CN110272858B

CN110272858B - 一种高产l-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110272858B
Application number: CN201910648950.8A
Authority: CN
Inventors: 刘佳; 刘立明; 罗秋玲; 陈修来; 宋伟
Original assignee: Wuxi Chenming Biotechnology Co ltd; Jiangnan University
Current assignee: Biogrowing Co ltd; Hefei Xingzhicheng Information Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110272858A

Abstract

本发明公开了一种高产L‑乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME‑BC，利用其发酵生产L‑乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％，同时其可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造，敲除凝结芽孢杆菌FMME‑BC中D‑乳酸脱氢酶基因，得到的突变株FMME‑BCM，其发酵生产L‑乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。

Description

一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

乳酸(Lactic acid)，学名α-羟基丙酸，分子式为C₃H₆O₃，是世界上公认的三大有机酸之一。L-乳酸在食品、医药、农业、化妆品等众多领域有着广泛的应用，特别是高光学纯度的L-乳酸，L-乳酸聚合而成的聚乳酸因其有生物降解性和生物相容性而被广泛用于生产可生物降解塑料。20世纪80年代，我国约有50多家小乳酸厂，数年来，随着市场竞争逐渐淘汰至10家左右，年产能合计约20万吨。但近两年，随着聚乳酸生产技术的进步及下游应用领域开拓所带来的巨大市场空间，行业内企业及新进入者开始看好乳酸行业未来发展前景，先后投资建厂以扩大乳酸产能。

微生物发酵已成为乳酸生产最成熟的方法。微生物发酵具有产量高、产品纯度高、反应条件温和、不受任何环境污染等优点。微生物发酵原料通常是葡萄糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉等。发酵所用菌种主要包括芽孢杆菌、乳杆菌、根霉、曲霉以及工程菌株。传统乳酸发酵采用的菌种主要为乳酸菌和米根霉等。乳酸菌发酵生产L-乳酸多为同型发酵，具有较高的转化率，因而成为主要的工业菌种，针对乳酸菌的基因工程改造工作也取得了长足的发展。

嗜热的芽孢杆菌是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的微生物，具有较高的糖酸转化率。由于嗜热芽孢杆菌可以在45～60℃正常生长，对营养成分要求不高，极大地减少了发酵过程中污染杂菌的可能，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步骤的操作。

目前，虽然凝结芽孢杆菌发酵产L-乳酸的研究很多，但是大多数凝结芽孢杆菌尚无可成熟的基因操作系统，进行遗传操作的菌株并不常见。关于可在凝结芽孢杆菌中自主复制质粒的报道很少，而且菌株电转化及敲除等遗传操作效率并不高。现报道只有两种凝结芽孢杆菌DSMl和P4-102B可以接受外源DNA电转化、基因敲除等遗传操作，但是这两株菌发酵生产L-乳酸产率很低，其中Sun LF等人利用凝结芽孢杆菌DSMl以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸，在50℃条件下，发酵24h，乳酸产量仅为49.4g/L，产物的光学纯度为99.8％，产率达2.06g/L/h(Scientific reports,2016,6:37916)；Wang QZ利用凝结芽孢杆菌P4-102B以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸，在50℃下发酵48h获得光学纯度100％的L-乳酸，L-乳酸产量仅为336.4mM(30.3g/L)，葡萄糖得率为0.89g/g(PNAS,2011,108(47):18920-18925.)。因此，无法满足工业上生产L-乳酸的需求。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明提供了一株凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)FMME-BC，利用其发酵生产L-乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％，同时其可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造，敲除凝结芽孢杆菌FMME-BC中D-乳酸脱氢酶基因，得到的突变株FMME-BCM，其发酵生产L-乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。

本发明的第一个目的是提供一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，所述凝结芽孢杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。

本发明的第二个目的是提供所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的感受态细胞。

本发明的第三个目的是提供一种制备所述感受态细胞的方法，所述制备包括在细胞培养过程中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

