CN1766098A

CN1766098A - 一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1766098A
Application number: CN 200510103125
Authority: CN
Inventors: 丁宏标; 乔宇; 陈小兵; 岳明; 高秀华
Original assignee: Beijing Challenge Agricultural Science & Technology Co ltd; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhanhua Lingxiu Huaan Biological Technology Co. Ltd.
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2006-05-03
Anticipated expiration: 2025-09-16
Also published as: CN100348720C

Abstract

本发明公开了一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用。该甘露聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有甘露聚糖酶活性的蛋白质。本发明的甘露聚糖酶活性高，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389中甘露聚糖酶的表达量可达200000IU/mL发酵液，比现有甘露聚糖酶的产量高，生产成本低。本发明的甘露聚糖酶可以用于制备甘露寡糖。

Description

一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78)是一种半纤维素酶，可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。在食品、医药、造纸、洗涤和石油压裂液破胶等方面具有重要应用价值(Tipdon，et al.，Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry，32：299-316，1976；Khanongnuch，et al.Biotechnol Lett.21(1)：61-63，1999：Philippe，etal.EP1059351，2000；Kelly，et al.USP6,197,730，2001)。

目前，已从不同来源的的生物中分离得到了甘露聚糖酶，如芽孢杆菌、气单孢菌、梭孢菌、真菌和链霉菌等(Braithwaite，et al.，Biochem J，305：1005-1010，1995；Duffaud，et al.，Appl Environ Microbiol，63(1)：169-177，1997；Reese和Shibata，Can J Microbiol，11：167-183，1965；Akino，etal.，ApplMicrobial Biotech，26：323-327，1987)。

关于甘露聚糖酶已有专利和文献报道。如：中国发明专利03118984.9公开了一种甘露聚糖酶，该甘露聚糖酶在小试水平上表达酶活性最高达到1030IU/ml。单位体积发酵液中的酶活性仍然偏低，因而生产成本较高。中国发明专利01128868.X公开了一种中性甘露聚糖酶，该甘露聚糖酶在摇瓶水平上表达酶活性为307IU/ml；另外中国科学院微生物研究所枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BMG602产生的中性甘露聚糖酶，在适宜条件下酶活力为96IU/ml；中国科学院微生物研究所Alkalophilic bacillus sp.N16-5发酵生产的碱性甘露聚糖酶的活力为160IU/ml.在这些研究中，或者存在酶活力不高，不稳定，或者工艺复杂，成本高等不足。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种活性高，表达水平高的甘露聚糖酶。

本发明所提供的甘露聚糖酶，是β-1，4-甘露聚糖酶，名称为BSMA，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有甘露聚糖酶活性的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中的序列2由360个氨基酸残基组成。自序列2的氨基端的第1位至第24位氨基酸残基为信号肽序列，自序列2的氨基端的第25位至第360位氨基酸残基为BSMA的成熟蛋白序列。

该甘露聚糖酶分子量为40kda；酶活性的pH值范围为3.0～10.0，酶活性的最适pH值为5.5；pH值的稳定性范围为2.0～10.0；酶活性的温度范围为20～80℃，酶活性的最适温度为30～60℃，该酶最适反应温度为50℃；温度的稳定性范围为20～80℃。

上述甘露聚糖酶编码基因(BSMA)，也属于本发明的保护范围。

上述甘露聚糖酶编码基因可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列1由1083个脱氧核苷酸组成，它的编码序列为自序列1的5端第1位至1083位脱氧核苷酸。

自序列1的5′端第1位至第72位脱氧核苷酸是信号肽的编码序列，自序列1的5′端第73位至1083位脱氧核苷酸是BSMA的成熟蛋白的编码序列。

含有本发明基因的表达载体(如pQY22)、细胞系和工程菌均属于本发明的保护范围。

所述工程菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22。

巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22已于2005年06月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.1389。

巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389，是单细胞的真核生物，呈卵圆形。无性生殖为芽殖，有时有假菌丝。有性生殖时产生子囊，每一子囊内含有1-4枚光滑圆形、礼帽形或土星形子囊孢子。巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)MAN22具有毕赤酵母的生理生化特征，同时因插入β-甘露聚糖酶基因，具有高效表达β-甘露聚糖酶基因的特性。

