ES2334592T3 - Bacteria productora de acido l-glutamico y procedimiento de producir acido l-glutamico. - Google Patents

Bacteria productora de acido l-glutamico y procedimiento de producir acido l-glutamico. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE ACIDO L GLUTAMICO QUE CONSISTE EN CULTIVAR UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO KLEBSIELLA, ERWINIA O PANTOEA, Y QUE TIENE LA CAPACIDAD DE PRODUCIR ACIDO GLUTAMICO, EN UN MEDIO DE CULTIVO, Y EN RECOGER EL ACIDO L - GLUTAMICO PRODUCIDO A PARTIR DEL MEDIO DE CULTIVO. LA CEPA MICROBIANA UTILIZADA ES PREFERIBLEMENTE UNA CEPA QUE REDUCE O ES DEFICIENTE EN UNA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA QUE CATALIZA UNA REACCION QUE SE BIFURCA A PARTIR DE UNA VIA METABOLICA DE BIOSINTESIS DE ACIDO L - GLUTAMICO Y QUE PRODUCE UN COMPUESTO DISTINTO DEL ACIDO L - GLUTAMICO, O BIEN UNA CEPA QUE INCREMENTA UNA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA QUE CATALIZA UNA REACCION PARA LA BIOSINTESIS DEL ACIDO GLUTAMICO.

Description

Bacteria productora de ácido L-glutámico y procedimiento para producir ácido L-glutámico.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a una bacteria productora de ácido L-glutámico y a un procedimiento para producir ácido L-glutámico mediante fermentación, utilizando la misma. El ácido L-glutámico constituye un aminoácido importante como alimento, medicamento y similares.
El ácido L-glutámico se ha producido convencionalmente mediante procedimientos de fermentación que utilizan las bacterias productoras de ácido L-glutámico denominadas corineformes, que pertenecen principalmente a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium y Microbacterium o sus variantes ("Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, págs 195-215, 1986). Como procedimientos para producir ácido L-glutámico mediante fermentación, utilizando otras cepas bacterianas, han existido procedimientos conocidos que utilizan microorganismos de los géneros Bacillus, Streptomyces, Penicillium y similares (patente US nº 3.220.929), procedimientos que utilizan microorganismos de los géneros Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida y similares (patente US nº 3.563.857), procedimientos que utilizan las cepas variantes de Escherichia coli (solicitud de patente japonesa abierta al público (KOKAI) nº 5-244970 (1993) deficientes en o que poseen una actividad alfa-cetoglutárico deshidrogenasa reducida y que tienen una actividad digestiva reducida del ácido L-glutámico, y un procedimiento que utiliza cepas variantes de Escherichia coli, cuya alfa-cetoglutarato deshidrogenasa es deficiente o está reducida y las actividades fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa es potenciada (EP 0 670 370 A).
Aunque la productividad del ácido L-glutámico ha mejorado considerablemente criando dichos microorganismos tal como se ha mencionado anteriormente, o mejorando dichos procedimientos de producción, es deseable todavía desarrollar un procedimiento más eficiente y menos caro para obtener ácido L-glutámico para cumplir con la demanda futura notablemente incrementada del aminoácido.
M. Regue et al., "Genetica Iberica" Vol. 34, 1982, págs 223-234, da a conocer cepas de K. pneumoniae C3 que adquirieron diversas características fenotípicas conferidas por el plásmido S.
Sumario de la invención
El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar nuevas bacterias productoras de ácido L-glutámico que posean una alta capacidad para producir ácido L-glutámico, desarrollando, por lo tanto, un procedimiento menos caro y más eficiente para obtener el ácido L-glutámico.
Para alcanzar el objetivo mencionado anteriormente, en el contexto de la invención se investigaron intensivamente y estudiaron microorganismos que presentaran la capacidad para producir ácido L-glutámico que fueran distintos de los microorganismos de los que se ha informado. Como resultado, se descubrió que ciertas cepas derivadas de microorganismos pertenecientes al género Klebsiella o al género Erwinia presentaban una alta capacidad para producir ácido L-glutámico, cumpliendo la presente invención.
Así, la presente invención proporciona:
(1)
Un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, al género Erwinia o al género Pantoea, que posee la capacidad para producir ácido L-glutámico, y que presenta un aumento en la actividad de una enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico, cuando se compara con una cepa no transformada, aumentando el número de copias del gen de la enzima, en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico es, por lo menos, una que se selecciona de entre el grupo constituido por la citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
(2)
Un microorganismo según (1) que es Klebsiella planticola o Pantoea agglomerans.
(3)
Un microorganismo según (1) o (2), en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico incluye la totalidad de citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
(4)
Un microorganismo según cualquiera (de los apartados) 1 a 3, que muestra una disminución en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se compara con una cepa no mutada, o es deficiente en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia de dicha actividad.
(5)
Un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, al género Erwinia o al género Pantoea, que posee capacidad para producir ácido L-glutámico, y que disminuye en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se compara con una cepa no mutada, o es deficiente en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia de dicha actividad.
(6)
Un microorganismo según el apartado (5), que es Klebsiella planticola.
(7)
Un procedimiento para producir ácido L-glutámico que comprende el cultivo del microorganismo tal como se define en cualquiera de los apartados (1) a (6), en un medio líquido de cultivo para producir y acumular ácido L-glutámico en el medio de cultivo, y recuperar el ácido L-glutámico a partir del medio de cultivo.
