CN1163606C - 一种植酸酶基因序列及其在酵母中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适于酵母分泌表达的编码值酸酶基因序列及其应用，其主要特征在于：从phyA全长结构基因序列中去除+45～+146位的核苷酸序列，去除+1～+44，+147～+159的黑曲霉信号肽编码序列，在5′端连接一段适于在酵母中分泌表达的信号肽编码序列，在3′端连接一个限制性内切酶位点。该基因序列可连接入不同的载体，形成不同功能的重组质粒，以pPICZαA为载体的重组质粒转化巴斯德毕赤酵母后经筛选最后获得了本发明的巴斯德毕赤酵母基因工程菌(CCTCC NO：M200005)。通过本发明成功实现了植酸酶生物表达的工业化过程。

Description

一种植酸酶基因序列及其在酵母中的应用

本发明涉及一种对phyA全长结构基因序列进行改造后形成的植酸酶基因序列及其在酵母中的表达应用。

磷是动物生长发育等生命活动必需的重要矿物质，在动物体内与钙构成骨骼和牙齿，还以磷酸根的形式参与机体代谢活动，如氧化磷酸化、DNA、RNA合成及糖代谢等。

植酸(亦称六磷酸肌醇)或植酸盐广泛存在于植物体内，尤其是籽实中，是植物储磷的主要形式，在植物性饲料原料中有50％-80％的磷是以植酸磷形式存在的(见表1)。单胃动物(猪、鸡、鱼等)缺乏内源性植酸酶，因而对饲料日粮中植酸磷的利用率很低，必须添加无机磷(如磷酸氢钙)才能满足其正常生长发育对磷的需求。同时，饲料中的植酸磷随粪便排出体外，造成磷的大量浪费和对土壤及水源的严重污染，这一问题在集约化饲养密度较高，而水和土地资源较为贫乏的地区尤为突出。

此外，植酸能与钙、镁、磷、铜、锌、锰等离子结合形成稳定的络合物，降低这些离子的可消化性，还可抑制消化酶活性，影响动物的消化吸收。因此，植酸还被认为是饲料中的抗营养因子。

                表1：主要饲料原料中总磷及其中植酸磷的含量

     (《动物饲养学》第四版，吉林科学技术出版社1999年出版。有删节。)

            饲料原料名称    总磷含量(％)    植酸磷/总磷(％)

               玉米            0.28              69.6

               大麦            0.37              63.9

               小麦            0.35              71.4

               高粱            0.17              55.7

               大豆饼          0.59              41.0

               棉子饼          1.05              59.5

               菜子饼          0.84              62.8

               大米糠          1.78              75.7

               小麦麸          1.02              72.7

植酸酶(E.C.3.1.3.8)可以水解植酸或植酸盐释放磷酸基团，理论上的催化反应如下：

在饲料中添加植酸酶能够提高植物性饲料中磷的利用率，减少粪尿中磷的排泄，降低植酸磷的抗营养作用，促进动物生长发育，达到提高畜牧业生产效益，减少环境污染的作用，这些效用已经在全世界范围内得到证实(参考文献：Ware and Shieh，(1967)USPatent 3,297,548；Nelson，et al.，(1971)J.Nutrition 101：1289-1294；Graf，E.ed.，(1986)《PhyticAcid：Chemistry and Applications》Pilatus Press，Minneapolis，MN，Chapter 2，pp.23-42；Lei，XG.，et al.，(1993)J.Nutr.123(6)：1117-1123；Lei，XG.，et al.，(1993)J.Anim.Sci.71(12)：3359-3367；Lei，XG.，et al.，(1994)J.Anim.Sci.72(1)：139-143；Cromwell，GL.，et al.，(1995)J.Anim.Sci.73(2)：449-456；Adeola，O.，et al.，(1995)J.Anim.Sci.73(11)：3384-3391；Cromwell，GL.，et al.，(1995)J.Anim.Sci.73(7)：2000-2008；Han，YM.，et al.，(1997)J.Anim.Sci.75(4)：1017-1025)。

植酸酶可以直接或间接用于人的营养药物或食品添加剂，在工业上还可以用于酶解法制备肌醇等用途。但目前还没有发现采用基因工程技术设计并合成的植酸酶在上述领域的应用。

研究发现，大量天然微生物都能够产生并分泌植酸酶，包括细菌、酵母、丝状真菌等，但这些天然微生物产生分泌植酸酶的量极少，用其作为植酸酶的生产菌种，成本高，产量低，难以实现工业化生产。

