MX2013005778A - Ingenieria del bacillus coagulans termotolerante para la produccion de acido d(-)-lactico. - Google Patents

Abstract

Se proveen microorganismos modificados genéticamente que tienen la capacidad de producir ácido D-(-)-láctico a temperaturas entre 30 °C y 55 °C; en las diversas modalidades, los microorganismos pueden tener el gen de lactato deshidrogenasa cromosómico (Idh) y/o el gen de acetolactato sintasa cromosómico (aIsS) desactivados; microorganismos ejemplares para usarse en los métodos descritos son Bacillus spp., tales como Bacillus coagulans.

Description

INGENIERÍA DEL BACILLUS COAGULANS TERMOTOLERANTE PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO Df-)-LÁCTICO INTERREFERENCIA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. Número de Serie 61/416,002, presentada el 22 de noviembre de 2010, cuya descripción completa se incorpora aquí como referencia en su totalidad, incluyendo todas las figuras, cuadros y secuencias de ácido nucleico.

APOYO DEL GOBIERNO Esta invención se hizo con apoyo del gobierno de EE. UU. bajo la subvención número DE-FG36-04GO14019 del Departamento de Energía. El gobierno de EE. UU. tiene ciertos derechos en la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El petróleo no solo sirve como la fuente primaria de combustible, sino también como la materia prima para la producción de varios polímeros usados en la industria del plástico. La naturaleza finita de las reservas de petróleo y el impacto ambiental negativo del uso del petróleo han desviado la atención hacia fuentes alternas renovables de combustible y sustancias químicas como reemplazo del petróleo (23). Se ha mostrado que la fermentación de los carbohidratos produce varios hidroxiácídos de cadena corta y también otras sustancias químicas que se pueden polimerizar para producir plásticos con diferentes propiedades físicas y químicas. Entre estos productos de fermentación, el ácido láctico destaca como una sustancia química primaria que puede ser un material inicial para la fabricación de plásticos biodegradables renovables con un mínimo impacto ambiental, CO2 neutros. La fermentación de azúcares a ácido láctico se remonta a tiempos prehistóricos y la producción comercial de ácido láctico usando cultivos bacterianos puros inició desde 1895 (3). Aunque el ácido láctico es usado principalmente por las industrias alimentaria y farmacéutica, se espera que la producción de biopolímeros derivados del ácido láctico supere estos usos, dado que el costo de producción del polímero basado en ácido láctico es comparable con los polímeros derivados de sustancias petroquímicas (8, 14, 18).

El ácido láctico se condensa formando lactida, se purifica y se polimeriza formando polilactida (PLA), un material termoplástico (18, 22). Mezclando atinadamente el ácido D(-)- y L(+)-láctico, se pueden producir polímeros con varias propiedades físicas y termoquímicas. Aunque el ácido láctico se puede sintetizar del petróleo, el producto es una mezcla de los dos isómeros y no es adecuado para la producción de PLA. El ácido láctico ópticamente puro requerido para la producción de PLA es producido solamente por fermentación microbiana (14). Algunas bacterias de ácido láctico, Lactobacillus, Lactococcus, etc., producen ácido L(+)-láctico en alto rendimiento y título a partir de azúcares fermentables, tales como glucosa y sacarosa (6, 14). Sus requerimientos nutricionales son complejos y su temperatura de crecimiento varía entre 30 °C y 35 °C. Se han descrito microorganismos que producen ácido D(-)-láctico como producto de fermentación primario, y actualmente se está usando en la industria (25, 34, 36) (12). La fermentación del ácido láctico por estos biocatalizadores microbianos se realiza actualmente a 30-37 °C, y elevando la temperatura de crecimiento y fermentación a 50-55 °C se espera minimizar la contaminación de las fermentaciones industriales en escala industrial grande (1). Para reducir el costo de la producción del ácido láctico y también para eliminar el uso de carbohidratos alimenticios como materia prima para la producción de ácido láctico, se están desarrollando fuentes alternas de azúcares fermentables y biocatalizadores microbianos. La biomasa lignocelulósica es una fuente atractiva de azúcares; glucosa, xilosa, etc. Sin embargo, las bacterias del ácido láctico usadas por la industria no tienen la capacidad de fermentar eficientemente las pentosas a ácido láctico, aunque hay varios intentos de mejorar la propiedad de fermentación de xilosa de estas bacterias de ácido láctico (25, 31).

El Bacillus coagulans es una bacteria esporogénica del ácido láctico que crece a 50-55 °C y pH 5.0, y fermenta tanto hexosas como pentosas (10, 27). Se ha mostrado que esta bacteria produce ácido L(+)- láctico a concentraciones tan altas como 180 g/l en fermentaciones de carga por lote a partir tanto de glucosa como de xilosa, y también es un candidato excelente para la sacarificación y fermentación simultánea de celulosa a ácido láctico ópticamente puro (26). Generalmente, el B. coagulans es recalcitrante a la ingeniería genética y se necesitan métodos para producir ácido láctico puro (particularmente usando microorganismos diseñados por ingeniería genética que no contengansecuencias de ácido nucleico exógeno). Un aspecto de la invención revelada en la presente provee un método general para diseñar por ingeniería esta bacteria genéticamente recalcitrante. Usandoel método descrito y selección basada en el crecimiento, el producto de fermentación de B. coagulans, cepa P4-102B, cambia de ácido L(+)-láctico a ácido D(-)-láctico. El biocatalizador diseñado por ingeniería produjo aproximadamente 90 g/l de ácido D(-)-láctico en menos de 48 horas a 50 °C.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen microorganismos modificados genéticamente que tienen la capacidad de producir ácido D(-)-láctico a temperaturas entre 30 °C y 55 °C. En varias modalidades, los microorganismos pueden tener el gen de lactato deshidrogenase cromosómico (Idh) y/oel gen de acetolactato sintasa cromosómico (alsS) desactivados. Microorganismos ejemplares para usarse en los métodos descritos son Bacillus spp., tales como Bacillus coagulans. Los microorganismos producidos de acuerdo con la presente descripción producen ácido D(-)-láctico en cantidades de por lo menos 60g/l de medio de cultivo (por ejemplo, por lo menos 70g/l, 80g/l, 90g/l o 10Og/l). También se proveen métodos para hacer y usar los microorganismos descritos modificados genéticamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1B. Perfil de fermentación de B. coagulans cepa QZ4 (Aldh) a pH 5.0 (figura 1A) y pH 7.0 (figura 1 B). Las fermentaciones se hicieron en fermentadores pequeños con control de pH en LB con glucosa. La concentración inicial dé glucosa fue de 30 g/l a pH 5.0, y 50 g/l a pH 7.0.

Figuras 2A-2B. Perfil de fermentación de B. coagulans cepa QZ5 (Aldh, AalsS) a pH 5.0 (figura 2A) y pH 7.0 (figura 2B). Las fermentaciones se hicieron en fermentadores pequeños con control de pH mediante la adición automática de KOH en LB + glucosa (30 g/l).

Figura 3. Selección basada en crecimiento de B. coagulanscepa QZ5 en fermentadores pequeñosen LB + glucosa (30 g/l) a pH 5.0,llevando a la cepa QZ13.

Figura 4. Selección basada en crecimiento de B. coagulans cepa QZ13 en fermentadores pequeños en LB + glucosa (50 g/l) a pH 7.0, llevando a la cepa QZ14.

Figura 5. Selección basada en crecimiento de B. coagulans cepa QZ1 en fermentadores pequeños en LB + glucosa a pH 7.0, con concentración creciente de glucosa, llevando a la cepa QZ15. El medio también contenía 20 g/lde CaCÜ3. La concentración inicial de glucosa fue de 50 g/l. Después de la tercera transferencia se aumentó la concentración de glucosa a 60 g/l. Después de la quinta transferencia la concentración de glucosa del medio fue de 100 g/l.

Figura 6. Perfil de fermentación deS. coagulans cepa QZ19 a pH 7.0 en LB + glucosa.con 20 g/lde CaC03. No fue detectable ácido L(+)-lácticoni formiatoen el caldo de fermentación.

Figura 7. Esquema ejemplar de la producción de cepas bacterianas productoras de ácido D(-)-láctico. En general, la cepa/célula bacteriana objetivoserá modificada genéticamente para anular la actividad de la L-lactato deshidrogenasa y acetolactato sintasa, reacciones en competencia en el nodulo de piruvato. Después, las células se cultivarán bajo condiciones limitativas de O2 a un pH entre 4.5 y 5.5. Las células que producen rendimiento celular y/o producción de ácido láctico más alta en comparación con la cepa progenitora se seleccionan para desarrollo ulterior. Después, las células seleccionadas se cultivan bajo condiciones limitativas de 02/anaeróbicas a un pH entre 6.5 y 7.5 Las células que producen rendimiento celular y/o producción de ácido láctico más alta en comparación con la cepa seleccionada original, se seleccionan para desarrollo ulterior o para usarse en la producción de ácido D(-)-láctico. Enalgunos aspectos preferidos de la invención las células usadas para la producción de ácido D(-)-láctico producen por lo menos 60 g de ácido láctico por litro de medio de cultivo (preferiblemente en el transcurso de 48 horas aproximadamente).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 codifica el gen de lactato deshidrogenasa de 8. coagulans P4-102B.

La SEQ ID NO: 2 codifica la acetolactato sintasa de B. coagulans P4-102B.

La SEQ ID NO: 3 codifica la piruvato formiato liasa (pff) de B. coagulans ?4-?02?.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente solicitud provee microorganismos modificados genéticamente que tienen la capacidad de producir ácido D(-)-láctico. En varias modalidades de este aspecto de la invención, los microorganismos pueden tener el gen de lactato deshidrogenasa cromosómico (Idh), el gen de piruvato formiato liasa cromosómico (pflB), la enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa {alsD) y/o el gen de acetolactato sintasa cromosómico (a/sS) desactivados; y el microorganismo es un Bacillus spp., tal como Bacillus coagulans. Los microorganismos producidos de acuerdo con la presente descripción producen ácido D(-)-láctico en cantidades de por lo menos 60 g/l de medio de cultivo (por ejemplo, 70g/l, 80g/l, 90g/l o 100g/l). En algunos aspectos de la invención, el gen de lactato deshidrogenasa cromosómico (Idh), el gen de piruvato formiato liasa cromosómico (pflB), y el gen de acetolactato sintasa cromosómico (a/sS) están desactivados. Otros aspectos proveen microorganismos en los que el gen de lactato deshidrogenasa cromosómico (Idh) y el gen de acetolactato sintasa cromosómico (a/sS) están desactivados. Otros aspectos de la invención proveen microorganismos que tienen varias combinaciones de actividad enzimática anulada (véase la exposición que se da más abajo).