本发明的另一个目的是提供一种表达甘露聚糖酶BSMA的方法。

本发明所提供的表达甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)接种前，在10×Basal Salts中加入质量百分浓度为25％的氨水使培养基的pH达到5.0，再按每升培养基加4.35mL的量加入PTM1，然后接入巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389，调节溶氧电极为100％，培养至培养体系中的溶氧恢复至80％；所述10×Basal Salts由以下质量百分浓度的成分组成：2.67％85％H₃PO₄、0.093％CaSO₄、1.49％MgSO₄、1.82％K₂SO₄、0.413％KOH、0.5％葡萄糖；所述PTM1由以下质量百分浓度的成分组成：0.6％CuSO4、0.008％KI、0.3％MnSO₄、0.02％Na₂MoO₄、0.002％硼酸、0.05％CoCl₂、2％ZnCl₂、6.5％FeSO₄、0.0025％生物素、0.5％H₂SO₄；

2)向步骤1)得到的培养体系中流加质量百分比浓度为25％的葡萄糖水溶液，流加量为18mL/h/L培养液，每升所述质量百分比浓度为25％的葡萄糖水溶液中含12mL PTM1；并使该体系中的溶氧量大于20％，培养6h；

3)向步骤2)得到的培养体系中流加质量百分比浓度为25％的葡萄糖和甲醇(体积比为8∶1)，流加量为9mL/h/L培养液；并使该体系中的溶氧量大于20％，培养4h；

(4)向步骤3)得到的培养体系中加入甲醇，每升甲醇中含12mL PTM1，使甲醇终浓度维持在0.3％，并使该体系中的溶氧量大于20％，诱导培养12-96h，得到甘露聚糖酶。

本发明的甘露聚糖酶活性高，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCCNo.1389中甘露聚糖酶的表达量可达200000IU/mL发酵液，比现有甘露聚糖酶的产量高，生产成本低。本发明的甘露聚糖酶可以用于制备甘露寡糖。

附图说明

图1为Bacillus subtilis22的胞外上清液在含魔芋粉的平板上酶解作用后用刚果红染色形成的透明圈

图2为重组酵母表达载体pQY22的物理图谱

图3为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389的PCR鉴定

图4为5L发酵罐中不同诱导时间所累积的甘露聚糖酶的SDS-PAGE

图5为5L发酵罐中巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389诱导产酶曲线

具体实施方式

材料

1)菌株和质粒大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株和质粒pGEM-TVector购自Promega公司；毕赤酵母Pichia Pastoris GS115和pPIC9K分泌型表达载体购自Invitrogen公司；

2)酶和试剂盒限制性内切酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T₄ DNA连接酶等工具酶购TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒购自上海申能博彩生物技术有限公司；

3)生化试剂 G418购自Invitrogen公司；蛋白质分子量标准购自上海生物化学研究所；IPTG、X-Gal、SDS及次槐豆胶为Sigma产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为Promega产品。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、甘露聚糖酶BSMA及其编码基因的获得

1、甘露聚糖酶的菌株的筛选

供试菌株包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.1849、Bacillusstearother-mophilus(嗜热性脂肪芽孢杆菌)、Pseudomonas fluorescens(荧光假单胞菌)、Azotobacter chroococum(褐球固氮菌)、Micrococcus luteus(藤黄微球菌)，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。挑取供试菌株单菌落接种于5mL含魔芋粉的液体诱导培养基(0.5％魔芋粉、0.5％NH₄NO₃、0.05％NaCl、0.05％MgSO₄、0.03％MnSO₄、0.03％FeSO₄，pH7.0)中，30℃培养2天，离心取上清液100μL加入含0.5％的魔芋粉的琼脂平板(0.5％魔芋粉、0.5％NH₄NO₃、0.05％NaCl、0.05％MgSO₄、0.03％MnSO₄、0.03％FeSO₄、2％琼脂，pH7.0)的孔穴中，50℃培养1h，用0.1％的刚果红染色1h，再用1mol/L NaCl脱色40min。观察产生的透明圈(图1)。挑取产生透明圈的菌株的上清夜进行酶活测定：按照Akino(Agr.Biol.Chem.1988，52，773-779)方法，用0.05mol/L磷酸氢二钠-0.025mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.0)精确稀释酶液；向试管加入1.8ml 0.5％次槐豆胶溶液，置50℃水浴保温5min，分别加入0.2ml稀释酶样，混匀，置50℃水浴中；准确保温5min；分别加入1.5ml DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即冷却到室温，再向每管加入21.5毫升蒸馏水，摇匀；于520nm波长处测OD值；空白酶液使用灭活酶样，原酶液在100℃加热10分钟后，与待测酶液做同样稀释操作。参照Akino(Agr.Biol.Chem.1988，52，773-779)方法，一个酶活单位(IU)定义为：每分钟水解底物产生1μg相当于甘露糖的还原糖的酶量定义为一个甘露聚糖酶单位。在此条件下测到的最高酶活为32IU/ml，其产生的菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.1849(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。