基因工程技术是实现植酸酶大量表达的有效途径，在微生物植酸酶基因克隆与表达方面，已有不少成功报道，其中真菌植酸酶基因的克隆、表达研究尤多，已经克隆出植酸酶基因的丝状真菌包括：Aspergillus niger、Asp.niger var.awamori、Asp.fumigatus、Emericella nidulans、Talaromyces thermophilus、Asp.terreus and Myceliophthora thermophila等(参考文献：Mullaney，E.J.，et al.，(1991)Appl.Microbiol.Biotechnol.35，611-614；vanGorcom，R.F. M.，et al.，(1993)Gene 127：87-94；Piddington，C.S.，et al.，(1993)Gene 133(1)，55-62；Pasamontes，L.，et al.，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63(5)：1696-1700；Pasamontes，L.，et al.，(1997)Biochim.Biophys.Acta 1353(3)，217-223；Mitchell，DB.，et al.，(1997)Microbiology 143(Pt 1)，245-252；Kerovuo，J.，et al.，(2000)Lett.Appl.Microbiol.30(4)：325-329；Han，Y.，et al.，(1999)Appl.Environ.Microbiol.65(5)：1915-1918.Berka，RM.，etal.，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64(11)：4423-4427)。

这些从不同微生物中克隆的植酸酶基因均进行了表达研究，常用的策略是将克隆的基因或略加改造或直接用于表达研究，表达宿主常常是原菌种，异源表达研究并不多。由于基因及表达系统的不同，表达量也有差异。据目前的有关报道，在巴斯德毕赤酵母细胞中表达的植酸酶基因，有来自Asp.niger、Asp，fumigatus和Selenomonas ruminantium等微生物，酶活力在10～65U/mL之间(参考文献：姚斌等，(1998)中国专利申请号：97121731.9；Cheng，et al.(1999)US Patent：5,985,605；Han Y，et al.，(1999)Arch.Biochem.Biophys.364(1)：83-90)，目前还未见有人工合成植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达研究。

本发明中phyA全长结构基因序列来自黑曲霉NRRL3135(参考文献：vanHartingsveldt，W.，et al.，(1993)Gene 127(1)：87-94)，用黑曲霉NRRL3135作为植酸酶的生产菌种，产量低，发酵液酶活力仅0.2U/mL，不适宜工业化生产。现代生物技术的发展，已经使基因的获得、体外改造十分方便、快捷，通过对黑曲酶NRRL3135植酸酶基因序列的体外设计、修改，使其更适于在巴斯德毕赤酵母中表达；通过基因合成、重组表达载体的构建、转化及表达筛选，即可获得高效表达植酸酶的毕赤酵母基因工程菌，为工业化大规模发酵生产植酸酶提供基础。

本发明的第一个目的是提供一种能在酵母应用的植酸酶序列。

本发明的第二个目的是提供对应于上述基因序列的重组质粒。

本发明的第三个目的是提供一种采用上述基因序列、重组质粒而形成的酵母基因工程菌。

本发明的第四个目的提供一种能有效表达植酸酶的巴斯德毕赤酵母基因工程菌的筛选方法。

本发明的第五个目的是提供采取上述方法获得的高水平表达植酸酶的巴斯德毕赤酵母基因工程菌(CCTCC NO：M200005，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心)。

本发明的第六个目的是提供上述工程菌经发酵培养，甲醇诱导表达分泌的基因工程植酸酶。

本发明的第一个目的是这样实现的：在phyA(A.niger NRRL3135的植酸酶基因)全长结构基因序列中去除+45～+146位的核苷酸序列，去除+1～+44，+147～+159的黑曲霉信号肽编码序列，在5′端连接一段适于在酵母中分泌表达的信号肽编码序列，在3′端连接一个限制性内切酶位点。天然A.niger NRRL3135菌株phyA结构基因全长1506个核苷酸(见图1)，其中+45～+146的102个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列：Donor序列GTATGC、Lariat序列GCTGAC及Acceptor序列CAG。phyA基因编码467个氨基酸(见图2)，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在第19位的Gly之后，其活性位点序列(Active-site sequence)：CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，其中RHGARYPT是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列(参考文献：van Hartingsveldt，W.，et al.，(1993)Gene 127(1)：87-94；UllahAH，et al.，(1993)Biochem Biophys Res Commun 192(2)：754-759；Ullah AH，etal.，(1995)Ann N Y Acad Sci 750：51-57；)。如果不将+45～+146的核苷酸序列去除，酵母在转录该基因时可能无法进行内含子序列的切除，会将该序列翻译为氨基酸序列，这样将导致其所表达的植酸酶蛋白序列与天然的植酸酶的成熟肽序列不同，植酸酶功能丧失。如果不切除+1～+44，+147～+159的信号肽编码序列，酵母在表达该基因时不能识别该序列编码的曲霉特征信号肽及其上的切割位点，会将该序列所翻译的肽段保留至终产物中，导致其所表达的植酸酶蛋白序列与天然的植酸酶的成熟肽序列不同，引起植酸酶功能的丧失。在phyA全长结构基因序列中去除+1～+44、+45～+146、+147～+159序列并不会影响phyA成熟肽的氨基酸序列。同时，为了在酵母中分泌表达该植酸酶蛋白，必须在植酸酶成熟肽编码序列的5′端加上一段适合于在酵母中分泌表达的信号肽编码序列。为了方便将该序列克隆入合适的表达载体，在该序列的5′端、3′端还应引入限制性内切酶切位点(例如：KpnI、XhoI)。