在一种实施方式中，所述CTAB的浓度为0.02％(w/v)。

在一种实施方式中，所述感受态细胞制备方法具体为：从甘油管中挑取FMME-BC划线至LB固体培养基平板上，挑取单菌落接种至装有25mL GM液体培养基的250mL三角瓶中，50℃静置培养过夜，1％～2％的接种量转接至装有80mL GM液体培养基的500mL三角瓶中，50℃，200rpm培养至OD600约为0.4，加入0.02％的CTAB继续培养直OD₆₀₀为0.6～0.8，冰上预冷细胞15～30min，5000rpm，4℃离心收集菌体。用40mL预冷的电转缓冲液SG洗涤菌体3次。加800μL的SG重悬洗涤后的菌体，分装到1.5mL的离心管中，每管200μL，-80℃保存备用。

在本发明的一种实施方式中，所述转化具体为，向200μL感受态细胞中加入8～16μg质粒DNA，冰浴10～20min后转移至预冷的电转杯中，电压设置1.5kv，电击时间控制在5.0～6.0ms。电击后迅速加入600～1000μL复苏培养基RM，75～80℃下热击60s，转移至50℃摇床中，200rpm培养2～3h后涂布平板，培养后进行筛选。

本发明的第四个目的是提供所述凝结芽孢杆菌在基因工程领域的应用，所述应用是在所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的基础上进行基因工程改造。

在一种实施方式中，所述基因工程改造是敲除所述凝结芽孢杆菌的D-乳酸脱氢酶基因。

在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第五个目的是提供根据所述应用得到的基因工程菌。

本发明的第六个目的是提供一种生产L-乳酸的方法，所述方法是应用所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述凝结芽孢杆菌或所述突变菌的种子液接种到发酵培养基中进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵培养基(g/L)的组成为：工业葡萄糖100～120，玉米浆5～10，MgSO₄ 0.5～1.0，调节pH为6.0。

本发明的第七个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌。

本发明的第八个目的是提供一种组合物，所述组合物含有所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌。

本发明还提供所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌在制备L-乳酸或其衍生产品方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME-BC，利用其发酵生产L-乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％；

(2)同时本发明筛选的凝结芽孢杆菌FMME-BC可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造。将基因组上D-乳酸脱氢酶基因敲除，获生产高纯度L-乳酸的突变株FMME-BCM，其发酵生产L-乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。

生物材料保藏

本发明所提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME-BC，分类学命名为Bacillus coagulans FMME-BC，已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。

附图说明

图1：双交换法敲除ldhD基因PCR验证；(a)M:Maker；1:第一次重组后PCR验证6.1kb；2:第二次重组后PCR验证1.9kb；3：野生型对照2.9kb.(b)M:Maker；1：引物ldhD-up和ldhD-down PCR突变株；2：引物ldhD-up和ldhD-down PCR野生型。

图2：FMME-BCM发酵过程曲线。

具体实施方式

(1)乳酸的光学纯度的测定

使用高效液相色谱仪测定发酵液的光学纯度，色谱柱为手性柱(MCI GelCRS10W)。流动相为2mM CuSO₄，流速为0.5min/mL，柱温25℃，进样5μL，紫外检测器检测，检测波长254nm。光学纯度定义为：L-乳酸光学纯度＝L-乳酸浓度/(L-乳酸浓度+D-乳酸浓度)×100％。

