CN1238515C - 生产l－谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属并且具有生产L-谷氨酸能力的微生物，并且从该培养基中收集产生的L-谷氨酸，所使用的微生物菌株优选的是催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏，或催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加的菌株。

Description

生产L-谷氨酸的方法
本发明涉及新的生产L谷氨酸的细菌和通过利用同样细菌发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是可作为食物，药物和诸如此类的重要氨基酸。
通常L-谷氨酸已经利用所谓的生产L-谷氨酸的棒状细菌通过发酵方法产生，该细菌原则上属于短杆菌属，棒状杆菌，和微杆菌或它们的变异体(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan中心，第195-215页，1986)。至于通过利用其它细菌菌株发酵生产L-谷氨酸的方法，已知有利用芽孢杆菌，链霉菌，青霉菌和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,220,929)，利用假单孢菌，节杆菌，沙雷伯氏菌，念珠菌属和诸如此类的微生物的微生物的方法(美国专利号3,563,857)，利用大肠杆菌的变异体菌株的方法(日本未审专利中请公开号(KOKAI)5-244970(1993))和诸如此类的方法。
虽然通过前面所述培育这样的微生物或改善的生产方法已经相当大地提高L-谷氨酸的生产率，仍然需要开发更廉价和更有效的生产L-谷氨酸的方法，以便满足将来对氨基酸的明显增长的需要。
本发明的目的是发现生产L-谷氨酸的能力高的新的生产L-谷氨酸细菌，从而开发生产L-谷氨酸的更廉价和更有效的方法。
为了达到前面的目的，本发明人广泛地寻找和研究具有生产L-谷氨酸能力的微生物，这些微生物与过去报道的微生物不同。作为结果是，他们发现了某些起源于属于克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的微生物的菌株具有高的生产L-谷氨酸的能力，并且已经完成本发明。
所以，本发明提供：
(1)属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物并且具有生产L-谷氨酸的能力的微生物：
(2)是植生克雷伯氏菌或草生欧文氏菌的上面(1)的微生物；
(3)增加了催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性的上面(1)或(2)中的微生物；
(4)上面(3)中的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶至少选自包括柠檬酸合成酶(下面简写为“CS”)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下面简写为“PEPC”)，和谷氨酸脱氢酶(下面简写为“GDH”)中的一种；
(5)上面(4)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶包括CS，PEPC和GDH三者；
(6)上面(1)到(5)中的任何一个的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的分支反应途径并且产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏；
(7)上面(6)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应和生产不是L-谷氨酸的化合物的酶是α-酮戊二酸脱氢酶(下面简写为“αKGDH”)；
(8)生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培育如上面(1)到(7)的任何一个定义的微生物以便生产和在培养基中积累L-谷氨酸，并收集来自培养基的L-谷氨酸。
由于本发明的微生物具有高的生产L-谷氨酸的能力，通过利用前面已知的生产L-谷氨酸的棒状细菌和诸如此类的培育技术使微生物具有更高的生产能力被认为是可能的，可以期望通过适当选择培养条件和诸如此类能够发展更廉价和更有效的生产L-谷氨酸的方法。
图1显示具有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建。
图2显示了具有gdhA基因的质粒pMWG的构建。
图3显示了具有gltA基因的质粒pMWC的构建。
图4显示了具有广谱寄主范围的质粒RSF1010的复制原点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。