本发明的上述方案可作进一步的完善：①加入适合在毕赤酵母中分泌表达的信号肽部分，编码序列为：GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT。②在该序列的5′端、3′端引入单酶切位点，例如：KpnI、XhoI。③将在毕赤酵母中使用频率低的密码子替换为使用频率高的密码子。作为信号肽编码序列，在巴斯德毕赤酵母中的信号肽部分编码序列以：GAATTCTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGCT为好。由于phyA基因成熟肽编码序列中有许多在巴斯德毕赤酵母中使用频率较低的密码子，如果不做密码子的变动，巴斯德毕赤酵母可能无法正确翻译植酸酶基因，因此应尽量将植酸酶成熟肽编码序列中毕赤酵母中使用频率较低的密码子替换为使用频率较高的密码子，本发明的一种替换密码子方案见图5。通过增减、替换，设计出本发明的一个新植酸酶基因序列，其最终序列为：GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTGGCAGTCCCAGCCTCTAGAAATCAATCCTCTTGTGATACTGTCGATCAGGGTTATCAATGTTTCTCCGAGACTTCTCATCTTTGGGGTCAATACGCACCATTCTTCTCTCTGGCAAACGAATCTGTCATCTCCCCTGAGGTGCCAGCCGGATGTAGAGTCACTTTCGCTCAGGTCCTTTCCAGACATGGAGCTAGATATCCAACCGACTCCAAGGGTAAGAAATACTCCGCTCTTATTGAGGAGATCCAGCAGAACGCTACCACCTTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGAAGACATACAACTACTCTTTGGGTGCAGATGACCTGACTCCATTCGGAGAACAGGAGCTTGTCAACTCCGGTATCAAGTTCTACCAGAGATACGAATCTTTGACAAGAAACATCGTTCCATTCATCAGATCCTCTGGTTCCTCTAGAGTTATCGCCTCCGGTAAGAAATTCATCGAGGGTTTCCAGAGCACTAAGCTGAAGGATCCTAGAGCCCAGCCAGGTCAATCTTCTCCAAAGATCGACGTTGTCATTTCCGAGGCCTCTTCATCCAACAACACTCTTGACCCAGGTACTTGTACTGTCTTCGAAGACTCTGAATTGGCCGATACTGTCGAAGCCAATTTCACTGCCACTTTCGTCCCATCCATTAGACAAAGACTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTTACTCTTACTGACACTGAAGTTACTTACCTTATGGACATGTGTTCCTTCGACACTATCTCCACTTCTACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCATTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACTTGCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGTCATGGTGCAGGTAACCCATTGGGTCCAACCCAGGGTGTCGGTTACGCTAACGAGTTGATCGCCAGACTGACCCACTCTCCTGTCCACGATGACACCTCTTCCAACCACACTTTGGACTCTTCTCCAGCTACCTTTCCATTGAACTCTACTTTGTACGCTGACTTTTCTCATGACAACGGTATCATCTCCATTTTGTTTGCTTTAGGTCTGTACAACGGTACTAAGCCATTGTCTACCACTACCGTTGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCTTCTGCTTGGACTGTTCCATTTGCTTCTAGATTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCTGAGCAGGAGCCACTGGTCAGAGTCTTGGTTAATGATAGAGTTGTCCCACTGCATGGTTGTCCTGTTGATGCTTTGGGTAGATGTACCAGAGATTCTTTTGTTAGAGGTTTGTCTTTTGCTAGATCTGGTGGTGATTGGGCTGAGTGTTTTGCTTAAGGTACC。