El término "gen" incluye genes estructurales y regiones que tienen funciones reguladoras específicas, tales como promotores y operadores. El término "gen" incluye el marco de lectura abierto del gen y también las secuencias reguladores en dirección 5' y 3'. La región reguladora de dirección 5' también se denomina la región de promotor del gen. La región reguladora de dirección 3' también se denomina la región de secuencia terminadora. La desactivación de Idh y alsS se puede efectuar por supresión de secuencias de nucleótidos en el ADN cromosómico que: (1) están implicadas en la regulación de transcripción del promotor, operador, o similar del gen Idh, pflA, pflB, alsD y/o alsS; (2) un desplazamiento de marco introducido de modo que la lactato deshidrogenasa, piruvato formiato liasa, enzima activadora de piruvato formiato liasa, alfa-acetolactato descarboxilasay/oacetolactato sintasa no sean expresadas como proteínas activas; o (3) se ha suprimido todo el gen estructural, o una porción del mismo, que codifica lactato deshidrogenase, piruvato formiato liasa, enzima activadora de piruvato formiato liasa, alfa-acetolactato descarboxilasa y/oacetolactato sintasa. En algunas modalidades preferidas se proveen microrganismos en los que se ha suprimido todo el gen que codifica lactato deshidrogenase, piruvato formiato liasa, enzima activadora de piruvato formiato liasa, alfa-acetolactato descarboxilasay/oacetolactato sintasa. En SEQ ID NOs: 1 y 2 se proveen secuencias ejemplares para el gen de lactato deshidrogenase y el gen de acetolactato sintasa, el gen de alfa-acetolactato descarboxilasa, respectivamente. La secuencia codificadora de piruvato formiato liasa y enzima activadora de piruvato formiato liasa se provee en la SEQ ID NO: 3.

La frase "porción de un gen estructural" o todo el gen estructural, o "una porción del mismo", se pueden referir a la supresión de un solo nucleótido en la porción de gen estructural. La supresión es preferiblemente una supresión de cinco a diez nucleótidos en el gen estructural, preferiblemente de diez a 50 nucleótidos, muy preferiblemente de 50 a 100 nucleótidos. En algunos aspectos de la invención se provee la supresión de lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa (pflB), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (a/sD) y/oacetolactato sintasa (a/sS). Los marcos de lectura abiertos de los genes que codifican las enzimas antes mencionadas se indican en el listado de secuencias. Como se describe abajo, puede ser suprimido/afi y cualquier combinación de pflA, pfíB, alsS y alsD.

En un aspecto, la mutación de los genes en el cromosoma del microorganismo se efectúa sin introducir genes o porciones de los mismos de fuentes exógenas. Otro aspecto provee la mutación de genes endógenos mediante la introducción de una o más mutaciones de punto o mediante la introducción de uno o más codones de detención en el marco de lectura abierto del gen endógeno que está siendo modificado. En otro aspecto, el marco de lectura abierto del gen endógeno puede ser suprimido del ADN cromosómico.

Con la finalidad de seleccionar una cepa bacteriana con un gen mutado que tiene un fenotipo deseado, en algunos aspectos se puede introducir una secuencia de nucleótidos exógena para desactivar un gen objetivo. La secuencia de nucleótidos exógena introducida en el genoma microbiano puede ser retirada subsiguientemente de manera sin interrupción, sin dejar ninguna secuencia de nucleótidos exógena residual.

En una modalidad se seleccionan biocatalizadores por su capacidad para producir ácido D(-)-láctico con un título, rendimiento y productividad volumétrica altos. Una modalidad provee un biocatalizador capaz de producir por lo menos 0.5 moles de ácido D(-)-láctico por cada mol consumido de fuente de carbono (por ejemplo, glucosa). Opcionalmente, estos biocatalizadores pueden ser seleccionados usando selección basada en crecimiento.

El término "título" significa la concentración molar de un compuesto particular en el caldo de fermentación. De esta manera, en el proceso de fermentación para la producción de ácido D(-)-láctico, un título de 100 mM significaría que el caldo de fermentación en el momento de la medición contiene 100 mmoles de ácido láctico por litro del caldo de fermentación.

El término "rendimiento" se refiere a los moles producidos de compuesto particular por mol de materia prima consumida durante el proceso de fermentación. De esta manera, en el proceso de fermentación para la producción de ácido D(-)-láctico usando glucosa como materia prima, el término rendimiento se refiere al número de moles de ácido D(-)-láctico producidos por mol de glucosa consumida.

El término "productividad volumétrica" se refiere a la cantidad de compuesto particular en gramos producida por unidad de volumen por unidad de tiempo. De esta manera, un valor de productividad volumétrica de 0.9 g G1 h"1 para ácido D(-)-láctico significaría que se acumulan 0.9 gramos de ácido D(-)-láctico en un litro de caldo de fermentación durante una hora de crecimiento. La escala de productividad volumétrica de los organismos modificados genéticamente descritos en la presente puede ser de hasta 4 g G1 h'1, por ejemplo QZ19 puede alcanzar una productividad volumétrica mayor de 3 g l'V1.

Los términos "título", "rendimiento" y "productividad volumétrica", como se usan en esta descripción, también incluyen "título normalizado", "rendimiento normalizado" y "productividad volumétrica normalizada". En la determinación del título normalizado, rendimiento normalizado y productividad volumétrica normalizada, también se toma en consideración el volumen de los reactivos neutralizantes añadido al recipiente de fermentación para mantener el pH del medio de crecimiento.

El término "(p/v)" se refiere a la cantidad de una sustancia (en gramos) por litro (g/l).

Los términos "diseñado por ingeniería genética" o "modificado genéticamente", como se usan en la presente, se refieren a la práctica de alterar la expresión de una o más enzimas en un microorganismo manipulando su ADN genómico. Los términos "microorganismo modificado genéticamente", "cepa bacteriana modificada genéticamente (GMBS)" y "biocatalizador" se pueden usar intercambiablemente en esta descripción. En algunas modalidades se pueden modificar genéticamente varias Bacülus spp., por ejemplo, cepas de Bacülus coagulans, cepas de Bacillus licheniformis, cepas de Bacillus subtilis.cepas de Bacillus amyloliquifaciens, cepas óeBacillus megaterium, cepas de Bacillus macerans, Paenibacillusspp. oGeobacillusspp., tales como cepas deGeobacillusstearothermophilus. Se puede obtener otra cepa deBacillus de las colecciones de cultivo como la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) y esta se puede modificar genéticamente como se describe en la presentepara la producción de ácido D(-)-láctico. En algunas modalidades de la invención, la cepaSuy27-13 de B. coagulansy /ocepas de fí. coagulansque contienen la mutación de punto encontrada en Suy27-13.se pueden excluir específicamentedel alcance de las reivindicaciones.

De esta manera, en un aspecto se provee un procedimiento deproducción de ácido láctico en cantidades comercialmente significativas a partir de compuestos de carbono por medio de cepas bacterianas modificadas genéticamente. Los microorganismos adecuados para la producción de ácido D(-)-láctico se pueden cultivar en procedimientos de un paso o dos pasos como se describe en la presente. Para cualquiera de los pasos del método, los microorganismos modificados genéticamente se pueden mantener a una temperatura entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 65 °C. Varias modalidades contemplan cultivar los microorganismos a una temperatura de aproximadamente 30 °C, 37 °C o 55 °C. Otras modalidades contemplan el cultivo de los microorganismos a una temperatura entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 65°C, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 55°C, entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C, o entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 50°C.

La "mutación" o "desactivación" se refiere a modificaciones genéticas hechas al gen que incluye el marco de lectura abierto, región reguladora de dirección 5' y región reguladora de dirección 3'. Las mutaciones génicas resultan en una regulación negativa o inhibición completa de la transcripción del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Las mutaciones génicas se pueden lograr suprimiendo toda la región codificadora del gen (ORF) o una porción de la secuencia de nucleótidos codificadores (ORF), introduciendo una mutación de desplazamiento de marco dentro de la región codificadora, introduciendo una mutación de codificación errada, inserción de secuencias que interrumpen la actividad de la proteína codificada por el gen, introduciendo un codón de detención, o cualquier combinación de las mutaciones génicas antes mencionadas.

Como se usa en la presente, el término "exógeno" significa que una molécula o una actividad derivada del exterior de una célula es introducida en el organismo microbiano hospedero. En el caso de una molécula de ácido nucleico exógeno introducido en la célula microbiana, el ácido nucleico introducido puede existir como un plásmido independiente o se puede llegar a integrar en el ADN cromosómico del hospedero. En algunas modalidadesno se encuentra ácido nucleico exógeno que codifique una proteínaen el biocatalizador descrito en la presente. Otras modalidades permiten que el biocatalizador contenga genes exógenos. Cuando está presente, un gen exógeno (secuencia de ácido nucleico) se puede introducir en la célula microbiana en una forma expresable con sus propias secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y terminador. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico exógeno se puede llegar a integrar en el ADN cromosómico del hospedero y puede estar bajo el control de las secuencias reguladoras del hospedero.

El término "endógeno" se refiere a las moléculas y actividad que están presentes naturalmente (nativamente) dentro de la célula hospedera. Cuando se usa haciendo referencia a una actividad biosintética, el término "exógeno" se refiere a una actividad que es introducida en el organismo del hospedero de referencia. La fuente puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico codificante homólogo o heterólogo que expresa la actividad referida después de su introducción en el organismo microbiano hospedero. Si el ácido nucleico que codifica una proteína es obtenido de la misma especie del organismo microbiano, es referido como ADN homólogo. Si el ácido nucleico deriva de una especie microbiana diferente es referido como ADN heterólogo. Sin importar la naturaleza del ADN, ya sea homólogo o heterólogo, cuando se introduce en una célula hospedera, el ADN y también la actividad derivada de ese ADN introducido son referidos como exógenos. Por lo tanto, la expresión exógena de un ácido nucleico codificante puede utilizar cualquier ácido nucleico codificante, heterólogo u homólogo, o ambos.

Un aspecto provee GMBS que muestra títulos sorprendentes, rendimiento alto y productividad volumétrica significativa para ácido D(-)-láctico. Los microorganismos descritos en la presente se pueden usar en un procedimiento de producción para producir ácido D(-)-láctico usando varios azúcares. En una modalidad, las modificaciones genéticas incluyen solo la manipulación de genes dentro del genoma nativo del microorganismo. En esa modalidad, no está presente material genético exógeno, tal como plásmidos que llevan genes de resistencia a antibiótico o cualquier otra secuencia de nucleótidos exógena que codifique ciertas proteínas enzimas en la cepa bacteriana, para la producción del ácido D(-)-láctico.

La presente invención combina la técnica de modificaciones genéticas específicas con un procedimiento de selección basado en crecimiento para obtener cepas que muestran rendimiento, título y productividad volumétrica altas para la producción de ácido D(-)-láctico. Las cepas microbianas modificadas genéticamente por medio de los métodos descritos se pueden desarrollar subsiguientemente por varias generaciones bajo varias condiciones, tales como pH bajo, para seleccionar un clon que produzca ácido D(-)-láctico en cantidades más altas que la cepa progenitora original, y/o que tenga un rendimiento celular más alto en comparación con la cepa progenitora. A este respecto, en la figura 7 se muestra un esquema ejemplar. Este procedimiento para la selección basada en crecimiento de un clon con el fenotipo preferido es referido como selección basada en crecimiento.

