KR100674401B1 - Ｌ-글루탐산-생성 세균 및 ｌ-글루탐산 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
코리네형 세균으로 부터 유래된 시트레이트 신타제 유전자가 도입된, L-글루탐산 생산능을 갖는 장내 세균에 속하는 미생물을 배지에서 배양하여 배지내에 L-글루탐산이 생성되어 축적되도록 한 후, 배지로부터 L-글루탐산을 수취하는 방법으로 L-글루탐산을 제조한다.
L-글루탐산, 코리네형 세균, 시트레이트 신타제 유전자, 엔테로박터, 클렙시엘라
Description
도 1은 gltA 유전자를 지닌 플라스미드 pMWCB의 작제를 도시한다.
도 2는 gltA 유전자를 지닌 플라스미드 pMWC의 작제를 도시한다.
본 발명은 새로운 L-글루탐산 생성 세균 및 이를 사용한 발효 방법에 의한 L-글루탐산의 제조 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 식품, 약제 등으로서 중요한 아미노산이다.
지금까지, 주로 L-글루탐산은 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속에 속하는 소위 코리네(coryne)-형 L-글루탐산 생성 세균 또는 이의 변이체를 사용하는 발효 방법에 의해 제조되어 왔다[Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pp. 195-215, 1986]. 기타 균주를 이용하는 발효 방법에 의한 공지된 L-글루탐산 생산 방법에는 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 페니실륨(Penicullium) 속에 속하는 미생물을 이용하는 방법[미국 특허 제3,220,929호], 슈도모나스(Pseudomonas), 아르토박터(Arthrobacter), 세라티아(Serratia), 또는 칸디다(Candida) 속에 속하는 미생물을 이용하는 방법[미국 특허 제 3,563,857호], 바실루스, 슈도모나스, 세라티아 또는 에어로박터 아에로게네스(Aerobacter aerogenes)[현재 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)] 속에 속하는 세균와 같은 미생물을 이용하는 방법[심사된 일본 특허 공보 제32-9393호], 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 돌연변이체를 이용하는 방법[일본 특허원 공개공보 제5-244970호] 등이 포함된다.
L-글루탐산 생산능은 상기 미생물의 육종 또는 제조법의 개선에 의해 상당히 개선되어 왔다. L-글루탐산에 대한 증가하는 수요를 충족시키기 위해, 더욱 저렴하고 효율적으로 L-글루탐산을 제조하는 방법에 대한 개발이 요망되었다.
이러한 상황하에서, 본 발명의 발명자들은 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물을 광범위하게 조사하고 연구했다. 이러한 결과로, 엔테로박터, 세라티아, 클렙시엘라(Klebsiella) 또는 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 미생물의 L-글루탐산 생합성 반응을 촉매하는 효소(시트레이트 신타제, 포스포엔올피루베이트 카복실라제, 글루타메이트 데하이드로게나제)의 활성을 증진시키는 방법으로, 높은 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물이 수득될 수 있다는 것이 밝혀졌다[일본 특허원 공개 공보 제10-224909호 및 제10-297129호].
또한, 본 발명의 발명자들에 의해, 에스케리키아 속으로부터 유래된 시트레이트 신타제(이후, 종종 "CS"로 약칭되기도 함) 및 포스포엔올피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자를 에스케리키아 속에 속하는 발린 선택성 균주에 도입하여 상기 효소 각각의 활성을 증진시키는 방법으로, 높은 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물이 수득된다는 것이 밝혀졌다[WO 97/08294].
한편, 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 시트레이트 신타제를 암호화하는 유전자(CS 유전자)의 도입은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움의 L-글루탐산 생산능을 개선하는데 있어 효과적이라는 것이 보고 되었다[심사된 일본 특허 공보 제7-121228호]. 이들 코리네형 세균을 숙주로서 사용하였을 때, 숙주와 동일한 종의 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 CS 유전자를 도입하는 경우가 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 CS 유전자를 도입하는 경우보다 다소 높은 효과를 보였지만, 이들간에 현저한 차이는 없었다.
