ES2334592T3 - Bacteria productora de acido l-glutamico y procedimiento de producir acido l-glutamico. - Google Patents
Bacteria productora de acido l-glutamico y procedimiento de producir acido l-glutamico. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE ACIDO L GLUTAMICO QUE CONSISTE EN CULTIVAR UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO KLEBSIELLA, ERWINIA O PANTOEA, Y QUE TIENE LA CAPACIDAD DE PRODUCIR ACIDO GLUTAMICO, EN UN MEDIO DE CULTIVO, Y EN RECOGER EL ACIDO L - GLUTAMICO PRODUCIDO A PARTIR DEL MEDIO DE CULTIVO. LA CEPA MICROBIANA UTILIZADA ES PREFERIBLEMENTE UNA CEPA QUE REDUCE O ES DEFICIENTE EN UNA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA QUE CATALIZA UNA REACCION QUE SE BIFURCA A PARTIR DE UNA VIA METABOLICA DE BIOSINTESIS DE ACIDO L - GLUTAMICO Y QUE PRODUCE UN COMPUESTO DISTINTO DEL ACIDO L - GLUTAMICO, O BIEN UNA CEPA QUE INCREMENTA UNA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA QUE CATALIZA UNA REACCION PARA LA BIOSINTESIS DEL ACIDO GLUTAMICO.
Description
Bacteria productora de ácido
L-glutámico y procedimiento para producir ácido
L-glutámico.
La presente invención se refiere a una bacteria
productora de ácido L-glutámico y a un procedimiento
para producir ácido L-glutámico mediante
fermentación, utilizando la misma. El ácido
L-glutámico constituye un aminoácido importante
como alimento, medicamento y similares.
El ácido L-glutámico se ha
producido convencionalmente mediante procedimientos de fermentación
que utilizan las bacterias productoras de ácido
L-glutámico denominadas corineformes, que pertenecen
principalmente a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium
y Microbacterium o sus variantes ("Amino Acid
Fermentation", Gakkai Shuppan Center, págs
195-215, 1986). Como procedimientos para producir
ácido L-glutámico mediante fermentación, utilizando
otras cepas bacterianas, han existido procedimientos conocidos que
utilizan microorganismos de los géneros Bacillus,
Streptomyces, Penicillium y similares (patente US nº
3.220.929), procedimientos que utilizan microorganismos de los
géneros Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida y
similares (patente US nº 3.563.857), procedimientos que utilizan
las cepas variantes de Escherichia coli (solicitud de patente
japonesa abierta al público (KOKAI) nº 5-244970
(1993) deficientes en o que poseen una actividad
alfa-cetoglutárico deshidrogenasa reducida y que
tienen una actividad digestiva reducida del ácido
L-glutámico, y un procedimiento que utiliza cepas
variantes de Escherichia coli, cuya
alfa-cetoglutarato deshidrogenasa es deficiente o
está reducida y las actividades fosfoenolpiruvato carboxilasa y
glutamato deshidrogenasa es potenciada (EP 0 670 370 A).
Aunque la productividad del ácido
L-glutámico ha mejorado considerablemente criando
dichos microorganismos tal como se ha mencionado anteriormente, o
mejorando dichos procedimientos de producción, es deseable todavía
desarrollar un procedimiento más eficiente y menos caro para obtener
ácido L-glutámico para cumplir con la demanda
futura notablemente incrementada del aminoácido.
M. Regue et al., "Genetica Iberica"
Vol. 34, 1982, págs 223-234, da a conocer cepas de
K. pneumoniae C3 que adquirieron diversas características
fenotípicas conferidas por el plásmido S.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar nuevas bacterias productoras de ácido
L-glutámico que posean una alta capacidad para
producir ácido L-glutámico, desarrollando, por lo
tanto, un procedimiento menos caro y más eficiente para obtener el
ácido L-glutámico.
Para alcanzar el objetivo mencionado
anteriormente, en el contexto de la invención se investigaron
intensivamente y estudiaron microorganismos que presentaran la
capacidad para producir ácido L-glutámico que fueran
distintos de los microorganismos de los que se ha informado. Como
resultado, se descubrió que ciertas cepas derivadas de
microorganismos pertenecientes al género Klebsiella o al
género Erwinia presentaban una alta capacidad para producir
ácido L-glutámico, cumpliendo la presente
invención.
Así, la presente invención proporciona:
- (1)
- Un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, al género Erwinia o al género Pantoea, que posee la capacidad para producir ácido L-glutámico, y que presenta un aumento en la actividad de una enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico, cuando se compara con una cepa no transformada, aumentando el número de copias del gen de la enzima, en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico es, por lo menos, una que se selecciona de entre el grupo constituido por la citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
- (2)
- Un microorganismo según (1) que es Klebsiella planticola o Pantoea agglomerans.
- (3)
- Un microorganismo según (1) o (2), en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico incluye la totalidad de citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
- (4)
- Un microorganismo según cualquiera (de los apartados) 1 a 3, que muestra una disminución en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se compara con una cepa no mutada, o es deficiente en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia de dicha actividad.
- (5)
- Un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, al género Erwinia o al género Pantoea, que posee capacidad para producir ácido L-glutámico, y que disminuye en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se compara con una cepa no mutada, o es deficiente en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia de dicha actividad.
- (6)
- Un microorganismo según el apartado (5), que es Klebsiella planticola.
- (7)
- Un procedimiento para producir ácido L-glutámico que comprende el cultivo del microorganismo tal como se define en cualquiera de los apartados (1) a (6), en un medio líquido de cultivo para producir y acumular ácido L-glutámico en el medio de cultivo, y recuperar el ácido L-glutámico a partir del medio de cultivo.