图5显示了具有广谱寄主范围的质粒RSF1010的复制原点，四环素抗性基因，gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。
下面将详细解释本发明。
可用于本发明的属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物的例子如下列出。
植生克雷伯氏菌
土生克雷伯氏菌
草生欧文氏菌(现在也划分为成团泛菌)
菠萝欧文氏菌
灭仙人掌欧文氏菌
菊欧文氏菌
野梧桐欧文氏菌
桃色欧文氏菌
番石榴欧文氏菌
栎欧文氏菌
大黄欧文氏菌
生红欧文氏菌
柳欧文氏菌
噬夏孢欧文氏菌
成团泛菌
分散泛菌
更优选地，可以提到下面列出的那些细菌菌株：
植生克雷伯氏菌AJ13399
草生欧文氏菌IAM1595(成团泛菌AJ2666)
植生克雷伯氏菌AJ 13399于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，接受的登记号是FERM P-16646，然后于1999年1月11日根据布达佩斯条约转为国际保藏，登记号是FERM BP-6616。已经划分为草生欧文氏菌的微生物现在被划分为成团泛菌。因此，草生欧文氏菌IAM1595被命名为成团泛菌AJ2666，并且于1999年2月25日保藏于通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，根据布达佩斯条约进行国际保藏，登记号是FERM BP-6660。
植生克雷伯氏菌AJ 13399是在Sapporo-shi，Hokkaido，日本的土壤分离的菌株。
AJ13399的生理特性如下：
(1)细胞形态：杆状
(2)游动性：没有
(3)孢子形成：没有
(4)在LabM营养琼脂培养基上菌落形态：环状，表面光滑，奶白色，规则，隆起，有光泽
(5)葡萄糖OF测试：发酵能力阳性
(6)革兰氏染色：阴性
(7)氧行为：兼性厌氧菌
(8)过氧化氢酶：阳性
(9)氧化酶：阴性
(10)脲酶：阳性
(11)细胞色素氧化酶：阴性
(12)β-半乳糖苷酶：阳性
(13)精氨酸脱水酶：阴性
(14)鸟氨酸脱羧酶：阴性
(15)赖氨酸脱羧酶：阳性
(16)色氨酸脱氨酶：阴性
(17)Voges-Proskauer反应：阳性
(18)吲哚产生：阳性
(19)在TSI培养基中产生硫化氢：阴性
(20)柠檬酸同化能力：阳性
(21)间羟基苯甲酸同化能力：阴性
(22)明胶液化：阴性
(23)从糖产生酸
葡萄糖：阳性
甘露醇：阳性
鼠李糖：阳性
阿拉伯糖：阳性
蔗糖：阳性
山梨醇：阳性
肌醇：阳性
蜜二糖：阳性
苦杏仁苷：阳性
阿东糖醇-胨-水：阳性
纤维二糖-胨-水：阳性
半乳糖醇-胨-水：阴性
棉籽糖-胨-水：：阳性
(23)生长温度：在37℃生长很好，在45℃不能生长。
从这些细菌特性，确定AJ13399是植生克雷伯氏菌。
在细菌伯杰氏手册，第9版中没有描述草生欧文氏菌并且将已经划分为草生欧文氏菌的微生物划分为成团泛菌。因此，属于欧文氏菌属的微生物和属于泛菌属的微生物互相密切相关。因此，属于欧文氏菌属的任何微生物和属于泛菌属的任何微生物可用于本发明。
由属于例如上面介绍的克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的任何细菌的通过Embden-Meyerhof途径完成糖代谢，在这一途径产生的丙酮酸在需氧条件下的三羧酸循环中氧化。通过GDH或谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶从三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸生物合成L-谷氨酸。所以，这些微生物拥有同样的L-谷氨酸生物合成途径，并且属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物包含在本发明的一个构思中。所以，除了特别上面提到的种类和菌株，属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的其它微生物也在本发明的范围内。
本发明的微生物是属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属并且具有产生L-谷氨酸的能力的微生物。在本文使用的表述“具有生产L-谷氨酸的能力”指具有在培养过程中在培养基中积累L-谷氨酸的能力。产生L-谷氨酸的能力可以是具有类似于野生型特性的能力，或通过育种授予的或加强的能力。属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属并且具有生产L-谷氨酸能力的微生物的例子包括例如催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加了的这样的微生物，和催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏的微生物。所述的微生物的例子进一步包括催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加，和催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏的微生物。