상기한 바와 같이, L-글루탐산 생산능을 증가시키기 위해, 각종 미생물에 CS 유전자를 도입시킨다는 것이 공지되어 있다. 그러나, 코리네형 세균으로부터 유래된 CS 유전자가, 에스케리키아 속에 속하는 세균과 같은 장내 세균에 속하는 미생물에 도입된 예는 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은, 저렴하고 효율적인 L-글루탐산 제조 방법을 개발하기 위하여, L-글루탐산 생산능을 갖는 새로운 L-글루탐산-생성 세균을 발견하는 것이다
본 발명의 발명자들은 유전자를 도입하여 장내 세균을 육종하여 이들의 L-글루탐산 생산능을 개선시켜 왔다. 일반적으로, 숙주가 유전자 증폭에 의해 미생물을 육종하고자 하는 표적 유전자를 가질 때에는, 숙주의 내생 유전자 또는 숙주와 연관이 있는 미생물로부터 유래된 유전자를 사용하는 경우에 이종성 유전자를 도입하는 경우 보다 더 나은 효과가 수득된다고 여겨왔다. 그러나, 본 발명의 발명자들은, 장내 세균의 경우 미생물의 L-글루탐산 생산능을 증가시키는데 있어서, 코리네형 박테라아로부터 유래된 CS 유전자를 도입하는 것이 장내 세균와 동일한 종의 미생물으로부터 유래된 CS 유전자를 도입하는 것보다 훨씬 더 효과적이라 것을 밝혀 내었다. 본 발명은 이러한 발견을 토대로 성취되었다.
즉, 본 발명은,
(1) 코리네형 세균으로부터 유래된 시트레이트 신타제가 도입된, L-글루탐산 생산능을 지닌 장내 세균에 속하는 미생물,
(2) 상기 (1)의 미생물 중, 코리네형 세균이 브레비박테리움 락토페르멘튬(Brevibacterium lactofermentum)인 미생물,
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 미생물 중, 장내 세균에 속하는 미생물이 엔테로박터 또는 클렙시엘라 속에 속하는 세균인 미생물,
(4) 상기 (3)의 미생물중, 엔테로박터 아글로메란스 또는 클렙시엘라 플란티콜라에 속하는 세균인 미생물, 및
(5) 상기 (1) 내지 (4)중 어느 하나의 미생물을 액체 배지에서 배양하여 배지내에 L-글루탐산이 생성되어 축적되도록 하는 단계 및 배지로부터 L-글루탐산을 수취하는 단게를 포함하는 L-글루탐산 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 아래에서 상세히 기술될 것이다.
(1) 본 발명의 미생물
본 발명의 장내 세균에 속하는 미생물은, 코리네형 세균으로부터 유래된 CS 유전자를 도입함으로써 L-글루탐산 생산능이 부여되거나 개선될 수 있는 장내 세균에 속하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 이러한 미생물로는 엔테로박터, 클렙시엘라, 세라티아, 에르위니아, 판토에아(Pantoea) 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균이 예시된다. 이들 중에서, 엔테로박터 또는 클렙시엘라 속에 속하는 세균이 바람직하다. 당해 세균의 구체적인 예가 아래에 기술될 것이나, 본 발명의 미생물이 이들 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용될 수 있는 엔테로박터 속에 속하는 미생물의 예는 다음과 같다:
엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)
엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)
엔테로박터 암니게너스(Enterobacter amnigenus)
엔테로박터 아스부리아에(Enterobacter asburiae)
엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae)
엔테로박터 디스솔벤스(Enterobacter dissolvens)
엔테로박터 게르고비아에(Enterobacter gergoviae)
엔테로박터 호르매케이(Enterobacter hormaechei)
엔테로박터 인터메디우스(Enterobacter intermedius)
엔테로박터 니미프레쑤랄리스(Enterobacter nimipressuralis)
엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii)
엔테로박터 타일로라에(Enterobacter taylorae).
보다 바람직하게는, 아래에 기술된 세균 균주가 언급될 수 있다:
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355
세라티아 리퀘파시엔스(Serratia liquefacience) ATCC 14460
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술 연구소에 1998년 2월 19일자로 기탁되어 수탁번호 FERM P-16644를 부여받은 다음, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관으로 1999년 1월 11자로 이관되어 수탁번호 FERM BP-6614를 부여받았다. 엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287 및 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460은 ATCC로부터 분양받을 수 있다.
엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주는 일본 시즈오카 이와타시의 토양으로부터 분리된 균주이다.