(2)葡萄糖测定方法

使用SBA-40生物传感分析仪进行分析。

(3)培养基

LB培养基(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，氯化钠10。

RM培养基(g/L)：LB，山梨醇0.5mM，甘露醇0.38mM。

SG电转缓冲液(g/L)：甘油100，蔗糖171.1，121℃高温高压灭菌15min。

(4)转化效率

转化效率＝阳性克隆/筛选的总克隆菌株

(5)生产强度的计算公式

生产强度(g/L/h)＝L-乳酸产量(g/L)/发酵时间(h)。

(6)葡萄糖得率的计算公式

葡萄糖得率(％)＝L-乳酸产量(g/L)/葡萄糖的添加量(g/L)×100

实施例1：菌株的筛选

采集上海某牛奶厂附近的土壤，取土样2g加入到有玻璃珠的无菌生理盐水中振荡10min，然后转至总体积为100mL的富集培养基中，55℃厌氧培养24h后按照30％接种量转接一次。将富集培养后的菌液梯度稀释至合适倍数，涂布于含溴甲酚蓝琼脂培养基，55℃厌氧培养，24-36h后部分菌落周围的平板颜色变为黄色，挑取黄色变色圈大的菌株进一步厌氧发酵；将变色圈较大的菌株接种于24深孔板的种子培养基中55℃振荡培养10h，按照10％接种量转接于24深孔板中的发酵培养基中，50℃厌氧发酵48h，HPLC检测发酵液中L-乳酸产量，从538株菌株中获得高产L-乳酸菌株F-101，经过16S rDNA鉴定该菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，将该菌株命名为Bacillus coagulans FMME-BC。

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME-BC，分类学命名为Bacilluscoagulans FMME-BC，已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例2：敲除质粒pMH77-△ldhD的构建

以FMME-BC基因组为模板，使用引物ldhD-up-1和ldhD-up-2克隆ldhD上游同源臂ldhD-up(716bp，序列如SEQ ID NO.3所示)，使用引物ldhD-down-1和ldhD-down-2克隆ldhD下游同源臂ldhD-down(925bp，序列如SEQ ID NO.4所示)，使用融合PCR的方法将上游片段和下游片段融合获得敲除框，以敲除框为模板，利用引物ldhD-up-1和ldhD-down-2扩增得到1.6kb的同源臂片段。将得到的ldhD的同源臂片段和敲除质粒pMH77(Scientificreports,2016,6:37916，公开日：2016-12-31)分别经BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切后，采用T4DNA连接酶进行连接，最后将连接产物转化至乳酸乳球菌Lactococcus lactisMG1363(乳酸菌模式菌株，参见Scientific reports,2016,6:37916，公开日：2016-12-31)中进行扩增，经菌落PCR和测序验证正确后，提取得到质粒pMH77-△ldhD。

表1引物序列表

实施例3：电转化参数的优化

GM培养基(g/L)：LB，山梨醇0.5mM。

为了提高质粒的整合到FMME-BC的效率，对感受态细胞制备与转化条件进行优化。

(1)感受态细胞的制备的优化。

培养感受态细胞时加入0.02％的表面活性剂：吐温80、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、曲拉通X-114和十二烷基肌氨酸钠(NLS)中的一种，弱化细胞壁。具体操作如下：

将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME-BC按2％的接种量转接至装有80mLGM液体培养基的500mL三角瓶中，50℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.4，加入0.02％(w/v)的表面活性剂继续培养直OD₆₀₀为0.6～0.8，冰上预冷细胞15～30min，5000rpm，4℃离心收集菌体，制备感受态细胞。结果如表2，使用0.02％CTAB处理细胞，敲除效率最高，达到1:3500，相比于不添加表面活性剂时提高了1.67倍。

表2表面活性剂对转化效率的影响

(2)感受态和载体DNA的浓度比例的优化

200μL感受态细胞中分别添加4～16μg的pMH77-△ldhD质粒，转化结果如表3，添加8～16ug质粒时，转化效率达到1:2700～3000。

表3外源DNA添加量对转化效率的影响

(3)热击温度的优化

电击转化后并加入复苏培养基后进行热激以便破坏细胞内的限制系统，电击感受态和重组载体并加入复苏培养基后分别在60～80℃条件下进行热激处理。结果如表4，当在75～80℃下热击60s时，转化效率显著提升达到1:1500。

表4热击温度对转化效率的影响

实施例4：突变株FMME-BCM菌株的构建

GM培养基(g/L)：LB，山梨醇0.5mM。

使用双交换法敲除实施例1中得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME-BC的基因组上的D-乳酸脱氢酶基因ldhD。