Durante la selección basada en crecimiento, la cepa modificada genéticamente es transferida repetidamente a medio nuevo durante un tiempo para obtener un clon que exhiba un crecimiento celular rápido/más alto, consumo rápido de diferentes fuentes de carbono, capacidad de usar simultáneamente muchos azúcares, capacidad para tolerar sustancias químicas tóxicas en la fuente de carbono y rendimiento de producción y productividad altas del ácido orgánico deseado unto con la producción baja de otros ácidos orgánicos. Durante la selección basada en crecimiento se debe poner atención en seleccionar el clon con los fenotipos deseables expuestos arriba. Un clon originado del procedimiento de selección que muestra una velocidad de crecimiento muy buena pero que no ha mejorado en el rendimiento del ácido orgánico deseado no es un clon deseable. En la práctica de los métodos descritos, las cepas se seleccionan empezando el cultivo de una cepa modificada genéticamente de forma aeróbica y realizando pases en serie de la cepa bajo condiciones que limitan el oxigeno en el sistema de cultivo (por ejemplo, el fermentador). Los microorganismos - modificados genéticamente capaces de crecer bajo condiciones limitativas de oxígeno se seleccionan para continuar los pases hasta que se alcanzan condiciones microaeróbicas o anaeróbicas. Después, los microorganismos se cultivan anaeróbicamente bajo condiciones de pH creciente y se seleccionan basándose en la producción de D(-)-lactato bajo las condiciones del cultivo. Para cualquiera de los pasos del método, los microorganismos modificados genéticamente se pueden mantener a una temperatura entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 65°C. Varias modalidades contemplan cultivar los microorganismos a una temperatura de aproximadamente 30°C, 37°C o 55°C. Otras modalidades contemplan cultivar los microorganismosa una temperatura entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 65°C, entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 55°C, entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C, o entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 50°C.

Las manipulaciones genéticas se pueden hacer en varias etapas diferentes, acompañadas por selección basada en crecimiento entre las etapas de manipulaciones genéticas. Las manipulaciones genómicas incluyen alterar las secuencias de ADN endógeno o quitar completamente secuencias de ADN específicas del ADN genómico. Las manipulaciones genéticas también pueden incluir insertar una secuencia de ADN ajeno dentro de la secuencia de ADN genómico del microorganismo. En algunas modalidadeslas manipulaciones genéticas se realizan por medio de la remoción de secuencias de ADN específicas del ADN genómico de los microorganismos sin introducir ningún ADN ajeno. Algunas manipulaciones genéticas necesarias para desactivar la expresión de un gen que codifica un producto de proteína particular requierenla inserción de una secuencia de ADN ajeno en el genoma del microorganismo, para seleccionar un clon con la modificación genética deseada. Por ejemplo, se pueden usar genes marcadores de antibiótico exógenos para desactivar insercionalmente los genes endógenos y para seleccionar el clon con el genotipo deseado. En una modalidad de la presente invención, las secuencias de ADN exógeno introducido son removidas finalmente del ADN genómico del microorganismo, de modo que el microorganismo al final del procedimiento de ingeniería genética tenga poco o nada del ADN exógeno en su ADN genómico resultante, particularmente ningún gen de ADN exógeno (o porciones del mismo). Varias técnicas de ingeniería genética necesarias para alcanzar los objetivos de la modalidad preferida de la presente invención son conocidas, incluyendo el uso de plásmidos que exhiben inestabilidad a temperaturas elevadas (véase por ejemplo el material y los métodos expuestos en la Sección de Ejemplos de esta solicitud). Cualquier publicación científica citada y también los documentos de patente se incorporan como referencia en su totalidad, con la finalidad de proveer los detalles necesarios para las técnicas de ingeniería genética útiles para la presente invención.

En una modalidad de la presente invención, uno o más de los genes que codifican las proteínas que se sabe funcionan en rutas fermentativas, son desactivados por medio de una o más manipulaciones genéticas o técnicas de ingeniería genética como se expone arriba. Los genes y enzimas que pueden ser desactivados incluyen: Idh, lactato deshidrogenasa; y alsS, acetolactato sintasa.

Por consiguiente se proveen las siguientes modalidades no limitativas: 1.- Una célula bacteriana que comprende modificaciones genéticas que causan la anulación de la actividad enzimática para: a) lactato deshidrogenasa y opcionalmenteacetolactato sintasa y/o piruvato formiato liasa; b) lactato deshidrogenasa y acetolactato sintasa; c) lactato deshidrogenasa, acetolactato sintasa y piruvato formiato liasa; o d) cualquiera de las siguientes combinaciones de actividad enzimática: lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa; lactato deshidrogenasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + acetolactato sintasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshldrogenasa + piruvato formiato liasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa + acetolactato sintasa. 2. - La célula bacteriana de acuerdo con la modalidad 1 , que comprende además modificaciones genéticas que causan la anulación de una actividad enzimática deseada. 3. - La célula bacteriana de acuerdo con la modalidad 1 o 2, que comprende además modificaciones genéticas que introducen genes exógenos en dicha célula bacteriana. 4. - La célula bacteriana de acuerdo con la modalidad 1 o 2, en donde dicha modificación genética comprende la mutación de un gen que codifica lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa (p/78), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (a/sD) y/o acetolactato sintasa (a/sS), o la supresión de una porción o todo el gen que codifica lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa (pflB), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (alsD) y/o acetolactato sintasa (alsS). 5. - La célula bacteriana de acuerdo con la modalidad 4, la mutación de dichos genes comprende la introducción de una o más mutaciones de punto o la introducción de uno o más codones de detención en el marco de lectura abierto del gen. 6. - La célula bacteriana de acuerdo con las modalidades 1 -3, en donde dicha modificación genética comprende una mutación de punto o una supresión en la secuencia codificadora/marco(s) de lectura abierto(s) de lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa (pflB), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (alsD) y/o acetolactato sintasa (a/sS), o la inserción de una secuencia exógena en la región codificadora/marco(s) de lectura abierto(s) de lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa (pflB), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (alsD) y/o acetolactato sintasa (alsS). 7 - La célula bacteriana de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 , 2, 4, 5 o 6, en donde dicha célula bacteriana no contiene genes exógenos o porciones de los mismos. 8. - La célula bacteriana de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 , 2, 4, 5 o 6, en donde la actividad enzimática de L-lactato deshidrogenasa, piruvato formiato liasa y/o acetolactato sintasa es anulada por recombinación homologa, usando opcionalmente un plásmido sensible a la temperatura. 9. - La célula bacteriana de acuerdo con la modalidad 8, en donde dicha modificación genética comprende la supresión parcial o total de nucleótidos que codifican acetolactato sintasa, lactato deshidrogenasa y/o piruvato formiato liasa. 10.- La célula bacteriana de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-9, en donde: a) dicha bacteria es una Bacillus spp., tal comoBacillus coagulaos, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus pumilus, Bacillus circulans o Bacillus thiaminolyticus; y b) en donde Bacillus coagulaos Suy27-13 puede ser excluida opcionalmente del alcance de las reivindicaciones. 11.- Una célula bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-10, en donde dicha célula bacteriana modificada genéticamente es QZ15 o QZ19. 12.- Un método de producción de ácido D(-)-láctico, que comprende cultivar una célula bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-1 1 en un medio que comprende una fuente de carbono, bajo condiciones que permiten la producción del ácido D(-)-láct¡co. 13. - El método de acuerdo con la modalidad 12, que comprende además aislar o purificar el ácido D(-)-láctico. 14. - El método de acuerdo con la modalidad 13, en donde dicha cepa bacteriana se cultiva bajo condiciones anaeróbicas. 15. - El método de acuerdo con la modalidades 12-14, en donde dicho medio comprende entre 2% y 20% (p/v) de fuente de carbono. 16. - Un método de creación de una célula bacteriana modificada genéticamente productora de ácido D(-)-láctico, que comprende: a) anular la actividad de lactato deshidrogenasa y acetolactato sintasa en dicha célula bacteriana; b) cultivar dicha célula bacteriana a un pH entre 3.0 y 6.0 bajo condiciones aeróbicas y/o limitativas de oxígeno en un medio que contiene una fuente de carbono; c) seleccionar una célula bacteriana que exhibe un rendimiento celular y/o producción de ácido D(-)-lácticomayor en comparación con la cepa progenitora; d) cultivar la célula bacteriana seleccionada a un pH entre 6.5 y 8.0 bajo condiciones anaeróbicas en un medio que contiene una fuente de carbono; y e) seleccionar una célula bacteriana que exhibe un rendimiento celular y/o producción de ácido D(-)-láctico mayor en comparación con la célula bacteriana progenitora o la célula bacteriana seleccionada en el paso d). 17. - El método de acuerdo con la modalidad 16, en donde el paso b) se efectúa a un pH de: a) aproximadamente 4.5 o 5.5; o b) aproximadamente 5.0. 18. - El método de acuerdo con la modalidad 16, en donde el paso d) se efectúa a un pH de: a) aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5; o b) aproximadamente 7.0. 19. - El método de acuerdo con las modalidades 16-18, en donde los pasos d) y e) se repiten en medio que contiene cantidades crecientes de una fuente de carbono. 20. - El método de acuerdo con las modalidades 16-18, en donde los pasos b) y c) se repiten en medio que contiene cantidades crecientes de una fuente de carbono. 21. - El método de acuerdo con las modalidades 16-18, en donde los pasos b) - e) se repiten en medio que contiene cantidades crecientes de una fuente de carbono. 22. - El método de acuerdo con la modalidades 12-21 , en donde la fuente de carbono es glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosas, celulosa, glicerol, o combinaciones de las mismas. 23. - El método de acuerdo con las modalidades 12-15, en donde dicha fermentación se realiza bajo condiciones anaeróbicas a un pH de: a) aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5; o b) aproximadamente 7.0. 24. - El método de acuerdo con las modalidades 12-22, en donde dicha célula bacteriana modificada genéticamente produce por lo menos 60 g de ácido láctico por litro, por lo menos 80 g de ácido láctico por litro, o por lo menos 90 g de ácido láctico por litro de medio de fermentación en el transcurso de 48 horas del inicio de la fermentación. 25. - El método de acuerdo con la modalidades 12-24, en donde el pH del medio usado para cultivar dicha célula bacteriana modificada genéticamente es mantenido mediante la adición automática de ácido o base. 26. - El método de acuerdo con las modalidades 16-23, en donde dicha célula bacteriana modificada genéticamente se cultiva inicialmente bajo condiciones aeróbicas, y se pasa seriadamente bajo condiciones que reducen la cantidad de oxígeno presente en el sistema de cultivo hasta que se alcanzan condiciones microaeróbicas o anaeróbicas. 27. - El método de acuerdo con la modalidades 16-23 o 26, en donde la célula bacteriana es una Bacillus spp., tal comoBacillus coagulans, Bacillus lichenifonmis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus pumilus, Bacillus circulaos o Bacillus thiaminolyticus; en dondeSac/7/us coagulans Suy27- 3 se puede excluir opcionalmente. 28. - La célula bacteriana o método de cualquiera de las modalidades 1-10 y 12-27, en donde la célula bacteriana tiene una de las siguientes combinaciones de desactivaciones de gen: Idh + pflB; Idh + pflA; idh + pflA + pflB; Idh + alsS; Idh + alsD; Idh + alsS + alsD; Idh + pflB + alsS; Idh + pflB + a/sD; /dft + pflA + a/sS; /c#7 + pflA + alsD; Idh + pflA + pflB + alsS; Idh + pflA + pflB + a/sD; /aft + pflA + a/sD + a/sS; Idh + ? ß + a/sD + alsS; Idh + pflA + pflB + a/sD + alsS; o anulación de una de las siguientes combinaciones de actividad enzimática: lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa; lactato deshidrogenasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + acetolactato sintasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa + acetolactato sintasa; lactato deshidrogenasa + enzima activadora de piruvato formiato liasa + piruvato formiato liasa + alfa-acetolactato descarboxilasa + acetolactato sintasa. 29. - La célula bacteriana de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-11 o 28, en donde la célula bacteriana produce ácido D(-)-láctico a una temperatura de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 65°C; entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 65°C¡ entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 55°C; entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C; entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 50°C; o a una temperatura de aproximadamente 30°C, aproximadamente 37°C, o aproximadamente 55°C. 30. - El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 12-28, en donde el método comprende cultivar la célula bacteriana a una temperaturade entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 65°C; entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 65°C; entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 55°C; entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C; entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 50°C; o a una temperatura de aproximadamente 30°C, aproximadamente 37°C, o aproximadamente 55°C.