作为催化L-谷氨酸的生物合成的反应的酶的例子，可以提到的是GDH，谷氨酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合酶，CS，PEPC，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油酸变位酶，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果糖二磷酸醛缩酶，磷酸果糖激酶，葡糖磷酸异构酶和诸如此类。在这些酶中，CS，PEPC和GDH中的一个或两个或三种是优选的。作为本发明的微生物，更加优选的是所有三种酶CS，PEPC和GDH的活性增加。是否微生物增加了靶酶的活性，活性增强的程度通过细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性的测量，并且将它与野生型菌株或亲本菌株比较可以确定。
本发明的微生物，属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属，并且催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增强，例如这种微生物可以作为变异体获得，其中在编码该酶的基因中已经产生突变，或通过利用上面提到的微生物作为起始亲本菌株的遗传重组菌株获得。
为了增强CS，PEPC或GDH的活性，例如，编码CS，PEPC或GDH的基因可以克隆进入适当质粒，可以利用得到的质粒转化作为寄主的前面提到的起始亲本菌株。这可以增加编码各个CS，PEPC和GDH的基因的拷贝数(下面分别简写为“gltA基因”，“ppc基因”，和“gdhA基因”)，结果，增强了CS，PEPC和GDH的活性。
将选自克隆的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的一种或两种或三种以任何联合导入上面提到的起始亲本菌株。当导入两或三种基因时，将这两或三种基因克隆进入一种质粒，并且导入寄主，或者它们分别克隆进入两或三种质粒，所述质粒可以在同一寄主中存在，并且导入寄主中。
对质粒没有特别限制只要它能够在属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物中自主复制。质粒的例子包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218和诸如此类。除了这些质粒，也可以使用噬菌体DNA载体。
通过例如，D.M.Morrison(酶学方法68，326(1979))的方法，利用氯化钙增强受体细胞对DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))，或诸如此类的方法可以达到转化。
CS，PEPC和GDH的活性也可以通过存在于作为寄主的起始亲本菌株的染色体DNA上的gltA基因，ppc基因和/或gdh基因的多个拷贝增强。为了在属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物的染色体DNA中导入多个拷贝的gltA基因，ppc基因和/或gdhA基因，可以利用多个拷贝数的染色体DNA上的序列如重复DNA，和存在于转座因子末端的倒转重复。可选择地，也可以将多个拷贝的基因导入染色体DNA，方法是利用携带gltA基因，ppc基因或gdhA基因的转座子的转座。这些技术可以增加转化体细胞中的gltA基因，ppc基因，和gdhA基因的拷贝数，结果增强了CS，PEPC和GDH的活性。
可以利用任何生物体作为用于增加拷贝数的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的来源，只要生物体具有CS，PEPC和GDH活性。在这些生物体中，细菌，即原核生物，如那些属于肠杆菌，克雷伯氏菌，欧文氏菌，泛菌，沙雷伯氏菌，埃希氏菌，棒状杆菌，短杆菌，或芽孢杆菌属的细菌是优选的。作为特定的实例，可以提到大肠杆菌。从上面提到的这样的微生物的染色体DNA可以得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。
通过分离补充缺乏CS，PEPC或GDH活性的变异体菌株的营养缺陷型的DNA片断可以从前面提到的任何微生物的染色体DNA分别得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。可选择地，因为已经阐明了埃希氏菌或棒状杆菌属的细菌的这些基因的核苷酸序列(生物化学，22卷，5243-5249，1983；生物化学杂志，95卷，909-916，1984；基因，27卷，193-199，1984；微生物学，140卷，1817-1828，1994；分子遗传学，218卷，330-339，1989；和分子微生物学，6卷，317-326，1992)，利用根据每个阐明的核苷酸序列合成的引物和染色体DNA作为模板，通过PCR可以获得这些基因。
