CN109536395A - 一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用 - Google Patents

一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用 Download PDF

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CN109536395A CN201810124606.4A CN201810124606A CN109536395A CN 109536395 A CN109536395 A CN 109536395A CN 201810124606 A CN201810124606 A CN 201810124606A CN 109536395 A CN109536395 A CN 109536395A
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梁运祥
田建平
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Abstract

本发明公开了一种高表达β‑甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用，所述的工程菌为：毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115‑syn‑Man，保藏编号：CCTCC NO：M2017827。申请人将syn‑Man插入表达载体pPIC9K中获得pPIC9K‑syn‑Man，再优化载体中信号序列，同源重组等方法，提高syn‑Man序列在毕赤酵母中的拷贝数，用不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质粒的重组GS115菌株，最终筛选得到一株表达量稳定，抗性和酶活最高的菌株。通过50L发酵罐中高密度发酵，156h获得β‑甘露聚糖酶活达到最高值110000 U/mL，显示出良好的应用前景。

Description

一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用
技术领域
本发明属于基因生物工程技术领域，具体涉及一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工 程菌株及应用。
背景技术
β-甘露聚糖酶来源广泛，存在于低等动物如海洋软体动物Mytilus edulis、Littorina ber vicula、pomacea insularus、Helix lucorum等；也存在于植物的储藏器官中，如魔芋球茎和 种子，如南欧紫荆、番茄、莴苣、黄桧、芝麻等；但微生物仍是β-甘露聚糖酶的主要来源。 细菌、放线菌和真菌中均有多种常见类群可以产生β-甘露聚糖酶。例如细菌中的革兰氏阳 性菌芽孢杆菌包括芽孢杆菌(Bacillus species)和梭菌(Clostridiaspecies)，少数的革兰 氏阴性菌，弧菌(Vibrio)和拟杆菌(Bacteroides)，还有一些嗜热菌和极端微生物。微生 物来源的β-甘露聚糖酶具有许多优点，酶活性高、生产成本低、提取方便，pH、温度作用 范围广以及底物专一性较高等。因此，微生物来源的β-甘露聚糖酶已得到了广泛应用。
β-甘露聚糖酶因其来源不同而性质迥异。一般来说，细菌中的β-甘露聚糖酶分子量多在 35kD-55kD之间，等电点多为4.0-5.5，其最适反应温度为50℃-70℃。不过嗜碱性芽孢杆菌 的最适pH值可达到9.0-10.0。不同微生物所产的β-甘露聚糖酶在分子量、最适反应条件、 等电点、底物专一性等方面均有一定的差异。真菌来源的β-甘露聚糖酶作用范围偏酸，最 适反应pH偏低，一般在4.0-5.5之间，最适反应温度一般在55-75℃之间，耐热性比较差， 如嗜温真菌Trichoderma harzianum T4产的甘露聚糖酶在55℃放置45分钟后酶活性就降低 了70％。细菌和放线菌来源的β-甘露聚糖酶作用范围广，pH在5.0-9.5之间，最适反应温度 在40-90℃之间。
随着对β-甘露聚糖酶的深入研究，该酶在造纸、饲料、洗涤、纺织、食品、医药和石油开采等工业领域中得到了广泛的应用，特别是在造纸和饲料工业中。此外，β-甘露聚糖酶作为一种工具酶在糖结构的分析和植物基因工程等生物研究领域中有重要用途。
发明内容
本发明目的在于提供一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌，所述的菌株已于20 17年12月22日，送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M201782 7，分类命名：毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌在生产β -甘露聚糖酶中的应用。
本发明的最后一个目的在于提供了一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的发酵 方法，方法简单，适用于大规模生产。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的获得：
