製）を用い、ＴａＫａＲａ
Ｔａｑ（宝酒造（株）製）を使用した。
ー ＭＰ型（宝酒造（株）製）を用い、ＴａＫａＲａ
Ｔａｑ（宝酒造（株）製）を使用した。
【００６２】ＰＣＲ産物はＯｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を
使用して直接プラスミドｐＣＲ２．１ベクターにライゲ
ーションして、ＩＮＶαＦ’のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃ
ｅｌｌを用いて形質転換を行い、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド）４０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌ
を含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイ
ーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１５ｇ／Ｌ、
寒天１５ｇ／Ｌ）に塗布し、一晩培養後、出現した白色
のコロニーをつり上げ、単コロニー分離して、形質転換
株を得た。
ｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を
使用して直接プラスミドｐＣＲ２．１ベクターにライゲ
ーションして、ＩＮＶαＦ’のＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃ
ｅｌｌを用いて形質転換を行い、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド）４０μｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌ
を含むＬ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイ
ーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１５ｇ／Ｌ、
寒天１５ｇ／Ｌ）に塗布し、一晩培養後、出現した白色
のコロニーをつり上げ、単コロニー分離して、形質転換
株を得た。
【００６３】形質転換株からプラスミドを抽出し、ＰＣ
Ｒ法によりｓｅｒＡ断片の挿入が確認できたものについ
ては制限酵素ＥｃｏＲＩ処理を行いシャトルベクター
ｐＶＫ７につなぎかえた。これの塩基配列を決定したと
ころＣ末端側には完全長の配列が含まれていないと考え
られた。得られた配列は配列表の配列番号１３の、５’
側はさらに２７７塩基上流、３’側は１１３４番目の塩
基までにあたる。
Ｒ法によりｓｅｒＡ断片の挿入が確認できたものについ
ては制限酵素ＥｃｏＲＩ処理を行いシャトルベクター
ｐＶＫ７につなぎかえた。これの塩基配列を決定したと
ころＣ末端側には完全長の配列が含まれていないと考え
られた。得られた配列は配列表の配列番号１３の、５’
側はさらに２７７塩基上流、３’側は１１３４番目の塩
基までにあたる。
【００６４】ｓｅｒＡ遺伝子全長を含む断片を取得する
ため、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を使用し、
添付のプロトコールに従ってブレビバクテリウム フラ
バムＡＪ１３３２７の染色体ＤＮＡから欠損部分のクロ
ーニングを行った。
ため、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を使用し、
添付のプロトコールに従ってブレビバクテリウム フラ
バムＡＪ１３３２７の染色体ＤＮＡから欠損部分のクロ
ーニングを行った。
【００６５】まず、調製した染色体ＤＮＡを各種制限酵
素で完全消化し、ライゲーション反応によりこれらにそ
れぞれ対応する制限酵素サイトを持つカセットを連結し
た。カセットプライマー（Ｃ１）（配列表配列番号５）
と、ＤＮＡ上の既知領域に相補的なプライマー（Ｓ１）
（配列表配列番号６）を用いて１回目のＰＣＲを行っ
た。反応液の一部を用いて、内側のプライマーＣ２（配
列表配列番号７）とＳ２（配列表配列番号８）で２回目
のＰＣＲを行い、目的のＤＮＡのみを増幅させた。
素で完全消化し、ライゲーション反応によりこれらにそ
れぞれ対応する制限酵素サイトを持つカセットを連結し
た。カセットプライマー（Ｃ１）（配列表配列番号５）
と、ＤＮＡ上の既知領域に相補的なプライマー（Ｓ１）
（配列表配列番号６）を用いて１回目のＰＣＲを行っ
た。反応液の一部を用いて、内側のプライマーＣ２（配
列表配列番号７）とＳ２（配列表配列番号８）で２回目
のＰＣＲを行い、目的のＤＮＡのみを増幅させた。
【００６６】制限酵素としてＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）
製）を使用した際に目的ＤＮＡの増幅が確認され、この
ＰＣＲ産物の塩基配列を直接決定した。得られた塩基配
列に基づきＣ末側をコードするプライマーを作製し、野
生型としてブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１
４０６７、変異型としてＡＪ１３３２７からｓｅｒＡ全
長を含む断片の取得を行った。ここで使用したＮ末側の
ＤＮＡプライマ−の配列を配列表の配列番号９に、作製
したＣ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番
号１０に示す。
製）を使用した際に目的ＤＮＡの増幅が確認され、この
ＰＣＲ産物の塩基配列を直接決定した。得られた塩基配
列に基づきＣ末側をコードするプライマーを作製し、野
生型としてブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１
４０６７、変異型としてＡＪ１３３２７からｓｅｒＡ全
長を含む断片の取得を行った。ここで使用したＮ末側の
ＤＮＡプライマ−の配列を配列表の配列番号９に、作製
したＣ末側のＤＮＡプライマーの配列を配列表の配列番
号１０に示す。
【００６７】得られた野生型ｓｅｒＡ及び変異型ｓｅｒ
Ａ全長を含む遺伝子断片をＯｒｉｇｉｎａｌＴＡ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用
いて、ＥｃｏＲＩ切断したシャトルベクターｐＶＫ７に
接続した。各遺伝子断片を搭載したプラスミドを各々作
製し、塩基配列の決定を行った。野生型の配列を配列表
の配列番号１１に、変異型の配列を配列表の配列番号１
３に示す。これらの配列によってコードされ得るアミノ
酸配列を配列番号１２及び１４にそれぞれ示す。決定し
たこれらの塩基配列を比較したところ変異型ｓｅｒＡで
は１０８７番目のＧがＡに変異しており、この結果アミ
ノ酸配列では３２５番目のグルタミン酸がリジンに変化
していることが確認された。
Ａ全長を含む遺伝子断片をＯｒｉｇｉｎａｌＴＡ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用
いて、ＥｃｏＲＩ切断したシャトルベクターｐＶＫ７に
接続した。各遺伝子断片を搭載したプラスミドを各々作
製し、塩基配列の決定を行った。野生型の配列を配列表
の配列番号１１に、変異型の配列を配列表の配列番号１
３に示す。これらの配列によってコードされ得るアミノ
酸配列を配列番号１２及び１４にそれぞれ示す。決定し
たこれらの塩基配列を比較したところ変異型ｓｅｒＡで
は１０８７番目のＧがＡに変異しており、この結果アミ
ノ酸配列では３２５番目のグルタミン酸がリジンに変化
していることが確認された。
【００６８】（実施例６）３−ＰＧＤＨ遺伝子を含むプ
ラスミドのブレビバクテリウム フラバムへの導入 野生型ｓｅｒＡ又は変異型ｓｅｒＡを搭載したプラスミ
ドをブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３７７に
それぞれ導入した。プラスミドの導入の方法は、電気パ
ルス法（杉本ら、特開平２−２０７７９１号公報）によ
った。形質転換体の選択は２５μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンを含む完全培地にて行った。
ラスミドのブレビバクテリウム フラバムへの導入 野生型ｓｅｒＡ又は変異型ｓｅｒＡを搭載したプラスミ
ドをブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３７７に
それぞれ導入した。プラスミドの導入の方法は、電気パ
ルス法（杉本ら、特開平２−２０７７９１号公報）によ
った。形質転換体の選択は２５μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンを含む完全培地にて行った。
【００６９】（実施例７）形質転換体によるＬ−セリン
の生産 野生型ｓｅｒＡ又は変異型ｓｅｒＡ全長を含む遺伝子断
片を搭載したプラスミドが導入された形質転換体をそれ
ぞれ実施例３に従い５００ｍｌ振とうフラスコを用いて
培養し、生産物であるＬ−セリンの測定を行った。対照
として宿主であるＡＪ１３３７７株についても同様に培
養を行った。野生型ｓｅｒＡを導入した形質転換体では
Ｌ−セリン生産能に影響は認められなかったが、変異型
ｓｅｒＡを導入した形質転換体ではＬ−セリン生産能の
向上が確認された（表３）。
の生産 野生型ｓｅｒＡ又は変異型ｓｅｒＡ全長を含む遺伝子断
片を搭載したプラスミドが導入された形質転換体をそれ
ぞれ実施例３に従い５００ｍｌ振とうフラスコを用いて
培養し、生産物であるＬ−セリンの測定を行った。対照
として宿主であるＡＪ１３３７７株についても同様に培
養を行った。野生型ｓｅｒＡを導入した形質転換体では
Ｌ−セリン生産能に影響は認められなかったが、変異型
ｓｅｒＡを導入した形質転換体ではＬ−セリン生産能の
向上が確認された（表３）。
