CN1205339C - 生产l－谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

通过在培养基中培养属于肠细菌并具有L-谷氨酸生成能力的微生物来生产L-谷氨酸，所述微生物中引入了来自棒状细菌的柠檬酸合酶基因，在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并由培养基中收集L-谷氨酸。

Description

生产L-谷氨酸的方法

本发明涉及新型L-谷氨酸产生菌和使用该细菌通过发酵方法生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的食用、医用氨基酸。

迄今，L-谷氨酸一直通过发酵方法生产，主要使用产L-谷氨酸的所谓棒状细菌，它们属于短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属或其变异体(氨基酸发酵，Gakkai Shuppan Center，pp.195-215，1986)。已知的使用其它菌株通过发酵方法生产L-谷氨酸的方法包括，使用属于芽胞杆菌属、链霉菌属或青霉菌属的微生物的方法(美国专利3220929)，使用属于假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属或念珠菌属的微生物的方法(美国专利3563857)，使用属于芽胞杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属或产气节杆菌(现为产气肠杆菌)(审结日本专利公开32-9393)的细菌等微生物的方法，使用大肠杆菌的突变体的方法(日本公开专利申请5-244970)等。

通过上述微生物的育种或生产方法的改进已大大提高了L-谷氨酸的生成能力。为满足对L-谷氨酸的增长的需求，需要开发更廉价和有效的生产L-谷氨酸的方法。

鉴于上述情况，本发明的发明人已广泛考察和研究了产生L-谷氨酸的微生物。结果发现，高产L-谷氨酸的微生物可通过增加属于肠杆菌、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的微生物中催化L-谷氨酸生物合成的酶的活性获得(日本公开专利申请10-224909和10-297129)。

发明人还发现高产L-谷氨酸的微生物可通过将来自埃希氏菌属的柠檬酸合酶(以下简称为“CS”)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的编码基因引入属于埃希氏菌属的缬氨酸敏感菌株(WO 97/08294)得到。

同时，有报导说引入来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的柠檬酸合酶编码基因(CS基因)可有效提高棒杆菌属或微杆菌属的L-谷氨酸生成能力(审结日本专利公开7-121228)。当这些棒状细菌用作宿主时，引入来自作为宿主的同种谷氨酸棒杆菌的CS基因较引入来自大肠杆菌的CS基因的效果略好，但没有显著差别。

如上所述，已知可将CS基因引入各种微生物以提高L-谷氨酸的生成能力。然而，还没有将来自棒状细菌的CS基因引入属于肠细菌如属于埃希氏菌属的细菌的微生物的实例。

本发明的目的是寻找产L-谷氨酸的新的L-谷氨酸产生菌，以开发生产L-谷氨酸的廉价和有效的方法。

本发明的发明人已通过引入基因提高L-谷氨酸的生成能力来进行肠细菌的育种。一般认为，当宿主具有通过基因扩增进行微生物育种的靶基因时，使用内源性基因或来自宿主近亲的微生物的基因较引入异源基因效果要好。然而，本发明的发明人发现，对于肠细菌来说，就提高微生物的L-谷氨酸生成能力而言，引入来自棒状细菌的CS基因较引入同种肠细菌的CS基因更为有效。基于该发现完成了本发明。

即，本发明提供：

(1)属于肠细菌并具有L-谷氨酸生成能力的微生物，其中引入了来自棒状细菌的柠檬酸合酶基因，

(2)上述(1)中的微生物，其中棒状细菌是乳发酵短杆菌，

(3)上述(1)或(2)中的微生物，其中属于肠细菌的微生物是属于肠杆菌属或克雷伯氏菌属的细菌，

(4)上述(3)中的微生物，其中所述细菌属于成团肠杆菌或植生克雷伯氏菌，及

(5)生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养上述(1)到(4)中的任一种微生物，在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并由培养基中收集L-谷氨酸。