AJ13355의 생리학적 특성은 다음과 같다:
(1) 그람 염색성: 음성
(2) 산소에 대한 거동: 통성 혐기성
(3) 카탈라제: 양성
(4) 옥시다제: 음성
(5) 니트레이트 환원 능력: 음성
(6) 보게스-프로스카우어(Voges-Proskauer) 반응: 양성
(7) 메틸 레드 시험: 음성
(8) 우레아제: 음성
(9) 인돌 생산능: 양성
(10) 운동성: 유
(11) TSI 배양 배지 내의 황화수소 생성: 미약한 활성
(12) β-갈락토시다제: 양성
(13) 당-동화능:
아라비노즈: 양성
수크로즈: 양성
락토즈: 양성
크실로즈: 양성
소르비톨: 양성
이노시톨: 양성
트레할로즈: 양성
말토즈: 양성
멜리비오즈: 양성
아도니톨: 음성
라피노즈: 양성
살리신: 음성
멜리비오즈: 양성
(14) 글리세로즈 동화능: 양성
(15) 유기산 동화능
시트르산: 양성
타르타르산: 음성
글루콘산: 양성
아세트산: 양성
말론산: 음성
(16) 아르기닌 데하이드라타제: 음성
(17) 오르니틴 데카복실라제: 음성
(18) 리신 데카복실라제: 음성
(19) 페닐알라닌 데아미나제: 음성
(20) 색소형성: 황색
(21) 겔라틴 액화능: 양성
(22) 생육 pH: pH4 에서는 생육이 양호하지 않음, pH 4.5 내지 7에서는 생육이 양호
(23) 생육 온도: 25℃에서는 생육이 양호, 30℃에서는 생육이 양호, 37℃에서는 생육이 양호, 42℃에서는 생육이 가능, 45℃에서는 생육이 불가능.
이러한 세균적 특성으로부터, AJ13355가 엔테로박터 아글로메란스인 것으로 판정되었다.
본 발명에 사용될 수 있는 클렙시엘라 속에 속하는 미생물의 예는 다음과 같다:
클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)
클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena).
보다 바람직하게는, 미생물의 예로는 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399가 포함된다.
클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술 연구소에 1998년 2월 19일자로 기탁되어 수탁번호 FERM P-16646를 부여 받은 다음, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관으로 1999년 1월 11자로 이관되어 수탁번호 FERM BP-6616을 부여 받았다.
클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399 균주는 일본 혹카이도 사포로시 토양으로부터 분리된 균주이다.
AJ13399의 생리학적 특성은 다음과 같다:
(1) 세포 형태: 간상균
(2) 운동성: 무
(3) 포자 형성: 무
(4) LabM 영양 한천 배지에서의 콜로니 형태: 환형, 평활한 표면, 크림색, 돌기상, 광택성
(5) 글루코즈 OF 시험: 발효능에 대해 양성
(6) 그람 염색성: 음성
(7) 산소에 대한 거동: 통성 혐기성
(8) 카탈라제: 양성
(9) 옥시다제: 음성
(10) 우레아제: 양성
(11) 시토크롬 옥시다제: 음성
(12) β-갈락토시다제: 양성
(13) 아르기닌 데하이드라타제: 음성
(14) 오르니틴 데카복실라제: 음성
(15) 리신 데카복실라제: 양성
(16) 트립토판 데아미나제: 음성
(17) 보게스-프로스카우어 반응: 양성
(18) 인돌 생산능: 양성
(19) TSI 배양 배지 내의 황화수소 생성: 음성
(20) 시트르산 동화능: 양성
(21) m-하이드로벤젠산 동화능: 음성
(22) 겔라틴 액화능: 음성
(23) 당으로부터의 산 생성:
글루코즈: 양성
만니톨: 양성
람노즈: 양성
아라비노즈: 양성
수크로즈: 양성
소르비톨: 양성
이노시톨: 양성
멜비오즈: 양성
아미그달린: 양성
아도니톨-펩톤-수: 양성
셀로비오즈-펩톤-수: 양성
둘시톨-펩톤-수: 음성
라피노즈-펩톤-수: 양성
(24) 생육 온도: 37℃에서는 생육이 양호, 45℃에서는 생육이 불가능
이들 세균적 특성으로부터, AJ13399는 클렙시엘라 플란티콜라로 판정되었다.
본 발명에 사용될 수 있는 세라티아 속에 속하는 미생물의 예는 다음과 같다:
세라티아 리퀘파시엔스(Serratia liquefacience)
세라티아 엔토모필라(Serratia entomophila)
세라티아 피카리아(Serratia ficaria)
세라티아 폰티콜라(Serratia fonticola)
세라티아 그리메시(Serratia grimesii)
세라티아 프로테아마쿨란스(Serratia proteamaculans)
세라티아 오도리페라(Serratia odorifera)
세라티아 플리무티카(Serratia plymuthica)
세라티아 루비다에아(Serratia rubidaea).