A causa de que los microorganismos de la
presente invención poseen una alta capacidad para producir ácido
L-glutámico, se considera que es posible comunicar
otra capacidad de producción más alta al microorganismo, utilizando
las técnicas de cría conocidas previamente para las bacterias
corineformes productoras de ácido L-glutámico y
similares, esperando (de esta forma) contribuir al desarrollo de un
procedimiento más eficiente y más barato para la producción del
ácido L-glutámico mediante la selección apropiada de
las condiciones de cultivo y similares.
La figura 1 representa la construcción de un
plásmido pMWCPG con un gen gltA un gen ppc y un gen
gdhA.
La figura 2 representa la construcción de un
plásmido pMWG con el gen gdhA.
La figura 3 representa la construcción de un
plásmido pMWC con el gen gltA.
La figura 4 representa la construcción de un
plásmido RSF-Tet que tiene un origen de replicación
de un plásmido RSF1010 con un amplio espectro de huéspedes y un gen
de resistencia a la tetraciclina.
La figura 5 representa la construcción de un
plásmido RSFCPG que tiene un origen de replicación del plásmido
RSF1010 con un amplio espectro de huéspedes, el gen de resistencia a
la tetraciclina, el gen gltA, el gen ppc y el gen
gdhA.
La presente invención se explicará con mayor
detalle a continuación.
Se proporcionan a continuación los ejemplos de
los microorganismos pertenecientes a los géneros Klebsiella,
Erwinia o Pantoea que pueden utilizarse para la presente
invención.
\newpage
Más preferentemente, pueden mencionarse las
cepas bacterianas que se presentan a continuación:
Klebsiella planticola AJ13399
Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea
agglomerans AJ2666)
\vskip1.000000\baselineskip
La Klebsiella planticola AJ13399 se
depositó en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry, el 19 de
febrero de 1998, recibiendo el número de registro FERM
P-16646, siendo entonces transferida a un depósito
internacional bajo el Tratado de Budapest, el 11 de enero de 1999,
recibiendo el número de registro FERM BP-6616. Los
microorganismos que se clasificaron como Erwinia herbicola
se clasifican ahora como Pantoea agglomerans. Por
tanto, la Erwinia herbicola IAM1595 se denomina como
Pantoea agglomerans AJ2666, y se depositó en el National
Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency
of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry, el 25 de febrero de 1999, como un depósito
internacional bajo el Tratado de Budapest, recibiendo el número de
registro FERM BP-6660.
La Klebsiella planticola AJ13399 es una
cepa aislada del suelo en Sapporo-shi, Hokkaido,
Japón.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades fisiológicas de AJ13399 son las
siguientes:
- (1)
- Morfología celular: en forma de bastoncillo
- (2)
- Motilidad: ausente
- (3)
- Formación de esporas: ausente
- (4)
- Morfología de las colonias sobre agar nutriente LabM: circulares, superficie suave, color de crema, uniforme, elevada, y que ofrece una reflexión general de la superficie.
- (5)
- Ensayo OF de la glucosa: Positivo para capacidad de fermentación
- (6)
- tinción Gram-negativa
- (7)
- Comportamiento respecto al oxígeno: anaerobio facultativo
- (8)
- Catalasa: positiva
- (9)
- Oxidasa: negativa
- (10)
- Ureasa: positiva
- (11)
- Citocromo oxidasa: negativa
- (12)
- \beta-galactosidasa: positiva
- (13)
- Arginina deshidratasa: negativa
- (14)
- Ornitina decarboxilasa: negativa
- (15)
- Lisina decarboxilasa: positiva
- (16)
- Triptófano desaminasa: negativa
- (17)
- Reacción de Voges-Proskauer: positiva
- (18)
- Producción de indol: positiva
- (19)
- Producción de sulfuro de hidrógeno en medio de cultivo TSI: negativa
- (20)
- Capacidad de asimilación de ácido cítrico: positiva
- (21)
- Capacidad de asimilación del ácido m-hidroxibenceno: negativa
- (22)
- Licuefacción de la gelatina: negativa
- (23)
- Producción de ácidos a partir de azúcares:
- \quad
- Glucosa: positiva
- \quad
- Manitol: positiva
- \quad
- Ramnosa: positiva
- \quad
- Arabinosa: positiva
- \quad
- Sacarosa: positiva
- \quad
- Sorbitol: positiva
- \quad
- Inositol: positiva
- \quad
- Melibiosa: positiva
- \quad
- Amigdalina: positiva
- \quad
- Adonitol-peptona-agua: positiva
- \quad
- Celobiosa-peptona-agua: positiva
- \quad
- Dulcitol-peptona-agua: negativa
- \quad
- Rafinosa-peptona-agua: positiva
- (23)
- Temperatura de desarrollo: buen desarrollo a 37ºC, sin desarrollo a 45ºC.
A partir de estas propiedades bacteriológicas,
se determina que AJ13399 es Klebsiella planticola.
En el "Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, novena edición", Erwinia herbicola no se
describe y los microorganismos que se han clasificado como
Erwinia herbicola se clasifican como Pantoea
agglomerans. Así, los microorganismos que pertenecen al género
Erwinia y los microorganismos que pertenecen al género
Pantoea están relacionados estrechamente entre ellos. Por
tanto, cualquiera de los microorganismos que pertenecen al género
Erwinia y al género Pantoea pueden utilizarse en la
presente invención.
Al metabolismo de los azúcares por las bacterias
que pertenecen al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea
tales como las mencionadas anteriormente, se accede mediante la vía
de Embden-Meyerhof, y el piruvato que se produce en
esta vía es oxidado en el ciclo del ácido tricarboxílico en
condiciones aeróbicas. El ácido L-glutámico es
biosintetizado a partir del ácido
\alpha-cetoglutárico que constituye un
intermediario del ciclo del ácido tricarboxílico, por el GDH o la
glutamina sintetasa/glutamato sintasa. De este modo, estos
microorganismos comparten idéntica vía biosintética para el ácido
L-glutámico, y los microorganismos que pertenecen a
los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, se integran
en un concepto único según la presente invención. Por tanto, los
microorganismos que pertenecen a los géneros Klebsiella,
Erwinia o Pantoea distintos a las especies y cepas que
se mencionan específicamente antes, forman asimismo parte del
alcance de la presente invención.