图1示具有gltA基因的质粒pMWCB的构建；

图2示具有gltA基因的质粒的构建。

以下详述本发明。

1.本发明的微生物

本发明属于肠细菌的微生物没有特别的限制，只要它属于通过引入来自棒状杆菌的CS基因可获得或提高L-谷氨酸生成能力的肠细菌即可。微生物的实例是属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属或埃希氏菌属的细菌。其中，优选属于肠杆菌属或克雷伯氏菌属的细菌。细菌的说明性实例以下介绍，但本发明的微生物并不限于这些实例。

可用于本发明的属于肠杆菌属的微生物的实例如下。

成团肠杆菌

产气肠杆菌

河生肠杆菌

阿氏肠杆菌

阴沟肠杆菌

溶解肠杆菌

日勾维肠杆菌

霍氏肠杆菌

中间肠杆菌

超压肠杆菌

阪崎肠杆菌

生癌肠杆菌

更优选地，可以提到下面列出的细菌菌株：

成团肠杆菌AJ 13355

液化沙雷氏菌ATCC 14460

成团肠杆菌AJ13355于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，保藏号是FERM P-16644，于1999年1月11日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6614。可从ATCC得到成团肠杆菌ATCC12287和液化沙雷氏菌ATCC 14460。

成团肠杆菌AJ13355是在日本Iwata-shi，Shizuoka的土壤分离的菌株。

AJ13355的生理特性如下：

(1)革兰氏染色：阴性

(2)厌氧性：兼性厌氧

(3)过氧化氢酶：阳性

(4)氧化酶：阴性

(5)硝酸盐还原：阴性

(6)Voges-Proskauer反应：阳性

(7)甲基红测试：阴性

(8)脲酶：阴性

(9)吲哚产生：阳性

(10)运动性：存在

(11)在TSI培养基中产生硫化氢：微小活性

(12)β-半乳糖苷酶：阳性

(13)糖同化能力：

阿拉伯糖：阳性

蔗糖：阳性

乳糖：阳性

木糖：阳性

山梨糖醇：阳性

肌醇：阳性

海藻糖：阳性

麦芽糖：阳性

蜜二糖：阳性

阿东糖醇：阴性

蜜三糖：阳性

水杨苷：阴性

蜜二糖：阳性

(14)甘油糖同化能力：阳性

(15)有机酸同化能力：

柠檬酸：阳性

酒石酸：阴性

葡糖酸：阳性

乙酸：阳性

丙二酸：阴性

(16)精氨酸脱水酶：阴性

(17)鸟氨酸脱羧酶：阴性

(18)赖氨酸脱羧酶：阴性

(19)苯丙氨酸脱氨酶：阴性

(20)色素形成：黄色

(21)明胶液化：阳性

(22)生长pH：在pH4生长不好，在pH4.5到7生长良好

(23)生长温度：在25℃生长良好，在30℃生长良好，在37℃生长良好，在42℃能够生长，在45℃不能生长。

从这些细菌特性，确定AJ13355是成团肠杆菌。

可用于本发明属于克雷伯氏菌属的微生物的实例如下。

植生克雷伯氏菌

土生克雷伯氏菌

更优选地，上述微生物的实例包括植生克雷伯氏菌AJ 13399。

植生克雷伯氏菌AJ 13399于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，保藏号是FERM P-16646，于1999年1月11日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6616。