(1)凝结芽孢杆菌FMME-BC感受态细胞制备

从甘油管中挑取FMME-BC划线至LB固体培养基平板上，挑取单菌落接种至装有25mL GM液体培养基的250mL三角瓶中，50℃静置培养过夜，1％～2％的接种量转接至装有80mL GM液体培养基的500mL三角瓶中，50℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.4，加入0.02％的CTAB继续培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，冰上预冷细胞15～30min，5000rpm，4℃离心收集菌体。用40mL预冷的电转缓冲液SG洗涤菌体3次。加800μL的SG电转缓冲液重悬洗涤后的菌体，分装到1.5mL的离心管中，每管200μL，-80℃保存备用。

(2)凝结芽孢杆菌FMME-BC电转化

向200μL感受态细胞中加入8～16μg质粒pMH77-△ldhD，冰浴10～20min后转移至预冷的电转杯中，电压设置1.5kv，电击时间控制在5.0～6.0ms。电击后迅速加入600～1000μL复苏培养基RM，75～80℃下热击60s，转移至45℃摇床中，100rpm培养2～3h后涂布含5mg/L氯霉素的平板，45℃培养过夜后进行筛选。

将敲除载体pMH77-△ldhD电转化到FMME-BC，将含敲除质粒pMH77-△ldhD的FMME-BC接种到含5mg/L氯霉素的液体培养基45℃，100rpm培养过夜，再将菌液放入60℃培养24h，菌液稀释后涂布于含5mg/L氯霉素抗性培养基平板上，60℃培养40h，此时质粒消除，长出的菌落已发生第一次同源重组，即敲除质粒pMH77-△ldhD整合到基因组上，设计同源臂两侧引物Yz-ldhd-up与Yz-ldhd-down进行验证，目的片段为6.1kb左右，为阳性克隆。

将阳性克隆接种到无抗培养基中45℃，100rpm培养24h，菌液稀释后涂布到无抗的培养基平板上，待单菌落长出后，将单菌落依次划线到有抗性和无抗性的培养基平板上，选择在无抗性平板上能生长，有抗性平板上不能生长的菌落，同源臂两侧引物Yz-ldhD-up与Yz-ldhD-down验证，野生型菌株得到约2.9kb的片段，敲除菌株得到约1.9kb的片段(图1a)，得到ldhD敲除菌株FMME-BCM，为进一步验证ldhD基因被敲除，使用ldhD两端引物ldhD-up和ldhD-down进行验证，结果PCR无目的条带(图1b)。

表5引物序列表

实施例5：突变株FMME-BCM与FMME-BC发酵性能比较

种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，KH₂PO₄ 0.2，MgSO₄ 0.2，CaCO₃ 8，调节pH为6.0，108℃灭菌10min。

发酵培养基(g/L)：工业葡萄糖80，玉米浆5，MgSO₄ 0.5，调节pH为6.0，100℃煮沸灭菌10min。

挑取FMME-BCM与FMME-BC单菌落，接种于种子培养基中，50℃培养12h，按照10％接种量转接于发酵培养基中，发酵温度50℃，发酵前期0-1h好氧发酵，通气量1.0vvm，搅拌转速300rpm，1h以后停止通气，搅拌转速50rpm，采用CaCO₃调节pH 5.8～6.5，发酵过程中当葡萄糖浓度低于20g/L开始补加800g/L葡萄糖溶液，控制葡萄糖浓度为20～35g/L，发酵35h，葡萄糖添加共计100g/L，L-乳酸的浓度不再增加，结束发酵。

结果表明：野生型菌株L-乳酸和D-乳酸浓度分别为151.3g/L和4.56g/L，光学纯度为97.1％，敲除ldhD基因后得到的突变株FMME-BCM发酵生产L-乳酸浓度达到155.0g/L，光学纯度达到100％，说明ldhD基因敲除可以显著提高凝结芽孢杆菌生产L-乳酸的光学纯度，有利于下游的分离纯化。

表6突变株FMME-BCM与FMME-BC发酵性能比较

实施例6：突变株FMME-BCM发酵生产L-乳酸

种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉6，KH₂PO₄ 0.2，MgSO₄ 0.4，CaCO₃ 8，调节pH为6.0，108℃灭菌10min。