El microorganismo de la presente invención es un
microorganismo que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o
Pantoea y que tiene una capacidad para producir el ácido
L-glutámico. La expresión "que tiene una capacidad
para producir ácido L-glutámico" tal como se
utiliza en la presente memoria, significa que tiene la capacidad
para acumular el ácido L-glutámico en un medio de
cultivo durante éste. La capacidad para producir ácido
L-glutámico puede ser una que posea una cepa de
tipo salvaje como propiedad suya, o una comunicada o potenciada por
la cría. Los ejemplos de microorganismos que pertenecen a los
géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, y que tienen
la capacidad para producir el ácido L-glutámico,
incluyen, por ejemplo, los microorganismos que aumentan la
actividad de la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis
del ácido L-glutámico, y los microorganismos que
disminuyen o son deficientes en la actividad de una enzima que
cataliza una reacción procedente de una vía para la biosíntesis del
ácido L-glutámico y que produce un compuesto
distinto del ácido L-glutámico. Los ejemplos del
microorganismo incluyen además los que aumentan la actividad de la
enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido
L-glutámico, y los que disminuyen o son deficientes
en la actividad de la enzima que cataliza la reacción que se
ramifica (procede) de la vía para la biosíntesis del ácido
L-glutámico y que produce el compuesto distinto del
ácido L-glutámico.
Las enzimas que catalizan la reacción para la
biosíntesis del ácido L-glutámico son GDH, CS y
PEPC. Como para el microorganismo de la presente invención, se
prefiere además que aumenten las actividades de la totalidad de los
tres tipos de enzimas, CS, PEPC y GDH. Si un microorganismo aumenta
la actividad de una enzima diana, el grado del aumento de la
actividad puede determinarse midiendo la actividad enzimática de un
extracto celular bacteriano o de una fracción purificada, y
comparándolo con el de una cepa de tipo salvaje o de una cepa
parental.
\newpage
El microorganismo de la presente invención, que
pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea,
y aumenta la actividad de la enzima que cataliza la reacción para
la biosíntesis del ácido L-glutámico, puede
obtenerse como, por ejemplo, una variante en la que se ha llevado a
cabo una mutación en un gen que codifique la enzima, o (como) una
cepa genética recombinante, utilizando cualquiera de los
microorganismos anteriormente citados como cepa parental
inicial.
Para potenciar la actividad de CS, PEPC o GDH,
por ejemplo, un gen que codifique CS, PEPC o GDH, puede clonarse en
un plásmido apropiado, y la cepa parental inicial anteriormente
mencionada como huésped puede transformarse con el plásmido
resultante. Esto puede aumentar el número de copias de cada uno de
los genes que codifican CS, PEPC y GDH (que se abrevian en adelante
como "gen gltA", "gen ppc" y "gen
gdhA", respectivamente), y como resultado, las
actividades de CS, PEPC y GDH, pueden aumentar.
Uno o dos o tres tipos que se seleccionan a
partir de los genes gltA, ppc y gdhA clonados, en
cualquier combinación, se introducen en la cepa parental inicial
mencionada anteriormente. Cuando dos o tres tipos de los genes se
introducen, los dos o tres tipos de los genes son clonados en un
tipo de plásmido, e introducidos en el huésped, o se clonan de
forma separada en dos o tres tipos de plásmidos que pueden existir
en el mismo huésped, introduciéndolos en éste.
El plásmido no está limitado particularmente,
siempre que pueda replicarse autónomamente en un microorganismo que
pertenezca al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea.
Los ejemplos de plásmidos incluyen, por ejemplo, puC19, puC18,
pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118,
pMW219, pMW218 y similares. Además de estos plásmidos, pueden
utilizarse también vectores de ADN fágico.
La transformación puede obtenerse mediante, por
ejemplo, el procedimiento de D.M. Morrison (Methods in Enzymology
68, 326 (1979)), el procedimiento de aumento de la permeabilidad de
las células receptoras para el ADN con cloruro cálcico (Mandel, M.
y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), o similares.
Las actividades de CS, PEPC y GDH pueden
aumentarse asimismo utilizando copias múltiples de los genes
gltA, ppc y/o el gen gdh que se encuentran en
el ADN cromosómico de la cepa parental inicial como huésped. Para
introducir copias múltiples del gen gltA, ppc y/o el
gen gdhA en un ADN cromosómico de un microorganismo que
pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea,
pueden utilizarse las secuencias presentes en el ADN cromosómico en
un número múltiple de copias tal como en el ADN repetitivo, y en las
repeticiones inversas que se encuentran en el extremo de factores
de transposición. Alternativamente, pueden también introducirse
copias múltiples de los genes en un ADN cromosómico, utilizando la
transposición de transposones que transportan el gen gltA,
ppc o el gen gdhA. Estas técnicas pueden aumentar el
número de copias de los genes gltA, ppc o gdhA
en las células transformantes, aumentando, como resultado, las
actividades de CS, PEPC y GDH.
Pueden utilizarse cualesquiera organismos como
fuente de los genes gltA, ppc o gdhA utilizados
para aumentar el número de copias, siempre que los organismos
muestren actividades CS, PEPC y GDH. Entre dichos organismos,
resultan preferidas las bacterias, es decir, procariotas, tales como
las bacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter,
Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia,
Corynebacterium, Brevibacterium o Bacillus. Como ejemplo
específico, puede mencionarse Escherichia coli. Los genes
gltA, ppc y gdhA pueden obtenerse a partir de
un ADN cromosómico de dichos microorganismos tal como se ha
mencionado anteriormente.