申请人自从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus CCAM080065)中克隆β-甘露聚糖酶原始 基因Man；通过去掉信号肽、优化密码子、调整GC含量、降低RNA二级结构能值后获得优化序列syn-Man(优化后的序列为SEQ ID NO.1所示)；将syn-Man插入表达载体pPIC9 K中获得pPIC9K-syn-Man，再优化载体中信号序列，同源重组等方法，提高syn-Man序列 在毕赤酵母中的拷贝数，用不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质粒的重组GS115 菌株，筛选得到一株表达量稳定，抗性和酶活最高的菌株。
以上所述菌株已于2017年12月22日，送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号： CCTCC NO：M2017827，分类命名：毕赤酵母(Pichia pastoris)，地址：中国武汉武汉大学。
所构建毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man工程菌株菌株最适生长及诱导表达 温度为28-30℃，温度超过32℃不利于菌株生长，造成β-甘露聚糖酶酶活降低。需氧，生 长培养基为YPD培养基，BMGY、BMMY培养基用来进行β-甘露聚糖酶表达。菌体倍增 时间约为2h，甲醇诱导阶段，倍增时间扩大至4-6h。
一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的高密度发酵方法，包括下述步骤：
1.种子液培养阶段
将毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man用YPD液体培养基活化后转接至YPG 培养基中培养16-25h，25-32℃，220-300r/min；
2.菌体生长阶段
把1L种子液接种到装有20-30L BSM培养基的发酵罐中。在发酵起始阶段设置转速250-350r/min，通气率0.55-0.80vvm，pH 4.5-5.5.0，DO>30％直到升至100％，当BSM培 养基中的甘油消耗完且DO降低后又急剧上升时，进入连续补甘油阶段，加入50％甘油(含 有1.2％的PTM1)共4-5L。随着菌体生物量的增加，溶氧DO迅速下降，此时需要根据D O值不断提高转速和增加罐压，保持DO值在在20％-40％的范围内；
3.甲醇诱导表达阶段
补加甘油结束后，当DO值再次急剧上升时就进入甲醇诱导阶段。甲醇诱导开始时设置 搅拌速度450-550r/min，通气率维持在1.5-2.5vvm，甲醇(含有1.2％的PTM1)添加量为0.8-1.5mL/(h·L)。整个阶段观察监测DO值。根据DO值的变化和酵母对碳源代谢的需求，逐渐增加甲醇添加量，使DO值稳定在30％～50％之间，并保持该速率至发酵结束。
一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌在生产β-甘露聚糖酶中的应用，包括利用 本领域的常规方式利用本发明提供的工程菌生产β-甘露聚糖酶。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所构建高拷贝表达β-甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌株的优势在于：首先从短小芽孢 杆菌(Bacillus pumilus CCAM080065)中获得原始基因，充分发挥其酶活性高、生产成本 低、提取方便，具有pH、温度作用范围广以及底物专一性较高等特点，所表达β-甘露聚糖 酶最适PH为5.5或7.5，最适反应温度为50℃。然后再通过优化密码子、调整GC含量、降低R NA二级结构能值等获得优化序列syn-Man，再优化载体中信号肽序列，同源重组等方法，提 高syn-Man序列在毕赤酵母中的拷贝数，最终筛选出一株稳定高效表达β-甘露聚糖酶的基因 工程菌。再通过发酵工艺优化，优化结果为：发酵温度为30℃，甲醇添加量为1％，甲醇与 山梨醇质量比为20:1混合添加以及添加0.5％的吐温80等条件下进行发酵，β-甘露聚糖酶酶活 最高，可达6339U/mL。再通过50L发酵罐中高密度发酵，156h获得β-甘露聚糖酶活达到最 高值110000U/mL，显示出良好的应用前景。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的具体说明，不是对本发明的限制。下面结合具体实施例子对 本发明作进一步的说明。本发明所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。 本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主 编。
本发明实施例所使用的引物如下：
实施例1：
高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的筛选：
(1)β-甘露聚糖酶基因全长的扩增
在短小芽孢杆菌Man基因(1041bp)序列两侧序列设计引物对[P(336)-fwd和P(1723) -rev]。以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板，利用该引物对基因组中Man基因序列进行扩增。
得到一段1400bp左右的基因片段，其中包含β-甘露聚糖酶基因的全长序列，对其进行 测序，结果显示该片段总长1387bp。用pDRAW32软件分析其开放阅读框，结果表明，Man基因包含1101个核苷酸，编码367个氨基酸。通过软件预测，氨基酸序列中前31个氨基 酸为信号肽序列，成熟蛋白的分子量为38.005kD，等电点为5.60。