除了通过上面提到的基因扩增，通过增强gltA基因，ppc基因或gdhA基因的表达也可以增强CS，PEPC或GDH的活性。例如，通过利用另一个强启动子替代gltA基因，ppc基因或者gdhA基因的启动子增强表达。这样的强启动子的例子包括，例如1ac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体PR启动子和PL启动子和诸如此类。启动子已经被替代的gltA基因，ppc基因，gdhA基因可以克隆进入质粒和导入寄主微生物，或利用重复DNA，倒转重复，转座子或诸如此类导入寄主微生物的染色体DNA。
通过利用另一个较强启动子(参见WO87/03006，和日本未审专利申请公开号(KOKAI)，61-268183(1986))替代染色体上的gltA基因，ppc基因，gdhA基因的启动子或在每个基因的编码序列的上游插入强启动子(参见基因，29，231-241，1984)也可以增强CS，PEPC或GDH的活性。特定地说，通过在gltA基因，ppc基因，gdhA基因(这些基因的启动子用强启动子替代)或含有它们的一部分的DNA，和染色体上对应的基因之间的同源重组可以达到。
属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物的特定例子包括例如，植生克雷伯氏菌ATJ13399/RSFCPG，和草生欧文氏菌IAM1595/RSFCPG，其中这些微生物的CS，PEPC或GDH活性增强。
催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的例子包括例如，αKGDH，异柠檬酸裂合酶，磷酸乙酰转移酶，乙酸激酶，乙酰羟酸合成酶，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，L-谷氨酸脱羧酶，1-吡洛啉脱氢酶和诸如此类。在这些酶中间，αKGDH是优选的。
为了在属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物中获得上面提到的酶活性的下降和缺乏，可以通过常规诱变技术或遗传工程技术在编码该酶的基因中导入引起酶活性的下降或缺乏的突变。
诱变技术的例子包括例如，利用X-射线或紫外光辐射的方法，利用诱变试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和诸如此类处理的方法。导入突变的基因的位置可以是编码酶蛋白的编码区或如启动子的表达调节区。
遗传工程技术的例子包括，例如遗传重组，遗传转导，细胞融合和诸如此类。例如，在靶基因中插入药物抗性基因以便产生功能失活的基因(缺陷基因)。然后，这一缺陷基因可以导入属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物的细胞，并且在染色体上的靶基因可以用缺陷基因通过同源重组替代(基因破坏)。
通过测量候选菌株的细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性，并且将它与野生型菌株或亲本菌株的比较可以确定是否微生物降低了靶酶的活性或缺乏该活性，和该酶活性的降低程度。通过例如Reed等人的方法可以测量αKGDH酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法，1969，13，p55-61)。
根据靶酶，可以在变异体的表现型的基础上选择靶变异体。例如，在含有葡萄糖的基本培养基或含有乙酸或L-谷氨酸作为唯一碳源的基本培养基上缺乏αKGDH活性或降低该活性的变异体不能生长，或显示了明显的在需氧条件下生长速率降低。但是，甚至在同样条件下，通过在含有葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸可以展示出正常的生长。根据这些现象，可以选择缺乏αKGDH活性或降低该活性的变异体。
在WO95/34672详细叙述了通过同源重组生产缺乏αKGDH基因的产谷氨酸短杆菌菌株的方法，同样的方法可以用于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的微生物。
另外，在分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)和诸如此类中详细叙述了基因克隆，DNA切割和连接，转化和诸如此类。
如上所述得到的缺乏αKGDH活性或降低该活性的变异体菌株的例子是植生克雷伯氏菌AJ13410。将植生克雷伯氏菌AJ13410于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，接受的登记号RERM P-16647，然后按照布达佩斯条约在1999年1月11日转为国际保藏，接受的登记号是FERM BP-6617。