本发明上述序列以pPICZαA作为载体构成重组质粒能有效地转化巴斯德毕赤酵母，得到表达植酸酶的巴斯德毕赤酵母基因工程菌。

上述发明所设计的植酸酶基因序列与已报道的A.niger NRRL3135植酸酶原始成熟肽编码序列相比较，有152个核苷酸的差异，同源性为88.7％(见图5)。与已报道的A.niger963植酸酶基因phyA2(姚斌，范云六，王建华等，1998，中国科学(C缉)28(3)；237-243)相比较，在核苷酸方面，有123个核苷酸的差异，同源性为91.8％；在氨基酸方面，有39个氨基酸不同，同源性为91.6％；在糖基化位点上，本发明所设计的植酸酶基因编码蛋白上有10个潜在的糖基化位点，而phyA2有9个，其中8个位置相同。本发明所设计的植酸酶基因植酸酶活性位点中最保守序列为RHGARYPT。

本发明所设计的植酸酶基因可以通过PCR合成的方法来获得：首先根据植酸酶基因序列设计19对引物，每对引物之间各有平均20nt的重复序列。合成19对引物，再将不同对引物通过DNA聚合酶反应(链延长反应和PCR反应)、酶切和连接反应等最终合成为全长植酸酶基因(见图6～11)。

本发明中引物的合成、PCR法合成全长植酸酶基因等工作可以通过专门的生物技术公司或机构来完成。类似思路也同样可用来改造植酸酶基因或其他基因，使它在别的表达系统中表达，如借助杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等。

本发明的第二个目的是这样实现的：通过在5′端及3′端的限制性酶切位点将功能序列连接入载体。由于在基因设计时加入了限制性内切酶位点，合成的植酸酶基因可以通过在5′端及3′端的限制性酶切位点将功能序列连接入载体。

上述植酸酶基因可以组成以下的重组质粒：通过在5′端及3′端的限制性酶切位点将编码植酸酶基因序列连接入酵母表达载体。为了使植酸酶合成基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有乙醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOX I的巴斯德毕赤酵母表达载体(例如pPICZαA，美国Invitrogen公司)，利用植酸酶合成基因序列5′端的XhoI限制性内切酶位点与3′端的KpnI限制性内切酶位点，将该植酸酶合成基因克隆入载体pPICZαA(见图12、14)。由于在植酸酶成熟肽编码序列前加入了部分α信号肽编码序列，该序列与载体pPICZαA中的部分α信号肽编码序列发生融合，从而构成完整的α信号肽编码序列，并形成正确的读码框，为植酸酶基因在酵母中的正确分泌表达奠定了基础。巴斯德毕赤酵母表达载体以pPICZαA为较佳选择。

上述植酸酶基因可以组成以下的重组质粒：通过在5′端及3′端的限制性酶切位点将功能序列连接入细菌载体pBlueScript，形成含有植酸酶合成基因的重组载体(见图12、13)。该重组载体可以转化大肠杆菌，由于重组质粒含有Amp⁺抗性基因，通过筛选Amp⁺阳性克隆即可获得含重组质粒的大肠杆菌；尽管重组质粒在大肠杆菌中并不能表达植酸酶基因，但可以通过大肠杆菌的快速增殖获得大量重组质粒，在需要时利用内切酶将植酸酶基因分离出来，用作表达研究或其他用途。