植生克雷伯氏菌AJ 13399是在日本Sapporo-shi，Hokkaido的土壤分离的菌株。

AJ13399的生理特性如下：

(1)细胞形态：杆状

(2)运动性：没有

(3)孢子形成：没有

(4)在LabM营养琼脂上的菌落形态：环状，表面光滑，奶白色，规则，隆起，有光泽

(5)葡萄糖OF测试：发酵能力阳性

(6)革兰氏染色：阴性

(7)厌氧性：兼性厌氧

(8)过氧化氢酶：阳性

(9)氧化酶：阴性

(10)脲酶：阳性

(11)细胞色素氧化酶：阴性

(12)β-半乳糖苷酶：阳性

(13)精氨酸脱水酶：阴性

(14)鸟氨酸脱羧酶：阴性

(15)赖氨酸脱羧酶：阳性

(16)色氨酸脱氨酶：阴性

(17)Voges-Proskauer反应：阳性

(18)吲哚产生：阳性

(19)在TSI培养基中产生硫化氢：阴性

(20)柠檬酸同化能力：阳性

(21)间羟基苯甲酸同化能力：阴性

(22)明胶液化：阴性

(23)从糖产生酸

葡萄糖：阳性

甘露醇：阳性

鼠李糖：阳性

阿拉伯糖：阳性

蔗糖：阳性

山梨醇：阳性

肌醇：阳性

蜜二糖：阳性

苦杏仁苷：阳性

阿东糖醇-胨-水：阳性

纤维二糖-胨-水：阳性

半乳糖醇-胨-水：阴性

密三糖-胨-水：阳性

(24)生长温度：在37℃生长良好，在45℃不能生长。

从这些细菌特性，确定AJ13399是植生克雷伯氏菌。

可用于本发明的属于沙雷氏菌属的微生物的实例如下。

液化沙雷氏菌

嗜虫沙雷氏菌

无花果沙雷氏菌

居泉沙雷氏菌

格氏沙雷氏菌

变形斑沙雷氏菌

气味沙雷氏菌

普城沙雷氏菌

深红沙雷氏菌

更优选地，可提到液化沙雷氏菌ATCC14460。液化沙雷氏菌ATCC14460可由ATCC获得。

可用于本发明的属于欧文氏菌属的微生物的实例如下。

草生欧文氏菌(现在划分为成团泛菌)

菠萝欧文氏菌

灭仙人掌欧文氏菌

菊欧文氏菌

野梧桐欧文氏菌

桃色欧文氏菌

番石榴欧文氏菌

栎欧文氏菌

大黄欧文氏菌

生红欧文氏菌

柳欧文氏菌

噬夏孢欧文氏菌

更优选地，可以提到草生欧文氏菌IAM1595(成团泛菌AJ2666)。草生欧文氏菌IAM1595可由东京大学分子和细胞生物学研究所获得。应当注意，在《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版中没有描述草生欧文氏菌并且将已经划分为草生欧文氏菌的微生物划分为成团泛菌。已被划分为草生欧文氏菌的微生物现在被划分为成团泛菌。因此，属于欧文氏菌属的微生物和属于泛菌属的微生物彼此密切相关。因此，属于欧文氏菌属的任何微生物和属于泛菌属的任何微生物均可用于本发明。这些微生物包括成团泛菌和分散泛菌。草生欧文氏菌IAM1595被称为成团泛菌AJ2666，于1999年2月25日根据布达佩斯条约在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所进行了国际保藏，保藏号为FERM BP-6660。

可用于本发明属于埃希氏菌属的微生物的实例包括大肠杆菌。

更优选地，缬氨酸抗性大肠杆菌的实例包括如下菌株。

大肠杆菌K-12(ATCC10798)

大肠杆菌B(ATCC11303)

大肠杆菌W(ATCC9637)

大肠杆菌K-12(ATCC10798)、大肠杆菌B(ATCC11303)和大肠杆菌W(ATCC9637)可由ATCC获得。

应当注意，属于上述肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属和埃希氏菌属的细菌的糖代谢可通过Embden-Meyerhof途径完成，在该途径中生成的丙酮酸在厌氧条件下经三羧酸循环被氧化。L-谷氨酸由三羧酸循环的中间体α-酮戊二酸合成，催化的酶是GDH或谷氨酰胺合酶/谷氨酸合酶。因此，这些微生物具有同样的L-谷氨酸生物合成途径，上述微生物包括在本发明的一个构思中。因此，除上述种和菌株以外属于肠道细菌的微生物也在本发明的范围之内。