Los microorganismos se depositaron en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola, 1815 N. University Street, Peoría, Illinois, 61604, EE. UU. (cuadro 5). Estos cultivos se depositaron bajo condiciones que aseguran que los cultivos estarán disponibles durante la pendencia de esta solicitud de patente para la persona determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas que tenga derecho a lo mismo, según el título 37, 1.14, del CFR, y título 35, 122, del USC. Los depósitos están disponibles según sea requerido por las leyes de patente extranjeras en los países en donde se presenten los equivalentes de la presente solicitud.. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de los depósitos no constituye una licencia para la práctica de la presente invención en menoscabo de los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.

Además, los presentes depósitos de cultivo serán guardados y se pondrán disponibles al público de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, se guardarán con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante un periodo de por lo menos cinco años después de la petición más reciente de la provisión de una muestra de los depósitos, y en cualquier caso, durante un periodo de por lo menos 30 (treinta) años después de la fecha del depósito, o durante la vigencia de cualquier patente que pueda expedirse que revele los cultivos. El depositante reconoce la obligación de reemplazar los depósitos si el depositario fuera incapaz de proveer una muestra cuando le sea solicitada, debido a la condición de los depósitos. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los presentes depósitos de cultivo serán retiradas irrevocablemente tras la concesión de una patente que los revele.

Los siguientes ejemplos se proveen como una manera de ilustrar la presente invención. Estas invenciones no limitan en modo alguno el alcance de esta invención. Una persona experimentada en el campo de la microbiología industrial sería capaz de practicar la presente invención en varias modalidades diferentes sin violar el espíritu de la presente invención.

Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones referidas o citadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad, incluso todas las figuras y cuadros, siempre que no sean inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta especificación.

Los siguientes son ejemplos que ilustran los procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no se deben considerar limitativos. Todos los porcentajes son peso y todas las proporciones de mezcla de disolventes son en volumen a menos que se indique de otra manera.

EJEMPLO 1 Construcción de un Bacillus coa ulans termotolerante productor de ácido D(-)-láctico Materiales y Métodos Cepas bacterianas y plásmidos El 8. coagulaos de tipo silvestre, cepa P4-102B, se describió anteriormente (27). La Escheríchia coli cepaTopl O (Invitrogen) y Bacillus subtilis cepa HB1000 (1 1 ) se usaron como hospederos durante la construcción de varios plásmidos usados en este estudio. El plásmido pGK12 lleva genes de resistencia a cloranfenicol y eritromicina y se replica en varias bacterias Gram-positivas y E. coli (17, 21). Aunque este plásmido tiene una gama amplia de hospederos, su replicación está restringida naturalmente a temperaturas <42°C. Esta naturaleza sensible a la temperatura de la replicación del plásmido pGK12 a 50°C, provee la oportunidad de seleccionar integrantes de ADN cromosómico de ß. coagulans que crecen a 50-55 °C. El plásmido pGK12 y sus derivados se mantuvieron en B. subtilis cepa HB1000 a 37°C. Cuando se transformaron en B. coagulans, los transformantes se seleccionaron y se mantuvieron a 37°C. Las cepas mutantes de ß. coagulans y los plásmidos usados en la construcción de los mutantes se indican en el cuadro 1.

Medio y condiciones de crecimiento Se usó caldo L (LB) (19) como el medio rico para el cultivo de bacterias a pH 5.0 o 7.0 según fuera necesario. Se esterilizó glucosa separadamente y se añadió al medio a la concentración indicada antes de la inoculación. Al medio LB se le agregócuando fue necesario cloranfenicol, eritromicina y ampicilina a 7.5 mg/l, 5 mg/l y 100 mg/l, respectivamente. Se preparó medio de carbonato de calcio cubriendo medio, LB-agar suplementado con glucosa (2%, p/v) con 2.5 mi de agar de CaCÜ3 (CaCÜ3 sólido suspendido en agua (1 % p/v) con 1.5% de agar) como se describió anteriormente (30).

Se desarrollaron cultivos aeróbicos en un agitador a 200 rpm. Las fermentaciones se hicieron en fermentadores pequeños a la medida (2) o termentadores de 2.5 I (New Brunswick Scientific Bioflo 110). El pH del cultivo se mantuvo al valor establecido mediante la adición automática de KOH 2N o 6N. Se agregó CaCO3 sólido (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) al principio de la fermentación según fuera necesario, a una concentración de 2.0% (p/v), a menos que se especifique de otra manera. El inoculo para estos cultivos se desarrolló aeróbicamente en el mismo medio a 50 °C durante la noche, y las fermentaciones se iniciaron con 1% (v/v) de inoculo. Se tomaron muestras periódicamente para determinar los productos de fermentación y la concentración residual de azúcar.

Construcción de mutantes de supresión de B. coagulaos El aislamiento de mutantes de supresión de B. coagulans se basó en los métodos descritos previamente, en donde un ADN plasmidico que contiene los dos extremos del gen objetivo se integró en el cromosoma en el sitio objetivo con la homología de secuencia de ADN apropiada, usando un solo evento de recombinación. Tales recombinantes con la resistencia a antibiótico apropiada se pueden identificar fácilmente usando plásmidos condicionales de replicación a la temperatura restrictiva que elimina el plásmido intacto del citoplasma (13). Subsiguientemente el ADN plasmidico y el gen asociado de resistencia a antibiótico se separandel cromosoma por medio de una sola recombinación homologa de las diferentes partes de ADN plasmidico introducido y el ADN cromosómico apropiado, dejando una supresión del gen objetivo. En la construcción de una supresión del gen Idh de 8. coagulans, se utilizaron inicialmente vectores plasmldicos que no se pueden replicar en 8. coagulans. Sin embargo, usando estos plásmidos no se detectaron inserciones cromosómicas del ADN plasmídico introducido. Esto podría ser una consecuencia de la eficiencia de transformación del plásmido de la cepa P4-102B de 8. coagulans que es más baja (29) que la frecuencia de recombinación potencial del plásmido entrante al cromosoma. Para superar estos eventos de frecuencia baja se usó el plásmido pGK12 como el vehículo primario para la transferencia de ADN a B. coagulans para la construcción de la supresión. El plásmido pGK12 es estable en B. coagulans a 37 °C y no a 50 °C. La presencia del plásmido en cada célula de una población (109 UFC/ml) a 37 CC ayuda a superar la baja eficiencia de transformación del ADN plasmídico en esta bacteria. La población grande de células con el ADN plasmídico permite la selección de eventos de recombinación raros entre las regiones homologas del ADN plasmídico y el cromosoma. Estos recombinantes raros en la población de células que tienen el ADN plasmídico (junto con el gen de resistencia a antibiótico) integrado en el cromosoma, pueden ser identificados fácilmente cuando el ADN plasmídico es eliminado de las células después del crecimiento a 50-55 °C.

Aislamiento de la cepa mutante Mdh Para la construcción del derivado de supresión de Idh, se usaron dos series de iniciadores [iniciadores 9 (BsaAl), 10 (EcoRI) y 1 1 (EcoRI), 12 (Stul)] (cuadro 2) para amplificar separadamente los extremos 5' y 3' del gen Idh usando como molde el ADN genómico de B. coagulans cepa P4-102B. Estos iniciadores tienen secuencias de reconocimiento de endonucleasa únicas en el extremo 5'. Los dos fragmentos amplificados se digirieron con EcoRI y se ligaron entre sí. El producto de ligación se usó como molde (iniciadores 9 y 12) para producir un fragmento del gen Idh sin promotor que carece de una región de 100 p.b. en la mitad del Idh, empezando 431 p.b. desde la "A" en la "ATG" del gen Idh. Este fragmento se digirió con BsaAl y Stul y después se ligó al plásmido pGK12 digerido similarmente (plásmido pQZ44). La inserción en este plásmido se confirmó mediante secuenciación. El plásmido pQZ44 se transformó en la cepa P4-102B y se seleccionaron colonias resistentes a eritromicina a 37°C. Uno de los transformantes se cultivó a 50°C y se seleccionó un derivado resistente a eritromicina que también era L-LDH-negativo (aproximadamente 1 %) (cepa QZ3). La presencia del ADN plasmídico en el gen Idh en el cromosoma de la cepa QZ3 se confirmómediante la amplificación de PCR del ADN genómico con los iniciadores apropiados y determinando la secuencia del producto amplificado. Durante subcultivos en medio sin eritromicina, se encontró que la propiedad /oft-negativo de la cepa QZ3 era inestable y se aislaron rápidamente los reversores/dr7+. La cepa QZ3 se transfirió seriadamentea medio nuevo (1% v/v de inoculo) todos los días por 10 días a 55°C sin eritromicina. El cultivo final se diluyó y se sembró en placas de medio LB-agar. Después de desarrollar durante la noche a 50°C, las colonias se transfirieronduplicando el cultivo en placas de LB-agar, LB-agar + eritromicinay medio de carbonato de calcio (LB-agar suplementado con glucosay CaC03 (30)). Se escogieron las colonias que crecieron sobre LB-agar, pero no en LB-agar + eritromicina y no produjeron lactato basándose en la magnitud de clarificación del medio de carbonato de calcio, y estas colonias se analizaron ulteriormente en cultivos líquidos para determinar la producción de lactato. Es de esperar que la segunda recombinación produzca derivados sensibles a la eritromicina que carecen de actividad L-LDH debido a la supresión de 100 p.b. en el gen Idh. En estos experimentos, la frecuencia de Aldh fue 1 de 5000 colonias sensibles a la eritromicina. Uno de estos mutantes Aldh, la cepa QZ4, fue seleccionada para estudio ulterior.