本发明的第三个目的是这样实现的：将重组质粒转化入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。本发明优选的巴斯德毕赤酵母表达系统与Van Gorcom等的专利(US Patent：5436156，1995；US Patent：5863533，1999)所采用的宿主菌Asp.niger相比，有很多优势。第一，霉菌的生长繁殖周期比毕赤酵母长很多；第二，霉菌的营养生长是通过菌丝体尖端的伸长生长实现的，这种生长特性尤其适合固体培养，而并不适合现代发酵工艺所常用的液态发酵，一般而言固体发酵工效低，周期长，成本高，由此使获得大量发酵产品的成本比之液态发酵要增加很多。相比之下，毕赤酵母是通过裂殖而增加营养体的，这种繁殖特性十分适合液态发酵：第三，霉菌营养体在生长发育期间需要提供足够的较复杂的碳氮有机养分，这也会增加发酵成本，毕赤酵母营养体的生长发育主要利用廉价的简单养分如甲醇、葡萄糖和氨水等，获得同等量的营养体毕赤酵母比霉菌消耗的养分要便宜的多。酵母的高细胞密度、低成本发酵方法已经建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，34：403-404，1989)，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素和生物素等都很便宜：第四，霉菌特有的霉味会降低牲畜的适口性，而毕赤酵母发酵产生的一种酱香味具有良好的诱食作用；第五，毕赤酵母含有多种大量的促进生长的有机化合物，如低聚糖、核苷酸、各种氨基酸、短肽等，这些优势都是霉菌比不上的或所不具有的；第六，在真核生物表达系统中，酵母，包括毕赤酵母在内无疑是研究得最为详透的，在进行分子生物学操作时酵母比霉菌更为容易、方便和有效。酵母作为一种良好的真核表达系统已成功地高效表达出许多具有生物活性的外源基因产物。第七、毕赤酵母本身具有很好的安全性，曾作为单细胞蛋白广泛应用，酵母培养基中不含有毒物质和致热源，所以重组酵母表达的植酸酶就可以不用分离纯化而能直接以酵母培养物的形式添加到饲料中，可降低植酸酶的生产成本；第八、表达的植酸酶在信号肽的引导下会分泌到培养基中，这使植酸酶直接暴露出来而无需破碎酵母菌体，也为把包含植酸酶的酵母培养物直接作为饲料添加剂提供了可能；以上这些优势都是利用Asp.niger作为植酸酶表达受体(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent：5436156，1995；US Patent：5863533，1999)所不具备的，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产植酸酶定了基础。

本发明采用的含植酸酶合成基因的重组表达质粒pPICZαA可以转化酵母，成为能分泌表达外源植酸酶的功能酵母菌：由于含合成基因的重组表达质粒pPICZαA上有巴斯德毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPICZαA可以定向整合到巴斯德毕赤酵母基因组DNA上。在外源诱导物中醇存在的条件下，AOX I启动子启动植酸酶合成基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，正确切割，具有生物活性的外源蛋白表达产物--植酸酶最终分泌至胞外。

含植酸酶合成基因的重组表达质粒pPICZαA转化巴斯德毕赤酵母前，需将环状的重组表达质粒pPICZαA用内切酶酶切，使之线性化。不同的表达质粒、不同的内切酶位点，可选择不同的内切酶。本发明用内切酶SacI消化重组表达质粒pPICZαA，电泳检测酶切是否完全，纯化回收完全线性化的重组表达质粒pPICZαA，-20℃保存备用。

巴斯德毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法，准备受体菌(P.pastoris野生型菌株X-33)，将50～80μl受体菌和5～90μg线性化重组表达质粒DNA混匀，电激(电压：1500V；电容：25μF；电阻：200Ω)处理，然后筛选重组子。

上述发明中含植酸酶合成基因的重组质粒pBlueScript或pPICZαA需用的工具酶及载体、表达系统等，均有专门的生物技术公司提供(如：美国Promega公司、日本TaKaRa公司、美国Invitrogen公司等)。构建方法、详细步骤也有专门的说明书介绍。

本发明的第四个目的是这样实现的：本发明中转基因工程菌的筛选方法在表型筛选(Zeo⁺Mut^-)的基础上，通过酶活力测定进行植酸酶表达的功能筛选。其特征在于：以系列浓度无机磷及其在钒钼显色剂下的吸光度(OD₄₁₅)建立标准曲线，根据标准曲线计算发酵液在相同反应体系、相同反应条件下的酶活力(U/mL)，进行筛选。表达载体pPICZαA上原本带有Zeocin抗性基因和AOX I启动子序列，当含有植酸酶基因的重组表达质粒转化进入巴斯德毕赤酵母并重组至染色体上后，该转基因工程菌即获得对Zeocin的抗性，由于重组发生在AOX基因位点，使AOX基因失活，不能利用甲醇。通过表型筛选(Zeo⁺Mut^-)就可以初步筛选出阳性重组子。为了证实合成的植酸酶基因整合并表达，进一步测定阳性重组子诱导发酵液的植酸酶活力。发酵液中植酸酶的酶活力是通过测定在一定反应条件下，反应体系中所释放的无机磷量来表示的。一个植酸酶酶活力单位的定义是：在37℃，pH5.5的条件下，每分钟从8.4g/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷所需要的酶量。