2、甘露聚糖酶BSMA及其编码基因的获得

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.1849基因组DNA的提取采取CTAB法：100ml枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.1849 10小时培养液，加9.5mlTE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％SDS，50μ1 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀；再加1.5ml 10％CTAB溶液(用0.7mol/LNaCl溶液配制)，混匀，65℃保温20分钟；用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管；用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，上清液加1倍体积异丙醇，沉淀DNA。

根据已报道的来源于枯草芽孢杆菌的不同的甘露聚糖酶基因序列，设计合成PCR引物MnF和MnR：

MnF：5’ GAATTCATGCTTAAAAAGTTAGCAGTCTGC 3’

MnR：5’TT GCGGCCGCAAACCGATTTTCAAAAGAA 3’

这两段引物设计都设计在甘露聚糖酶结构基因之外，上游引物设计了EcoRI酶切位点，下游引物设计了NotI酶切位点。PCR反应体系为50μL，含有50ng枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.1849基因组DNA，0.2m mol/L dNTP，25pmol每种引物，1×PCR反应缓冲液，2.5U Deep Vent DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性5min后；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；然后在72℃延伸7min。扩增出的约1.0Kb的DNA片段经DNA回收试剂盒回收，连接到pGEM-T Vector上，转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，得到重组质粒pQY-1。通过DNA全序列分析，获得了甘露聚糖酶基因(BSMA)的完整DNA序列(序列1)，全长1083个核苷酸，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的甘露聚糖酶BSMA。根据信号肽序列的结构预测，N端的24个氨基酸(自序列2的氨基端第1位至第24位氨基酸残基)为信号肽，具有典型的信号肽结构，N端两个亲水的氨基酸(lys)后是一个疏水的核心区，C端为Ala。信号肽的切割位点自氨基端第24位Ala至第25位His之间。甘露聚糖酶BSMA成熟蛋白的分子量约为36960Dal。

实施例2、甘露聚糖酶BSMA的表达

1、酵母表达载体pQY22的构建

为了使BSMA能在酵母中顺利异源表达，去掉了BSMA中信号肽编码序列，具体方法是参照信号肽编码序列之后的核苷酸序列合成一个29个寡核苷酸片段MnM(5’CG GAATTCCACACCGTTTATCCCGTCAAC 3’)，作为上游引物，增加EcoRI酶切位点，下游引物用实施例1的MnR。PCR反应的方法同例1。扩增出的约1.0Kb的DNA片段经DNA回收试剂盒回收，连接到pGEM-T Vector上，转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性克隆，得到重组质粒pQY-2。

将BSMA插入到表达载体pPIC9k(Invitrogen)的信号肽序列下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母染色体基因组之间的同源重组使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：将BSMA基因从质粒pQY-2经EcoRI、NotI双酶切后插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoRI和NotI识别位点之间，并位于α-因子信号肽序列的下游，得到重组质粒pQY22，对pQY22进行测序，测序结果表明pQY22含有自序列1的5′端第73位脱氧核苷酸至第1083位脱氧核苷酸的甘露聚糖酶BSMA成熟蛋白编码基因序列，且该甘露聚糖酶BSMA成熟蛋白编码基因序列与pPIC9k(Invitrogen)的信号肽形成正确的开放阅读框架(图2)。这样就将带有分泌信号的目的基因克隆到了AOX1启动子下游。