Usando métodos similares no se pudo aislar un mutante Aldh usando resistencia al cloranfenicol como marcador selectivo. Sin importar el esqueleto del plásmido, se encontró que la presencia del gen de resistencia a cloranfenicol dirige la inserción del ADN plasmídico a un lugar único en el cromosoma que no está relacionado con el ADN cromosómico de B. coagulans en el plásmido (Su y Rhee, datos no publicados). Estos resultados indican que el gen de resistencia al cloranfenicol es inadecuado para la construcción de mutante en esta cepa de B. coagulans.

Construcción de un mutante Aa/s No es de esperar que un mutante derivado de la cepa QZ4, que carece de actividad de acetolactato sintasa, produzca acetoína y 2,3- butanodiol, productos de fermentación producidos por el muíante de Idh de 8. coagulans (30). Como un primer paso hacia la construcción de este mutante doble (Aldh Aals), las secuencias de alsD (alfa-acetolactato descarboxilasa) y a/sS (acetolactato sintasa) se amplificaron por PCR a partir del ADN genómico de la cepa P4-102B usando los iniciadores 17 y 21. Este fragmento de PCR se trató con polinucleótido cinasa T4 y se ligó en el vector plasmídico pUC19 digerido con Hincll para formar el plásmido pQZ45. Este inserto de ADN dealsSDen el plásmido pQZ45 se verificómediante secuenciacióncon los iniciadores apropiados. Se usaron los iniciadores 18 y 22 para amplificar por PCR un ADN de 2,380 p.b.a partir del plásmido pQZ45 que contiene solólas regiones codificadoras dealsSD (sin el promotor). El ADN amplificadose clonó en el sitio Hincll del plásmido pUC19, generando el plásmido pQZ45-1. Una región de 596 p.b.dela/sSse removió del plásmido pQZ45-1 después de digestión con Afel y Hincll, y se insertó un cásete de gen de resistencia a eritromicina en ese lugar. Este nuevo plásmido, pQZ54, sirvió como molde (iniciadores 18 y 22) para amplificarun fragmentocon los genesa/sSDcon una supresión de 596 p.b.ena/sS y el genque codifica la resistencia a eritromicina. El producto de PCR se fosforiló con polinucleótidocinasa y se ligócon el plásmido pGK12 digerido con BsaAl y Afel. El plásmido resultante, pQZ64,se transformó enfi. coagulans cepa QZ4 (Aldh) por electroporación, y las colonias resistentes a eritromicina se seleccionaron a 37°C. Usando los procedimientos anteriormente descritos para la construcción de Aldh, se introdujo una mutación AalsSen la cepa QZ4. Este método produjo varios mutantesdea/sSque difieren en sus velocidades de crecimientobajo condiciones tanto aeróbicas como anaeróbicas. Uno de los mutantes con velocidad de crecimiento más alta (cepa QZ5) fue seleccionado para estudio ulterior.

Transformación de E. coli, B. subtilis y B. coagulans La transformación de E. coli se basó en la técnica estándar descrita anteriormente. La cepa HB1000 de Bacillus subtilis se transformó de acuerdo con el procedimiento descrito por Boylan et al. (4) con algunos cambios. Las células de un cultivo nocturno en fase estacionaria de crecimiento en medio LB se inocularon (10% v/v) en 10 mi de medio de competencia modificado recién preparado (29), que contenía amortiguador de fosfato 100mM (pH 7.0), citrato trisódico 3mM, sulfato de magnesio 3mM, 2% de glucosa, 22 pg/ml de citrato férrico de amonio, 0.1 % de hidrolizado de caseína y 0.2% de glutamato de potasio, en un matraz Erlenmeyer de 125 mi, y se incubaron a 37 °C con agitación durante 3 h. Cuando la DOeoonm alcanzó cerca de 0.6, se transfirieron 0.6 mi del cultivo a un tubo de ensayo de 13 x 100 mm y se añadió el ADN a las células. Este cultivo con ADN se incubó en un aparato rotativo a 37 °C durante 2.5 horas. Las células se recogieron por medio de centrifugación a temperatura ambiente, se resuspendieron en 0.1 mi de LB y se sembraron en placas de LB-agar con los antibióticos adecuados. Las placas se incubaron a 37 °C y los transformantes se seleccionaron al día siguiente.

Para la transformación de S. coagulans de tipo silvestre P4-102B, células que crecieron en 10 mi de LB en un matraz de 125 mi a 50 °C (DO42onm 0.3) se inocularon (10% v/v) en 100ml de medio LB en un matraz de 1 litro. Las células se incubaron a 50 °C con agitación (200 rpm) durante aproximadamente 3-4 h, hasta que la DO a 420 nm alcanzó aproximadamente 0.3-0.5. Las células se recogieron por medio de centrifugación (4 °C; 4,300 x g; 10 min) y se lavaron tres veces con 30, 25 y 15 mi de medio SG (sacarosa 0.5 M, 10% de glicerol) enfriado con hielo. Estas células electrocompetentes se usaron inmediatamente. Se mezclaron 75 µ? de suspensión celular con 0.1 pg de ADN plasmídico y se transfirieron a una cubeta de electroporación enfriada (espacio 1 mm). Las condiciones de electroporación (electroporador Bio-Erad) se pusieron como onda cuadrada por 5 ms a 1.75 kV. Después de la electroporación, las células se transfirieron a 2 mi de medio RG prelavado (37 °C o 50 °C) (medio LB con sacarosa 0.5M, glucosa 55.6mM y MgCI2 20mM). Estas células se transfirieron a un tubo con tapa de rosca de 13 x 100 mm y se incubaron en un aparato rotativo de tubo durante 3 h a 50 °C, antes de sembrar sobre placas de medio selectivo de antibiótico. Para la transformación de plásmidos sensibles a la temperatura, la temperatura de regeneración fue de 37 °C y los cultivos se incubaron durante la noche. Para transformación del mutante QZ4, la concentración del ADN se incrementó a 1 g de ADN plasmídico, y la condiciones de electroporación se alteraron a un tiempo constante de 10 ms a 1.5 kV, 25 pF y 600 ohm.

Selección basada en crecimiento para mutantes espontáneos con el fenotipo deseado Puesto que cada cultivo microbiano tendrá un cierto número de mutaciones aleatorias espontáneas, un mutante con el fenotipo deseado puede aislarse fácilmente de esa población suministrando una condición de crecimiento que sostengapreferentemente el crecimiento del mutante específico. Puesto que el mutante Aldh AalsS, cepa QZ5, es defectuoso en crecimiento anaeróbico a un pH de cultivo de 5.0, es de esperar que las mutaciones que aumenten el crecimiento anaeróbico iniciando una nueva ruta de fermentación (por ejemplo, producción de ácido D(-)-láctico) tengan una ventaja de crecimiento sobre el resto de la población progenitora. La obtención de una velocidad más alta de crecimiento anaeróbico puede requerir más de una mutación (para iniciar la ruta de fermentación, para incrementar el flujo metabólico a esa ruta aumentando la concentración de enzima, etc.). La acumulación de mutaciones ventajosas, cada una suministrando un aumento creciente de la velocidad de crecimiento y/o producción de producto, puede ser lograda mediante la transferencia seriada de un cultivo hasta que el número deseado de mutaciones se acumule en una célula individual y se manifieste como un fenotipo identificable. Puesto que la cepa QZ5 es defectuosa de crecimiento anaeróbico, los cultivos se iniciaron en termentadores pequeños de pH controlado (250 mi en un recipiente de 500 mi) con aire como fase gaseosa. Conforme empieza a crecer el cultivo, la limitación severa de 02 limitaría el crecimiento y rendimiento celular. Un aumento adicional de la densidad celular dependería de la capacidad de la célula para fermentar ios azúcares presentes en el medio. Para aislar un derivado mutante de la cepa QZ5 que pudiera crecer anaeróbicamente, el cultivo del fermentador se subcultivó secuencialmente bajo las condiciones indicadas usando fermentadores pequeños de pH controlado. Las condiciones de transferencia se ajustaron a diferentes tiempos y cantidades de inoculo. En un promedio, las transferencias fueron después de cada 2 o 3 días de crecimiento con 2% de inoculo durante la adaptación a la concentración creciente de azúcar.

Determinación de la concentración de ARNm Para determinar la concentración del ARNm en B. coagulans, células desarrolladas bajo diferentes condiciones se recogieron por centrifugación (16,000 x g; 30 s; temperatura ambiente). El ARN se aisló usando el método de extracción de fenol ácido como se describió antes (30). La concentración total de ARN se determinó de la absorbancia a 260 nm (NanoVue, GE). La copia de ADNc se preparó con transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen) usando iniciadores específicos para el gen de elección. La concentración de ADNc (ARNm) se determinó por medio de PCR usando iniciadores específicos de gen y la mezcla de reacción de PCR, que contiene SYBR-verde (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El ciclo de umbral para cada reacción de PCR con diferentes concentraciones de ADNc se determinó y se comparó contra un molde de ADN estándar que también se corrió al mismo tiempo (16). De estos resultados se calculó una relación de la concentración de ARNm específico de gen presente en la muestra. Los resultados reportados son el promedio de por lo menos tres experimentos. Los iniciadores usados para la RJ-PCR se listan en el cuadro 2; iniciadores Idh - iniciadores 23 y 24, iniciadores pfl -iniciadores 25 y 26, iniciadores de pdhA (E1a)- iniciadores 27 y 28, iniciadores de d-ldh - iniciadores 29 y 30, iniciadores de ais - iniciadores 31 y 32, iniciadores de polA usados como control interno - iniciadores 33 y 34.

Análisis de enzima Para determinar el grado de actividad de PDH y LDH, las células se cultivaron en LB hasta que el cultivo alcanzó la fase de crecimiento exponencial media a tardía. Las células se cosecharon por centrifugación (10,000 x g, 10 min; temperatura ambiente), se lavaron una vez con 10 mi de amortiguador de fosfato (50 mM, pH 7.0) y se resuspendieron en 5.0 mi del mismo amortiguador de fosfato. Las células se lisaron pasándolas a través de una celda de presión French ( 37.9 MPa). Todas las operaciones después de este paso fueron a 4 °C. El extracto celular se centrifugó a 12,000 x g durante 30 min para separar los desechos celulares, y el sobrenadante se centrifugó de nuevo a 100,000 x g (Beckman) durante 1 h para separar las partículas grandes y vesículas de membrana. El sobrenadante se usó para el análisis de la enzima. La actividad de PDH se basó en la reducción dependiente de piruvato de NAD+ a 340 nm (e = 6,220 M~1 crrf 1) como se describió anteriormente (33). Cada mi de mezcla de reacción contenía amortiguador de fosfato de potasio (50 mM; pH 7.5), pirofosfato de tiamina (0.4 mM), CoA (0.13 mM), MgCI2-6H20 (2 mM), ditiotreitol (2.6 mM), NAD+ (0.75 mM) y extracto crudo. La reacción se inició agregando piruvato (5 mM). La actividad de LDH se determinó como se describió anteriormente (35) como la oxidación de NADH en presencia de piruvato. Cada mi de mezcla de reacción contenía amortiguador de fosfato de potasio (50 mM; pH 7.5), NADH (0.1 mM) y extracto crudo. La reacción se inició agregando piruvato (25 mM). La concentración de proteína se determinó mediante el método de Bradford con albúmina de suero bovino como estándar (5).