A causa de que los microorganismos de la presente invención poseen una alta capacidad para producir ácido L-glutámico, se considera que es posible comunicar otra capacidad de producción más alta al microorganismo, utilizando las técnicas de cría conocidas previamente para las bacterias corineformes productoras de ácido L-glutámico y similares, esperando (de esta forma) contribuir al desarrollo de un procedimiento más eficiente y más barato para la producción del ácido L-glutámico mediante la selección apropiada de las condiciones de cultivo y similares.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa la construcción de un plásmido pMWCPG con un gen gltA un gen ppc y un gen gdhA.
La figura 2 representa la construcción de un plásmido pMWG con el gen gdhA.
La figura 3 representa la construcción de un plásmido pMWC con el gen gltA.
La figura 4 representa la construcción de un plásmido RSF-Tet que tiene un origen de replicación de un plásmido RSF1010 con un amplio espectro de huéspedes y un gen de resistencia a la tetraciclina.
La figura 5 representa la construcción de un plásmido RSFCPG que tiene un origen de replicación del plásmido RSF1010 con un amplio espectro de huéspedes, el gen de resistencia a la tetraciclina, el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se explicará con mayor detalle a continuación.
Se proporcionan a continuación los ejemplos de los microorganismos pertenecientes a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea que pueden utilizarse para la presente invención.
Klebsiella planticola Klebsiella terrigena Erwinia herbicola (ahora clasificada como Pantoea agglomerans) Erwinia ananas Erwinia cacticida Erwinia chrysanthemi Erwinia mallotivora Erwinia persicinus Erwinia psidii Erwinia quercina Erwinia rhapontici Erwinia rubrifaciens Erwinia salicis Erwinia uredovora Pantoea agglomerans Pantoea dispersa 
\newpage
Más preferentemente, pueden mencionarse las cepas bacterianas que se presentan a continuación:
Klebsiella planticola AJ13399
Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea agglomerans AJ2666)
\vskip1.000000\baselineskip
La Klebsiella planticola AJ13399 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, el 19 de febrero de 1998, recibiendo el número de registro FERM P-16646, siendo entonces transferida a un depósito internacional bajo el Tratado de Budapest, el 11 de enero de 1999, recibiendo el número de registro FERM BP-6616. Los microorganismos que se clasificaron como Erwinia herbicola se clasifican ahora como Pantoea agglomerans. Por tanto, la Erwinia herbicola IAM1595 se denomina como Pantoea agglomerans AJ2666, y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, el 25 de febrero de 1999, como un depósito internacional bajo el Tratado de Budapest, recibiendo el número de registro FERM BP-6660.
La Klebsiella planticola AJ13399 es una cepa aislada del suelo en Sapporo-shi, Hokkaido, Japón.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades fisiológicas de AJ13399 son las siguientes:
(1)
Morfología celular: en forma de bastoncillo
(2)
Motilidad: ausente
(3)
Formación de esporas: ausente
(4)
Morfología de las colonias sobre agar nutriente LabM: circulares, superficie suave, color de crema, uniforme, elevada, y que ofrece una reflexión general de la superficie.
(5)
Ensayo OF de la glucosa: Positivo para capacidad de fermentación
(6)
tinción Gram-negativa
(7)
Comportamiento respecto al oxígeno: anaerobio facultativo
(8)
Catalasa: positiva
(9)
Oxidasa: negativa
(10)
Ureasa: positiva
(11)
Citocromo oxidasa: negativa
(12)
\beta-galactosidasa: positiva
(13)
Arginina deshidratasa: negativa
(14)
Ornitina decarboxilasa: negativa
(15)
Lisina decarboxilasa: positiva
(16)
Triptófano desaminasa: negativa
(17)
Reacción de Voges-Proskauer: positiva
(18)
Producción de indol: positiva
(19)
Producción de sulfuro de hidrógeno en medio de cultivo TSI: negativa
(20)
Capacidad de asimilación de ácido cítrico: positiva
(21)
Capacidad de asimilación del ácido m-hidroxibenceno: negativa
(22)
Licuefacción de la gelatina: negativa
(23)
Producción de ácidos a partir de azúcares:
\quad
Glucosa: positiva
\quad
Manitol: positiva
\quad
Ramnosa: positiva
\quad
Arabinosa: positiva
\quad
Sacarosa: positiva
\quad
Sorbitol: positiva
\quad
Inositol: positiva
\quad
Melibiosa: positiva
\quad
Amigdalina: positiva
\quad
Adonitol-peptona-agua: positiva
\quad
Celobiosa-peptona-agua: positiva
\quad
Dulcitol-peptona-agua: negativa
\quad
Rafinosa-peptona-agua: positiva
(23)
Temperatura de desarrollo: buen desarrollo a 37ºC, sin desarrollo a 45ºC.
A partir de estas propiedades bacteriológicas, se determina que AJ13399 es Klebsiella planticola.
En el "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, novena edición", Erwinia herbicola no se describe y los microorganismos que se han clasificado como Erwinia herbicola se clasifican como Pantoea agglomerans. Así, los microorganismos que pertenecen al género Erwinia y los microorganismos que pertenecen al género Pantoea están relacionados estrechamente entre ellos. Por tanto, cualquiera de los microorganismos que pertenecen al género Erwinia y al género Pantoea pueden utilizarse en la presente invención.