보다 바람직하게는, 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460이 예시될 수 있다. 세라티아 리퀘파시엔스 ATCC 14460은 ATCC로부터 분양될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 미생물의 예는 다음과 같다:
에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola)(현재 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans)로 분류됨)
에르위니아 아난아스(Erwinia ananas)
에르위니아 칵티시다(Erwinia cacticida)
에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)
에르위니아 말로티보라(Erwinia mallotivora)
에르위니아 페르시키누스(Erwinia persicinus)
에르위니아 시디(Erwinia psidii)
에르위니아 퀘르시나(Erwinia quercina)
에르위니아 라폰티시(Erwinia rhapontici)
에르위니아 루브리파시엔스(Erwinia rubrifaciens)
에르위니아 살리시스(Erwinia salicis)
에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora).
보다 바람직하게는, 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595(현재 판토에아 아글로메란스 AJ2666)이 예시된다. 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595는 동경 대학교 분자세포 생물학 연구소로부터 분양받을 수 있다. 문헌[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ninth edition]에서는 에르위니아 헤르비콜라가 기술되어 있지 않으며, 에르위니아 헤르비콜라로 분류되었던 미생물이 판토에아 아글로메란스로 분류되어 있음에 주목해야 한다. 에르위니아 헤르비콜라로 분류되었던 미생물은 현재 판토에아 아글로메란스로 분류된다. 따라서, 에르위니아 속에 속하는 미생물과 판토에아 속에 속하는 미생물은 서로 밀접한 관계에 있다. 따라서, 판토에아 속에 속하는 미생물은 물론 에르위니아 속에 속하는 미생물도 사용될 수 있다. 이러한 미생물로는 판토에아 아글로메란스 및 판토에아 디스페르사가 포함된다. 에르위니아 헤르비콜라 IAM1595는 판토에아 아글로메란스 AJ2666로 명명되며, 부다페스트 조약하의 국제 기탁으로서 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술 연구소에 1999년 2월 25일자로 기탁되었으며, 수탁번호 FERM BP-6660을 부여 받았다.
본 발명에 사용될 수 있는 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 예로는 에스케리키아 콜라이가 포함된다.
보다 바람직하게는, 발린 내성을 갖는 에스케리키아 콜라이, 예를 들어 다음의 균주들이 예시될 수 있다:
에스케리키아 콜라이 K-12 (ATCC10798)
에스케리키아 콜라이 B (ATCC11303)
에스케리키아 콜라이 W (ATCC9637)
에스케리키아 콜라이 K-12 (ATCC10798)
이중 에스케리키아 콜라이 B (ATCC11303) 및 에스케리키아 콜라이 W (ATCC9637)는 ATCC로부터 분양될 수 있다.
상기한 바와 같은 엔테로박터, 클렙시엘라, 세라티아, 에르위니아, 판토에아 및 에스케리키아 속에 속하는 세균에 의한 당 대사는 Embden-Meyerhof 경로를 통해 수행될 수 있으며 이러한 경로중에 생성되는 피루브산은 호기성 조건하에서는 트리카복실산 사이클로 산화된다는 것에 주목해야 한다. L-글루탐산은 GDH 또는 글루타민 신테타제/글루타메이트 신타제에 의해 트리카복실산 사이클의 중간체인 α-케토글루타르산으로부터 생합성된다. 따라서, 이들 미생물들은 L-글루탐산에 대해 동일한 생합성 경로를 가지며, 상술한 미생물들은 본 발명에 따른 단일 개념에 속한다. 따라서, 상술한 종 및 균주 이외의 장내 세균에 속하는 미생물도 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에 따른 미생물은 장내 세균에 속하고 L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물이다. 본원에 사용된 용어 "L-글루탐산 생산능을 갖는"은 배양 동안 배양 배지내에 L-글루탐산을 축적시키는 능력을 갖는다는 것을 의미한다. 이러한 L-글루탐산의 생성능은 야생형 균주 자체의 특성으로서 보유되는 것 또는 육종에 의해 부여되거나 증진되는 것일 수 있다. gltA 유전자의 도입으로 L-글루탐산 생성능이 부여될 수 있는 미생물도 사용될 수 있다. 장내 세균에 속하고 L-글루탐산 생성능을 갖는 미생물로는, 예를 들어 L-글루탐산을 생합성하기 위한 하나 이상의 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 증가된 미생물, 및 L-글루탐산 생합성을 위한 경로로부터 분기되어 L-글루탐산 이외의 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 이러한 효소의 활성이 결손된 미생물이 포함된다. 또한, 상기한 미생물로는 L-글루탐산의 생합성을 위한 하나 이상의 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성이 증가되고, L-글루탐산 생합성을 위한 경로로부터 분기되어 L-글루탐산 이외의 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 이러한 효소의 활성이 결손된 미생물이 포함된다.