Métodos analíticos La glucosa y los productos de fermentación se determinaron mediante HPLC con la columna de exclusión iónica Aminex HPX-87H (300mm x 7.8mm) como se describió anteriormente (32). Los isómeros ópticos de los ácidos D-(-)- y L-(+)-láctico se determinaron mediante HPLC con una columna Chirex 3126(D)-penicilamina (150 x 4.6 mm, 5 mieras) (Phenomenex), con CuS04 2 mM como eluente. El D-(-)-lactato también se analizó mediante un método basado en enzima con D-lactato deshidrogenasa (Sigma Chemical Co.: San LuisMisuri).

Materiales Las sustancias bioquímicas eran de Sigma Chemical Co. (San Luis Misuri) y las sustancias orgánicas e inorgánicas eran de Fisher Scientific (Pittsburgh, Pensilvania). Los reactivos y suministros de Biología Molecular eran de New England Biolabs (Ipswich, Massachusetts), Invitrogen o Bio-Rad Laboratories.

Resultados y discusión Las bacterias esporogénicas del ácido láctico como B. coagulans producen ácido L(+)-láctico como el producto de fermentación principal sin importar la fuente de carbono (glucosa, xilosa, celobiosa, etc.) (10, 27, 28). En apoyo de esto, el ARNm que codifica el gen /dftestuvo presente a la concentración más alta entre los genes que codifican proteínas en un nodulo de piruvato, sin importar el pH de crecimiento o la etapa de crecimiento (cuadro 3) (3). Se ha identificado un gen que codifica D(-)-lactato deshidrogenasa {IdhA) en 8. coagulans, que se ha clonado y expresado en Escherichia coli en una forma activa. Sin embargo, la concentración de D(-)-lactato en el caldo de fermentación de B. coagulans nunca superó el 5% del total de ácido láctico producido, y la mayoría de los caldos de fermentación en realidad carecen de ácido D(-)-láctico detectable (27). La concentración del ARNm de IdhA en la célula fue menor de 0.5% de la concentración del ARNm de Idh (cuadro 3).

Durante la fermentación de azúcar, 8. coagulans también produce pequeñas cantidades de acetato, etanol y formiato, especialmente durante la fermentación de pentosas como la xilosa, indicando la presencia de una piruvato formiato liasa activa (27). Aunque los genes que codifican las enzimas en la ruta de 2,3-butanodiol están presentes en el genoma secuenciado de B. coagulans, no fue detectado 2,3-butanodiol en el caldo de fermentación de 8. coagulans de tipo silvestre, sin importar el pH de crecimiento. Esto es consecuencia, aparentemente, de una expresión deficiente del operón de alsSD'en el tipo silvestre (cuadro 3), o el flujo hacia lactato es suficientemente alto para agotar la reserva de piruvato. Para construir un derivado de B. coagulans que produzca ácido D(-)-láctico como el producto principal de la fermentación, es necesario suprimir la ruta de fermentación primaria hacia ácido L(+)-láctico catalizada por L-LDH (Idh), y se requiere aumentar el grado de expresión de IdhA que codifica D-LDH.

Construcción de un mutanteA/dft Un muíante de B. coagulans que carece de actividad L-LDH descrito anteriormente (30) produjo acetato, etanol, formiato y 2,3-butanodiol como productos de fermentación, pero no D(-)-lactato. Este mutante de Idh, Suy27-13, lleva un solo cambio de base en el gen Idh y fue sometido a reversión durante crecimiento anaeróbico, especialmente durante crecimiento a pH 5.0. Para superar la alta tasa de reversión de la mutación de Idh en la cepa Suy27-13, el gen Idh fue suprimido.

Están disponibles varios métodos para construir supresiones de genes en bacterias, y muchos de estos utilizan el ADN lineal apropiado con un gen de selección positiva, tal como un gen de resistencia a antibiótico, flanqueado por una secuencia corta de ADN que corresponde al gen objetivo (7, 20, 24). Sin embargo, los intentos de construir mutantes Aldh usando AND lineal no tuvieron éxito en B. coagulans. Esto podría ser resultado de una eficiencia de transformación baja de B. coagulans, combinada con la necesidad de que el ADN entrante se recombine para producir transformantes seleccionabas. Para superar esta limitación, se usó un método alterno que ha mostrado ser útil en supresiones de genes (13). Se construyó un plásmido sensible a la temperatura con la secuencia apropiada del gen Idh objetivo y el gen de resistencia a eritromicina (plásmido pQZ44). Después de transformación de la cepa P4-102B de B. coagulans por electroporación, los transformantes que contienen el plásmido pQZ44 se seleccionaron a 37 °C, que sostuvo un mantenimiento estable del plásmido. Es de esperar que al continuar el cultivo de este derivado que contiene el plásmido.éste se movilice al cromosoma en una fracción de la población por medio de una sola recombinación en el gen Idh. Durante el crecimiento a 50 °C, debido a la incapacidad del plásmido para replicarse a esta temperatura, los plásmidos serán curados fuera de las células, y se espera que las colonias resistentes a eritromicina que aparecen a 50 °C tengan el ADN plasmídico en el gen Idh cromosómico. El cultivo ulterior de estos derivados producirá trasposiciones de ADN que llevan a la supresión del gen objetivo Idh. Uno de estos mutantes de Idh, la cepa QZ4, fue identificado por la pérdida de resistencia a eritromicina y la ausencia de lactato como producto de fermentación (cuadros 3 y 4). En concordancia con el reporte anterior sobre Idh muíante (30), el crecimiento anaeróbico de la cepa QZ4 fue mínimo, incluso en un medio rico con glucosa a pH 5.0.

Propiedades de la cepa QZ4 de Mdh La cepa QZ4 muíante de Idh produjo etanol como producto principal de la fermentación cuando se cultivó a pH 7.0, y 2,3-butanodiol como producto primario durante el crecimiento y fermentación a pH 5.0 (cuadro 4; figuras 1A-1B). Tanto PFL como PDH contribuyeron conacetil-CoA para la producción de etanol a pH 7.0, y se calculó que la contribución de PDH al etanol era de aproximadamente 80% basado en la cantidad de formiato en el caldo. En apoyo de la producción de etanol basada en PDH, la actividad de PDH fue aproximadamente 2 veces más alta en el muíante desarrollado en las fermeníaciones a pH 7.0 durante la fase de crecimiento exponencial (cuadro 2). Sin embargo, la actividad de PDH declinó conforme el cultivo entró a la fase eslacionaria, en conlraste con un aumento de acíividad en la cepa progeniíora en la misma elapa de crecimienlo. A pH 5.0, el crecimiento anaeróbico del muíante no fue deíecíable y la fermeníación de pH controlado iniciada con aire en la fase gaseosa (condición limitaíiva de 02) permife el crecimienlo del mulaníe. Sin embargo, como el 02 se hizo muy limilado debido al aumenío de la densidad celular, el crecimienlo se deluvo y el rendimienlo celular final del cullivo de la fermeníación a pH 5.0 fue solo aproximadamente ½ del cultivo progenitor. En esta fermentación con oxígeno limitado, el muíante Idh produjo una concentración muy baja de etanol en comparación con las fermentaciones a pH 7.0. La mayor parte del producto del cultivo a pH 5.0 fue 2,3-butanodiol (cuadro 4; figuras 1A-1 B).

El grado de expresión comparativamente bajo del gen pflB en cultivos de pH 5.0, y la baja concentración de formiato en la fermentación de O2 limitado (cuadros 3, 4; figuras 1A-1 B), sugieren que a pH 5.0 el mutante de Idh es fenotípicamente LDH- y PFL-negativo. Anteriormente se reportó que un mutante doble Idh, pfl de E. coli es anaerobio negativo (15), y las mismas características también son transferidas a B. coagulans. Aunque el mutante de Idh produjo 2,3-butanodiol como el producto principal de la fermentación a pH 5.0, no pudo crecer anaeróbicamente usando esta ruta de fermentación. Esto se debe aparentemente a desequilibrio redox, puesto que la introducción de una pequeña cantidad de O2 en la fermentación de pH 5.0 sostiene la producción de una concentración más alta de 2,3-butanodiol y crecimiento asociado. Puesto que el butanodiol es un producto de fermentación significativo del mutante de Idh incluso durante crecimiento a pH 7.0, se construyó un mutante doble, la cepa QZ5, que carece tanto de L-LDH como de ALS.

Mutante doble ldh Aa/sS de B. coagulans El mutante doble de Idh y alsS, cepa QZ5, creció aeróbicamente tanto a pH 5.0 como 7.0. El crecimiento anaeróbico del mutante doble en fermentaciones de pH controlado que iniciaron aeróbicamente fue detectable solo a pH 7.0, una propiedad que el mutante doble comparte con la cepa progenitora QZ4 (figuras 2A-2B). Los productos primarios de la fermentación a pH 7.0 fueron etanol, formiato, piruvato y acetato. La cantidad significativa de piruvato en el caldo de fermentación de los cultivos de pH 7.0 del mutante doble indica que PDH y PFL combinados no pueden igualar la velocidad de conversión de glucosa a piruvato por glicólisis. Ni el mutante sencillo ni el doble produjeron ácido L(+)-láctico a una concentración detectable.

Puesto que el mutante doble produjo una cantidad significativa de formiato y otros productos de actividad de PFL, se construyó un mutante triple que carece de la actividad de PFL. Sin embargo, este mutante triple que carece de actividad de L-LDH, ALS y PFL no pudo crecer anaeróbicamente bajo todas las condiciones probadas y no se usó más.