本发明的微生物是属于肠道细菌并具有L-谷氨酸生成能力的微生物。本文中“具有L-谷氨酸生成能力”是指培养时有在培养基中积累L-谷氨酸的能力。该L-谷氨酸生成能力可以是野生型菌株本身所具有的，或通过育种获得或提高了的。可通过引入gltA基因获得L-谷氨酸生成能力的微生物也可使用。属于肠道细菌并具有L-谷氨酸生成能力的微生物包括，例如一种或多种催化L-谷氨酸生物合成的一个或多个反应的酶的活性提高了的微生物，和催化L-谷氨酸生物合成的分支反应并产生非L-谷氨酸的产物的酶的活性降低或缺乏的微生物。所述微生物还包括一种或多种催化L-谷氨酸生物合成的一个或多个反应的酶的活性提高，同时催化L-谷氨酸生物合成的分支反应并产生非L-谷氨酸的产物的酶的活性降低或缺乏的微生物。

可以是被引入肠道细菌的gltA基因来源的“棒状细菌”包括此前被分类为短杆菌属但目前被归入棒杆菌属的细菌(国际系统细菌学杂志，41，255(1981))，并包括与棒杆菌属密切相关、属于短杆菌属的细菌。上述产L-谷氨酸的棒状细菌的实例包括如下。

嗜乙酰乙酸棒杆菌

醋谷棒杆菌

Corynebacterium alkanolyticum

美棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)

Corynebacterium melassecola

力士棒杆菌

Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌

解糖短杆菌

生硫短杆菌

Brevibacterium album

Brevibacterium cerinum

嗜氨微杆菌

具体而言，可举出这些细菌的下列菌株：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，13032，13060

百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC15990

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826，ATCC14067

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13655，ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

Brevibacterium album ATCC15111

Brevibacterium cerinum ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

来自棒状细菌的gltA基因可通过自棒状细菌的染色体DNA分离补充缺乏CS活性的细菌的营养缺陷型如棒状细菌的突变体的DNA片段获得。棒状细菌的gltA基因的核苷酸序列已经公开(微生物学，140，1817-1828(1994))。因此，gltA基因可使用染色体DNA作为模板通过PCR方法获得，引物根据其核苷酸序列合成。引物的实例如具有SEQ ID NO：1和NO：2所示核苷酸序列的寡核苷酸。

要将来自棒状细菌的CS基因引入属于肠细菌的微生物，可将CS基因克隆到合适的质粒上，作为宿主的上述出发亲本菌株可用所获得的重组质粒转化。转化子细胞中CS基因(以下简称为gltA基因)的拷贝数增加，因此CS活性提高。

所述质粒没有特别的限制，只要其可以在属于肠道细菌的微生物中自主复制即可，其实例包括，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等。除这些质粒外，噬菌体DNA载体也可使用。

引入gltA基因可通过使gltA基因存在于作为宿主的上述出发亲本菌株的染色体DNA上，优选以多个拷贝存在。为将gltA基因以多个拷贝引入属于肠细菌的微生物的染色体DNA上，可以使用以多个拷贝存在于染色体DNA上的序列如重复DNA或存在于可转录因子的末端区域的倒转重复。或者，gltA基因可通过将gltA基因插入转座子并使转座子转座以多个拷贝引入gltA基因。在转化子细胞中gltA基因的拷贝数增加，因此提高了CS活性。

转化可根据例如D.A.Morrison(酶学方法，68，326(1979))的方法进行，或根据Mandel，M.和Higa，A.的方法(分子生物学杂志，53，159(1970))进行，后一方法中受体细胞用氯化钙处理以增加对DNA的通透性。

待引入的gltA基因可具有适合于属于肠细菌的微生物的启动子，如lac，trp或P_L，来代替gltA基因的内源启动子。

基因克隆、DNA消化和连接及转化方法可参见《分子克隆》第2版，冷泉港实验室出版社(1989)。

在本发明的微生物中，除了引入来自棒状细菌的gltA基因之外，非CS的催化L-谷氨酸生物合成的酶的活性也可以被提高。催化L-谷氨酸生物合成的酶的说明性实例包括谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸水合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶等。

通过偏离L-谷氨酸生物合成途径催化生成非L-谷氨酸产物的反应的酶可以减少或失去。通过偏离L-谷氨酸生物合成途径催化生成非L-谷氨酸产物的反应的酶的说明性实例包括α-酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰基转移酶、乙酸激酶、acetohydroximate合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰基转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。其中，αKGDH是优选的。