【表３】 ──────────────────────────── 菌 株 増幅遺伝子 Ｌ−セリン蓄積量 （ｇ／Ｌ） ──────────────────────────── − ５．０ ＡＪ１３３７７ serA ５．０ serA* １２．０ ──────────────────────────── serA*：変異型serA遺伝子
【００７０】ブレビバクテリウム フラバムＡＪ１３３
７７は、平成９年１０月１５日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４７
１が付与され、平成１０年１１月２０日にブダペスト条
約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−６５７６が付与されている。また、変異型ｓｅｒＡを
含むプラスミドをブレビバクテリウム フラバムＡＴＣ
Ｃ１４０６７に保持させた。同プラスミド保持株は、ブ
レビバクテリウム フラバムＡＪ１３３７８と命名され
て、平成９年１０月１５日に、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３
号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４
７２が付与され、平成１０年１１月２０日にブダペスト
条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５７７が付与されている。
７７は、平成９年１０月１５日に、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４７
１が付与され、平成１０年１１月２０日にブダペスト条
約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−６５７６が付与されている。また、変異型ｓｅｒＡを
含むプラスミドをブレビバクテリウム フラバムＡＴＣ
Ｃ１４０６７に保持させた。同プラスミド保持株は、ブ
レビバクテリウム フラバムＡＪ１３３７８と命名され
て、平成９年１０月１５日に、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３
号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４
７２が付与され、平成１０年１１月２０日にブダペスト
条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６５７７が付与されている。
【発明の効果】本発明により、糖からＬ−セリンを生成
するコリネ型細菌が提供される。同コリネ型細菌は、工
業的に有利なＬ−セリンの製造法に利用することができ
る。
するコリネ型細菌が提供される。同コリネ型細菌は、工
業的に有利なＬ−セリンの製造法に利用することができ
る。
【００７１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc） <120> 発酵法によるＬ−セリンの製造法 <130> P-6039 <141> 1998-12-11 <150> JP 10-3751 <151> 1998-01-12 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００７２】 <210> 1 <211> 1432 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (398)..(1432) <400> 1 ggatccggac acacgtgaca aaattgtaga aaattggatg attttgtcac gcctgtctgg 60 tttagctctg gttcgggacg ggcgtggaat ggaggtagcg caccgagacc ttgacccgcg 120 gcccgacaag ccaaaagtcc ccaaaacaaa cccacctcgc cggagacgtg aataaaattc 180 gcagctcatt ccatcagcgt aaacgcagct ttttgcatgg tgagacacct ttgggggtaa 240 atctcacagc atgaatctct gggttagatg actttctggg tgggggaggg tttagaatgt 300 ttctagtcgc acgccaaaac ccggcgtgga cacgtctgca gccgacgcgg tcgtgcctgt 360 tgtaggcgga cattcctagt ttttccagga gtaactt gtg agc cag aat ggc cgt 415 Val Ser Gln Asn Gly Arg 1 5 ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag tcc act gtt gac gcg 463 Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln Ser Thr Val Asp Ala 10 15 20 ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac gga cct aac cgc cca 511 Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp Gly Pro Asn Arg Pro 25 30 35 gaa ctg ctt gat gca gtt aag gaa gcg gac gca ctg ctc gtg cgt tct 559 Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp Ala Leu Leu Val Arg Ser 40 45 50 gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct gcc cct aac ttg aag 607 Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala Ala Pro Asn Leu Lys 55 60 65 70 atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac gtt gac atc cct gct 655 Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn Val Asp Ile Pro Ala 75 80 85 gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca ccg acc tct aac att 703 Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala Pro Thr Ser Asn Ile 90 95 100 cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg ctg tct act gct cgc 751 His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu Leu Ser Thr Ala Arg 105 110 115 cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag ggc gag tgg aag cgg 799 Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Trp Lys Arg 120 125 130 tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa act gtc ggt atc gtc 847 Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys Thr Val Gly Ile Val 135 140 145 150 ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag cgt ctt gct gcg ttt 895 Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln Arg Leu Ala Ala Phe 155 160 165 gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gcc aac cct gct cgt gca 943 Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala Asn Pro Ala Arg Ala 170 175 180 gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat gag ctg atg agc cgt 991 Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu Asp Glu Leu Met Ser Arg 185 190 195 tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc aag gaa act gct ggc 1039 Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr Lys Glu Thr Ala Gly 200 205 210 atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag aag ggc cag atc atc 1087 Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ile Ile 215 220 225 230 atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gag cag gct ttg gct gat 1135 Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu Gln Ala Leu Ala Asp 235 240 245 gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt ttc gat gtg tac tcc 1183 Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly Phe Asp Val Tyr Ser 250 255 260 acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag ttg cct cag gtt gtt 1231 Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys Leu Pro Gln Val Val 265 270 275 gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag gct cag gat cgt gcg 1279 Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu Ala Gln Asp Arg Ala 280 285 290 ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg ctg gct ggc gag ttc 1327 Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala Leu Ala Gly Glu Phe 295 300 305 310 gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc gtg ggc gaa gag gtt 1375 Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg Val Gly Glu Glu Val 315 320 325 gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt ctt ctt gct ggc aag 1423 Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly Leu Leu Ala Gly Lys 330 335 340 ctt gtc gac 1432 Leu Val Asp 345
【００７３】 <210> 2 <211> 345 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val 20 25 30 Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp 35 40 45 Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala 50 55 60 Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn 85 90 95 Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu 100 105 110 Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg 115 120 125 Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly 130 135 140 Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala 145 150 155 160 Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr 165 170 175 Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu 180 185 190 Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys 195 200 205 Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser 210 215 220 Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp 225 230 235 240 Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala 245 250 255 Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe 260 265 270 Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu 275 280 285 Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys 290 295 300 Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly 305 310 315 320 Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu 325 330 335 Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp 340 345
【００７４】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 3 ggacacacgt gacaaaattg tag 23
【００７５】 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 4 gccagcaaga agaccaagct tgc 23
【００７６】 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 5 gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca 35
【００７７】 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 6 tcatcaacgc tgctcgtggt ggc 23
【００７８】 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 7 cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga 35
【００７９】 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 8 gacgttgctg attctgtgct caa 23
【００８０】 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 9 gggagggttt agaatgtttc tag 23
【００８１】 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 ggttcaagca aatggatctc taa 23
【００８２】 <210> 11 <211> 1730 <212> DNA <213> Brevibacterium flavum <220> <221> CDS <222> (115)..(1704) <400> 11 gggagggttt agaatgtttc tagtcgcacg ccaaaacccg gcgtggacac gtctgcagcc 60 gacgcggtcg tgcctgttgt aggcggacat tcctagtttt tccaggagta actt gtg 117 Val 1 agc cag aat ggc cgt ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag 165 Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln 5 10 15 tcc act gtt gac gcg ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac 213 Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp 20 25 30 gga cct aac cgc cca gaa ctg ctt gat aca gtt aag gaa gcg gac gca 261 Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp Ala 35 40 45 ctg ctc gtg cgt tct gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct 309 Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala 50 55 60 65 gcc cct aac ttg aag atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac 357 Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn 70 75 80 gtt gac atc cct gct gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca 405 Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala 85 90 95 ccg acc tct aac att cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg 453 Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu 100 105 110 ctg tct act gct cgc cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag 501 Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu 115 120 125 ggc gag tgg aag cgg tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa 549 Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys 130 135 140 145 act gtc ggt atc gtc ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag 597 Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln 150 155 160 cgt ctt gct gcg ttt gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gct 645 Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala 165 170 175 aac cct gct cgt gcg gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat 693 Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu Asp 180 185 190 gag ctg atg agc cgt tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc 741 Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr 195 200 205 aag gaa act gct ggc atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag 789 Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys 210 215 220 225 aag ggc cag atc atc atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gaa 837 Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu 230 235 240 cag gct ttg gct gat gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt 885 Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly 245 250 255 ttc gat gtg tac tcc acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag 933 Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys 260 265 270 ttg cct cag gtt gtt gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag 981 Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu 275 280 285 gct cag gat cgt gcg ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg 1029 Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala 290 295 300 305 ctg gct ggc gag ttc gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc 1077 Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg 310 315 320 gtg ggc gaa gag gtt gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt 1125 Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly 325 330 335 ctt ctt gct ggc aag ctt gtc gac gcc gcc cca gtc tcc att gag gtt 1173 Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Val 340 345 350 gag gct cga ggc gag ctt tct tcc gag cag gtc gat gca ctt ggt ttg 1221 Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly Leu 355 360 365 tcc gct gtt cgt ggt ttg ttc tcc gga att atc gaa gag tcc gtt act 1269 Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val Thr 370 375 380 385 ttc gtc aac gct cct cgc att gct gaa gag cgt ggc ctg gac atc tcc 1317 Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile Ser 390 395 400 gtg aag acc aac tct gag tct gtt act cac cgt tcc gtc ctg cag gtc 1365 Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln Val 405 410 415 aag gtc att act ggc agc ggc gcg agc gca act gtt gtt ggt gcc ctg 1413 Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala Leu 420 425 430 act ggt ctt gag cgc gtt gag aag atc acc cgc atc aat ggc cgt ggc 1461 Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg Gly 435 440 445 ctg gat ctg cgc gca gag ggt ctg aac ctc ttc ctg cag tac act gac 1509 Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr Asp 450 455 460 465 gct cct ggt gca ctg ggt acc gtt ggt acc aag ctg ggt gct gct ggc 1557 Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala Gly 470 475 480 atc aac atc gag gct gct gcg ttg act cag gct gag aag ggt gac ggc 1605 Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp Gly 485 490 495 gct gtc ctg atc ctg cgt gtt gag tcc gct gtc tcc gaa gag ctg gaa 1653 Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu Glu 500 505 510 gct gaa atc aac gct gag ttg ggt gct act tcc ttc cag gtt gat ctt 1701 Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp Leu 515 520 525 gac taattagaga tccattttct agaacc 1730 Asp 530