属于克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属并且αKGDH活性降低或缺失该活性，或增加了如上所述获得的CS，PEPC或GDH活性的那些细菌菌株具有在下文的实施例中显示的产生L-谷氨酸的能力。
就属于埃希氏菌的微生物而言，已经被划分为克雷伯氏菌属，欧文氏菌属或泛菌属的肠细菌，已经已知αKGDH的活性减少或缺乏该活性的菌株可以产生L-谷氨酸(日本未审专利申请5-244970(1993))，αKGDH的活性减少或缺乏该活性的菌株并且PEPC和GDH活性增加了的菌株可以产生进一步提高产量的L-谷氨酸(日本未审专利申请7-203980(1995))，和显示缬氨酸敏感性和具有CS和GDH的增加的活性的菌株可以产生L-谷氨酸(WO97/08294)。
就属于肠杆菌属的微生物而言，类似地被划分为肠细菌，本发明人发现αKGDH的活性减少或缺乏该活性的菌株，或具有PEPC，CS和GDH的增加的活性的菌株可以产生L-谷氨酸(日本专利申请10-69068(1998))。
此外，如也是属于沙雷伯氏菌的微生物，本发明人发现具有增加的PEPC和GDH和CS活性的菌株可以产生L-谷氨酸(日本专利申请10-69068(1998))。
根据该事实，可以预期除了描述于实施例的菌株以外，就属于克雷伯氏菌，欧文氏菌，泛菌，埃希氏菌，肠杆菌或沙雷氏伯菌属的细菌而言，αKGDH的活性减少或缺乏该活性的菌株，或具有PEPC，CS和GDH的增加的活性的菌株可以产生L-谷氨酸。如在实施例中证明的，强烈地支持事实：通过缺失αKGDH使植生克雷伯氏菌AJ13399具有产生L-谷氨酸的能力这一事实可应用到克雷伯氏菌，欧文氏菌，泛菌属的其它细菌。
通过培养属于克雷伯氏菌，欧文氏菌，或泛菌属并且具有在液体培养基中产生L-谷氨酸的能力的微生物在该培养基中产生和积累L-谷氨酸，并且从该培养基中收集L-谷氨酸。
培养基可以是如果需要，含有碳源，氮源，和无机盐，以及有机营养如氨基酸，维生素，和诸如此类的普通营养培养基。这可以是合成培养基或天然培养基。任何碳源和氮源可以用于培养基，只要它们可以被培养的微生物利用。
碳源可以是糖，如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物，糖蜜和诸如此类。另外，有机酸如乙酸和柠檬酸也可以单独利用或联合其它碳源利用。
氮源可以是氨，铵盐如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵，和乙酸铵，硝酸盐和诸如此类。
作为微量有机营养，可以使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有它们的物质如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白质分解产物和诸如此类物质，并且当利用其生长需要氨基酸和诸如此类的营养缺陷型变异体时，必需补充需要的营养。
作为无机盐，可以使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐和诸如此类。
至于培养条件，可以在需氧条件下进行培养，温度为20到42℃，pH为4到8。可以连续培养10小时到4天以便在液体培养基中积累相当量的L-谷氨酸。
在完成培养后，通过已知方法可以收集培养基中积累的L-谷氨酸。例如，通过包括在除去细胞后浓缩培养基以便结晶产物，离子交换层析和诸如此类的方法可以分离L-谷氨酸。
参考下面的实施例将更具体地说明本发明。
(1)构建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒
参考图1，2和3将能够解释构建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒的方法。
利用HindIII和SphI消化含有起源于大肠杆菌的gdhA基因的质粒pBRGDH(日本未审专利申请公开号(KOKAI)7-203980(1995))，通过T4DNA聚合酶处理将两个末端平齐化。然后，纯化和收集含有gdhA基因的DNA片断。在另一方面，利用XbaI消化含有起源于大肠杆菌的gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(WO97/08294)，利用T4DNA聚合酶处理将两个末端平齐化。将这与含有上面纯化的含有gdhA基因的DNA片断混合，利用T4连接酶连接，得到质粒pMWCPG，该质粒对应于另外携带gdhA基因的pMWCP(附图1)。