El gene gltA, el gen ppc y el gen
gdhA pueden obtenerse cada uno a partir de un ADN cromosómico
de cualquiera de los microorganismos anteriormente mencionados,
aislando un fragmento de ADN que complemente la auxotrofia de una
cepa variante a la que le falte la actividad CS, PEPC o GDH.
Alternativamente, debido a que las secuencias nucleótidas de estos
genes de las bacterias de los géneros Escherichia o
Corynebacterium ya se han dilucidado (Biochemistry, Vol. 22,
páginas 5243-5249, 1983; J. Biochem. Vol. 95,
págs 909-916, 1984; Gene, Vol. 27, págs
193-199, 1984; Microbiology, Vol. 140; págs
1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet. Vol. 218, págs
330-339, 1989; y Molecular Microbiology, Vol. 6,
págs 317-326, 1992), los genes pueden obtenerse
mediante PCR, utilizando cebadores sintetizados basándose en cada
una de las secuencias nucleótidas dilucidadas, y en el ADN
cromosómico como matriz.
La actividad de CS, PEPC o GDH puede también
aumentarse mediante (otro procedimiento) que la amplificación
génica mencionada anteriormente, potenciando la expresión del gen
gltA, del gen ppc o del gdhA. Por ejemplo, la
expresión se potencia reemplazando el promotor del gen gltA,
del gen ppc o del gen gdhA con otro promotor más
intenso. Los ejemplos de dichos promotores más intensos incluyen,
por ejemplo, un promotor lac, un promotor trp, un
promotor trc, un promotor tac, un promotor P_{R} y
un promotor P_{L} del fago lambda y similares. El gen gltA,
el gen ppc o el gen gdhA del cual se ha sustituido el
promotor, es clonado en un plásmido e introducido en un
microorganismo huésped, o introducido en un ADN cromosómico del
microorganismo huésped utilizando un ADN repetitivo, una repetición
inversa, u un transposón o similar.
Las actividades de CS, PEPC o GDH pueden también
aumentarse t reemplazando el promotor del gen gltA, del gen
ppc, o del gen gdhA en un cromosoma con otro promotor
más intenso (véase WO 87/03006, y la solicitud de patente japonesa
abierta al público (KOKAI) nº 61-268183 (1986)), o
insertando un promotor más intenso por encima de cada secuencia
codificante de los genes (véase Gene, 29, págs
231-241, 1984). Específicamente, estas
(actividades) se alcanzan mediante recombinación homóloga entre el
gen gltA, el gen ppc, o el gen gdhA del cual
se reemplaza un promotor con un promotor más intenso o un ADN que
contiene una parte de ellos, y un gen correspondiente en el
cromosoma.
Los ejemplos específicos del microorganismo que
pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea del
cual la actividad CS, PEPC o GDH ha aumentado, incluyen, por
ejemplo, Klebsiella planticola ATJ13399/RSFCPG, y Erwinia
herbicola IAM1595/RSFCPG.
La enzima que cataliza la reacción que proviene
de la vía de la biosíntesis del ácido L-glutámico y
que produce el compuesto distinto del ácido
L-glutámico, es \alphaKGDH.
Para obtener dicha disminución o deficiencia de
la actividad enzimática en un microorganismo que pertenece al
género Klebsiella, Erwinia o Pantoea, tal como se ha
mencionado anteriormente, puede introducirse una mutación en un gen
que codifique la enzima mediante una técnica convencional de
mutagénesis, como una técnica de ingeniería genética, mutación que
provoque la disminución o deficiencia de dicha actividad
enzimática.
Los ejemplos de la técnica de mutagénesis
incluyen, por ejemplo, el procedimiento que utiliza la irradiación
de rayos X o de la luz ultravioleta, el procedimiento que utiliza el
tratamiento con u un agente mutagénico cono la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
y similares. El sitio génico en el que se introduce una mutación
puede ser una región codificante que codifique una proteína
enzimática, o una región reguladora de la expresión, tal como un
promotor.
Los ejemplos de la técnica de ingeniería
genética incluyen, por ejemplo, la recombinación genética, la
transducción genética, la fusión celular y similares. Por ejemplo,
se inserta un gen de resistencia a los medicamentos en un gen
diana, para producir un gen funcionalmente inactivado (gen
defectuoso). Entonces, este gen defectuoso se introduce en una
célula de un microorganismo que pertenece al género Klebsiella,
Erwinia o Pantoea, y el gen diana en un cromosoma es
reemplazado con el gen defectuoso mediante recombinación homóloga
(interrupción génica).
Puede determinarse si un microorganismo
disminuye la actividad de una enzima diana o si es defectuoso en la
actividad, o el grado de disminución de ésta, midiendo la actividad
enzimática de un extracto celular bacteriano o de una fracción
purificada de una cepa candidata y comparándola con la de una cepa
de tipo salvaje o de una cepa parental. La actividad enzimática de
\alphaKGDH puede medirse, por ejemplo, mediante el procedimiento
de Reed et al (L.J. Reed y B. B. Mukherjee, Methods in
Enzymology 1969,13, págs 55-61).
Dependiendo de la enzima diana, puede
seleccionarse una variante diana basándose en un fenotipo de la
variante. Por ejemplo, una variante que es defectuosa en la
actividad \alphaKGDH o disminuye la actividad, no puede
desarrollarse en un medio mínimo que contenga glucosa, o en un medio
mínimo que contenga ácido acético o ácido
L-glutámico como fuente exclusiva de carbono, o que
muestre una notable reducción del crecimiento bajo condiciones
aeróbicas. Sin embargo, incluso bajo idénticas condiciones, puede
mostrar un crecimiento normal añadiendo ácido succínico o lisina,
metionina y diaminopimelato al medio mínimo que contiene glucosa.