【００８３】 <210> 12 <211> 530 <212> PRT <213> Brevibacterium flavum <400> 12 Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val 20 25 30 Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp 35 40 45 Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala 50 55 60 Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn 85 90 95 Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu 100 105 110 Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg 115 120 125 Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly 130 135 140 Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala 145 150 155 160 Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr 165 170 175 Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu 180 185 190 Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys 195 200 205 Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser 210 215 220 Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp 225 230 235 240 Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala 245 250 255 Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe 260 265 270 Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu 275 280 285 Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys 290 295 300 Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly 305 310 315 320 Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu 325 330 335 Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu 340 345 350 Val Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly 355 360 365 Leu Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val 370 375 380 Thr Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile 385 390 395 400 Ser Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln 405 410 415 Val Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala 420 425 430 Leu Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg 435 440 445 Gly Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr 450 455 460 Asp Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala 465 470 475 480 Gly Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp 485 490 495 Gly Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu 500 505 510 Glu Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp 515 520 525 Leu Asp 530
【００８４】 <210> 13 <211> 1730 <212> DNA <213> Brevibacterium flavum <220> <221> CDS <222> (115)..(1704) <400> 13 gggagggttt agaatgtttc tagtcgcacg ccaaaacccg gcgtggacac gtctgcagcc 60 gacgcggtcg tgcctgttgt aggcggacat tcctagtttt tccaggagta actt gtg 117 Val 1 agc cag aat ggc cgt ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag 165 Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln 5 10 15 tcc act gtt gac gcg ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac 213 Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp 20 25 30 gga cct aac cgc cca gaa ctg ctt gat aca gtt aag gaa gcg gac gca 261 Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp Ala 35 40 45 ctg ctc gtg cgt tct gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct 309 Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala 50 55 60 65 gcc cct aac ttg aag atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac 357 Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn 70 75 80 gtt gac atc cct gct gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca 405 Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala 85 90 95 ccg acc tct aac att cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg 453 Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu 100 105 110 ctg tct act gct cgc cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag 501 Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu 115 120 125 ggc gag tgg aag cgg tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa 549 Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys 130 135 140 145 act gtc ggt atc gtc ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag 597 Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln 150 155 160 cgt ctt gct gcg ttt gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gct 645 Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala 165 170 175 aac cct gct cgt gcg gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat 693 Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu Asp 180 185 190 gag ctg atg agc cgt tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc 741 Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr 195 200 205 aag gaa act gct ggc atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag 789 Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys 210 215 220 225 aag ggc cag atc atc atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gaa 837 Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu 230 235 240 cag gct ttg gct gat gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt 885 Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly 245 250 255 ttc gat gtg tac tcc acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag 933 Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys 260 265 270 ttg cct cag gtt gtt gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag 981 Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu 275 280 285 gct cag gat cgt gcg ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg 1029 Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala 290 295 300 305 ctg gct ggc gag ttc gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc 1077 Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg 310 315 320 gtg ggc gaa aag gtt gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt 1125 Val Gly Glu Lys Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly 325 330 335 ctt ctt gct ggc aag ctt gtc gac gcc gcc cca gtc tcc att gag gtt 1173 Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Val 340 345 350 gag gct cga ggc gag ctt tct tcc gag cag gtc gat gca ctt ggt ttg 1221 Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly Leu 355 360 365 tcc gct gtt cgt ggt ttg ttc tcc gga att atc gaa gag tcc gtt act 1269 Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val Thr 370 375 380 385 ttc gtc aac gct cct cgc att gct gaa gag cgt ggc ctg gac atc tcc 1317 Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile Ser 390 395 400 gtg aag acc aac tct gag tct gtt act cac cgt tcc gtc ctg cag gtc 1365 Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln Val 405 410 415 aag gtc att act ggc agc ggc gcg agc gca act gtt gtt ggt gcc ctg 1413 Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala Leu 420 425 430 act ggt ctt gag cgc gtt gag aag atc acc cgc atc aat ggc cgt ggc 1461 Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg Gly 435 440 445 ctg gat ctg cgc gca gag ggt ctg aac ctc ttc ctg cag tac act gac 1509 Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr Asp 450 455 460 465 gct cct ggt gca ctg ggt acc gtt ggt acc aag ctg ggt gct gct ggc 1557 Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala Gly 470 475 480 atc aac atc gag gct gct gcg ttg act cag gct gag aag ggt gac ggc 1605 Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp Gly 485 490 495 gct gtc ctg atc ctg cgt gtt gag tcc gct gtc tcc gaa gag ctg gaa 1653 Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu Glu 500 505 510 gct gaa atc aac gct gag ttg ggt gct act tcc ttc cag gtt gat ctt 1701 Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp Leu 515 520 525 gac taattagaga tccattttct agaacc 1730 Asp 530
【００８５】 <210> 14 <211> 530 <212> PRT <213> Brevibacterium flavum <400> 14 Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val 20 25 30 Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp 35 40 45 Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala 50 55 60 Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn 85 90 95 Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu 100 105 110 Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg 115 120 125 Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly 130 135 140 Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala 145 150 155 160 Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr 165 170 175 Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu 180 185 190 Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys 195 200 205 Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser 210 215 220 Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp 225 230 235 240 Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala 245 250 255 Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe 260 265 270 Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu 275 280 285 Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys 290 295 300 Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly 305 310 315 320 Arg Val Gly Glu Lys Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu 325 330 335 Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu 340 345 350 Val Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly 355 360 365 Leu Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val 370 375 380 Thr Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile 385 390 395 400 Ser Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln 405 410 415 Val Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala 420 425 430 Leu Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg 435 440 445 Gly Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr 450 455 460 Asp Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala 465 470 475 480 Gly Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp 485 490 495 Gly Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu 500 505 510 Glu Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp 515 520 525 Leu Asp 530
【図１】各種株由来の３−ＰＧＤＨのＬ−セリンによる
フィードバック阻害の様子を示す。横軸は、酵素液中に
存在するＬ−セリンの濃度を示す。縦軸は、Ｌ−セリン
が存在しない時の３−ＰＧＤＨ活性に対する、Ｌ−セリ
ンが存在するときの３−ＰＧＤＨ活性を百分率で示す。
◆はＡＴＣＣ１４０６７株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セ
リンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。
■はＡＪ１３３７７株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリン
によって受けるフィードバック阻害の様子を示す。▲は
ＡＪ１３３２４株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによ
って受けるフィードバック阻害の様子を示す。×はＡＪ
１３３２５株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによって
受けるフィードバック阻害の様子を示す。＊はＡＪ１３
３２７株由来の３−ＰＧＤＨのがＬ−セリンによって受
けるフィードバック阻害の様子を示す。
フィードバック阻害の様子を示す。横軸は、酵素液中に
存在するＬ−セリンの濃度を示す。縦軸は、Ｌ−セリン
が存在しない時の３−ＰＧＤＨ活性に対する、Ｌ−セリ
ンが存在するときの３−ＰＧＤＨ活性を百分率で示す。
◆はＡＴＣＣ１４０６７株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セ
リンによって受けるフィードバック阻害の様子を示す。
■はＡＪ１３３７７株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリン
によって受けるフィードバック阻害の様子を示す。▲は
ＡＪ１３３２４株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによ
って受けるフィードバック阻害の様子を示す。×はＡＪ
１３３２５株由来の３−ＰＧＤＨがＬ−セリンによって
受けるフィードバック阻害の様子を示す。＊はＡＪ１３
３２７株由来の３−ＰＧＤＨのがＬ−セリンによって受
けるフィードバック阻害の様子を示す。
【図２】プラスミドｐＶＫ７およびｐＶＫ６の構築図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年１２月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】すなわち本発明は、アザセリンまたはβ−
（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セ
リン生産能を有するコリネ型細菌である。さらに本発明
は、コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによるフィード
バック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリセレートデ
ヒドロゲナーゼ；アザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を
有するコリネ型細菌からえられうる同Ｄ−３−ホスホグ
リセレートデヒドロゲナーゼ；配列表配列番号１２に記
載されるアミノ酸配列、または同配列に、１または複数
のアミノ酸置換、付加または欠失が生じたアミノ酸配列
を有するＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
において、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の３
２５番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基に置換したことを特徴とする同Ｄ−３
−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ；および、配列
表配列番号１１に記載されるアミノ酸配列を有する同Ｄ
−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである。
（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セ
リン生産能を有するコリネ型細菌である。さらに本発明
は、コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによるフィード
バック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリセレートデ
ヒドロゲナーゼ；アザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を
有するコリネ型細菌からえられうる同Ｄ−３−ホスホグ
リセレートデヒドロゲナーゼ；配列表配列番号１２に記
載されるアミノ酸配列、または同配列に、１または複数
のアミノ酸置換、付加または欠失が生じたアミノ酸配列
を有するＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
において、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の３
２５番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基に置換したことを特徴とする同Ｄ−３
−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ；および、配列
表配列番号１１に記載されるアミノ酸配列を有する同Ｄ
−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】さらに本発明は、前記Ｄ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、およ
び、配列表配列番号１３に記載される塩基配列を有する
同ＤＮＡである。さらに本発明は、前記ＤＮＡを含む組
み換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌である。さらに、
前記細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリンを蓄積さ
せ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収することを特徴と
するＬ−セリンの製造法である。
セレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、およ
び、配列表配列番号１３に記載される塩基配列を有する
同ＤＮＡである。さらに本発明は、前記ＤＮＡを含む組
み換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌である。さらに、
前記細菌を培地に培養し、培地中にＬ−セリンを蓄積さ
せ、培地中から当該Ｌ−セリンを回収することを特徴と
するＬ−セリンの製造法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】同様にβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラ
ニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン
を含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性
質をいうが、例えば、０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チエ
ニル）−ＤＬ−アラニンを含有する固体培地上で、３０
℃、４〜５日でコロニーを形成できる株はβ−（２−チ
エニル）−ＤＬ−アラニン耐性を有する。