Al metabolismo de los azúcares por las bacterias que pertenecen al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea tales como las mencionadas anteriormente, se accede mediante la vía de Embden-Meyerhof, y el piruvato que se produce en esta vía es oxidado en el ciclo del ácido tricarboxílico en condiciones aeróbicas. El ácido L-glutámico es biosintetizado a partir del ácido \alpha-cetoglutárico que constituye un intermediario del ciclo del ácido tricarboxílico, por el GDH o la glutamina sintetasa/glutamato sintasa. De este modo, estos microorganismos comparten idéntica vía biosintética para el ácido L-glutámico, y los microorganismos que pertenecen a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, se integran en un concepto único según la presente invención. Por tanto, los microorganismos que pertenecen a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea distintos a las especies y cepas que se mencionan específicamente antes, forman asimismo parte del alcance de la presente invención.
El microorganismo de la presente invención es un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea y que tiene una capacidad para producir el ácido L-glutámico. La expresión "que tiene una capacidad para producir ácido L-glutámico" tal como se utiliza en la presente memoria, significa que tiene la capacidad para acumular el ácido L-glutámico en un medio de cultivo durante éste. La capacidad para producir ácido L-glutámico puede ser una que posea una cepa de tipo salvaje como propiedad suya, o una comunicada o potenciada por la cría. Los ejemplos de microorganismos que pertenecen a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, y que tienen la capacidad para producir el ácido L-glutámico, incluyen, por ejemplo, los microorganismos que aumentan la actividad de la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico, y los microorganismos que disminuyen o son deficientes en la actividad de una enzima que cataliza una reacción procedente de una vía para la biosíntesis del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto del ácido L-glutámico. Los ejemplos del microorganismo incluyen además los que aumentan la actividad de la enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico, y los que disminuyen o son deficientes en la actividad de la enzima que cataliza la reacción que se ramifica (procede) de la vía para la biosíntesis del ácido L-glutámico y que produce el compuesto distinto del ácido L-glutámico.
Las enzimas que catalizan la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico son GDH, CS y PEPC. Como para el microorganismo de la presente invención, se prefiere además que aumenten las actividades de la totalidad de los tres tipos de enzimas, CS, PEPC y GDH. Si un microorganismo aumenta la actividad de una enzima diana, el grado del aumento de la actividad puede determinarse midiendo la actividad enzimática de un extracto celular bacteriano o de una fracción purificada, y comparándolo con el de una cepa de tipo salvaje o de una cepa parental.
\newpage
El microorganismo de la presente invención, que pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, y aumenta la actividad de la enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico, puede obtenerse como, por ejemplo, una variante en la que se ha llevado a cabo una mutación en un gen que codifique la enzima, o (como) una cepa genética recombinante, utilizando cualquiera de los microorganismos anteriormente citados como cepa parental inicial.
Para potenciar la actividad de CS, PEPC o GDH, por ejemplo, un gen que codifique CS, PEPC o GDH, puede clonarse en un plásmido apropiado, y la cepa parental inicial anteriormente mencionada como huésped puede transformarse con el plásmido resultante. Esto puede aumentar el número de copias de cada uno de los genes que codifican CS, PEPC y GDH (que se abrevian en adelante como "gen gltA", "gen ppc" y "gen gdhA", respectivamente), y como resultado, las actividades de CS, PEPC y GDH, pueden aumentar.
Uno o dos o tres tipos que se seleccionan a partir de los genes gltA, ppc y gdhA clonados, en cualquier combinación, se introducen en la cepa parental inicial mencionada anteriormente. Cuando dos o tres tipos de los genes se introducen, los dos o tres tipos de los genes son clonados en un tipo de plásmido, e introducidos en el huésped, o se clonan de forma separada en dos o tres tipos de plásmidos que pueden existir en el mismo huésped, introduciéndolos en éste.
El plásmido no está limitado particularmente, siempre que pueda replicarse autónomamente en un microorganismo que pertenezca al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea. Los ejemplos de plásmidos incluyen, por ejemplo, puC19, puC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 y similares. Además de estos plásmidos, pueden utilizarse también vectores de ADN fágico.
La transformación puede obtenerse mediante, por ejemplo, el procedimiento de D.M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)), el procedimiento de aumento de la permeabilidad de las células receptoras para el ADN con cloruro cálcico (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), o similares.
Las actividades de CS, PEPC y GDH pueden aumentarse asimismo utilizando copias múltiples de los genes gltA, ppc y/o el gen gdh que se encuentran en el ADN cromosómico de la cepa parental inicial como huésped. Para introducir copias múltiples del gen gltA, ppc y/o el gen gdhA en un ADN cromosómico de un microorganismo que pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, pueden utilizarse las secuencias presentes en el ADN cromosómico en un número múltiple de copias tal como en el ADN repetitivo, y en las repeticiones inversas que se encuentran en el extremo de factores de transposición. Alternativamente, pueden también introducirse copias múltiples de los genes en un ADN cromosómico, utilizando la transposición de transposones que transportan el gen gltA, ppc o el gen gdhA. Estas técnicas pueden aumentar el número de copias de los genes gltA, ppc o gdhA en las células transformantes, aumentando, como resultado, las actividades de CS, PEPC y GDH.
Pueden utilizarse cualesquiera organismos como fuente de los genes gltA, ppc o gdhA utilizados para aumentar el número de copias, siempre que los organismos muestren actividades CS, PEPC y GDH. Entre dichos organismos, resultan preferidas las bacterias, es decir, procariotas, tales como las bacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium o Bacillus. Como ejemplo específico, puede mencionarse Escherichia coli. Los genes gltA, ppc y gdhA pueden obtenerse a partir de un ADN cromosómico de dichos microorganismos tal como se ha mencionado anteriormente.