2、酵母转化及工程菌巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)MAN22CGMCC No.1389的获得

质粒pQY22的DNA经PEG转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因可以整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的甘露聚糖酶氨基酸序列与天然存在的成熟甘露聚糖酶完全相同。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化、形成二硫键，从而得到具有生物活性的蛋白产物。

首先用2～3倍过量的内切酶BglII酶切pQY22的DNA，电泳检测酶切是否完全，使之线性化。用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗盐，干燥后用无菌水溶解，-20℃保存备用。

巴氏毕赤酵母菌株GS115接种于10mL YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，调节pH为7.0)中30℃培养8小时，取培养物转接到新鲜的10mL YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，调节pH为7.0)中，使其OD值在0.1-0.2之间，继续在30℃振荡培养直到OD值在0.6-1.0之间。离心菌体用10mL溶液I(山梨醇溶液并含有聚乙二醇和DMSO，由Invitrogen公司Pichia Easy Comp^TMTransformation kit提供)重悬，离心后再将菌体重悬于上述1mL溶液I中，分装成50μL-200μL/管，酵母感受态细胞制备完毕，存于-80℃备用。

室温融化1管感受态细胞加入3μg线性化的pQY22质粒，加入1mL溶液II(PEG溶液，由Invitrogen公司Pichia Easy Comp^TM Transformation kit提供)混匀，于30℃孵育1小时，每15分钟振荡混匀一次。

42℃热激10分钟后离心，菌体用10mL溶液III(盐溶液，由Invitrogen公司Pichia Easy Comp^TM Transformation kit提供)混匀)重悬，离心后再用150μL该溶液重悬菌体，涂板于RDB固体培养基(18.6％山梨醇、1.34％YNB、2％葡萄糖、0.00004％生物素、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸，琼脂粉2％，调节pH值为7.0)上，30℃培养2-4天，直至转化子出现。转化子可在基本培养基(不含组氨酸)生长，由于载体中没有酵母复制子，所以His4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于转化的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(Mut^-)。另外，由于载体中具有编码抗性的基因已整合到酵母基因组中，赋予酵母抗G418的能力，所以转化子可以在含G418的培养基中生长。

用无菌牙签从转化平板(RDB固体培养基)上挑取生长的His⁺重组子，首先接种到MM固体培养基(1.34％YNB、0.5％甲醇、0.00004％生物素、2％琼脂粉，调节pH值为7.0)上，再接种到MD固体培养基(1.34％YNB(酵母氮源)、2％葡萄糖、0.00004％生物素、2％琼脂粉，调节pH值为7.0)上，如此挑取His⁺重组子，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子。

为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，再将His⁺Mut-转化子分别点板于含500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL G418的YPD固体平板(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉，调节pH值为7.0)上。挑选在2000μg/mL G418的YPD固体平板上生长的6株重组菌株进行诱导表达。首先在BMGY培养基(1％甘油、1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％酵母氮源(YNB)、0.00004％生物素、1％甘油，调节pH为6.0)(以甘油为碳源)中培养，待其生长到饱和状态，移去BMGY，换入诱导培养基BMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％酵母氮源(YNB)、0.00004％生物素、0.5％甲醇，pH6.0)(以甲醇作为诱导物)，在诱导36小时去取上清进行甘露聚糖酶活性分析。通过表达甘露聚糖酶的酶活性测定，筛选到一株酶活力最高重组菌株(200000IU/ml培养液)，定名为MAN22。巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)MAN22已于2005年06月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1389。