发酵培养基(g/L)：工业葡萄糖80，玉米浆10，MgSO₄ 0.5，调节pH为6.0，100℃煮沸灭菌10min。

挑取FMME-BCM单菌落，接种于种子培养基中，50℃培养16h，按照15％接种量转接于30L发酵罐中，发酵罐中培养基体积为20L，发酵温度50℃，发酵前期0-1h好氧发酵，通气量1.0vvm，搅拌转速300rpm，1h以后停止通气，搅拌转速50rpm，采用CaCO₃调节pH 5.8～6.5，发酵过程中当葡萄糖浓度低于20g/L开始补加800g/L葡萄糖溶液，控制葡萄糖浓度为20～35g/L，发酵30h，葡萄糖添加共计120g/L，L-乳酸的浓度不再增加，结束发酵。

结果表明：如图2所示，随着发酵的进行葡萄糖不断消耗，菌体浓度不断增加，L-乳酸不断积累，最终L-乳酸产量达到185.1g/L，葡萄糖转化率达到92.5％。发酵过程中未检测到D-乳酸，副产物丙酮酸、乙酸、琥珀酸和富马酸产量共计1.39g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

无锡宸明生物技术有限公司

<120> 一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Arg Lys Val Val Ala Tyr Glu Thr Arg Ala Asp Glu Phe Pro Leu

1 5 10 15

Phe Gln Lys Phe Ala Arg Lys Phe Asp Leu Asp Ile Lys Tyr Ile Asp

20 25 30

Asp Val Leu Thr Pro Glu Thr Ala Met Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala

35 40 45

Val Thr Ile Leu Gly Asn Tyr Pro Val Gly Ser Gly Thr Phe Lys Ala

50 55 60

Leu Arg Asp Val Gly Val Lys Tyr Ile Gly Leu Arg Thr Ala Gly Asn

65 70 75 80

Asn His Ile Asp Gln Glu Ala Ala Lys Ala Tyr Gly Ile Arg Phe Ser

85 90 95

Asn Val Ala Tyr Ser Pro Tyr Cys Val Ala Asp Phe Ala Thr Met Leu

100 105 110

Ile Leu Met Cys Val Arg Lys Ala Lys Gln Ile Leu Ser Arg Val Glu

115 120 125

Ala Gln Asp Phe Ser Val Glu Gly Ile Gln Gly Arg Glu Met Arg Asn

130 135 140

Leu Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly Ser Ile Val Ala

145 150 155 160

Lys Asn Leu Ser Gly Phe Gly Cys Asn Leu Ile Ala His Asp Thr Val

165 170 175

Glu Arg Asp Glu Leu Arg Gly Ile Leu Lys Tyr Val Ser Leu Asp Glu

180 185 190

Leu Leu Glu Glu Ser Asp Val Ile Thr Ile His Thr Pro Leu Phe Glu

195 200 205

Ser Thr Tyr His Met Ile Asn Gln Glu Arg Ile Ala Lys Ile Lys Asp

210 215 220

Gly Val Cys Ile Ile Asn Cys Ser Arg Gly Ala Glu Val Asp Thr Tyr

225 230 235 240

Ala Leu Ile Ala Gly Ile Glu Ala Gly Lys Ala Gly Ala Ala Gly Ile

245 250 255

Asp Val Leu Glu Asp Glu Glu Gly Ile Phe His Tyr Asp Arg Arg Thr

260 265 270

Asp Ile Leu Asp His Arg Gln Leu Ala Ile Leu Arg Ser Phe Pro Asn

275 280 285

Val Ile Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Pro Asn Gln Ala Val Ser