纯化和回收利用HindIII和SalI消化pBRGDH得到的含有gdhA基因的DNA片断，并导入质粒pMW219(从Nippon Gene购买)的HindIII-SalI位点，从而得到质粒pMWG(图2)。此外，利用HindIII和EcoRI消化含有起源于大肠杆菌的gltA基因的质粒pTWVC(WO97/08294)，和纯化和回收消化含有gltA基因的DNA片断，并导入质粒pMW219的HindIII-EcoRI位点，从而得到质粒pMWC(图3)。
在同一时间，将通过用NotI消化含有广谱宿主范围质粒RSF1010(日本来审专利申请公开号(KOKAI)8-047397(1996))的复制原点的质粒pVIC40，接着通过T4DNA聚合酶处理和PstI消化得到的产物，和通过利用EcoT141消化pBR322，接着T4DNA聚合酶处理和PstI消化得到的产物混合，并用T4连接酶连接以便得到含有RSF1010的复制原点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图4)。
然后，利用EcoRI和PstI消化pMWCPG，纯化和回收含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的DNA片断。同样，利用EcoRI和PstI消化RSF-Tet，纯化和回收含有RSF1010的复制原点的DNA片断。混合这些DNA片断，利用T4连接酶连接以便得到由携带gltA基因，ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet组成的质粒RSFCPG(附图5)。在缺乏gltA基因，ppc基因或gdhA基因的大肠杆菌菌株的营养缺陷型的补充和每种酶活性的测量的基础上证实了得到的质粒RSFCPG表达gltA基因，ppc基因和gdhA基因。类似地，在缺乏gltA基因，或gdhA基因的大肠杆菌菌株的营养缺陷型的补充和每种酶活性的测量的基础上证实了质粒pMWG或pMWC表达gdhA基因，或gltA基因。
(2)在克雷伯氏菌细菌和欧文氏菌(泛菌属)细菌中导入RSFCPG，pMWC和pMWG，和评估L-谷氨酸生产率
利用RSFCPG，pMWC和pMWG通过电穿孔转化草生欧文氏菌IAM1595(成团泛菌AJ2666)，和植生克雷伯氏菌AJ13399(Miller J.H.，“细菌遗传学的简短方法，手册”，冷泉港实验室出版，美国，1992)以便得到展示四环素抗性的转化体。
将每种得到的转化体和亲本菌株接种到50毫升体积的大小的试管，在试管中含有5毫升培养基，培养基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升四水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64亳克/升5水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，和30克/升碳酸钙，并且在37℃振摇培养，直到在培养基中含有的葡萄糖耗尽。在转化体的培养基中，加入25毫克/升的四环素。在完成培养后，测量培养基中积累的L-谷氨酸。结果表示在表1。
表1：L-谷氨酸的积累量
  细菌菌株   L-谷氨酸的积累量
  IAM1595IAM1595/RSFCPGAJ13399AJ13399/RSFCPGAJ13399/pMWCAJ13355/pMWG单独培养基   0.0克/升5.00.03.12.50.80.2
尽管草生欧文氏菌IAM1595，和植生克雷伯氏菌AJ13399不积累L-谷氨酸，但通过导入RSFCPG扩增了CS，PEPC和GDH活性的菌株分别积累5.0克/升，3.1克/升L-谷氨酸。CS活性单独扩增的AJ13399菌株积累2.5克/升L-谷氨酸，GDH活性单独扩增的菌株也积累0.8克/升的L-谷氨酸。
(3)植生克雷伯氏菌AJ13399的αKGDH部分基因片段的克隆
利用各具有其核苷酸序列已经被报道的生物体即维涅兰德固氮菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，谷氨酸棒状杆菌，流感嗜血菌，人和啤酒酵母(欧洲生物化学杂志，第187卷，第235-239页，分子遗传性，第234卷，第285-296页，1992；欧洲生物化学杂志，141，351-359，1984；微生物学，142，3347-3354，1996；科学，第269卷，第496-512页，1995；美国科学院年报，第89卷，第1963-1967页，1992；和细胞分子生物学，第9卷，第2695-2705页，1989)的αKGDH基因的同源区域的核苷酸序列和EcoRI位点的寡聚核苷酸作为引物进行PCR克隆具有植生克雷伯氏菌AJ13399的αKGDH基因的一部分的片段．
特别是，将下列序列用作为引物。
(引物1)
5’CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA3’(SEQ ID NO：1)
(引物2)
5’GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC3’(SEQ ID NO：2)