Selección basada en crecimiento para la producción de ácido D- (-)-láctico La pequeña cantidad de ácido láctico producida por el mutante doble fue ácido D-(-)-láctico (cuadro 4). Se espera que el aumento de la producción de ácido D-(-)-láctico sostenga el crecimiento anaeróbico del mutante doble, como es el caso con la cepa de tipo silvestre que puede crecer anaeróbicamente con ácido L-(+)-láctico como el producto primario de la fermentación. La cepa mutante de Idh produce una concentración más alta de ARNm de IdhA en comparación con el tipo silvestre, sin importar el pH del cultivo (cuadro 3). Un grado de actividad muy bajo de PFL (basado en la producción de formiato) (cuadro 4) y un grado de expresión bajo de pflB (cuadro 3) durante el crecimiento de las cepas mutantes a pH 5.0, sugiere que el pH del cultivo tiene una función en el control de PFL. Para aumentar la velocidad de crecimiento anaeróbico y el rendimiento celular en las fermentaciones a pH 5.0, debido a un aumento de la expresión de IdhA y/o actividad de D-LDH sobre las de PFL, se puso en práctica una selección basada en crecimiento. En contraste, una selección basada en crecimiento similar del muíante doble Idh, alsS a pH 7.0, que tiene un grado de actividad de PFL más alto, podría producir derivados con una cantidad elevada de PFL y no de D-LDH.

La selección dependiente de crecimiento anaeróbico de la cepa QZ5 a pH 5.0 en fermentaciones de LB + glucosa produjo un derivado después de aproximadamente 120 días (figura 3). Esta cepa, QZ13, produjo un rendimiento celular más alto que la cepa inicial QZ5 en fermentaciones de pH 5.0. Aunque el rendimiento celular y el consumo de glucosa de la cepa QZ13 y su progenitor de inicio, QZ5, fueron aproximadamenteiguales en las fermentaciones de pH 7.0, el rendimiento de ácido D-láctico de la cepa QZ13 en las fermentaciones de pH 7.0 fue aproximadamente 10 veces más alto que el rendimiento de ácido láctico de la cepa QZ5 al mismo pH de fermentación (cuadro 4). La contribución de PDH/PFL a los productos de fermentación también disminuyó a aproximadamente 0.4 de la glucosa consumida desde 0.85 de la cepa QZ5.

La necesidad de aumentar el rendimiento de ácido D-láctico con una reducción concomitante de productos derivados de PFL/PDH en las fermentaciones de pH 7.0 de la cepa QZ13, llevó a una selección adicional para obtener crecimiento y rendimiento celular más altos a pH 7.0 en fermentaciones de LB + glucosa. La cepa QZ14 se derivó después de aproximadamente 40 días de selección continua y enriquecimiento a pH 7.0 (figura 4). El rendimiento de lactato de la cepa QZ14 fue aproximadamente 0.8 de la glucosa fermentada, y la contribución de PFL/PDH disminuyó a aproximadamente 7% de los productos derivados de glucosa (cuadro 4). El caldo de fermentación de la cepa QZ14 todavía contenía concentración detectable de piruvato, sugiriendo que la concentración de D-LDH en la célula no iguala el flujo de glucosa a través de la glicólisis. La siguiente serie de selecciones se enfocó en aumentar el título de lactato para aislar un derivado mutante que acoplara eficientemente la actividad de LDH con el flujo de glucosa glicolítico. La cepa QZ15 se aisló después de 60 días más de transferencia y selección secuencial con concentración creciente de glucosa (figura 5). El título de ácido D-(-)-láctico de la cepa QZ15 en fermentaciones de pH 7.0 de glucosa fue mayor de 80 g/l. La evolución continuada de la cepa QZ15 produjo más aumento del flujo de glucosa a ácido láctico, alcanzando aproximadamente 90 g/l en menos de 48 horas en fermentaciones a pH 7.0 (cepa QZ19; cuadro 4; figura 6). En estos derivados con título alto de ácido láctico no se detectó formiato. La pequeña cantidad de etanol y acetato producidos por estos cultivos se deriva probablemente de acetil-CoA producida por PDH (15).

Estos resultados muestran que mediante la supresión de los genes Idh y alsS, combinada con selección basada en crecimiento anaeróbico de las mutaciones apropiadas, basándose en la comprensión de la fisiología del organismo en el nodulo de piruvato, puede resultar en alteración del producto de fermentación primario de B. coagulaos de ácido L-(+)-láctico a ácido D-(-)-láctico. Aunque los genes pflAB todavía están intactos en el derivado final, un aumento del flujo metabólico a D-lactato a través de D-LDH, neutraliza esencialmente cualquier flujo de piruvato a acetil-CoA a través de PFL. Se hicieron más estudios para identificar las mutaciones que resultan en actividad elevada de D-LDH en QZ19 (los resultados de los cuales se publicaron en un artículo titulado "Evolution of D-lactate dehydrogenase activity from glycerol dehydrogenase and its utility for D-lactate production from lignocellulose", Wang et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 2011 , publicado en línea el 7 de noviembre de 2011 ; doi 10.1073/pnas.1 111085108, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad).

Conclusión Usando un método desarrollado para suprimir un gen específico en el 8. coagulans genéticamente recalcitrante, se suprimió el gen Idh que codifica L-LDH. El mutante Aldh no pudo crecer anaeróbicamente a pH 5.0, mientras que el crecimiento a pH 7.0 no fue afectado significativamente. La ruta de PFL, PDH y 2,3-butanodiol sostuvieron el crecimiento fermentativo a pH 7.0. La supresión de Idh, alsS y pflB eliminó el crecimiento anaeróbico del mutante, aunque está presente en el cromosoma un gen que codifica D-LDH (Idh A). Basándose en la comprensión de las propiedades fisiológicas de Bacillus coagulans a varios pHs de crecimiento, y en el flujo de carbono en el nodulo de piruvato durante el crecimiento anaeróbico de esta bacteria, una selección basada en crecimiento iniciando con un mutante doble de Idh, alsS produjo un mutante con mayor capacidad para producir ácido D-láctico a concentraciones que son comparables con el rendimiento y título de ácido L-láctico en el tipo silvestre. Se espera un aumento adicional de la velocidad de producción de ácido láctico para eliminar la pequeña cantidad de los coproductos etanol y ácido acético presentes en el caldo de fermentación. Este es el primer reporte de una bacteria termofílica de ácido láctico en la que el producto de fermentación primario se ha cambiado de ácido L-(+)-láctico a ácido D-(-)-láctico, usando solo los genes nativos de la bacteria (sin gen ajeno). Esto se basa en mutaciones selectivas y evaluación de la fisiología de la bacteriano que resulta en estrategias apropiadas adicionales. Se espera que la disponibilidad de las cepas termotolerantes de 8. coagulans que producen ácido D(-)- o L(+)-láctico ópticamente puro a 50-55 °C ayude a reducir el costo del ácido láctico como materia prima para la producción de bioplásticos de polilactida de propiedades termoquímicas variables, minimizando los contaminantes potenciales que pueden reducir la pureza óptica del ácido láctico.

CUADRO 1 Cepas bacterianas, plásmidos e iniciadores usados en este estudio CUADRO 2 Iniciadores usados Las letras mayúsculas representan la secuencia de B. coagulans. Las letras minúsculas indican la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción y extensiones 5' para escisión óptima del producto amplificado por la enzima respectiva.

CUADRO 3 Concentración de ARNm de genes que codifican enzimas en el nodulo de piruvato de B. coaaulans de tip silvestre v mutante ?/d/i. cepa QZ4 Cepa PH DO 420 nm* ARNm (ng/ml)** Actividad de la enzima† cultivo pdhA Itiht pflB alsS IdhAt PDH LDH P4-102B 5.0 1.0 2.73 61.92 0.02 0.08 0.12 0.4 14.0 (t. s.) 5.0 3.4 25.59 61.55 0.87 0.27 0.19 8.0 23.5 7.0 1.0 2.59 55.11 0.09 0.14 0.22 3.8 29.9 7.0 4.3 11.53 12.75 3.20 0.11 0.15 20.6 28.1 Mutante QZ4 5.0 1.0 3.39 0.02 0.37 5.30 1.08 1.9 1.6 (? dft) 5.0 2.0 2.76 0.001 0.57 1.32 1.95 6.3 2.2 7.0 1.0 2.51 0.004 1.22 3.07 1.65 6.6 1.6 7.0 7.0 33.41 0.21 2.67 5.62 0.88 3.1 2.5 * Representa la DO420 nm en el momento de la cosecha. Las células se cosecharon de fermentaciones de pH controlado (LB+glucosa) durante la fase de crecimiento exponencial de temprana a media (valor de DO de 1 .0), y fase de crecimiento exponencial tardía (el segundo valor de DO).

** Concentración de ARNm especifico en el total de ARN aislado.

† La actividad de la enzima se determinó en extractos crudos y se expresa como nmoles min'1 mg proteina"1.

$ Idh y IdhA representan los genes que codifican L(+)- y D(-)- lactato deshidrogenase, respectivamente.

CUADRO 4 Perfiles de fermentación de derivados de B. coapulans en la ruta hacia la producción de ácido D-(-)-láctico 50 °C Genotipo pH Crecimiento Glucosa Producto (mM) Rendimiento cultivo (D042o nm) consumida Lactato* Piruvato Acetato Succ Formiato Etanol Lac Total (mM) L(+)- D(-) P4-102B tipo silvestre 5.0 3.0 144.3 255.6 ND ND 5.7 0.6 ND 10.5 0.90 1.00 7.0 7.1 188.6 336.4 ND ND 15.9 0.4 ND 4.6 0.89 0.96 QZ4** Mdh 5.0 1.8 53.8 ND 1.0 NDND 1.0 6.5 20.3 0.01 0.21 7.0 8.1 226.0 ND 9.7 ND 42.3 6.7 90.6 224.5 0.02 0.63 QZ5 Mdh Aa/sD 5.0 2.5 32.8 ND 9.8 4.5 4.6 0.1 25.3 25.6 0.15 0.72 7.0 5.8 152.5 ND 12.8 10.1 95.4 2.1 154.6 164.5 0.04 0.94 QZ13 Selección 5.0 3.7 34.5 ND 20.9 20.9 2.5 0.4 15.9 18.8 0.30 0.92 continuada 7.0 5.1 148.7 ND 139.9 15.8 45.2 3.2 90.0 80.7 0.50 1.00 QZ14 Selección 5.0 continuada 7.0 5.8 199.0 ND 335.3 11.4 5.7 0.5 44.0 39.0 0.80 0.99 7.0† 265.7 ND 468.4 1.6 ND 1.3 21.5 28.4 0.88 0.93 QZ15 Selección 7.0† (68h) 562.6 ND 928.2 ND 22.6 8.1 ND 97.5 0.83 0.94 continuada QZ19 7.0† (48h) 590.0 ND 993.0 ND 45.3 5.7 ND 84.2 0.84 0.96 Todas las fermentaciones se hicieron en medio LB con glucosa y los valores reportados fueron después de 72 h, a menos que se indique de otra manera.

* Los valores entre paréntesis indican que estaban presentes los dos isómeros.

" La cepa QZ4 también produjo acetolna y 2,3-butanodiol; cultivo a pH 5.0, 2,3-butanodiol 44.5 mM; cultivo a pH 7.0, acetolna 31.6 mM y 2,3-butanodiol 93.1 mM. Estos dos productos no se detectaron en los caldos de otros cultivos.

† Debido a la presencia de CaC03 en el medio, la densidad celular de estos cultivos no se determinó.