植酸酶的酶活力测定方法如下：

(1)以系列标准浓度无机磷溶液及其在钒钼显色剂下的吸光度(OD₄₁₅)建立标准曲线，根据反应体系组成及标准曲线计算酶活力(U/mL)。植酸和植酸盐在植酸酶的作用下，释放出无机磷，通过酸性钒-钼试剂与无机磷发生颜色反应，生成黄色合物((NH₄)₃PO₄NH₄Vo₃16MoO₃)，在415nm波长下进行比色。以标准无机磷为参照物，间接计算被测样品中植酸酶活力。所需试剂：0.25mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)；65％(W/W)HNO₃ 35％(W/W)H₂O；4mol/L乙酸；25％(W/W)氨水；0.84％(W/W)植酸钠溶液(pH5.5)；10％(W/W)钼酸铵溶液；0.235％(W/W)钒酸铵溶液；C/T终止液的组成：钼酸铵溶液∶钒酸铵溶液∶65％HNO₃∶H₂O＝50∶50∶33∶67，现用现配；以30ug/ml的KH₂PO₄溶液作为系列稀释的母液。

制备下述显色反应体系：

试管编号                  1       2       3       4       5        6

30u g/ml KH₂PO₄溶液(ml) 0       1       2       3       4        5

H₂O(ml)                  6       5       4       3       2        1

C/T终止液(ml)             4       4       4       4       4        4

OD₄₁₀值^*               -0.001   0.146   0.298   0.447   0.600    0.73

换算的磷含量(μmol)       0.9606  1.9372  2.9057  3.8743  4.8428   5.8114

^*线性回归分析，相关系数为0.9993863。

(2)Zeo⁺Mut^-重组子发酵液的酶活力测定。取0.5ml诱导发酵的上清液，视需要稀释10～3000倍，取2mL稀释液，加入到4mL预热至37℃的植酸钠溶液中，反应15min，再加入4mL的C/T液终止反应并显色。对照组除C/T液在反应开始时加入外，其余与实验组相同。以对照组作空白，测定各Zeo⁺Mut^-重组子OD₄₁₅值，根据回归方程求出反应体系的磷含量(μmol)，再根据下式计算酶活力：

    酶活力(U/mL)＝(A×D)÷T÷V

[A：P含量(umol)；D：稀释倍数；T：反应时间(单位：分钟)；V：体系中加入的稀释液(单位：ml)]

本发明的第五个目的是提供采取上述方法获得的高水平表达植酸酶的巴斯德毕赤酵母基因工程菌(CCTCC NO：M200005，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心)。其特征在于：经甲醇诱导210小时以下，工程菌发酵液的植酸酶活力可达到0～250U/mL(超过210小时，酶活力提高不大，见图18)；甲醇浓度为0.25～0.75％(在0.25～0.75％范围内效果较好，浓度单位是体积比W/W)，诱导培养条件是摇瓶转速230～250rpm/min(巴斯德毕赤酵母的生长强烈耗氧，普通摇床的最高转速一般为250rpm/min，低于230rpm/min可能会影响生长)，培养温度28～30℃(巴斯德毕赤酵母低于28℃生长缓慢，高于30℃则死亡)。经甲醇诱导72小时，发酵液植酸酶活力可达到150～165U/mL；诱导210小时，发酵液植酸酶活力达到250U/mL。本发明采用上述表型筛选方法一共得到85株Zeo⁺Mut^-重组子，经过酶活力测定，重组子均有酶活力，结果见表2。

表2：85株重组子的植酸酶酶活力测定结果(酶活力：U/ml发酵液)