장내 세균에 도입되는 gltA 유전자에 대한 공급원일 수 있는 "코리네형 세균"에는 지금까지 브레비박테리움 속(현재는 코리네박테리움 속으로 단일화됨: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 1981)으로 분류되어온 세균이 포함되며, 코리네박테리움 속과 밀접한 관계의 브레비박테리움 속에 속하는 세균이 포함된다. 이러한 코리네형 L-글루탐산-생성 세균의 예로는 다음이 포함된다:
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)(코리네박테리움 글루타미쿰)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 테르모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)(코리네박테리움 글루타미쿰)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(코리네박테리움 글루타미쿰)
브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)(코리네박테리움 글루타미쿰)
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)
미크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
특히, 이러한 세균으로서 다음의 균주를 예시할 수 있다: 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 알카놀리티쿰 ATCC21511, 코리네박테리움 칼루나에 ATCC15991, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13020, 13032, 13060, 코리네박테리움 릴리움(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC15990, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 테 르모아미노게네스 AJ12340(FERM BP-1539), 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868, 브레비박테리움 디바리카툼(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC14020, 브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC13826, ATCC14067, 브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC14068, 브레비박테리움 락토페르멘툼(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC13665, ATCC13869, 브레비박테리움 로세움 ATCC13825, 브레비박테리움 사카롤리티쿰 ATCC14066, 브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC19240, 브레비박테리움 알붐 ATCC15111, 브레비박테리움 세리눔 ATCC15112, 미크로박테리움 암모니아필룸 ATCC15354.
코리네형 세균으로부터 유래된 gltA 유전자는, 코리네형 세균의 염색체 DNA로부터 CS 활성이 결여된 세균(예: 코리네형 세균의 돌연변이체)의 영양요구성을 보완하는 DNA 단편을 분리함으로써 수득될 수 있다. 코리네형 세균의 gltA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다[참조: Microbiology, 140, 1817-1828, 1994]. 따라서, gltA 유전자는 주형으로서 염색체 DNA, 및 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성되는 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 수득될 수 있다. 프라이머는 서열 1 및 서열 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 예시될 수 있다.
코리네형 세균으로부터 유래된 CS 유전자를 장내 세균에 속하는 미생물에 도입시키기 위해서, CS 유전자를 적합한 플라스미드에 클로닝시킬 수 있으며, 숙주로서 사용되는 상기한 출발 모 균주를 수득된 재조합 플라스미드로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환체의 세포에 CS 유전자(이하, "gltA 유전자"라 칭함)의 복사체(copy) 수가 증가하면, CS 활성이 증진된다.
플라스미드는 이들이 장내 세균에 속하는 미생물에서 자가 복제될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않으며, 다음의 플라스미드가 예시할 수 있다: pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 등. 이들 플라스미드 이외에 파아지 DNA 벡터도 사용될 수 있다.
gltA 유전자의 도입은, gltA 유전자를 숙주로서 사용되는 상기한 출발 모 균주의 염색체 DNA상에, 바람직하게는 다수의 복사체로 위치시킴으로써, 실현될 수 있다. gltA 유전자를 장내 세균에 속하는 미생물의 염색체 DNA에 다수의 복사체로 도입시키기 위하여, 염색체 DNA에 다수의 복사체로 존재하는 서열, 예를 들어 전위 요소(transposable element)의 말단 영역에 존재하는 반복적 DNA 또는 역위된 반복 DNA를 사용할 수 있다. 달리는, gltA 유전자를 트랜스포존에 삽입시켜 트랜스포존을 전위시킴으로써 gltA 유전자를 다수의 복사체로 염색체 DNA에 도입시킬 수 있다. 형질전환체의 세포에 존재하는 gltA 유전자의 복사체 수가 증가되어, 결국 CS 활성이 증진된다.
형질전환은 예를 들어 D. A. Morrison 방법[참조: Methods in Enzymology, 68, 326, 1979], 또는 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증진시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970]으로 수행될 수 있다.
도입될 수 있는 gltA 유전자는 gltA 유전자의 고유한 프로모터 대신에 장내 세균에 속하는 미생물 세포에 적합한 프로모터, 예를 들어 lac, trp 또는 PL을 가질 수 있다
유전자의 클로닝, DNA의 분해 및 연결 및 형질전환법과 같은 기술이 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술되어 있다.