El gene gltA, el gen ppc y el gen gdhA pueden obtenerse cada uno a partir de un ADN cromosómico de cualquiera de los microorganismos anteriormente mencionados, aislando un fragmento de ADN que complemente la auxotrofia de una cepa variante a la que le falte la actividad CS, PEPC o GDH. Alternativamente, debido a que las secuencias nucleótidas de estos genes de las bacterias de los géneros Escherichia o Corynebacterium ya se han dilucidado (Biochemistry, Vol. 22, páginas 5243-5249, 1983; J. Biochem. Vol. 95, págs 909-916, 1984; Gene, Vol. 27, págs 193-199, 1984; Microbiology, Vol. 140; págs 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet. Vol. 218, págs 330-339, 1989; y Molecular Microbiology, Vol. 6, págs 317-326, 1992), los genes pueden obtenerse mediante PCR, utilizando cebadores sintetizados basándose en cada una de las secuencias nucleótidas dilucidadas, y en el ADN cromosómico como matriz.
La actividad de CS, PEPC o GDH puede también aumentarse mediante (otro procedimiento) que la amplificación génica mencionada anteriormente, potenciando la expresión del gen gltA, del gen ppc o del gdhA. Por ejemplo, la expresión se potencia reemplazando el promotor del gen gltA, del gen ppc o del gen gdhA con otro promotor más intenso. Los ejemplos de dichos promotores más intensos incluyen, por ejemplo, un promotor lac, un promotor trp, un promotor trc, un promotor tac, un promotor P_{R} y un promotor P_{L} del fago lambda y similares. El gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA del cual se ha sustituido el promotor, es clonado en un plásmido e introducido en un microorganismo huésped, o introducido en un ADN cromosómico del microorganismo huésped utilizando un ADN repetitivo, una repetición inversa, u un transposón o similar.
Las actividades de CS, PEPC o GDH pueden también aumentarse t reemplazando el promotor del gen gltA, del gen ppc, o del gen gdhA en un cromosoma con otro promotor más intenso (véase WO 87/03006, y la solicitud de patente japonesa abierta al público (KOKAI) nº 61-268183 (1986)), o insertando un promotor más intenso por encima de cada secuencia codificante de los genes (véase Gene, 29, págs 231-241, 1984). Específicamente, estas (actividades) se alcanzan mediante recombinación homóloga entre el gen gltA, el gen ppc, o el gen gdhA del cual se reemplaza un promotor con un promotor más intenso o un ADN que contiene una parte de ellos, y un gen correspondiente en el cromosoma.
Los ejemplos específicos del microorganismo que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea del cual la actividad CS, PEPC o GDH ha aumentado, incluyen, por ejemplo, Klebsiella planticola ATJ13399/RSFCPG, y Erwinia herbicola IAM1595/RSFCPG.
La enzima que cataliza la reacción que proviene de la vía de la biosíntesis del ácido L-glutámico y que produce el compuesto distinto del ácido L-glutámico, es \alphaKGDH.
Para obtener dicha disminución o deficiencia de la actividad enzimática en un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea, tal como se ha mencionado anteriormente, puede introducirse una mutación en un gen que codifique la enzima mediante una técnica convencional de mutagénesis, como una técnica de ingeniería genética, mutación que provoque la disminución o deficiencia de dicha actividad enzimática.
Los ejemplos de la técnica de mutagénesis incluyen, por ejemplo, el procedimiento que utiliza la irradiación de rayos X o de la luz ultravioleta, el procedimiento que utiliza el tratamiento con u un agente mutagénico cono la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y similares. El sitio génico en el que se introduce una mutación puede ser una región codificante que codifique una proteína enzimática, o una región reguladora de la expresión, tal como un promotor.
Los ejemplos de la técnica de ingeniería genética incluyen, por ejemplo, la recombinación genética, la transducción genética, la fusión celular y similares. Por ejemplo, se inserta un gen de resistencia a los medicamentos en un gen diana, para producir un gen funcionalmente inactivado (gen defectuoso). Entonces, este gen defectuoso se introduce en una célula de un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea, y el gen diana en un cromosoma es reemplazado con el gen defectuoso mediante recombinación homóloga (interrupción génica).
Puede determinarse si un microorganismo disminuye la actividad de una enzima diana o si es defectuoso en la actividad, o el grado de disminución de ésta, midiendo la actividad enzimática de un extracto celular bacteriano o de una fracción purificada de una cepa candidata y comparándola con la de una cepa de tipo salvaje o de una cepa parental. La actividad enzimática de \alphaKGDH puede medirse, por ejemplo, mediante el procedimiento de Reed et al (L.J. Reed y B. B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969,13, págs 55-61).
Dependiendo de la enzima diana, puede seleccionarse una variante diana basándose en un fenotipo de la variante. Por ejemplo, una variante que es defectuosa en la actividad \alphaKGDH o disminuye la actividad, no puede desarrollarse en un medio mínimo que contenga glucosa, o en un medio mínimo que contenga ácido acético o ácido L-glutámico como fuente exclusiva de carbono, o que muestre una notable reducción del crecimiento bajo condiciones aeróbicas. Sin embargo, incluso bajo idénticas condiciones, puede mostrar un crecimiento normal añadiendo ácido succínico o lisina, metionina y diaminopimelato al medio mínimo que contiene glucosa. Basándose en estos fenómenos, puede seleccionarse una variante que sea defectuosa en la actividad \alphaKGDH o la disminuya.
En el documento WO95/34672, se detalla un procedimiento para producir una cepa de Brevibacterium lactofermentum a la que le falta el gen \alphaKGDH, que se basa en la recombinación homogénea, y un procedimiento similar puede utilizarse para los microorganismos que pertenecen a a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea.