(2)β-甘露聚糖酶基因密码子的优化
从密码子适应指数、GC含量及分布、RNA二级结构能值三个方面来优化原始的Man基 因序列，将优化后的基因命名为syn-Man。原始序列的密码子全部替换为毕赤酵母使用频率 最高的密码子，G+C％也与毕赤酵母更为接近，RNA二级结构能值过大的地方同样也得到了 修改。
优化后基因序列由上海闪晶生物科技有限公司合成，优化后的序列为SEQ IDNO.1所 示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，合成后的syn-Man序列克隆到pUC18得到pUC 18-syn-Man。
(3)酵母重组表达载体的构建
以上述质粒pUC18-syn-Man为模板，用引物P-syn-Man-EcoRI和P-syn-Man-NotI-HIS6，该 引物在5’端加上EcoRI酶切位点，3’-端加上NotI酶切位点和HIS6-Tag标签，进行扩增得到特异 性扩增产物；
将特异性扩增产物及毕赤酵母表达载体pPIC9K分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，将上述酶 切后进行纯化的扩增DNA片段和质粒样品连接，酶切验证正确的，命名为pPIC9K-syn-Man 重组载体。
(4)G418抗性筛选
将5μL的线性化pPIC9K-syn-Man重组载体与80μL的酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰 预冷的电转杯中，再将电转杯冰浴5min。设定电激参数(1500V，5ms)，进行电激。电激完 毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的离心管中，将菌体悬液涂布 于MD平板上，每200-600μL涂布一块平板。将平板于30℃培养箱倒置培养，直至单个菌落 出现。并在高浓度梯度G418抗性的MD平板上筛选(10，15，20，25mg/mL)，挑选抗性 最高的转化子，得到低拷贝甘露聚糖酶基因GS115-syn-Man-L菌株。
(5)构建信号肽优化的表达载体pPIC9K-MF1-syn-Man
信号肽MF1优化方法：将原始信号肽序列的密码子全部改为毕赤酵母使用频率最高的密 码子，尽量避免出现富含AT的序列；去掉BamHI酶切位点，使信号肽与启动子直接相连。 在信号肽N段引入A、I和P 3个氨基酸；缺失原始信号肽第57-70共14个氨基酸。优化后的信 号肽合成：信号肽优化方法1共设计6条引物(α-1到α-6)如下：
将除α-1和α-6的其余引物各取5μL混合，将混合液(Mix)作为模板，以第一条和最后 一条引物扩增出所需信号肽片段MF1。反应体系如下：
PCR反应参数：90℃预变性30s；90℃变性30s；51℃退火45s；72℃延伸30s；25 个循环后72℃保温5min。电泳检测PCR产物。用Axygen公司的DNA切胶回收试剂盒对上述 PCR得到的产物进行切胶回收。用BamH I和EcoR I酶对上述产物以及pPIC9K载体进行酶切， 酶切产物用T4连接酶连接获得重组载体pPIC9K-MF1，并转化大肠杆菌DH5α，
以pPIC9K-MF1为模板，分别以SacI-F/1-R和2-F/EcoRI-R为引物扩增出上下游片段，回 收产物，上下游片段的拼接。体系如下
PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸1min；28 个循环后72℃保温5min。电泳检测PCR产物。用Axygen公司的DNA清洁回收试剂盒对上述 PCR得到的产物进行清洁回收。用Sac I和EcoR I酶对上述产物及pPIC9K载体进行酶切，回 收酶切产物，将上述两个酶切产物用T4连接酶连接并转化大肠杆菌DH5α。
(6)多拷贝甘露聚糖酶基因重组酵母构建
将上述已构建好的的低拷贝GS115-syn-Man-L菌株做成感受态，再将上述已构建成功的 重组质粒pPIC9K-MF1-syn-Man用Sac I线性化后电激转化酵母感受态细胞GS115-syn-Man-L， 采用同源重组的方式---即通过线性化表达载体pPIC9K-MF1-syn-Man，反复把目的基因整合 至低拷贝重组菌GS115-syn-Man-L的染色体，再用高浓度的遗传霉素G418大量筛选转化子， 从而获得高拷贝的重组酵母工程菌(在一定范围内，目的基因整合的拷贝数与重组菌的G41 8抗性成正比)。
(7)高拷贝重组酵母筛选
将电击转化且孵育后的感受态细胞直接涂布至含有8mg/mL G418的MD平板上培养， 再用不同高浓度G418抗性(10，15，20，25mg/mL)的MD平板进行筛选，挑选抗性最 高的几个转化子进行产酶发酵，最终筛得一株高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌，该 菌株已于2017年12月22日，送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M2017827，分类命名：毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man，地址：中国武汉武汉 大学。
实施例2：
高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的摇瓶发酵：