본 발명의 미생물에 있어, 코리네형 세균으로부터 유래된 gltA 유전자의 도입 이외에, CS 이외의 L-글루탐산의 생합성을 촉매하는 효소의 활성을 증진시킬 수 있다. L-글루탐산의 생합성을 촉매하는 효소의 예로는 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH), 글루타민 신타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 포스포엔올피루베이트 카복실라제(PEPC), 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 엔올라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 프룩토즈 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프룩토키나제, 글루코즈 포스페이트 이소머라제 등이 있다.
L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기되어 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성은 감소되거나 결손될 수 있다. L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기되어 L-글루탐산이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 예로는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(αKGDH), 이소시트레이트 리아제, 포스페이트 아세틸트랜스페라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이록시메이트 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스페라제, 락테이트 데하이드로게나제, 글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등이 있다. 이들 효소중 αKGDH가 바람직하다.
PEPC 및 GDH를 암호화하는 유전자는 각각, PEPC 또는 GDH 활성이 결손된 변이체 균주의 영양요구성을 보완하는 DNA 단편을 분리시킴으로써 상기한 미생물의 염색체 DNA로부터 수득될 수 있다. 달리는, 에스케리키아 또는 코리네박테리움 속 세균의 이들 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 이미 밝혀져 있기 때문에[참조: Biochemistry, 22, 5243-5249, 1983; J. Biochem., 95, 909-916, 1984; Gene, 27, 193-199, 1984; Mol. Gen. Genet., 218, 330-339, 1989, and Molecular Microbiology, 6, 317-326, 1992], 이미 밝혀진 각각의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 프라이머, 및 주형으로서 염색체 DNA를 사용한 PCR에 의해 상기 유전자가 수득될 수 있다.
장내 세균에 속하는 미생물에서 상기한 바와 같은 효소 활성을 감소시키거나 결손시키기 위해서는, 이러한 효소 활성의 감소 또는 결손을 유발하는 돌연변이를 통상의 돌연변이유발 기술 또는 유전자 조작 기술로 해당 효소를 암호화하는 유전자에 도입시킬 수 있다.
돌연변이유발 기술로는, 예를 들어 X-선 또는 자외선 조사를 사용하는 방법, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 돌연변이 유발제를 사용하는 방법 등이 있다. 돌연변이가 도입되는 유전자 부위는 효소 단백질을 암호화하는 암호영역, 또는 프로모터와 같이 발현 제어 영역일 수 있다.
유전자 조작 기술로는, 예를 들어 유전자 재조합, 유전자 형질도입, 세포 융합 등이 있다. 예를 들어, 약물 내성 유전자가 표적 유전자에 삽입되어 기능적으로 불활성화된 유전자(파괴된(disrupted) 유전자)를 생성시킨다. 따라서, 이러한 결실형 유전자는 장내 세균에 속하는 미생물 세포에 도입되어 염색체상의 표적 유전자가 상동 재조합에 의해 결실형 유전자로 대체될 수 있다(유전자 파괴).
유전자 조작 기술로는, 예를 들어 유전자 재조합, 유전자 형질도입, 세포 융합 등이 있다. 예를 들어, 약물 내성 유전자가 표적 유전자에 삽입되어 기능적으로 불활성화된 유전자(파괴된(disrupted) 유전자)를 생성시킨다. 따라서, 이러한 결실형 유전자는 장내 세균에 속하는 미생물 세포에 도입되어 염색체상의 표적 유전자가 상동 재조합에 의해 결실형 유전자로 대체될 수 있다(유전자 파괴).
미생물에서 표적 효소의 활성이 감소되거나 이러한 활성이 결손되었는 지의 여부, 또는 활성의 감소 정도는, 후보 균주의 세균 세포 추출물 또는 정제된 분획의 효소 활성을 측정하고 이를 야생형 균주의 활성과 비교함으로써 판정할 수 있다. 예를 들어, αKGDH 효소 활성은 Reed 등의 방법[참조: L. J. Reed and B. B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, p.55-61]에 의해 측정할 수 있다.
일부 효소의 경우, 표적 돌연변이체를 이러한 돌연변이체의 표현형으로 선별할 수 있다. 예를 들어, αKGDH 활성이 결손되거나 감소된 돌연변이체는 유일한 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 최소 배지 또는 아세트산 또는 L-글루탐산을 함유하는 최소 배지중에서는 생육 속도가 크게 감소되거나 생육될 수 없다. 그러나, 동일 조건하에서 글루코즈를 함유하는 최소 배지에 숙신산 또는 L-리신, L-메티오닌 및 디아미노피멜산을 가함으로써 정상적인 생육이 가능할 수 있다. αKGDH 활성이 결손되거나 감소된 돌연변이체 선별은 이러한 현상을 지표로서 이용하여 수행할 수 있다.