     编号      酶活力    编号      酶活力    编号      酶活力    编号      酶活力

     SPAN-1    32        SPAN-2    42        SPAN-3    46        SPAN-4    64

     SPAN-5    46        SPAN-6    59        SPAN-8    39        SPAN-9    54

     SPAN-10   72        SPAN-III  165       SPAN-12   41        SPAN-13   80

     SPAN-14   101       SPAN-15   79        SPAN-16   93        SPAN-17   65

     SPAN-18   34        SPAN-19   83        SPAN-20   91        SPAN-21   81

     SPAN-22   94        SPAN-23   69        SPAN-24   31        SPAN-25   87

     SPAN-26   66        SPAN-27   69        SPAN-28   57        SPAN-29   86

     SPAN-30   61        SPAN-31   74        SPAN-32   54        SPAN-33   82

     SPAN-34   31        SPAN-35   56        SPAN-36   45        SPAN-38   34

     SPAN-39   83        SPAN-40   32        SPAN-41   17        SPAN-42   43

     SPAN-43   68        SPAN-44   26        SPAN-45   44        SPAN-46   37

     SPAN-47   56        SPAN-48   64        SPAN-49   65        SPAN-50   55

     SPAN-51   66        SPAN-52   76        SPAN-53   64        SPAN-54   68

     SPAN-55   65        SPAN-56   41        SPAN-57   39        SPAN-58   69

     SPAN-60   54        SPAN-71   76        SPAN-72   50        SPAN-73   41

     B-1       17        B-3       74        B-4       62        B-5       91

     B-6       79        B-7       63        B-8       37        B-9       20

     B-10      53        B-11      69        B-12      67        B-13      49

     B-14      62        B-15      79        B-16      52        B-17      43

     B-18      6         B-19      56        B-20      65        B-21      44

     B-22      65        B-25      23        B-26      52        B-27      58

     B-28      20

本发明的第六个目的是提供CCTCC NO：M200005工程菌经发酵培养，甲醇诱导表达分泌的基因工程植酸酶。上述基因工程菌经液体发酵培养、甲醇诱导，编码植酸酶的合成基因表达并将植酸酶分泌到发酵液中。本发明提供的重组植酸酶基因工程菌株可以在摇床上用成分简单的培养基，经发酵、诱导产生植酸酶蛋白。具体方法为：

(1)菌种活化：将斜面保存的巴斯德毕赤酵母基因工程菌(CCTCC NO：M200005)接种于YPD平板，30℃静置培养36～48小时。

(2)扩大培养：活化菌种接种于5mL的YPD液体培养基中，28～30℃，230～250rpm/min水浴震荡培养16～18小时；5mL菌液再接种于45～95mL的YPD液体培养基中，28～30℃，230～250rpm/min水浴震荡培养24小时。取出菌液，室温下静置沉淀20min(或3000rpm/min离心10min)，移去上清液，加等体积MMY培养基重悬浮菌体。

(3)诱导培养：重悬浮菌液按0.25～0.75％(V/V)加入甲醇，28～30℃，230～250rpm/min水浴震荡诱导培养，以后每12小时按0.25～0.75％(V/V)入甲醇。72小时收获菌液，3000rpm/min离心15min，上清液用于酶活测定。巴斯德毕赤酵母基因工程菌(CCTCC NO：M200005)在YPD培养基中，30℃，230～250rpm/min循环振荡培养条件下，培养18～20小时后，菌体浓度可达到1～9×10⁹cfu/M1(见图17)，更换MMY培养液后，进行诱导培养，工程菌(CCTCC NO：M200005)在摇瓶诱导培养条件下，72小时酶活力达165U/Ml发酵液；诱导培养210小时，酶活力仍在上升(见图18)。

在不同pH值条件下测定发酵液中的植酸酶酶活性，结果表明，发酵液中植酸酶的最适pH5.5，在pH2.5时也有一个酶活峰(见图19)。在pH2～6范围内，植酸酶均能维持较高的酶活性。

在不同温度条件下测定发酵液的植酸酶的酶活性，结果表明，植酸酶的最适温度为55℃(见图20)。发酵液中植酸酶的最适pH和最适温度与原菌株A.nigerNRRL3135所产的植酸酶相比并没有明显差别。

上述结果表明，经人工设计并合成的植酸酶基因已经在巴斯德毕赤酵母基因组DNA中整合，高效表达出与天然植酸酶性质相近的酶蛋白。

本发明的总体流程如下：

综上所述，(1)本发明针对A.nigerNRRL3135的植酸酶全长结构基因phyA进行基因的人工改造，去除了影响该基因在酵母中正确表达的内含子序列、信号肽序列；增加了酵母分泌表达的信号肽序列和限制性内切酶位点；改造后的植酸酶基因序列能够在酵母中正确转录、翻译表达植酸酶并分泌至发酵液中。

(2)在上述基础上，针对本发明所选择的表达宿主巴斯德毕赤酵母设计了能使植酸酶基因分泌至胞外的部分信号肽序列。在构建重组表达质粒时能与表达载体形成正确的读码框，植酸酶基因能够分泌至胞外；同时，根据巴斯德毕赤酵母对遗传密码的偏爱程度，对A.nigerNRRL3135的植酸酶结构基因进行了部分密码子替换，用在巴斯德毕赤酵母中高频使用的密码子代替了原序列中的低频密码子，使改造后的基因序列能够在巴斯德毕赤酵母中正确表达。

经过上述改造，产生了一个能够在巴斯德毕赤酵母中正确、高效表达并分泌至胞外的植酸酶基因序列。

(3)通 过PCR合成出 该植 酸酶基因序列，采用表达载体pPICZαA，进一步构建出含有该植酸酶合成基因，并能在巴斯德毕赤酵母中整合、表达的重组表达质粒。

(4)将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母，得到一系列表达植酸酶的巴斯德毕赤酵母基因工程菌。