Además, en Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press (1989) y similares, se detallan procedimientos de clonación genética, fragmentación y unión del ADN, transformación y similares.
Un ejemplo de la cepa variante que es defectuosa en la actividad \alphaKGDH o disminuye la actividad obtenida, tal como se ha descrito anteriormente, es Klebsiella planticola AJ13410. La Klebsiella planticola AJ13410 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, el 19 de febrero de 1998, recibiendo el número de registro FERM P-16647, siendo entonces transferida a un depósito internacional bajo el tratado de Budapest, el 11 de enero de 1999, recibiendo el número de registro FERM BP-6617.
Las cepas bacterianas que pertenecen a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea y que disminuyen la actividad de \alphaKGDH o son defectuosas en ella, o las que aumentan la actividad de CS, PEPC o GDH, que se obtuvieron tal como se ha descrito anteriormente, tendrán la capacidad para producir ácido L-glutámico tal como se muestra en los ejemplos que siguen a continuación.
Como para los microorganismos que pertenecen al género Escherichia, que se clasifica dentro de las bacterias entéricas como los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, se ha conocido que las cepas que disminuyen la actividad de \alphaKDGH o son defectuosas en ella, pueden producir ácido L-glutámico (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 5-244970 (1993)), que las cepas que disminuyen la actividad de \alphaKDGH o son defectuosas en su actividad y aumentan las actividades de PEPC y GDH, pueden producir otro aumento de la cantidad de ácido L-glutámico (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 7-203980 (1995)), y que las cepas que muestran sensibilidad a la valina y y potenciación de las actividades de CS y GDH, pueden producir ácido L-glutámico (WO97/08294).
Como para los microorganismos que pertenecen al género Enterobacter, que se clasifica de manera similar en las bacterias entéricas, en el contexto de la presente invención se descubrió que las cepas que disminuyen la actividad de \alphaKGDH o son defectuosas en la actividad, o las cepas que aumentan las actividades de PEPC, GDH y CS, pueden producir ácido L-glutámico (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 10-69068 (1998).
Además, como también para los microorganismos que pertenecen al género Serratia, se descubrió en el contexto de la presente invención que las cepas que mostraban potenciación de las actividades de PEPC, GDH y CS, pueden producir ácido L-glutámico (solicitud de patente japonesa nº 10-69068 (1998)).
A partir de estos hechos, se deduce fácilmente, como para las bacterias que pertenecen a los géneros Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Escherichia, Enterobacter o Serratia distintas a las cepas que se describen en los Ejemplos, que las cepas que disminuyen la actividad de \alphaKGDH o que son defectuosas en la actividad, o las cepas que aumentan las actividades de PEPC, GDH y CS, pueden producir ácido L-glutámico. Tal como se demuestra en los ejemplos, se apoya fuertemente que el hecho de que la capacidad para producir ácido L-glutámico pueda comunicarse a Klebsiella planticola AJ13399 suprimiendo \alphaKGDH, (hace posible) que pueda aplicarse a las otras bacterias de los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea.
El ácido L-glutámico puede producirse cultivando el microorganismo que pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia o Pantoea, y que posee la capacidad para producir ácido L-glutámico en un medio líquido de cultivo, para obtener y acumular ácido L-glutámico en el medio, y recuperarlo a partir de éste.
El medio de cultivo puede ser un medio nutricional ordinario que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, y sales inorgánicas, así como nutrientes orgánicos tales como aminoácidos, vitaminas y similares, tal como se requieran. Puede ser un medio sintético o uno natural. Puede utilizarse para el medio de cultivo cualquier fuente de carbono y de nitrógeno, siempre que pueda utilizarse por el microorganismo que va a ser cultivado.
La fuente de carbono puede ser un sacárido tal como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizados de almidón, molasas y similares. Además, pueden también utilizarse solos un ácido orgánico tal como ácido acético y ácido cítrico, o en combinación con otras fuentes de carbono.
La fuente de nitrógeno puede ser amoníaco, sales amónicas tales como sulfato amónico, carbonato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico y acetato amónico, nitratos y similares.
Como nutrientes orgánicos en pequeñas cantidades, pueden utilizarse aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, materiales que los contengan, como peptona, casaminoácidos, extracto de levadura, y productos de la descomposición de las proteínas de la soja y similares, y cuando se emplea una variante auxotrófica que requiere un aminoácido o similar para su desarrollo, es necesario complementar el nutriente requerido.
Como sales inorgánicas, se utilizan fosfatos, sales magnésicas, sales cálcicas, sales de hierro, sales de manganeso y similares.
Como para las condiciones del cultivo, éste puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas a una temperatura de entre 20 y 42ºC y un pH de 4 a 8. El cultivo puede prolongarse durante 10 horas a 4 días, para acumular una cantidad considerable de ácido L-glutámico en el medio líquido de cultivo.
Después de que el cultivo finalice, el ácido L-glutámico que se acumule en el medio de cultivo puede ser recuperado mediante un procedimiento conocido. Por ejemplo, puede aislarse mediante un procedimiento que comprende la concentración del medio después de eliminar las células para cristalizar el producto, la cromatografía de intercambio iónico, o similar.
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Ejemplos
La presente invención se explicará más específicamente haciendo referencia a los ejemplos siguientes.
(1) Construcción del plásmido que posee el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA
El procedimiento para la construcción de un plásmido que posea un gen gltA, un gen ppc y un gen gdhA se explicará haciendo referencia a las figuras 1, 2 y 3.