通过如常规使用的从大肠杆菌提取染色体DNA的同样方法分离植生克雷伯氏菌AJ13399的染色体DNA用作PCR模板(Seibutsu KogakuJikken-sho(生物工程实验教科书)，发酵和生物工程协会编辑，日本，97-98，Baifukan，1992)。
进行PCR的循环包括94℃，1分钟，50℃，1分钟，和73℃进行3分钟，重复30个循环，和用EcoRI消化获得的DNA片段并且插入到已经用EcoRI消化的载体质粒pT7Blue以获得重组质粒pT7KP。所使用的载体质粒pT7Blue(氨苄青霉素抗性)是来源于Novagen的商品。
克隆的片段的DNA核苷酸序列和由该序列编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：3.相同的氨基酸序列单独表示在SEQ ID NO：4.该序列显示与大肠杆菌的αKGDH-E1亚单位基因有82.3％的同源性(下文称之为“sucA基因”)，已经被认作为植生克雷伯氏菌AJ13399的sucA基因的一部分。在显示于SEQ ID NO：3的核苷酸序列中，核苷酸编号18-1659来源于sucA基因，核苷酸编号0-17和1660-1679来源于引物。
(4)获得起源于植生克雷伯氏菌AJ13399的αKGDH缺陷菌株
利用具有如上所述获得的植生克雷伯氏菌的sucA基因的一部分的片段，通过同源重组获得植生克雷伯氏菌的缺乏αKGDH的菌株。
首先，利用BstEII消化pT7KP，在这一裂解位点，将从质粒pNEO(从Pharmacia购买)经过PCR克隆的并且在其两个末端导入了BstEII位点的卡那霉素抗性基因片段导入以获得质粒pT7KPKm，其中卡那霉素抗性基因插入到植生克雷伯氏菌的sucA基因的中央部分。
用于克隆卡那霉素抗性基因的引物如下。
(引物3)
5’TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT3’(SEQ ID NO：5)
(引物4)
5’CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG3’(SEQ ID NO：6)
然后，用KpnI裂解pT7KPKm，在该裂解位点，将从质粒pBR322(从Takara Shuzo购买)经过PCR克隆的并且在其两个末端导入了KpnI位点的四环素抗性基因片段导入以获得质粒pT7KPKmTc，其中卡那霉素抗性基因与插入的侧面四环素抗性基因一起插入到植生克雷伯氏菌的sucA基因的中央部分。
用于克隆四环素抗性基因的引物如下。
(引物5)
5’GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG3’(SEQ ID NO：7)
(引物6)
5’GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG3’(SEQ ID NO：8)
随后，用SacI和XbaI消化质粒pT7KPKmTc，以去除具有与插入的侧面四环素抗性基因一起插入到植生克雷伯氏菌的sucA基因的中央部分的卡那霉素抗性基因的DNA片段，并且将它插入到插入了革兰氏阴性细菌染色体的质粒载体pGP704(Marta Herrero等人，细菌学杂志，1990，172，p6557-6567)，所述质粒已经用SacI和XbaI消化以获得质粒pUTONOTK。
利用如上所述获得的质粒pUTONOTK，通过电击穿转化植生克雷伯氏菌AJ13399，和基于四环素抗性和卡那霉素抗性，选择其中通过sucA基因片段的同源重组将质粒pUTONOTK插入到染色体的菌株。从该菌株，基于四环素的敏感性和卡那霉素抗性进一步获得了失去sucA的植生克雷伯氏菌AJ13410菌株，其中用已经在中央部分插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因替代染色体上的sucA基因。
为了证实如上所述获得的AJ13410菌株缺乏αKGDH活性，通过Reed的方法确定它的酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法1969，13，p55-61)。结果，如表2所示，在AJ13410菌株中不能检测到αKGDH活性，从而证实该菌株缺乏需要的sucA。
           表2：αKGDH活性
  细菌菌株   αKGDH活性(ΔABS/分钟/毫克蛋白质)
  AJ13399AJ13410   0.101＜0.002
(5)评估缺乏αKGDH的植生克雷伯氏菌的L-谷氨酸生产率
在含有20毫升培养基的500毫升体积烧瓶中接种AJ13399和AJ13410菌株，该培养基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升7水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升五水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，30克/升碳酸钙，200毫克/升L-赖氨酸单盐酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和DL-α，ε-二氨基庚二酸(DAP)，在37℃振摇培养直到培养基中含有的葡萄糖耗尽。在完成培养后，测量在培养基中积累的L-谷氨酸和α-酮戊二酸(下文中简写为“αKG”)。表3显示了结果。