상동 재조합에 근거하여 αKGDH 유전자가 결손된 브레비박테리움 락토페르멘툼 균주를 생성하는 방법이 WO95/34672에 상술되어 있으며, 유사한 방법이 장내 세균에 속하는 미생물에 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이 수득된 αKGDH 활성이 결손되거나 감소된 돌연변이 균주의 예로는 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356 및 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410가 있 다. 균주 엔테로박터 아글로메란스 AJ13356 및 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410은 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 1998년 2월 19일자로 각각 수탁번호 FERM P-16645 및 FERM P-16647로 기탁되었으며 이후 1999년 1월 11일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁으로 이관되어 각각 FERM BP-6615 및 FERM BP-6617의 수탁번호를 부여 받았다.
L-글루탐산은, 코리네형 세균으로부터 유래된 gltA 유전자가 도입된, 장내 세균에 속하는 미생물을 배지중에서 배양함으로써 액체 배양 배지중에 생성되어 축적될 수 있다.
배지는 탄소원, 질소원 및 무기염뿐만 아니라, 필요에 따라 아미노산, 비타민 등과 같은 유기 영양소를 함유하는 통상의 영양 배지일 수 있다. 이는 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있다. 배양될 미생물에 의해 이용될 수 있는 한, 어떠한 탄소원 및 질소원이라도 배양 배지용으로 사용될 수 있다.
탄소원은 글루코즈, 글리세롤, 프럭토즈, 슈크로즈, 말토즈, 만노즈, 갈락토즈, 전분 가수분해물, 당밀 등과 같은 사카라이드일 수 있다. 또한, 아세트산 및 시트르산과 같은 유기산도 단독으로 또는 다른 탄소원과 배합하여 사용할 수 있다.
질소원은 암모니아, 암모늄염, 예를 들어 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 아세트산암모늄, 질산염 등일 수 있다.
유기 미량 영양소로서, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 이들을 함유하는 물질, 예를 들어 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물 및 대두단백질 분해 산물 등이 사용될 수 있으며, 생육에 아미노산 등이 요구되는 영양요구성 변이체가 사용되는 경우, 필요한 영양소를 보충해야 한다.
무기 염으로서, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염등이 사용될 수 있다.
배양 조건에 있어, 20 내지 42℃의 온도 및 pH 4 내지 8에서 호기 조건하에 배양한다. 배양을 10시간 내지 4일 동안 계속하여 상당량의 L-글루탐산을 액체 배지중에 축적시킬 수 있다.
배양이 종료된 후, 배양 배지중에 축적된 L-글루탐산을 공지된 방법으로 수취할 수 있다. 예를 들어, 이는 산물을 결정화시키기 위해 세포를 제거한 후 배지를 농축시키는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해 분리될 수 있다.
본 발명에 따르면, 장내 세균에 속하는 미생물에 L-글루탐산 생산능이 효율적으로 부여될 수 있으므로, 코리네형 L-글루탐산 생성 세균의 경우 통상의 육종 기술에 의해 미생물에 보다 높은 생산능이 부여될 수 있다고 여겨진다. 배양 조건 등의 연구로 L-글루탐산을 저렴하고 효율적으로 생산하는 방법을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명을 수행하는 최상의 양태
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명될 것이다.
(1) gltA 유전자를 갖는 플라스미드의 작제
브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유래된 gltA 유전자를 갖는 플라스미드를 하기와 같이 작제한다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 gltA 유전자의 뉴클레오타이드 서열[참조: Microbiology, 1994, 140, 1817-1828]을 기초로 하여 선택된 서열 1 및 서열 2에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머, 및 주형으로서 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 약 3kb의 gltA 유전자 단편을 수득한다. 이러한 단편을 SmaI로 분해된 플라스미드 pHSG399(Takara Shuzo로부터 구입)에 삽입시켜 플라스미드 pHSGCB(도 1)을 수득한다. 이어서, pHSGCB를 HindII로 분해시켜 잘라 나온 약 3kb의 gltA 유전자 단편을 HindIII로 분해된 플라스미드 pMW218(Nippon Gene로부터 구입)에 삽입시켜 플라스미드 pMWCB(도 1)를 수득한다. 생성된 플라스미드 pMWCB에 의한 gltA 유전자의 발현은 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 균주에서 효소 활성의 측정으로 확인된다.