Un plásmido pBRGDH que posee un gen gdhA derivado de Escherichia coli (solicitud de patente japonesa abierta al público (KOKAI) nº 7-203980(1995)) se sometió a digestión con HindIII y SphI, y ambos extremos se redondearon mediante un tratamiento con T4 ADN polimerasa. Entonces, un fragmento de ADN que contenía el gen gdhA se purificó y recuperó. Por otra parte, un plásmido pMWCP que posee un gen gltA y un gen ppc derivado de Escherichia coli (WO97/08294), fue sometido a digestión con XbaI, y ambos extremos se redondearon mediante un tratamiento con T4 ADN polimerasa. Éste se mezcló con el fragmento de ADN que posee el gen gdhA purificado anteriormente, y se unió con T4 ligasa, dando lugar a un plásmido pMWCPG, que corresponde al pMWCP que transporta ulteriormente el gen gdhA (Figura 1).
Un fragmento de ADN que posee el gen gdhA, obtenido mediante digestión de pBRGDH con HindIII y SalI, se purificó y recuperó, y se introdujo en el sitio HindIII-SalI de un plásmido pMW219 (obtenido de Nippon Gene), para obtener un plásmido pMWG (Figura 2). Además, un plásmido pTWVC con el gen gltA derivado de Escherichia coli (WO97/08294), se sometió a digestión con HindIII y EcoRI, y el fragmento resultante de ADN con el gen gltA se purificó y recuperó, y se introdujo en el sitio HindIII-EcoRI del plásmido pMW219 para obtener un plásmido pMWC (Figura 3).
Al mismo tiempo, un producto obtenido mediante digestión con NotI de un plásmido pVIC40 que posee un origen de replicación de un plásmido RSF1010 con un amplio espectro de huéspedes (Solicitud de patente japonesa abierta al público (KOKAI) nº 8-047397 (1996)), con NotI, seguido por un tratamiento con T4 ADN polimerasa y digestión mediante PstI, y un producto obtenido mediante digestión de PBR322 con EcoT14l, seguido por un tratamiento con T4 ADN polimerasa y digestión con PstI, se mezclaron y unieron con T4 ligasa para obtener un plásmido RSF-Tet, que posee el origen de replicación de RSF1010 y un gen de resistencia a la tetraciclina (fig 4).
Entonces, el pMWCPG se sometió a digestión con EcoRI y PstI, purificándose y recuperándose un fragmento de ADN que poseía el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA. De modo similar, el RSF-Tet se sometió a digestión con EcoRI y PstI, y un fragmento de ADN con el origen de replicación de RSF1010 se purificó y recuperó. Estos fragmentos de ADN se mezclaron y unieron con T4 ligasa para obtener un plásmido RSFCPG compuesto por RSF-Tet que transportaba el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA (figura 5). La expresión del gen gltA, del gen ppc y del gen gdhA por el plásmido resultante RSFCPG, se confirmó basándose en la complementación de la auxotrofía de las cepas de Escherichia coli a las que faltaba el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA, y la medición de cada actividad enzimática.
De modo similar, se confirmó la expresión por pMWG o pMWC del gen gdhA o del gen gltA, basándose en la complementación de la auxotrofia de las cepas de Escherichia coli a las que faltaba el gen gltA, o el gen gdhA, y la medición de cada actividad enzimática.
(2) Introducción de RSFCPG, pMWC y pMWG en la bacteria del género Klebsiella y en la bacteria del género Erwinia (Pantoea) y evaluación de la producción del ácido L-glutámico
La Erwinia herbicola IAM1595 (Pantoea agglomerans AJ2666) y la Klebsiella planticola AJ13399 se transformaron con el RSFCPG, pMWC y pMWG mediante electroporación (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992), para obtener transformantes que muestren resistencia a la tetraciclina.
Cada uno de los transformantes resultantes y las cepas parentales se inocularon en un tubo de ensayo de gran tamaño de un volumen de 50 ml, que contenía 5 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l de dihidrogenofosfato potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de heptahidrato cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato ferroso, 0,02 g/l de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l de dihidrato sulfato de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato cúprico, 0,72 mg/l de hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de extracto de levadura, y 30 g/l de carbonato de calcio, y que se cultivaron a 37ºC con agitación, hasta que la glucosa contenida en el medio de cultivo se consumió. Al medio de cultivo de los transformantes, se le añadieron 25 mg/l de tetraciclina. Después de que el cultivo finalizó, se midió el ácido L-glutámico acumulado en el medio de cultivo. Los resultados se presentan en la Tabla 1.
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TABLA 1 Cantidad acumulada de ácido L-glutámico
1 
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Mientras que Erwinia herbicola IAM1595 y Klebsiella planticola AJ13399 no acumularon ácido L-glutámico, las cepas cuyas actividades CS, PEPC y GDH se amplificaron introduciendo RSFCPG, acumularon 5,0 g/l y 3,1 g/l de ácido L-glutámico, respectivamente. La cepa AJ13399 de la cual se amplificó sólo la actividad CS, acumuló 2,5 g/l de ácido L-glutámico, y la cepa de la cual sólo se amplificó la actividad GDH, acumuló también 0,8 g/l de ácido L-glutámico.