Basándose en estos fenómenos, puede seleccionarse una variante que
sea defectuosa en la actividad \alphaKGDH o la disminuya.
En el documento WO95/34672, se detalla un
procedimiento para producir una cepa de Brevibacterium
lactofermentum a la que le falta el gen \alphaKGDH, que se
basa en la recombinación homogénea, y un procedimiento similar
puede utilizarse para los microorganismos que pertenecen a a los
géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea.
Además, en Molecular Cloning, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Press (1989) y similares, se detallan procedimientos
de clonación genética, fragmentación y unión del ADN, transformación
y similares.
Un ejemplo de la cepa variante que es defectuosa
en la actividad \alphaKGDH o disminuye la actividad obtenida, tal
como se ha descrito anteriormente, es Klebsiella planticola
AJ13410. La Klebsiella planticola AJ13410 se depositó en el
National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry, el 19 de
febrero de 1998, recibiendo el número de registro FERM
P-16647, siendo entonces transferida a un depósito
internacional bajo el tratado de Budapest, el 11 de enero de 1999,
recibiendo el número de registro FERM BP-6617.
Las cepas bacterianas que pertenecen a los
géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea y que disminuyen
la actividad de \alphaKGDH o son defectuosas en ella, o las que
aumentan la actividad de CS, PEPC o GDH, que se obtuvieron tal como
se ha descrito anteriormente, tendrán la capacidad para producir
ácido L-glutámico tal como se muestra en los
ejemplos que siguen a continuación.
Como para los microorganismos que pertenecen al
género Escherichia, que se clasifica dentro de las bacterias
entéricas como los géneros Klebsiella, Erwinia o
Pantoea, se ha conocido que las cepas que disminuyen la
actividad de \alphaKDGH o son defectuosas en ella, pueden producir
ácido L-glutámico (solicitud de patente japonesa
abierta al público nº 5-244970 (1993)), que las
cepas que disminuyen la actividad de \alphaKDGH o son defectuosas
en su actividad y aumentan las actividades de PEPC y GDH, pueden
producir otro aumento de la cantidad de ácido
L-glutámico (solicitud de patente japonesa abierta
al público nº 7-203980 (1995)), y que las cepas que
muestran sensibilidad a la valina y y potenciación de las
actividades de CS y GDH, pueden producir ácido
L-glutámico (WO97/08294).
Como para los microorganismos que pertenecen al
género Enterobacter, que se clasifica de manera similar en
las bacterias entéricas, en el contexto de la presente invención se
descubrió que las cepas que disminuyen la actividad de \alphaKGDH
o son defectuosas en la actividad, o las cepas que aumentan las
actividades de PEPC, GDH y CS, pueden producir ácido
L-glutámico (solicitud de patente japonesa abierta
al público nº 10-69068 (1998).
Además, como también para los microorganismos
que pertenecen al género Serratia, se descubrió en el
contexto de la presente invención que las cepas que mostraban
potenciación de las actividades de PEPC, GDH y CS, pueden producir
ácido L-glutámico (solicitud de patente japonesa nº
10-69068 (1998)).
A partir de estos hechos, se deduce fácilmente,
como para las bacterias que pertenecen a los géneros Klebsiella,
Erwinia, Pantoea, Escherichia, Enterobacter o Serratia
distintas a las cepas que se describen en los Ejemplos, que las
cepas que disminuyen la actividad de \alphaKGDH o que son
defectuosas en la actividad, o las cepas que aumentan las
actividades de PEPC, GDH y CS, pueden producir ácido
L-glutámico. Tal como se demuestra en los ejemplos,
se apoya fuertemente que el hecho de que la capacidad para producir
ácido L-glutámico pueda comunicarse a Klebsiella
planticola AJ13399 suprimiendo \alphaKGDH, (hace posible) que
pueda aplicarse a las otras bacterias de los géneros Klebsiella,
Erwinia o Pantoea.
El ácido L-glutámico puede
producirse cultivando el microorganismo que pertenece a los géneros
Klebsiella, Erwinia o Pantoea, y que posee la
capacidad para producir ácido L-glutámico en un
medio líquido de cultivo, para obtener y acumular ácido
L-glutámico en el medio, y recuperarlo a partir de
éste.
El medio de cultivo puede ser un medio
nutricional ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente
de nitrógeno, y sales inorgánicas, así como nutrientes orgánicos
tales como aminoácidos, vitaminas y similares, tal como se
requieran. Puede ser un medio sintético o uno natural. Puede
utilizarse para el medio de cultivo cualquier fuente de carbono y
de nitrógeno, siempre que pueda utilizarse por el microorganismo que
va a ser cultivado.
La fuente de carbono puede ser un sacárido tal
como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa,
galactosa, hidrolizados de almidón, molasas y similares. Además,
pueden también utilizarse solos un ácido orgánico tal como ácido
acético y ácido cítrico, o en combinación con otras fuentes de
carbono.
La fuente de nitrógeno puede ser amoníaco, sales
amónicas tales como sulfato amónico, carbonato amónico, cloruro
amónico, fosfato amónico y acetato amónico, nitratos y
similares.
Como nutrientes orgánicos en pequeñas
cantidades, pueden utilizarse aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos,
ácidos nucleicos, materiales que los contengan, como peptona,
casaminoácidos, extracto de levadura, y productos de la
descomposición de las proteínas de la soja y similares, y cuando se
emplea una variante auxotrófica que requiere un aminoácido o
similar para su desarrollo, es necesario complementar el nutriente
requerido.