ND - no detectable Succ, succinato; Lac, lactato CUADRO 5 Referencias 1. Abdel-Banat BMA, Hoshida H, Ano A, Nonklang S, Akada R (2010) High-temperature fermentation: how can processs for ethanoi production at high temperatures become superior to the traditional process using mesophilic yeast? Appl Microbiol Biotechnol 85:861-867. 2. Beall DS, Ohta K, Ingram LO (1991 ) Parametric studies of ethanoi production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli. Biotechnol Bioeng 38:296-303. 3. Benninga H 1990. A history of lactic acid making. Kluyver Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands. 4. Boylan RJ, Mendelson NH, Brooks D, Young FE (1972) Regulation of the bacterial cell wall: analysis of a mutant of Bacillus subtilis defective in biosynthesis of teichoic acid. J Bacteriol 110:281-290. 5. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254. 6. Carr FJ, Chill D, Maida N (2002) The lactic acid bacteria: A literature survey. Crit Rev Microbiol 28:281-370. 7. Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR producís. Proc Nati Acad Sci U S A 97:6640-6645. 8. Datta R, Henry M (2006) Lactic acid: recent advances in producís, processes and technologies - a review. J Chem Technol Biotechnol 81 :1 119-1129. 9. Davis RW, Botstein D, Roth JR 1980. Advanced Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 10. De Clerck E, Rodriguez-Diaz M, Forsyth G, Lebbe L, Logan NA, DeVos P (2004) Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains, illustrating heterogeneity within this species, and emended description of the species. System Appl Microbiol 27:50-60. 1 1. Fredrick K, Helmann JD (1996) FlgM is a primary regulator of sigmaD activity, and its absence restores motility to a sinR mutant. J Bacteriol 178:7010-7013. 12. Grabar TB, Zhou S, Shanmugam KT, Yomano LP, Ingram LO (2006) Methylglyoxal bypass identified as source of chiral contamination in L(+) and D(-)-lactate fermentations by recombinant Escheríchia coli. Biotechnol Lett 28:1527-1535. 13. Hamilton CM, Aldea , Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989) New method for generating deletions and gene replacements in Escheríchia coli. J Bacteriol 171 :4617-4622. 14. Hofvendahl K, Hans-Hagerdal B (2000) Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources. Enz Microb Technol 26:87-107. 15. Kim Y, Ingram LO, Shanmugam KT (2007) Construction of an Escherichia coli K-12 mutant for homoethanologenic fermentation of glucose or xylose without foreign genes. Appl Environ Microbiol 73:1766-1771. 16. Kim Y, Ingram LO, Shanmugam KT (2008) Dihydrolipoamide dehydrogenase mutation alters the NADH sensitivity of pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 190:3851-3858. 17. Kok J, van der Vossen JM, Venema G (1984) Construction of plasmid cloning vectors for lactic streptococci which also replícate in Bacillus subtilis and Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 48:726-731. 18. Kulkarni RK, Moore EG, Hegyeli AF, Leonard F (1971) Biodegradable poly(lactic acid) polymers. J Biomed Mater Res 5:169-181. 19. Lee JH, Patel P, Sankar P, Shanmugam KT (1985) Isolation and characterization of mutant strains of Escherichia coli altered in H2 metabolism. J Bacteriol 162:344-352. 20. Lin Y, Hansen JN (1995) Characterization of a chimeric proU operan in a subtilin-producing mutant of Bacillus subtilis 168. J Bacteriol 177:6874-6880. 21. Luchansky JB, Muriana PM, Klaenhammer TR (1988) Application of electroporation for transfer of plasmid DNA to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus and Propionibacterium. Mol Microbiol 2:637-646. 22. Matsumoto , Taguchi S Enzymatic and whole-cell synthesis of lactate-containing polyesters: toward the complete biological production of polylactate. Appl Microbiol Biotechnol 85:921-932. 23. Mecking S (2004) Nature or petrochemistry?-biologically degradable materials. Angew Chem Int Ed 43:1078-1085. 24. Morimoto T, Kadoya R, Endo K, Tohata M, Sawada K, Liu S, Ozawa T, Kodama T, Kakeshita H, Kageyama Y, Manabe K, Kanaya S, Ara K, Ozaki K, Ogasawara N (2008) Enhanced recombinant protein productivity by genome reduction in Bacillus subtilis. DNA Research 15:73-81. 25. Okano K, Yoshida S, Yamada R, Tanaka T, Ogino 6\ Fukuda H, Kondo A (2009) Improved production of homo-D-lactic acid via xylose fermentation by introduction of xylose assimilation genes and redirection of the phosphoketolase pathway to the pentose phosphate pathway in L-lactato deshidrogenasa gene-deficient Lactobacillus plantarum. Appl Environ Microbiol 75:7858-7861. 26. Ou MS, Ingram LO, Shanmugam KT (20 1 ) L: (+)-Lactic acid production from non-food carbohydrates by thermotolerant Bacillus coagulans. J Ind Microbiol Biotechnol. 38: 599-605.. 27. Patel MA, Ou MS, Harbrucker R, Aldrich HC, Buszko ML, Ingram LO, Shanmugam KT (2006) Isolation and characterization of acid-tolerant, thermophilic bacteria for effective fermentation of biomass-derived sugars to lactic acid. Appl Environ Microbiol 72:3228-3235. 28. Payot T, Chemaly Z, Fick M (1999) Lactic acid production by Bacillus coagulans - Kinetic studies and optimization of culture médium for batch and continuous fermentations. Enz Microb Technol 24:191-199. 29. Rhee MS, Kim JW, Qian Y, Ingram LO, Shanmugam KT (2007) Development of plasmid vector and electroporation condition for gene transfer ¡n sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans. Plasmid 58:13-22. 30. Su Y, Rhee MS, Ingram LO, Shanmugam KT (201 1 ) Physiological and fermentation properties of Bacillus coagulans and a mutant lacking fermentative lactate dehydrogenase activity. J Ind Microbiol Biotechnol.38:441-450.. 31. Tanaka K, Komiyama A, Sonomoto K, Ishizaki A, Hall SJ, Stanbury PE (2002) Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate ¡n mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1. Appl Microbiol Biotechnol 60:160-167. 32. Underwood SA, Zhou S, Causey TB, Yomano LP, Shanmugam KT, Ingram LO (2002) Genetic changes to optimize carbón partitioning between ethanol and biosynthesis in ethanologenic Escheríchia coli. Appl Environ Microbiol 68:6263-6272. 33. Visser J, Kester H, Jeyaseelan K, Topp R (1982) Pyruvate dehydrogenase complex from Bacillus. Methods Enzymol 89 Pt D:399-407. 34. Yanez R, Moldes AB, Alonso JL, Parajo JC (2003) Production of D(-)-lact¡c acid from cellulose by simultaneous saccharification and fermentation using Lactobacillus coryniformis subsp. torquens. Biotechnol Lett 25:1 161-1 164. 35. Yoshida A, Freese E (1975) Lactate dehydrogenase from Bacillus subtilis. Meth Enzymol 41 :304-309. 36. Zhou S, Shanmugam KT, Ingram LO (2003) Functional replacement of the Escherichia coli D-(-)-lactate dehydrogenase gene (IdhA) with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene (IdhL) from Pediococcus acidilactici. Appl Environ Microbiol 69:2237-2244.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Una célula bacteriana aislada modificada genéticamente que comprende: (i) desactivación o supresión del gen de L(+)-lactato deshidrogenasa; y (ii) desactivación o supresión del gen de acetolactato sintasa.

2.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende desactivación o supresión en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en: gen de piruvato formiato liasa, gen que codifica la enzima activadora de piruvato formiato liasa, gen de alfa-acetolactato descarboxilasa, gen de piruvato deshidrogenasa y gen de alcohol deshidrogenasa.

3.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende modificaciones genéticas que introducen genes exógenos en dicha célula bacteriana.

4.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha modificación genética comprende la mutación de un gen que codifica lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa {pflB), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (alsD) y/o acetolactato sintasa (a/sS), o la supresión de una porción o todo un gen que codifica lactato deshidrogenasa (Idh), piruvato formiato liasa (pflB), enzima activadora de piruvato formiato liasa (pflA), alfa-acetolactato descarboxilasa (alsD) y/o acetolactato sintasa (a/sS).

5. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la mutación de dichos genes comprende la introducción de una o más mutaciones de punto o la introducción de uno o más codones de detención en el marco de lectura abierto del gen.

6. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porquedicha modificación genética comprende una mutación de punto o una supresión en la secuencia codificadora de lactato deshidrogenase, piruvato formiato liasa y/o acetolactato sintasa, o la inserción de una secuencia exógena en la región codificadora de lactato deshidrogenasa, piruvato formiato liasa y/o acetolactato sintasa.

7. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque no contiene genes exógenos o porciones de los mismos.

8. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque su actividad enzimática de lactato deshidrogenasa, piruvato formiato liasa y/o acetolactato sintasa es anulada por recombinación homologa, usando opcionalmenteun plásmido sensible a la temperatura.

9. - La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha modificación genética comprende la supresión parcial o total del gen que codifica acetolactato sintasa.

10.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha bacteria es una Bacillus spp. o es una bacteria seleccionada del grupo que consiste enBacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus pumilus, Bacillus circulans o Bacillus thiaminolyticus.

11 - La célula bacteriana modificada genéticamente de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque es QZ4, QZ5, QZ13, QZ14, QZ15 o QZ19.

12.- Un método de producción de ácido D-(-)-láctico, que comprende cultivar una célula bacteriana modificada genéticamente en un medio que comprende una fuente de carbono, bajo condiciones que permiten la producción de ácido D-(-)-láctico, en donde dicha célula bacteriana modificada genéticamente se selecciona de: (a) una célula bacteriana modificada genéticamente que comprende (i) desactivación o supresión del gen de L(+)-lactato deshidrogenase, y (ii) desactivación o supresión del gen de acetolactato sintasa; o (b) QZ4, QZ5, QZ13, QZ14, QZ15 o QZ19.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende aislar o purificar el ácido D-(-)-láctico.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha cepa bacteriana se cultiva bajo condiciones anaeróbicas.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho medio comprende entre 2% y 20% (p/v) de fuente de carbono.

16 - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la fuente de carbono es glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosas, celulosa, glicerol, o combinaciones de las mismas.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha fermentación se realiza bajo condiciones anaeróbicas a un pH de: (a) aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.5; o (b) aproximadamente 7.0; o (c) aproximadamente 5.0.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha célula bacteriana modificada genéticamente produce por lo menos 60 g de ácido láctico por litro de medio de fermentación en el transcurso de 48 horas del inicio de la fermentación.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el pH del medio usado para cultivar dicha célula bacteriana modificada genéticamente se mantiene por medio de la adición automática de ácido o base.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende cultivar la célula bacteriana a una temperatura entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 65°C; entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 65°C; entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 55°C¡ entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C; entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 50°C; o a una temperatura de aproximadamente 30°C¡ aproximadamente 37°C; o aproximadamente 55°C.