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(3) Clonación de un fragmento que tiene parte del gen \alphaKGDH de Klebsiella planticola AJ13399
La clonación de un fragmento que tiene una parte del gen \alphaKGDH de Klebsiella planticola AJ13399 se llevó a cabo mediante PCR, utilizando oligonucleótidos, cada uno de los cuales tiene una secuencia nucleótida de una región homóloga del gen \alphaKGDH de los organismos de cuyas secuencias nucleótidas se había ya informado, es decir, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Haemophilus influenzae, la humana y Saccharomyces cerevisiae (Eur. J. Biochem., Vol. 187, págs 235-239, 1990; Mol. Gen. Genet., Vol. 234, págs 285-296, 1992; Eur. J. Biochem. Vol. 141, págs 351-359. 1984; Microbiology, Vol. 142, págs 3347-3354, 1996; Science, Vol. 269, págs 496-512, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, págs 1963-1967, 1992; y Mol. Cel. Biol. Vol. 9, págs 2695-2705, 1989), y un sitio EcoRI como cebadores.
Específicamente, las siguientes (secuencias) se utilizan como cebadores.
100
El ADN cromosómico de la Klebsiella planticola AJ13399 que se utilizó como una matriz de PCR se aisló mediante el mismo procedimiento que el utilizado convencionalmente para extraer el ADN cromosómico de Escherichia coli (Seibutsu Kogaku Jikken-sho (Textbook of Bioengineering Experiments), Editado por la Society of Fermentation and Bioengineering, Japón, págs 97-98, Baifukan, 1992).
La PCR se llevó a cabo con un ciclo consistente en 94ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto, y 73ºC durante 3 minutos, que se repitió durante 30 ciclos, sometiéndose a digestión con EcoRI el fragmento de ADN resultante, que se insertó en un plásmido vectorial pT7Blue digerido con EcoRI, para obtener un plásmido recombinante pT7KP. El plásmido vectorial pT7Blue (resistente a la ampicilina) que se utilizó fue un producto comercial de Novagen.
La secuencia nucleótida del ADN del fragmento clonado y la secuencia aminoácida codificada por la secuencia, se muestran en SEC ID nº:3. La misma secuencia aminoácida se representa de forma única en SEC ID nº:4. La secuencia mostró un 82,3% de homología con el gen de la subunidad \alphaKGDH-E1 de Escherichia coli (al que se hace referencia en adelante como "gen sucA"), y que es reconocido claramente como parte del gen sucA de Klebsiella planticola AJ13399. En la secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:3, los números de nucleótidos 18-1659 derivan del gen sucA, y los números de nucleótidos 0-17 y 1660-1679 derivan de los cebadores.
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(4) Adquisición de cepas deficientes en \alphaKGDH derivadas de Klebsiella planticola AJ13399
Una cepa de Klebsiella planticola deficiente en \alphaKGDH se obtuvo mediante recombinación homóloga, utilizando el fragmento que posee una parte del gen sucA de Klebsiella planticola obtenido tal como se ha descrito anteriormente.
En primer lugar, pT7KP fue digerido con BstEII y, en este sitio de fragmentación, un fragmento del gen resistente a la kanamicina, que se había clonado mediante PCR a partir de un plásmido pNEO (obtenido de Pharmacia) y en ambos extremos del cual se introdujeron sitios BstEII, se introdujo para obtener un plásmido pT7KPKm, en el cual el gen de resistencia a la kanamicina se insertó en la parte central del gen sucA de Klebsiella planticola.
Los cebadores utilizados para la clonación del gen de resistencia a la kanamicina fueron los siguientes:
101
Entonces, el pT7KPKm se fragmentó con KpnI y, en este sitio fragmentado, un fragmento del gen resistente a la tetraciclina, que se había clonado mediante PCR a partir de un plásmido pBR322 (obtenido de Takara Shuzo) y en ambos extremos del cual se introdujeron sitios KpnI, se introdujo para obtener un plásmido pT7KPKmTc, en el cual el gen de resistencia a la kanamicina se insertó en la parte central del gen sucA de Klebsiella planticola, junto con el gen franqueante de resistencia a la tetraciclina, insertado.
\newpage
Los cebadores utilizados para la clonación del gen de resistencia a la tetraciclina fueron los siguientes:
102
A continuación, el plásmido pT7KPKmTc fue sometido a digestión con SacI y XbaI para seccionar un fragmento de ADN que poseía el gen de resistencia a la kanamicina insertado en la parte central del gen sucA de Klebsiella planticola, junto con el gen flanqueante insertado de resistencia a la tetracilina, insertándose éste en un vector plasmídico pGP704 insertado en el cromosoma de una bacteria gram-negativa (Marta Herrero et al., Journal of Bacteriology, 1990, 172, págs 6557-6567) y digerido con SacI y XbaI para obtener un plásmido pUTONOTK.
Utilizando el plásmido pUTONOTK obtenido tal como se ha descrito anteriormente, Klebsiella planticola AJ13399 se transformó mediante electroporación, seleccionándose una cepa en la que el plásmido pUTONOTK se insertó en el cromosoma mediante recombinación homogénea del fragmento del gen sucA, basándose en la resistencia a la tetraciclina y a la kanamicina. A partir de esta cepa, se obtuvo posteriormente una cepa de Klebsiella planticola AJ13410 en la que faltaba sucA, en la que el gen sucA en el cromosoma fue reemplazado con el gen sucA en el que el gen de resistencia a la kanamicina se insertó en la parte central, basándose en la sensibilidad a la tetraciclina y en la resistencia a la kanamicina.
Para confirmar que la cepa AJ13410 obtenida tal como se ha descrito anteriormente, era deficiente en la actividad \alphaKGDH, se determinó su actividad enzimática mediante el procedimiento de Reed (L.J. Reed y B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, págs 55-61). Como resultado, la actividad \alphaKGDH no pudo detectarse en la cepa AJ13410, tal como se muestra en la Tabla 2, y de esta forma se confirmó que en la cepa faltaba el sucA tal como se deseaba.