Como sales inorgánicas, se utilizan fosfatos,
sales magnésicas, sales cálcicas, sales de hierro, sales de
manganeso y similares.
Como para las condiciones del cultivo, éste
puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas a una temperatura
de entre 20 y 42ºC y un pH de 4 a 8. El cultivo puede prolongarse
durante 10 horas a 4 días, para acumular una cantidad considerable
de ácido L-glutámico en el medio líquido de
cultivo.
Después de que el cultivo finalice, el ácido
L-glutámico que se acumule en el medio de cultivo
puede ser recuperado mediante un procedimiento conocido. Por
ejemplo, puede aislarse mediante un procedimiento que comprende la
concentración del medio después de eliminar las células para
cristalizar el producto, la cromatografía de intercambio iónico, o
similar.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará más
específicamente haciendo referencia a los ejemplos siguientes.
El procedimiento para la construcción de un
plásmido que posea un gen gltA, un gen ppc y un gen
gdhA se explicará haciendo referencia a las figuras 1, 2 y
3.
Un plásmido pBRGDH que posee un gen gdhA
derivado de Escherichia coli (solicitud de patente japonesa
abierta al público (KOKAI) nº 7-203980(1995))
se sometió a digestión con HindIII y SphI, y ambos
extremos se redondearon mediante un tratamiento con T4 ADN
polimerasa. Entonces, un fragmento de ADN que contenía el gen
gdhA se purificó y recuperó. Por otra parte, un plásmido
pMWCP que posee un gen gltA y un gen ppc derivado de
Escherichia coli (WO97/08294), fue sometido a digestión con
XbaI, y ambos extremos se redondearon mediante un
tratamiento con T4 ADN polimerasa. Éste se mezcló con el fragmento
de ADN que posee el gen gdhA purificado anteriormente, y se
unió con T4 ligasa, dando lugar a un plásmido pMWCPG, que
corresponde al pMWCP que transporta ulteriormente el gen
gdhA (Figura 1).
Un fragmento de ADN que posee el gen
gdhA, obtenido mediante digestión de pBRGDH con
HindIII y SalI, se purificó y recuperó, y se
introdujo en el sitio HindIII-SalI de un plásmido
pMW219 (obtenido de Nippon Gene), para obtener un plásmido pMWG
(Figura 2). Además, un plásmido pTWVC con el gen gltA
derivado de Escherichia coli (WO97/08294), se sometió a
digestión con HindIII y EcoRI, y el fragmento
resultante de ADN con el gen gltA se purificó y recuperó, y
se introdujo en el sitio HindIII-EcoRI del plásmido
pMW219 para obtener un plásmido pMWC (Figura 3).
Al mismo tiempo, un producto obtenido mediante
digestión con NotI de un plásmido pVIC40 que posee un origen
de replicación de un plásmido RSF1010 con un amplio espectro de
huéspedes (Solicitud de patente japonesa abierta al público (KOKAI)
nº 8-047397 (1996)), con NotI, seguido por un
tratamiento con T4 ADN polimerasa y digestión mediante PstI,
y un producto obtenido mediante digestión de PBR322 con EcoT14l,
seguido por un tratamiento con T4 ADN polimerasa y digestión con
PstI, se mezclaron y unieron con T4 ligasa para obtener un
plásmido RSF-Tet, que posee el origen de
replicación de RSF1010 y un gen de resistencia a la tetraciclina
(fig 4).
Entonces, el pMWCPG se sometió a digestión con
EcoRI y PstI, purificándose y recuperándose un
fragmento de ADN que poseía el gen gltA, el gen ppc y
el gen gdhA. De modo similar, el RSF-Tet se
sometió a digestión con EcoRI y PstI, y un fragmento
de ADN con el origen de replicación de RSF1010 se purificó y
recuperó. Estos fragmentos de ADN se mezclaron y unieron con T4
ligasa para obtener un plásmido RSFCPG compuesto por
RSF-Tet que transportaba el gen gltA, el gen
ppc y el gen gdhA (figura 5). La expresión del gen
gltA, del gen ppc y del gen gdhA por el
plásmido resultante RSFCPG, se confirmó basándose en la
complementación de la auxotrofía de las cepas de Escherichia
coli a las que faltaba el gen gltA, el gen ppc y
el gen gdhA, y la medición de cada actividad enzimática.
De modo similar, se confirmó la expresión por
pMWG o pMWC del gen gdhA o del gen gltA, basándose en
la complementación de la auxotrofia de las cepas de Escherichia
coli a las que faltaba el gen gltA, o el gen
gdhA, y la medición de cada actividad enzimática.
La Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea
agglomerans AJ2666) y la Klebsiella planticola AJ13399 se
transformaron con el RSFCPG, pMWC y pMWG mediante electroporación
(Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics;
Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992), para
obtener transformantes que muestren resistencia a la
tetraciclina.
Cada uno de los transformantes resultantes y las
cepas parentales se inocularon en un tubo de ensayo de gran tamaño
de un volumen de 50 ml, que contenía 5 ml de un medio de cultivo que
comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de
heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l de dihidrogenofosfato
potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de heptahidrato
cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato ferroso, 0,02 g/l
de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l de dihidrato sulfato
de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato cúprico, 0,72 mg/l de
hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l
de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de extracto de levadura, y 30
g/l de carbonato de calcio, y que se cultivaron a 37ºC con
agitación, hasta que la glucosa contenida en el medio de cultivo se
consumió. Al medio de cultivo de los transformantes, se le
añadieron 25 mg/l de tetraciclina. Después de que el cultivo
finalizó, se midió el ácido L-glutámico acumulado
en el medio de cultivo. Los resultados se presentan en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mientras que Erwinia herbicola IAM1595 y
Klebsiella planticola AJ13399 no acumularon ácido
L-glutámico, las cepas cuyas actividades CS, PEPC y
GDH se amplificaron introduciendo RSFCPG, acumularon 5,0 g/l y 3,1
g/l de ácido L-glutámico, respectivamente. La cepa
AJ13399 de la cual se amplificó sólo la actividad CS, acumuló 2,5
g/l de ácido L-glutámico, y la cepa de la cual sólo
se amplificó la actividad GDH, acumuló también 0,8 g/l de ácido
L-glutámico.