3、在分子水平上证实甘露聚糖酶基因在酵母中的重组及翻译

重组酵母菌株的甲醇利用缺陷型说明外源基因已经准确整合到酵母基因组中AOX1基因位点，从而破坏了该基因的功能。通过分子检测也证实了这一点。提取巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389基因组DNA，具体方法为取培养8小时的5mL酵母细胞离心收集菌体，1mL无菌水洗涤离心，沉淀加200μL破菌缓冲液(SDS 1％，Triton X-1002％，NaCl 100mM，Tris-Cl(pH8.0)10mM，EDTA 1mM)，剧烈振荡再加200μL酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，在vortex上高速振荡1-2min，取上清。无水乙醇沉淀，离心干燥基因组DNA。以巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)MAN22 CGMCC No.1389基因组DNA为模板，利用引物MnM和MnR PCR扩增去掉了BSMA中信号肽编码序列，其中，PCR反应体系为50μL，含有50ng基因组DNA，0.2m mol/L dNTP，25pmolMnM和MnR引物，1×PCR反应缓冲液，2.5UTaq DNA聚合酶。反应条件为：94℃预变性5min；再94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，进行35个循环；然后在72℃延伸7min。PCR结果如图3所示，PCR得到1.0Kb的DNA片段，表明去掉了BSMA中信号肽编码序列已整合到重组酵母基因组中。图3中，泳道1为DNA分子量标准，泳道2、3、4分别为巴氏毕赤酵母GS115、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389和质粒pQY22为模板的PCR产物。

取10μL无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE分析(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为30∶1)。所用分离胶为123.5％，浓缩胶为4％。电泳结束后用考马司亮蓝R250染色30分钟，接着用10％冰乙酸脱色。结果表明，表达的甘露聚糖酶的分子量约为40kD，与理论值相符，并且表达的甘露聚糖酶没有进行糖基化修饰。

实施例3、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389表达的甘露聚糖酶的性质分析

将巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389表达的甘露聚糖酶在不同pH值的缓冲液(pH 2.0-7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 8.0-9.0 Tris-盐酸缓冲液、pH 9.0-11.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)50℃保温30min，检测剩余的酶活力，结果表明该酶具有酶活性的pH值范围为3.0-10.0，在pH5.0-10.0的条件下保温30min后仍具有70％以上的酶活力，酶活性最适pH为5.5；酶pH值的稳定性范围为2.0-10.0。

在不同温度条件下测定巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389表达的甘露聚糖酶的酶活力，结果表明酶活性的温度范围为20-80℃，酶活性的最适温度范围为30-60℃，该酶最适反应温度为50℃，该甘露聚糖酶在60℃和70℃的条件下保温30min后仍具有约40％以上的酶活力；温度的稳定性范围为20-80℃。

实施例4、利用巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389表达甘露聚糖酶

利用巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389在5升发酵罐中高密度发酵生产甘露聚糖酶。发酵过程分为四个阶段。具体如下：(1)菌株培养阶段。接种前，在2.5升10×Basal Salts(2.67％85％H₃PO₄、0.093％CaSO₄、1.49％MgSO₄、1.82％K₂SO₄、0.413％KOH、0.5％葡萄糖)中加入质量百分浓度为25％的氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也作为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加4.35mL的量加入PTM1(0.6％CuSO4、0.008％KI、0.3％MnSO₄、0.02％Na₂MoO₄、0.002％硼酸、0.05％CoCl₂、2％ZnCl₂、6.5％FeSO₄、0.0025％生物素、0.5％H₂SO₄)。按8％(体积比)接种种子液，调节溶氧电极，将溶氧设置为100％，通气搅拌培养16h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80％以上时，开始碳源饲喂阶段。(2)碳源饲喂阶段。流加25％葡萄糖水溶液(每升中含12mLPTM1)，流加量为18mL/h/L培养液，培养6h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。(3)碳源-甲醇混合饲喂阶段。流加25％葡萄糖水溶液∶甲醇(体积比为8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。(4)诱导表达阶段。加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12h取样一次测定表达的甘露糖酶的积累量并进行表达蛋白的SDS-PAGE。SDS-PAGE结果如图4所示，甘露聚糖酶的酶活力测定曲线如图5所示，表明表达的甘露聚糖酶随诱导时间的增加而积累，在诱导96小时达到高峰，这时的生物量达到220g/L发酵液，酶活性达到2.0×10⁵IU/ml发酵液，表达的酶蛋白分子量大小约为40kD(图4中箭头示)。以上结果证明甘露聚糖酶基因不仅得到了表达、有效分泌，且表达的甘露聚糖酶具有正常的生物学活性。图4中，泳道1-8分别为诱导12、24、36、48、60、72、96、0小时的电泳结果，9为标准蛋白分子。将发酵结束后的发酵液用2kg玉米芯吸附，常温干燥后制成甘露聚糖酶BSMA固体产品。