编码PEPC和GDH的基因通过分离补充缺乏PEPC或GDH活性的变异菌株的营养缺陷型的DNA片段分别可获自上述微生物的染色体DNA。或者，因为埃希氏菌属或棒杆菌属细菌的这些基因的核苷酸序列已经公开(生物化学，22，5243-5249(1983)；生物化学杂志，95，909-916(1984)；基因，27，193-199(1984)；分子和普通遗传学，218，330-339(1989)和分子微生物学，6，317-326(1992))，这些基因可通过PCR获得，使用的引物根据公开的核苷酸序列合成，染色体DNA作为模板。

为了在属于肠道细菌的微生物中获得上述酶活性的降低或缺乏，可通过常规诱变技术或遗传工程技术将引起上述酶活性降低或缺乏的突变引入该酶的编码基因。

诱变技术的实例包括例如使用X射线或紫外光辐射的方法，利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等诱变剂处理的方法等。引入突变的基因位点可以是编码酶蛋白的编码区或启动子等表达控制区。

遗传工程技术的实例包括例如基因重组、基因转导、细胞融合等。例如，药物抗性基因可被插入靶基因，产生功能失活的基因(断裂基因)。然后该缺失型基因被引入属于肠道细菌的微生物的细胞中，染色体上的靶基因通过同源重组被置换为缺失型基因(基因断裂)。

一种微生物的靶酶活性是否降低或缺乏，或降低的程度，可通过测定候选菌株细菌细胞提取物或纯化部分的该酶活性，并与野生型菌株比较而得知。例如，αKGDH酶活性可通过Reed等的方法测定(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法1969，13，55-61)。

对于某些酶，靶突变体可通过突变体的表型选择。例如，αKGDH活性缺乏或降低的突变体在含葡萄糖或乙酸或L-谷氨酸作为唯一碳源的基本培养基上不能生长，或生长速率大大下降。但是，通过加入琥珀酸或L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸至含葡萄糖的基本培养基，同样条件下可支持正常生长。可使用该现象作为指标筛选αKGDH活性缺乏或降低的突变体。

根据同源重组获得缺乏αKGDH基因的乳发酵短杆菌菌株的方法参见WO95/34672，类似方法可用于属于肠道细菌的微生物。

如上述缺乏αKGDH活性或该活性降低的突变菌株的实例是成团肠杆菌AJ13356和植生克雷伯氏菌AJ13410。成团肠杆菌AJ13356和植生克雷伯氏菌AJ13410于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所保藏号分别是FERM P-16645和FERM P-16647，然后于1999年1月11日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号分别为FERM BP-6615和FERM BP-6617。

通过在培养基中培养被引入来自棒状细菌的gltA基因、属于肠道细菌的微生物，可在液体培养基中产生和积累L-谷氨酸。

培养基可以是普通培养基，含有所需的碳源、氮源、无机盐以及氨基酸、维生素等有机营养等等。可以是合成或天然培养基。碳源和氮源只要其可被培养的微生物同化即可用于培养基中。

碳源可以是糖，如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物，糖蜜等。另外，有机酸如乙酸和柠檬酸也可以单独利用或联合其它碳源利用。

氮源可以是氨，铵盐如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵，和乙酸铵，硝酸盐等。

微量有机营养，可以使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有它们的物质如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白降解物等，并且当利用其生长需要氨基酸等的营养缺陷型变异体时，必需补充需要的营养。

无机盐，可以使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐等。

至于培养条件，可以在需氧条件下进行培养，温度为20到42℃，pH为4到8。可以连续培养10小时到4天以便在液体培养基中积累相当量的L-谷氨酸。

在完成培养后，通过已知方法可以收集培养基中积累的L-谷氨酸。例如，可以通过包括在除去细胞后浓缩培养基以便结晶产物，离子交换层析等方法进行分离。

根据本发明，因为属于肠细菌的微生物可以有效地获得L-谷氨酸生成能力，推测通过产L-谷氨酸的棒状细菌的常规已知的育种技术可使微生物获得较高的生成能力。对培养条件等的研究预期会导致生产L-谷氨酸的廉价和有效的方法的出现。