\newpage
La clonación de un fragmento que tiene una parte
del gen \alphaKGDH de Klebsiella planticola AJ13399 se
llevó a cabo mediante PCR, utilizando oligonucleótidos, cada uno de
los cuales tiene una secuencia nucleótida de una región homóloga
del gen \alphaKGDH de los organismos de cuyas secuencias
nucleótidas se había ya informado, es decir, Azotobacter
vinelandii, Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Corynebacterium glutamicum, Haemophilus influenzae, la humana y
Saccharomyces cerevisiae (Eur. J. Biochem., Vol. 187, págs
235-239, 1990; Mol. Gen. Genet., Vol. 234, págs
285-296, 1992; Eur. J. Biochem. Vol. 141, págs
351-359. 1984; Microbiology, Vol. 142, págs
3347-3354, 1996; Science, Vol. 269, págs
496-512, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89,
págs 1963-1967, 1992; y Mol. Cel. Biol. Vol. 9, págs
2695-2705, 1989), y un sitio EcoRI como
cebadores.
Específicamente, las siguientes (secuencias) se
utilizan como cebadores.
El ADN cromosómico de la Klebsiella
planticola AJ13399 que se utilizó como una matriz de PCR se
aisló mediante el mismo procedimiento que el utilizado
convencionalmente para extraer el ADN cromosómico de Escherichia
coli (Seibutsu Kogaku Jikken-sho (Textbook of
Bioengineering Experiments), Editado por la Society of Fermentation
and Bioengineering, Japón, págs 97-98, Baifukan,
1992).
La PCR se llevó a cabo con un ciclo consistente
en 94ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto, y 73ºC durante 3
minutos, que se repitió durante 30 ciclos, sometiéndose a digestión
con EcoRI el fragmento de ADN resultante, que se insertó en
un plásmido vectorial pT7Blue digerido con EcoRI, para
obtener un plásmido recombinante pT7KP. El plásmido vectorial
pT7Blue (resistente a la ampicilina) que se utilizó fue un producto
comercial de Novagen.
La secuencia nucleótida del ADN del fragmento
clonado y la secuencia aminoácida codificada por la secuencia, se
muestran en SEC ID nº:3. La misma secuencia aminoácida se representa
de forma única en SEC ID nº:4. La secuencia mostró un 82,3% de
homología con el gen de la subunidad \alphaKGDH-E1
de Escherichia coli (al que se hace referencia en adelante
como "gen sucA"), y que es reconocido claramente como
parte del gen sucA de Klebsiella planticola AJ13399.
En la secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:3, los
números de nucleótidos 18-1659 derivan del gen
sucA, y los números de nucleótidos 0-17 y
1660-1679 derivan de los cebadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cepa de Klebsiella planticola
deficiente en \alphaKGDH se obtuvo mediante recombinación
homóloga, utilizando el fragmento que posee una parte del gen
sucA de Klebsiella planticola obtenido tal como se ha
descrito anteriormente.
En primer lugar, pT7KP fue digerido con
BstEII y, en este sitio de fragmentación, un fragmento del
gen resistente a la kanamicina, que se había clonado mediante PCR a
partir de un plásmido pNEO (obtenido de Pharmacia) y en ambos
extremos del cual se introdujeron sitios BstEII, se introdujo
para obtener un plásmido pT7KPKm, en el cual el gen de resistencia
a la kanamicina se insertó en la parte central del gen sucA
de Klebsiella planticola.
Los cebadores utilizados para la clonación del
gen de resistencia a la kanamicina fueron los siguientes:
Entonces, el pT7KPKm se fragmentó con
KpnI y, en este sitio fragmentado, un fragmento del gen
resistente a la tetraciclina, que se había clonado mediante PCR a
partir de un plásmido pBR322 (obtenido de Takara Shuzo) y en ambos
extremos del cual se introdujeron sitios KpnI, se introdujo
para obtener un plásmido pT7KPKmTc, en el cual el gen de
resistencia a la kanamicina se insertó en la parte central del gen
sucA de Klebsiella planticola, junto con el gen
franqueante de resistencia a la tetraciclina, insertado.
\newpage
Los cebadores utilizados para la clonación del
gen de resistencia a la tetraciclina fueron los siguientes:
A continuación, el plásmido pT7KPKmTc fue
sometido a digestión con SacI y XbaI para seccionar un
fragmento de ADN que poseía el gen de resistencia a la kanamicina
insertado en la parte central del gen sucA de Klebsiella
planticola, junto con el gen flanqueante insertado de
resistencia a la tetracilina, insertándose éste en un vector
plasmídico pGP704 insertado en el cromosoma de una bacteria
gram-negativa (Marta Herrero et al., Journal
of Bacteriology, 1990, 172, págs 6557-6567) y
digerido con SacI y XbaI para obtener un plásmido
pUTONOTK.
Utilizando el plásmido pUTONOTK obtenido tal
como se ha descrito anteriormente, Klebsiella planticola
AJ13399 se transformó mediante electroporación, seleccionándose una
cepa en la que el plásmido pUTONOTK se insertó en el cromosoma
mediante recombinación homogénea del fragmento del gen sucA,
basándose en la resistencia a la tetraciclina y a la kanamicina. A
partir de esta cepa, se obtuvo posteriormente una cepa de
Klebsiella planticola AJ13410 en la que faltaba sucA,
en la que el gen sucA en el cromosoma fue reemplazado con el
gen sucA en el que el gen de resistencia a la kanamicina se
insertó en la parte central, basándose en la sensibilidad a la
tetraciclina y en la resistencia a la kanamicina.