表3：L-谷氨酸和αKG的积累量
  细菌菌株   L-谷氨酸的积累量   αKG的积累量
  AJ13399AJ13410   0.0克/升12.8   0.0克/升1.5
缺乏αKGDH活性的AJ13410菌株积累12.8克/升L-谷氨酸，同时积累了1.5克/升αKG。
(6)在缺乏αKGDH的植生克雷伯氏菌中导入RSFCPG和评估L-谷氨酸的生产率
利用RSFCPG转化AJ13410，将获得的RSFCPG导入得到的菌株，AJ13410/RSFCPG接种到500毫升体积的烧瓶，该烧瓶含有20毫升培养基，该培养基中包括40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升7水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升五水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，25毫克/升四环素，30克/升碳酸钙，200毫克/升L-赖氨酸单盐酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和DL-α，ε-DAP，并在37℃振摇培养直到在培养基中含有的葡萄糖耗尽．在完成培养后，测量在培养基中积累的L-谷氨酸和αKG.表4显示了结果．
表4：L-谷氨酸和αKG的积累量
细菌菌株 L-谷氨酸的积累量  αKG的积累量
AJl3410AJl3410/RSFCPG     12.8克/升24.2     1.5克/升0.0
在通过导入RSFCPG扩增CF，PEPc和GDH活性的菌株中，αKG的积累量减少了，L-谷氨酸的积累量进一步提高。
序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>生产L-谷氨酸的细菌和生产L-谷氨酸的方法
<130>
<150>JP 10-69106
<151>1998-03-18
<150>JP 10-224909
<151>1998-08-07
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>特征
<222>(19)
<223>n＝a or c or g or t
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
 ccgggaattc ggtgacgtna artayca                               27
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
ggcgaattcg ggaacgggta sagytgytc                              29
<210>3
<211>1679
<212>DNA
<213>植生克雷伯氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1679)
<400>3
ggt gac gtg aaa tat cac atg ggc ttc tct tct gac atg gaa acc gaa 48
Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu
  1               5                  10                  15
ggc ggc ctg gtg cac ctg gcg ctg gcg ttt aac ccg tca cac ctc gaa 96

Claims (2)

1.生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养一种微生物，以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从培养基中收集L-谷氨酸，其中所述微生物是成团泛菌，并且被修饰使得其选自以下的至少一种酶活性增加：柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和谷氨酸脱氢酶。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物被修饰使得其中柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和谷氨酸脱氢酶活性增加。
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