(2) 이. 콜라이로부터 유래된 gltA 유전자을 갖는 플라스미드의 작제
대조군으로서, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 gltA 유전자를 갖는 플라스미드를 하기와 같이 작제한다. 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 gltA 유전자를 갖는 플라스미드 pTWVC(WO97/08294)를 HindIII 및 EcoRI으로 분해시키고, gltA 유전자를 갖는 생성된 DNA 단편을 정제하여 수취하고, 플라스미드 pMW219의 HindIII-EcoRI 부위에 도입시켜 플라스미드 pMWC(도 2)를 수득한다. 생성된 플라스미드 pMWC에 의한 gltA 유전자의 발현은 효소 활성의 측정, 및 gltA 유전자가 결손된 이. 콜라이의 영양요구성 균주의 보완으로 확인된다.
(3) 엔테로박터 아글로메란스 및 클렙시엘라 플란티콜라내로의 gltA 유전자의 도입 및 L-글루탐산의 생성
균주 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 및 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399를 pMWC 또는 pMWCB로 형질전환시킨다. 각각의 생성된 형질전환체 AJ13355/pMWC, AJ13355/pMWCB, AJ13399/pMWC 및 AJ13399/pMWCB, 및 모 균주를, 40 g/l 글루코즈, 20 g/l 황산암모늄, 0.5 g/l 황산마그네슘 7수화물, 2 g/l 인산이수소칼륨, 0.5 g/l 염화나트륨, 0.25 g/l 염화칼슘 7수화물, 0.02 g/l 황산제1철 7수화물, 0.02 g/l 황산망간 4수화물, 0.72 mg/l 황산아연 2수화물, 0.64 mg/l 황산구리 5수화물, 0.72mg/L 염화코발트 7수화물, 0.4 mg/l 붕산, 1.2 mg/l 몰리브덴산나트륨 2수화물, 2 g/l 효모 추출물 및 30 g/l 탄산칼슘을 포함하는 배양 배지 20 ml을 함유하는 500 ml 용적의 플라스크에 접종시킨 후, 37℃에서 15시간 동안 진탕시키면서 배양한다. 배양이 종료된 후, 배양 배지에 축적된 L-글루탐산 및 잔류 글루코즈를 측정한다. 그 결과가 하기 표 1에 나타나 있다:
| 세균 균주 | L-글루탐산의 축적 양(g/l) | 글루코즈의 잔류 양(g/l) |
| AJ13355 | 0 | 0 |
| AJ13355/pMWC | 0.01 | 6.0 |
| AJ13355/pMWCB | 0.78 | 28.5 |
| AJ13399 | 0 | 0 |
| AJ13399/pMWC | 2.85 | 0 |
| AJ13399/pMWCB | 4.71 | 0 |
L-글루탐산 생산능은 gltA 유전자를 도입시킴으로써 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355 및 클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399 모두에서 관측되었다. L-글루탐산의 축적은, 브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유래된 gltA 유전자가 도입된 경우가 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 gltA 유전자가 도입된 경우 보다 현저하였다. AJ13355/pMWCB의 경우 상기한 바와 같은 조건하에서 다량의 글루코즈가 소비되지 않고 잔류하였다. 모든 글루코즈가 소비될 때까지 배양을 수행하는 경우, 약 1.5 내지 2 g/l의 L-글루탐산이 축적될 수 있다.
AJ13355/pMWC와 AJ13355/pMWCB 사이 및 AJ13399/pMWC와 AJ13399/pMWCB 사이에서는 플라스미드의 복사체 수에 있어 현저한 차이가 없었다.
본 발명을 통해, 저렴하고 효율적으로 L-글루탐산을 제조할 수 있다.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> L-glutamic acid producing bacterium and process for producing L-g
lutamic acid
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<220>
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gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 30
Claims (6)
- 코리네형 세균으로부터 유래된 시트레이트 신타제 유전자가 도입된, L-글루탐산 생산능을 갖는 엔테로박터(Enterobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 세라티아(Serratia), 에르위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea) 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물.
- 제1항에 있어서, 코리네형 세균이 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)인 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 엔테로박터(Enterobacter) 또는 클렙시엘라(Klebsiella) 속에 속하는 세균인 미생물.
- 제3항에 있어서, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans) 또는 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)에 속하는 세균인 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 미생물을 액체 배지에서 배양하여 L-글루탐산이 배지중에 생성되어 축적되도록 하는 단계 및 배지로부터 L-글루탐산을 수취하는 단계를 포함하여, L-글루탐산을 제조하는 방법.
- 제3항에 따른 미생물을 액체 배지에서 배양하여 L-글루탐산이 배지중에 생성되어 축적되도록 하는 단계 및 배지로부터 L-글루탐산을 수취하는 단계를 포함하여, L-글루탐산을 제조하는 방법.
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