实施例5、利用巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389表达的甘露聚糖酶降解魔芋粉制备甘露寡糖

魔芋精粉中加入是魔芋精粉4倍质量的水，加热煮沸使粉充分溶解，冷却至40℃，分别加入是魔芋精粉质量的2％、5％和8％的实施例4中得到的甘露聚糖酶BSMA，搅拌均匀，分别反应48、27、10小时，取样检测糖组成。结果表明加入是魔芋精粉质量的2％的BSMA，反应48小时，2-20个糖基寡糖占总糖80％；加入是魔芋精粉质量的5％的BSMA，反应27小时，2-20个糖基寡糖占总糖82％；加入是魔芋精粉质量的8％的BSMA，反应10小时，2-20个糖基寡糖占总糖85％。将反应液干燥制成甘露寡糖。所制寡糖可用于动物饲料、生物农药等。

实施例6、利用巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389表达的甘露聚糖酶降解田箐胶制备甘露寡糖

田箐胶中加入是田箐胶4-8倍质量的水，加热煮沸使胶充分溶解，冷却至60℃，分别加入是田箐胶质量的2％、4％的实施例4中得到的甘露聚糖酶BSMA，搅拌均匀，反应48、24小时，取样检测糖组成。结果表明加入是田箐胶质量的2％的BSMA，反应48小时，2-20个糖基寡糖占总糖82％；加入是田箐胶质量的4％的BSMA，反应24小时，2-20个糖基寡糖占总糖81％。将反应液干燥制成甘露寡糖。所制寡糖可用于动物饲料、生物农药等。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1083

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>1

atgcttaaaa agttagcagt ctgcctgtct atcgttttat tactcttagg agccgccagt 60

ccgatatcgg ctcacaccgt ttatcccgtc aacccaaatg cccagcagac gacaaaagat 120

atcatgaact ggctggccca cctgcccaac cgttcagaaa acagggtcat gtccggagcg 180

ttcggcgggt acagcgatgt cactttttca atgacagagg aaaaccgctt gaaaaacgcg 240

acgggacagt ctcccgccat ctacggctgt gactatggga gagggtggct ggaaacagcg 300

gatatcaccg atactatcga ttactgctgc aacagcagct taatctcata ctggaaaagc 360

ggcggcctcc ctcaggtcag cctgcatctc gcaaatccgg cctttccatc cggaaactat 420

aaaacggcca tctcaaacag ccagtacaaa aacatccttg acccttcaac tgtggaagga 480

aaacggcttg aggcgctgct cagcaaaatt gccgacggcc ttactcagct gaaaaatcaa 540

ggcgtcaccg ttctgttcag accgctgcat gaaatgaacg gcgagtggtt ctggtggggg 600

ctgacaggct acaaccaaaa agacaatgag agaatctcgc tgtacaaaga gctttacaag 660

aaaatatacc gctatatgac agaaacaaga ggattggata accttttgtg ggtgtattcg 720

ccggatgcca acagagactt taaaacagac ttctacccag gctcatctta tgtagatatt 780

accggtctgg acgcttactt cactgatccg tatgcgatat caggctatga tgaaatgctg 840

tctctgaaaa aaccgtttgc ctttgccgaa accggtccgt ccggcaatat cggaagcttt 900

gattatgctg cttttattaa tgcgatcagg caaaaatacc ctcagaccac gtactttttg 960

acatgggatg aacaattaag tccggcggcc aatcaaggcg cgcaaagcct ttatcaaaac 1020

agctggacgc tgaacaaggg cgaaatatgg aacggcgggt ccttgacgcc gatcgcggaa 1080

taa 1083

<210>2

<211>360

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>2

Met Leu Lys Lys Leu Ala Val Cys Leu Ser Ile Val Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Pro Ile Ser Ala His Thr Val Tyr Pro Val Asn Pro

20 25 30

Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Asp Ile Met Asn Trp Leu Ala His Leu