Para confirmar que la cepa AJ13410 obtenida tal
como se ha descrito anteriormente, era deficiente en la actividad
\alphaKGDH, se determinó su actividad enzimática mediante el
procedimiento de Reed (L.J. Reed y B.B. Mukherjee, Methods in
Enzymology 1969, 13, págs 55-61). Como resultado, la
actividad \alphaKGDH no pudo detectarse en la cepa AJ13410, tal
como se muestra en la Tabla 2, y de esta forma se confirmó que en la
cepa faltaba el sucA tal como se deseaba.
Cada una de las cepas AJ13399 y AJ13410 se
inoculó en un matraz de un volumen de 500 ml que contenía 20 ml de
un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de
sulfato amónico, 0,5 g/l de heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l
de dihidrogenofosfato potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l
de heptahidrato cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato
ferroso, 0,02 g/l de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l
de dihidrato sulfato de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato
cúprico, 0,72 mg/l de hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de
ácido bórico, 1,2 mg/l de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de
extracto de levadura, 30 g/l de carbonato de calcio, 200 mg/l de
monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de
L-metionina, y ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico
(DAP), y se cultivaron a 37ºC con agitación, hasta que la glucosa
contenida en el medio de cultivo se consumió. Después de que el
cultivo finalizó, se midieron el ácido L-glutámico
y el ácido \alpha-cetoglutárico (abreviado como
"\alphaKG" en adelante) acumulados en el medio de cultivo.
Los resultados se representan en la Tabla 3.
La cepa AJ13410 deficiente en la actividad
\alphaKGDH acumuló 12,8 g/l de ácido L-glutámico,
y acumuló simultáneamente 1,5 g/l de \alphaKG.
La cepa AJ13410 se transformó con el RSFCPG, y
la cepa resultante en la que se introdujo RSFCPG, AJ13410/
RSFCPG, se inoculó en un matraz de un volumen de 500 ml que contenía 20 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l de dihidrogenofosfato potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de heptahidrato cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato ferroso, 0,02 g/l de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l de dihidrato sulfato de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato cúprico, 0,72 mg/l de hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de extracto de levadura, 25 mg/l de tetraciclina, 30 g/l de carbonato de calcio, 200 mg/l de monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, y ácido DL-\alpha,\varepsilon-DAP, y se cultivaron a 37ºC con agitación, hasta que la glucosa contenida en el medio de cultivo se consumió. Después de que el cultivo finalizó, se midieron el ácido L-glutámico y el ácido \alphaKG acumulados en el medio de cultivo. Los resultados se presentan en la Tabla 4.
RSFCPG, se inoculó en un matraz de un volumen de 500 ml que contenía 20 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l de dihidrogenofosfato potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de heptahidrato cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato ferroso, 0,02 g/l de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l de dihidrato sulfato de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato cúprico, 0,72 mg/l de hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de extracto de levadura, 25 mg/l de tetraciclina, 30 g/l de carbonato de calcio, 200 mg/l de monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, y ácido DL-\alpha,\varepsilon-DAP, y se cultivaron a 37ºC con agitación, hasta que la glucosa contenida en el medio de cultivo se consumió. Después de que el cultivo finalizó, se midieron el ácido L-glutámico y el ácido \alphaKG acumulados en el medio de cultivo. Los resultados se presentan en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
En la cepa de la cual las actividades CS, PEPC y
GDH se amplificaron introduciendo RSFCPG, la cantidad acumulada de
\alphaKG se redujo, y la cantidad acumulada de ácido
L-glutámico mejoró posteriormente.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bacteria que produce ácido
L-glutámico y procedimiento para producir ácido
L-glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-53127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-69106
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-03-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-224909
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-08-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=a o c o g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggaattc ggtgacgtna artayca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgaattcg ggaacgggta sagytgytc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella planticola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1679)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella planticola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactgggtca cctgacagct tatcatcgat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttcggtga ccaccaaagc ggccatcgtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtaccca aataggcgta tcacgag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtacccg cgatggatat gttctg
\hfill26
Claims (7)
1. Microorganismo que pertenece al género
Klebsiella, al género Erwinia o al género
Pantoea, que presenta la capacidad para producir ácido
L-glutámico, y que presenta la actividad aumentada
de una enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido
L-glutámico cuando se compara con una cepa no
transformada aumentando el número de copias del gen de la enzima,
en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del
ácido L-glutámico es por lo menos una de entre el
grupo constituido por la citrato sintasa, fosfoenolpiruvato
carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
2. Microorganismo según la reivindicación 1 que
es Klebsiella planticola o Pantoea agglomerans.
3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del
ácido L-glutámico incluye la totalidad de la citrato
sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato
deshidrogenasa.
4. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que presenta la actividad disminuida de la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se
compara con una cepa no mutada, o es deficiente en la actividad de
la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa
introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia
de dicha actividad.
5. Microorganismo que pertenece al género
Klebsiella, al género Erwinia o al género
Pantoea, que presenta capacidad para producir ácido
L-glutámico, y que disminuye en la actividad de la
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se
compara con una cepa no mutada, o es deficiente en una actividad de
la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa
introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia
de dicha actividad.
6. Microorganismo según la reivindicación 5, que
es la Klebsiella planticola.
7. Procedimiento para producir ácido
L-glutámico que comprende el cultivo del
microorganismo tal como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en un medio de cultivo líquido, para producir
y acumular ácido L-glutámico en el medio de
cultivo, y recoger el ácido L-glutámico del medio de
cultivo.
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