把筛选出来的高拷贝重组酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man接种到100mL 的BMGY培养基中(温度30℃，转速250r/min)培养至OD600＝4，离心收集菌体并转接到100 mL的BMMY诱导培养基中(温度30℃，转速250r/min)培养。每12h补加甲醇至终浓度为1％，每24h取样1mL，将发酵液离心收集上清即为粗酶液，并测定酶活。
探究了不同的发酵温度、甲醇添加量、山梨醇添加量以及吐温80的添加等发酵条件对β- 甘露聚糖酶诱导的影响。可以看出，诱导温度为30℃，甲醇添加量为1％，甲醇与山梨醇质 量比为20:1以及混合添加0.5％的吐温80更加适宜于诱导β-甘露聚糖酶酶活的生产，最高酶 活可达6339U/mL。
实施例3：
高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的高密度大型发酵：
高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的高密度大型发酵需要经过种子液培养、菌体生 长、甲醇诱导表达三个阶段，每阶段参数设置如下：
1.种子液培养阶段
将毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man用YPD液体培养基活化，培养24h后转接1mL到10瓶装有100mL YPG培养基的500mL三角瓶中，培养20h(30℃，250 r/min)。
2.菌体生长阶段
把1L种子液接种到装有20L BSM培养基的发酵罐中。在发酵起始阶段设置转速300r/min，通气率0.75vvm，pH 5.0，DO>30％直到升至100％，当BSM培养基中的甘油消 耗完且DO降低后又急剧上升时，进入连续补甘油阶段，加入50％甘油(含有1.2％的PTM 1微量盐)共4L。随着菌体生物量的增加，溶氧DO迅速下降，此时需要根据DO值不断 提高转速和增加罐压，保持DO值在在20％-40％的范围内，以保证发酵罐内溶氧在一定水 平，菌体生长阶段总共持续约2d。
3.甲醇诱导表达阶段
补加甘油结束后，当DO值再次急剧上升时就进入甲醇诱导阶段。甲醇诱导开始时设置 搅拌速度500r/min，通气率维持在2.0vvm，甲醇(含有1.2％的PTM1微量盐)添加量为1mL/(h·L)。整个阶段观察监测DO值。根据DO值的变化和酵母对碳源代谢的需求，逐 渐增加甲醇添加量，使DO值稳定在30％～50％之间，并保持该速率至发酵结束。
从起始发酵至结束，总发酵周期为156h，β-甘露聚糖酶活达到最高值110000U/mL，相比较未优化前，酶活提高了5倍，5000rpm/min，离心5min后且毕赤酵母菌体湿重达到440g/L。
实施例4：
毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man的传代及表达的稳定性：
将毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man反复培养50代后，β-甘露聚糖基因序列测 序后正确，并未发生突变与移码。菌株表型稳定，形态生长速率方面无明显变化，10mg/mL 含G418的MD平板上筛选，仍有强烈抗性，证明目的基因整合拷贝数正常。酶活正常表达产 量稳定，50L发酵罐高密度大型发酵β-甘露聚糖酶活仍可达到110000U/mL，显现出良好的 生产应用价值。
实施例5：
发酵产物的性质
本发明所构建毕赤酵母工程菌株所表达达β-甘露聚糖酶分子量为38kD，进一步探究该 重组酶的最适pH、最适温度、及金属离子与化学试剂对酶活的影响，结论如下：
pH5.5和7.5的反应体系中更加适宜于该酶促反应，并且该酶在pH5.0-8.0的反应体系中 保温30min，酶活仍维持在50％左右，说明该酶具有一定的pH耐受性。所表达重组酶最适 反应温度为50℃，在40℃-60℃的反应时间内保温60min后酶活仍保持在70％以上，说明 在该温度范围内具有较强的热稳定性。K+、Mn2+、Ag2+、Hg2+、Fe2+和SDS化学试剂对酶 活具有较强抑制作用，其余化学试剂并对酶活并无显著影响。
通过毕赤酵母高密度发酵在156h时β-甘露聚糖酶活达到110000U/mL，并通过发酵产物性质的相关研究表明该酶在工业生产中具有良好的应用前景。
序列表
<110> 四川润格生物科技有限公司
<120> 一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaagc tgaagcttac gttgaattcc atactgtttc tccagttaat 300
cctaacgctc aacaaacaac aaaggctgtt atgaactggt tggctcattt gccaaacaga 360
acggagaata gagttttgtc tggtgccttc ggtggttact ctcatgacac tttctctatg 420
gctgaggctg acagaattag atctgctact gggcaatcgc cagctatcta cggttgtgac 480
tatgctagag gttggttgga gactgctaag attgaggact ctattgacgt ttcttgtaac 540
ggtgacttga tttcttattg gaagaacggt ggtattccac aaatttcttt gcatttggct 600