ニン耐性とは、β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン
を含有する培地において野生株よりも速い生育を示す性
質をいうが、例えば、０．２５ｇ／Ｌのβ−（２−チエ
ニル）−ＤＬ−アラニンを含有する固体培地上で、３０
℃、４〜５日でコロニーを形成できる株はβ−（２−チ
エニル）−ＤＬ−アラニン耐性を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】野生型のコリネ型細菌由来の３−ＰＧＤＨ
（以下、これをコードするＤＮＡを「野生型ｓｅｒＡ」
ともいう）は配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列
を有する。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除
された３−ＰＧＤＨ（以下、これをコードするＤＮＡを
「変異型ｓｅｒＡ」ともいう）として具体的には、配列
表配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、または同配
列に１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生
じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１２に記載される
アミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したことを特
徴とするＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
が挙げられる。同他のアミノ酸残基として最も好ましい
ものはリジン残基である。
（以下、これをコードするＤＮＡを「野生型ｓｅｒＡ」
ともいう）は配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列
を有する。Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が解除
された３−ＰＧＤＨ（以下、これをコードするＤＮＡを
「変異型ｓｅｒＡ」ともいう）として具体的には、配列
表配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、または同配
列に１または複数のアミノ酸置換、付加または欠失が生
じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１２に記載される
アミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したことを特
徴とするＤ−３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ
が挙げられる。同他のアミノ酸残基として最も好ましい
ものはリジン残基である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 日比野 渉 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 伊藤 美佳 三重県四日市市大字日永1730番地味の素株 式会社東海工場内
Claims (9)
- 【請求項１】 アザセリンまたはβ−（２−チエニル）
−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を有す
るコリネ型細菌。 - 【請求項２】 コリネ型細菌に由来し、Ｌ−セリンによ
るフィードバック阻害が解除されたＤ−３−ホスホグリ
セレートデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項３】 アザセリンまたはβ−（２−チエニル）
−ＤＬ−アラニンに耐性を有しＬ−セリン生産能を有す
るコリネ型細菌から得られうる、請求項２記載のＤ−３
−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項４】 配列表配列番号１０に記載されるアミノ
酸配列に、１または複数のアミノ酸置換、付加または欠
失が生じたアミノ酸配列を有するＤ−３−ホスホグリセ
レートデヒドロゲナーゼにおいて、配列番号１０に記載
されるアミノ酸配列の３２５番目のグルタミン酸残基に
相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換したこ
とを特徴とする請求項２記載のＤ−３−ホスホグリセレ
ートデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項５】 配列表配列番号１１に記載されるアミノ
酸配列を有する請求項２記載のＤ−３−ホスホグリセレ
ートデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項６】 請求項２ないし５記載のＤ−３−ホスホ
グリセレートデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ。 - 【請求項７】 配列表配列番号１１に記載される塩基配
列を有する請求項６記載のＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項６記載のＤＮＡを含む組み換えＤ
ＮＡを保持するコリネ型細菌。 - 【請求項９】 請求項１または８記載の細菌を培地に培
養し、培地中にＬ−セリンを蓄積させ、培地中から当該
Ｌ−セリンを回収することを特徴とするＬ−セリンの製
造法。
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| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
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| JP4306169B2 (ja) * | 1999-12-24 | 2009-07-29 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法及び新規遺伝子 |
| US6395528B1 (en) | 2000-01-27 | 2002-05-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Phosphoserine phosphatase gene of coryneform bacteria |
| DE10231297A1 (de) * | 2002-07-10 | 2004-02-05 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine sowie Verfahren zur Herstellung von L-Serin |
| DE10311399A1 (de) * | 2003-03-13 | 2004-09-23 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für am L-Serinstoffwechsel beteiligte Proteine sowie Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| US7399571B2 (en) * | 2005-05-06 | 2008-07-15 | General Electric Company | Multilayered articles and method of manufacture thereof |
| DE102005049527B4 (de) * | 2005-10-17 | 2013-05-08 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Serin, Gensequenz, Vektoren sowie Mikroorganismus |
| WO2012053794A2 (en) | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same |
| KR101381048B1 (ko) * | 2010-10-20 | 2014-04-14 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 |
| KR101677328B1 (ko) | 2014-08-12 | 2016-11-18 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
| KR101694632B1 (ko) | 2015-09-11 | 2017-01-10 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| TWI598442B (zh) * | 2016-10-27 | 2017-09-11 | 元智大學 | 一種用於生產葡萄糖胺的培養基及其應用 |
| KR102221040B1 (ko) * | 2019-05-09 | 2021-03-03 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법 |
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1999
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- 1999-01-12 DE DE69929264T patent/DE69929264T2/de not_active Expired - Lifetime
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