TABLA 2 Actividad \alphaKGDH
2
(5) Evaluación de la producción de ácido L-glutámico de la cepa de Klebsiella planticola deficiente en \alphaKGDH
Cada una de las cepas AJ13399 y AJ13410 se inoculó en un matraz de un volumen de 500 ml que contenía 20 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l de dihidrogenofosfato potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de heptahidrato cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato ferroso, 0,02 g/l de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l de dihidrato sulfato de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato cúprico, 0,72 mg/l de hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de extracto de levadura, 30 g/l de carbonato de calcio, 200 mg/l de monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, y ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico (DAP), y se cultivaron a 37ºC con agitación, hasta que la glucosa contenida en el medio de cultivo se consumió. Después de que el cultivo finalizó, se midieron el ácido L-glutámico y el ácido \alpha-cetoglutárico (abreviado como "\alphaKG" en adelante) acumulados en el medio de cultivo. Los resultados se representan en la Tabla 3.
TABLA 3 Cantidades acumuladas de ácido L-glutámico y \alphaKG
3
La cepa AJ13410 deficiente en la actividad \alphaKGDH acumuló 12,8 g/l de ácido L-glutámico, y acumuló simultáneamente 1,5 g/l de \alphaKG.
(6) Introducción de RSFCPG en la cepa Klebsiella planticola deficiente en \alphaKGDH y evaluación de la producción de ácido L-glutámico
La cepa AJ13410 se transformó con el RSFCPG, y la cepa resultante en la que se introdujo RSFCPG, AJ13410/
RSFCPG, se inoculó en un matraz de un volumen de 500 ml que contenía 20 ml de un medio de cultivo que comprendía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de heptahidrato sulfato magnésico, 2 g/l de dihidrogenofosfato potásico, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de heptahidrato cloruro cálcico, 0,02 g/l de heptahidrato sulfato ferroso, 0,02 g/l de tetrahidrato sulfato de manganeso, 0,72 mg/l de dihidrato sulfato de cinc, 0,64 mg/l de pentahidrato sulfato cúprico, 0,72 mg/l de hexahidrato cloruro de cobalto, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de dihidrato molibdato sódico, 2 g/l de extracto de levadura, 25 mg/l de tetraciclina, 30 g/l de carbonato de calcio, 200 mg/l de monohidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, y ácido DL-\alpha,\varepsilon-DAP, y se cultivaron a 37ºC con agitación, hasta que la glucosa contenida en el medio de cultivo se consumió. Después de que el cultivo finalizó, se midieron el ácido L-glutámico y el ácido \alphaKG acumulados en el medio de cultivo. Los resultados se presentan en la Tabla 4.
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TABLA 4 Cantidades acumuladas de ácido L-glutámico y \alphaKG
4
En la cepa de la cual las actividades CS, PEPC y GDH se amplificaron introduciendo RSFCPG, la cantidad acumulada de \alphaKG se redujo, y la cantidad acumulada de ácido L-glutámico mejoró posteriormente.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Bacteria que produce ácido L-glutámico y procedimiento para producir ácido L-glutámico
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<130> EPA-53127
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<150> JP 10-69106
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<151> 1998-03-18
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-224909
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<151> 1998-08-07
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> característica_misc
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<222> (19)
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<223> n=a o c o g o t
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccgggaattc ggtgacgtna artayca 
\hfill
27 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggcgaattcg ggaacgggta sagytgytc 
\hfill
29 
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<210> 3
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<211> 1679
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<212> ADN
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<213> Klebsiella planticola 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1679)
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<400> 3
5
6
7 
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<210> 4
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<211> 559
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<212> PRT
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<213> Klebsiella planticola 
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<400> 4
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8
9 
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<210> 5
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
tactgggtca cctgacagct tatcatcgat 
\hfill
30 
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<210> 6
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgttcggtga ccaccaaagc ggccatcgtg 
\hfill
30 
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<210> 7
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 7
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ggggtaccca aataggcgta tcacgag 
\hfill
27 
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<210> 8
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 8
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ggggtacccg cgatggatat gttctg 
\hfill
26

Claims (7)

1. Microorganismo que pertenece al género Klebsiella, al género Erwinia o al género Pantoea, que presenta la capacidad para producir ácido L-glutámico, y que presenta la actividad aumentada de una enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico cuando se compara con una cepa no transformada aumentando el número de copias del gen de la enzima, en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico es por lo menos una de entre el grupo constituido por la citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
2. Microorganismo según la reivindicación 1 que es Klebsiella planticola o Pantoea agglomerans.
3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la enzima que cataliza una reacción en la biosíntesis del ácido L-glutámico incluye la totalidad de la citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.
4. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta la actividad disminuida de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se compara con una cepa no mutada, o es deficiente en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia de dicha actividad.
5. Microorganismo que pertenece al género Klebsiella, al género Erwinia o al género Pantoea, que presenta capacidad para producir ácido L-glutámico, y que disminuye en la actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa cuando se compara con una cepa no mutada, o es deficiente en una actividad de la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa introduciendo una mutación que provoca una disminución o deficiencia de dicha actividad.
6. Microorganismo según la reivindicación 5, que es la Klebsiella planticola.
7. Procedimiento para producir ácido L-glutámico que comprende el cultivo del microorganismo tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio de cultivo líquido, para producir y acumular ácido L-glutámico en el medio de cultivo, y recoger el ácido L-glutámico del medio de cultivo.
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