aacccagctt tccaatcagg tcatttcaag actccaatta ctaacgacca atataagaag 660
attttggact cttctactgc tgagggtaag agattgaacg ctatgttgtc taagattgct 720
gatggtttgc aagagttgga gaaccaaggt gttcctgttc tgttcagacc gttgcatgag 780
atgaacggtg aatggttctg gtggggtttg acttcttaca accaaaagga caacgagaga 840
atttctttgt acaagcaatt gtacagaaga tctaccatta catga 885
<210> 2
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe His Thr Val
85 90 95
Ser Pro Val Asn Pro Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Ala Val Met Asn
100 105 110
Trp Leu Ala His Leu Pro Asn Arg Thr Glu Asn Arg Val Leu Ser Gly
115 120 125
Ala Phe Gly Gly Tyr Ser His Asp Thr Phe Ser Met Ala Glu Ala Asp
130 135 140
Arg Ile Arg Ser Ala Thr Gly Gln Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Arg Gly Trp Leu Glu Thr Ala Lys Ile Glu Asp Ser Ile Asp
165 170 175
Val Ser Cys Asn Gly Asp Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Asn Gly Gly Ile
180 185 190
Pro Gln Ile Ser Leu His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Gln Ser Gly His
195 200 205
Phe Lys Thr Pro Ile Thr Asn Asp Gln Tyr Lys Lys Ile Leu Asp Ser
210 215 220
Ser Thr Ala Glu Gly Lys Arg Leu Asn Ala Met Leu Ser Lys Ile Ala
225 230 235 240
Asp Gly Leu Gln Glu Leu Glu Asn Gln Gly Val Pro Val Leu Phe Arg
245 250 255
Pro Leu His Glu Met Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Ser
260 265 270
Tyr Asn Gln Lys Asp Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Gln Leu Tyr
275 280 285
Arg Arg Ser Thr Ile Thr
290

Claims (3)

1.一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌，所述的工程菌为：毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-syn-Man，保藏编号：CCTCC NO：M2017827。
2.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌在生产β-甘露聚糖酶中的应用。
3.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌的发酵方法，包括下述步骤：
1）.种子液培养阶段
将毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115-syn-Man用YPD液体培养基活化后转接至YPG培养基中培养16-25h，25-32℃，220-300 r/min；
2）.菌体生长阶段
把1 L种子液接种到装有20-30 L BSM培养基的发酵罐中；在发酵起始阶段设置转速250-350 r/min，通气率0.55-0.80 vvm，pH 4.5-5.5.0，DO>30％直到升至100%，当BSM培养基中的甘油消耗完且DO降低后又急剧上升时，进入连续补甘油阶段，加入50%甘油共4 -5L；随着菌体生物量的增加，溶氧DO迅速下降，此时需要根据DO值不断提高转速和增加罐压，保持DO 值在在20%-40%的范围内；
所述的50%甘油含有1.2%的PTM1；
3）.甲醇诱导表达阶段
补加甘油结束后，当DO值再次急剧上升时就进入甲醇诱导阶段，甲醇诱导开始时设置搅拌速度450-550 r/min，通气率维持在1.5-2.5 vvm，甲醇添加量为0.8-1.5 mL/（h·L）；逐渐增加甲醇添加量，使DO值稳定在30%~50%之间，并保持该速率至发酵结束；
所述的甲醇含有1.2%的PTM1。
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