290 295 300

Asp Met Ala Glu Met Ala Leu Thr Ser Leu Val Ser Phe Val Glu Thr

305 310 315 320

Gly Lys Ser Arg Trp Glu Ile Lys Ser

325

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgagaaaag ttgttgccta tgagacgagg gcggatgagt tccccttatt tcaaaaattc 60

gcgagaaaat ttgatttgga catcaagtat attgatgatg tgttaacccc tgaaacggca 120

atggaagcaa aaggcgctga agcggtgacg atccttggga attatccggt cggctccggg 180

actttcaagg ctttaaggga tgtcggcgtg aagtatatcg gcctgaggac tgcaggaaat 240

aatcatatcg atcaggaagc cgcaaaagca tatggcatcc gtttttcgaa tgtggcgtat 300

tcgccttatt gcgtggccga ttttgcaacg atgctgattt tgatgtgtgt gcggaaagca 360

aaacagatct taagccgtgt cgaggcacag gatttttctg tggaagggat tcagggcagg 420

gaaatgcgca acttaacgat cgggattatt ggcgccggca gaatcggcag cattgttgca 480

aaaaatttgt ccggttttgg ctgcaacctc attgcacacg atactgttga aagggatgaa 540

ttgcgcggca tcctgaaata tgtatctttg gatgaactgc tggaggaaag cgatgtgatt 600

accatccaca cacccttgtt tgaaagtaca taccatatga ttaaccaaga acgtattgca 660

aaaataaagg acggcgtatg catcatcaat tgttcccgtg gtgctgaagt cgatacgtat 720

gcgctcatcg ccgggattga ggcggggaaa gccggcgctg ccgggattga tgtgctggag 780

gatgaggaag gaatttttca ttatgaccgc cgcacggata ttttggacca ccgccagctg 840

gcaattttga gatcttttcc caatgtgatc gtcacaccgc atactgcgtt ttaccccaac 900

caggcggtta gcgatatggc ggagatggcg cttacatcgc ttgtatcctt tgtggagacg 960

gggaagagca ggtgggagat aaaatcatga 990

<210> 3

<211> 716

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctccgtggat ccggtatgtt gatgatgagc tgattgttat agaaggaaaa acagtctact 60

accaagcaac ttcctgggaa aagccaagaa gagttgcggt catccgaaaa gctgacgagt 120

atggggaaga ccagcttcaa ttgtttgatt ttctctggga ttatgaagcc attgtgacaa 180

cgatggactg agaacctatg gatatttgga gattttacaa tcagagagcc tgtctggaaa 240

actatatcaa agagtctaaa tatggttttt cgatggacaa gattccaaca gattctttcg 300

gggcaaatca tatggatctt ctgattaaat tactggcgta caatttattc gagatcttta 360

aaaaggacca ttgcccggct gcgttcaagt cctataccat caggcggttt cggagagagt 420

ttatttattc ggccggcgtg ctgacgtctc acagccggag ggtctcattg aacatttgtg 480

agacatatgc ccacaaatgg gcattccgga aaatgattca aagtgtgcgc atgattgatt 540

gagagacagg aactgaatac tggaaattaa aaagcccgca aaggtgggga gggggaaagt 600

ataccttcaa ccacctgaaa ttatagattt ggattccata ttttactttt acttccacgt 660

gtgtggattt tagctatcaa atcgctgcac tttcgtaatt tgggtttatt ttatat 716

<210> 4

<211> 925

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aatttgggtt tattttatat gtgtgaagaa cataagcagt ttttttataa ttgtgagaca 60

aaaatagagg tatttaagca catattgaat gaccatttta cagcattgtt gttggcctga 120

tccgttgaaa taatgggggt aagctgattc tttgcgttaa tttttcgatt atggtaaact 180

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

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Claims

1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述凝结芽孢杆菌的感受态细胞。

3.一种制备权利要求2的感受态细胞的方法，其特征在于，所述制备包括在细胞培养过程中加入十六烷基三甲基溴化铵。

4.权利要求1所述凝结芽孢杆菌在基因工程领域的应用，其特征在于，所述应用是在所述凝结芽孢杆菌的基础上进行基因工程改造。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程改造是敲除权利要求1所述凝结芽孢杆菌的D-乳酸脱氢酶基因。

6.根据权利要求4或5所述应用得到的基因工程菌。

7.一种生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1所述凝结芽孢杆菌或权利要求6所述基因工程菌进行发酵生产。

8.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌或权利要求6所述基因工程菌。

9.权利要求1所述凝结芽孢杆菌或权利要求6所述基因工程菌在制备L-乳酸或其衍生产品方面的应用。