以下将参照具体实施例更具体地阐明本发明。

1.具有gltA基因的质粒的构建

具有来自乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒如下构建。使用具有根据谷氨酸棒杆菌gltA基因的核苷酸序列(微生物学，1994，140，1817-1828)选择的SEQ ID NO：1和2的核苷酸序列的引物进行PCR，模板为乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA，获得大约3kb的gltA基因片段。该片段插入SmaI消化的质粒pHSG399(购自Takara Shuzo)，获得质粒pHSGCB(图1)。然后，pHSGCB用HindIII消化，切出的约3kb的gltA基因片段插入HindIII消化的质粒pMW218(购自Nippon Gene)，获得质粒pMWCB(图1)。所得的pMWCB质粒的gltA基因的表达通过测定成团肠杆菌AJ13355菌株的酶活性而证实。

2.具有来自大肠杆菌的gltA基因的质粒的构建

作为对照，具有来自大肠杆菌的gltA基因的质粒如下构建。具有来自大肠杆菌的gltA基因的pTWVC质粒(WO97/08294)用HindIII和EcoRI消化，纯化并收集所得的具有gltA基因的DNA片段，引入质粒pMW219的HindIII-EcoRI位点，获得质粒pMWC(图2)。所得质粒pMWC的gltA基因的表达通过测定缺乏gltA基因的大肠杆菌营养缺陷型菌株的酶活性和互补作用而证实。

3.将gltA基因引入成团肠杆菌和植生克雷伯氏菌及产生L-谷氨酸

成团肠杆菌AJ13355和植生克雷伯氏菌AJ13399菌株用pMWC或pMWCB转化。将所得转化子AJ13355/pMWC，AJ13355/pMWCB，AJ13399/pMWC和AJ13399/pMWCB以及亲本菌株分别接种500毫升三角瓶中的20毫升培养基，培养基含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升七水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升七水氯化钙，0.02克/升四水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升五水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，和30克/升碳酸钙，并且在37℃振荡培养15小时。在完成培养后，测量培养基中积累的L-谷氨酸和残留的葡萄糖。结果表示在表1。

表1：L-谷氨酸的积累量

细菌菌株            L-谷氨酸的积累量(g/L)          残留葡萄糖量(g/L)

AJ13355             0                              0

AJ13355/pMWC        0.01                           6.0

AJ13355/pMWCB       0.78                           28.5

AJ13399             0                              0

AJ13399/pMWC        2.85                           0

AJ13399/pMWCB       4.71                           0

通过引入gltA基因，成团肠杆菌AJ13355和植生克雷伯氏菌AJ13399均见到L-谷氨酸生成。与引入来自大肠杆菌的gltA基因相比，引入来自乳发酵短杆菌的gltA基因时，L-谷氨酸的积累更为显著。在上述条件下，使用AJ13355/pMWCB时，残留大量的葡萄糖未被消耗。当培养进行至所有的葡萄糖被消耗时，推测可积累大约1.5到2g/L的L-谷氨酸。

AJ13355/pMWC和AJ13355/pMWCB以及AJ13399/pMWC和AJ13399/pMWCB之间的质粒拷贝数没有见到明显差异。

                                       序列表

(110)Ajinomoto Co.，Inc.

(120)L-谷氨酸产生菌和生产L-谷氨酸的方法

(130)OP892

(141)1999--

(150)JP 10-297350

(151)1999-10-19

(160)2

(170)PatentIn Ver.2.0

(210)1

(211)30

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：引物

(400)1

gtctacaata gccygaatct gttctggtcg                    30

(210)2

(211)30

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：引物

(400)2

aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt                    30

Claims (3)

1.生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养属于肠杆菌属或克雷伯氏菌属的细菌，其中在所述细菌中引入来自棒状细菌的柠檬酸合酶基因，在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并由培养基中收集L-谷氨酸。

2.权利要求1的方法，其中棒状细菌是乳发酵短杆菌。

3.权利要求1或2的方法，其中细菌是成团肠杆菌或是植生克雷伯氏菌。

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