35 40 45

Pro Asn Arg Ser Glu Asn Arg Val Met Ser Gly Ala Phe Gly Gly Tyr

50 55 60

Ser Asp Val Thr Phe Ser Met Thr Glu Glu Asn Arg Leu Lys Asn Ala

65 70 75 80

Thr Gly Gln Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Gly Arg Gly Trp

85 90 95

Leu Glu Thr Ala Asp Ile Thr Asp Thr Ile Asp Tyr Cys Cys Asn Ser

100 105 110

Ser Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Ser Gly Gly Leu Pro Gln Val Ser Leu

115 120 125

His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Pro Ser Gly Asn Tyr Lys Thr Ala Ile

130 135 140

Ser Asn Ser Gln Tyr Lys Asn Ile Leu Asp Pro Ser Thr Val Glu Gly

145 150 155 160

Lys Arg Leu Glu Ala Leu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Thr Gln

165 170 175

Leu Lys Asn Gln Gly Val Thr Val Leu Phe Arg Pro Leu His Glu Met

180 185 190

Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Asp

195 200 205

Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Tyr Arg

210 215 220

Tyr Met Thr Glu Thr Arg Gly Leu Asp Asn Leu Leu Trp Val Tyr Ser

225 230 235 240

Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ser

245 250 255

Tyr Val Asp Ile Thr Gly Leu Asp Ala Tyr Phe Thr Asp Pro Tyr Ala

260 265 270

Ile Ser Gly Tyr Asp Glu Met Leu Ser Leu Lys Lys Pro Phe Ala Phe

275 280 285

Ala Glu Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ile Gly Ser Phe Asp Tyr Ala Ala

290 295 300

Phe Ile Asn Ala Ile Arg Gln Lys Tyr Pro Gln Thr Thr Tyr Phe Leu

305 310 315 320

Thr Trp Asp Glu Gln Leu Ser Pro Ala Ala Asn Gln Gly Ala Gln Ser

325 330 335

Leu Tyr Gln Asn Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asn Gly

340 345 350

Gly Ser Leu Thr Pro Ile Ala Glu

355 360

Claims

1、甘露聚糖酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2、根据权利要求1所述的甘露聚糖酶，其特征在于：自所述SEQ ID №：2的氨基端的第25位至第360位氨基酸残基为甘露聚糖酶的成熟蛋白序列。

3、权利要求1所述的甘露聚糖酶的编码基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述甘露聚糖酶编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：自所述SEQ ID №：1的5′端第73位至第1083位脱氧核苷酸是甘露聚糖酶的成熟蛋白的编码序列。

6、含有权利要求3、4或5所述的甘露聚糖酶编码基因的表达载体。

7、含有权利要求3、4或5所述的甘露聚糖酶编码基因的细胞系。

8、含有权利要求3、4或5所述的甘露聚糖酶编码基因的工程菌。

9、根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389。

10、一种表达甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)接种前，在10×Basal Salts中加入质量百分浓度为25％的氨水使培养基的pH达到5.0，再按每升培养基加4.35mL的量加入PTM1，然后接入巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)MAN22 CGMCC No.1389，培养至培养体系中的溶氧恢复至80％；所述10×Basal Salts由以下质量百分浓度的成分组成：2.67％85％H₃PO₄、0.093％ CaSO₄、1.49％ MgSO₄、1.82％K₂SO₄、0.413％KOH、0.5％葡萄糖；所述PTM1由以下质量百分浓度的成分组成：0.6％CuSO₄、0.008％KI、0.3％MnSO₄、0.02％Na₂MoO₄、0.002％硼酸、0.05％CoCl₂、2％ZnCl₂、6.5％FeSO₄、0.0025％生物素、0.5％H₂SO₄；

3)向步骤2)得到的培养体系中流加体积比为8∶1的质量百分比浓度为25％的葡萄糖和甲醇，流加量为9mL/h/L培养液；并使该体系中的溶氧量大于20％，培养4h；

4)向步骤3)得到的培养体系中加入甲醇，每升甲醇中含12mL PTM1，使甲醇终浓度维持在0.3％，并使该体系中的溶氧量大于20％，诱导培养12-96h，得到甘露聚糖酶。