(5)通过对上述工程菌株的筛选，获得一株高效表达植酸酶合成基因的工程菌株CCTCCNO：M200005。

(6)对工程菌株CCTCC NO：M200005摇瓶发酵条件下的产酶特性和所产植酸酶的有关性质研究表明，本发明得到的工程菌株CCTCC NO：M200005产酶能力优于目前的同类研究，表达的植酸酶性质类似天然植酸酶，可以广泛用于饲料添加剂、食品和医药领域。

附图说明：

图1、A.niger NRRL3135的植酸酶全长结构基因序列(小写英文字母表示内含子序列，内含子序列中下划线的序列依次表示内含子donor、Iariat及acceptor序列)。

图2、A.niger NRRL3135植酸酶的氨基酸序列(垂直箭头表示信号肽切割位点；在氨基酸N下划线的表示潜在的糖基化位点；氨基酸序列加框表示植酸酶活性位点序列)。

图3、本发明的一种植酸酶基因序列。

图4、本发明图2的基因序列及相应的氨基酸序列。

图5、phyA原始成熟肽基因序列与图2基因序列的比较[Query：phyA原始成熟肽基因编码序列，Sbjct：图2基因编码序列(改造的密码子均已标出)]。

图6、图2基因序列的合成示意图(“←”正向引物；“→”反向引物)。

图7、十九对引物的碱基序列(F表示正向引物，R表示反向引物)。

图8、片断A1～C1的碱基序列。

图9、片断A2～C2的碱基序列。

图10、片断A3～C3的碱基序列。

图11A、合成的植酸酶基因全自动测序图(YL03-67T3片断，5′端开始)。

图11B、合成的植酸酶基因全自动测序图(YL03-67F片断，3′端开始)。

图11B、合成的植酸酶基因全自动测序图(YL03-67 YL03SP片断，5′端开始)。

图12、重组载体构建示意图。

图13、图12中含合成植酸酶基因的重组质粒pBlueScript电泳图。

图14、图12中含合成植酸酶基因的重组表达质粒pPICZαA电泳图(I：分子量标记；

II：pPICZaA空质粒XhoI、KpnI双酶切电泳结果；III：pPICZaA重组质粒XhoI、KpnI双酶切电泳结果；(显示1.4kb左右大小的合成植酸酶基因片段)；IV：分子量标记)。图15、巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005中植酸酶基因的PCR检测[I：分子量标记；II：含pPICZαA重组质粒的P.pastoris酵母裂解液PCR电泳结果(显示含合成植酸酶基因的重组表达质粒pPICZαA成功转化入酵母)；III：含pPICZaA空载体的重组酵母P.pastoris酵母裂解液的PCR电泳结果]。

图16、巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005中植酸酶的SDS-PAGE表达检测[1.工程菌CCTCCNO：M200005诱导表达48小时培养液上清；2.工程菌CCTCC NO：M200005诱导表达72小时培养液上清；3.工程菌CCTCC NO：M200005诱导表达48小时后，经EndoH处理的培养液上清；4.工程菌CCTCC NO：M200005诱导表达72小时后，经EndoH处理的培养液上清；5.分子量标记(华美公司)；6.分子量标记(华美公司)；7.含pPICZaA空载体的重组酵母P.pastoris诱导表达72小时培养液上清；8.含pPICZaA空载体的重组酵母P.pastoris诱导表达72小时后，经EndoH处理的培养液上清]。

图17、巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005的菌体增殖曲线(横坐标表示培养时间；纵坐标表示cfu/mL的对数值)。

图18、巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005的诱导产酶曲线(横坐标表示诱导培养时间；纵坐标表示酶活力U/mL)。

图19、发酵液植酸酶的最适pH曲线(横坐标表示pH；纵坐标表示酶活力U/mL)。

图20、发酵液植酸酶的最适温度曲线(横坐标表示温度℃；纵坐标表示酶活力U/mL)。

实施例1：一种编码植酸酶的基因序列的人工制造

天然A.niger NRRL3135菌株phyA结构基因全长1506个核苷酸(vanHartingsveldt，W.，et al.，(1993)Gene 127(1)：87-94；见图1)，其中，+1～+44、+147～+159共57个核苷酸序列是黑曲霉信号肽的编码序列，+45～+146共102个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，含有真菌内含子的特征保守序列：Donor序列GTATGC、Lariat序列GCTGAC及Acceptor序列CAG。phyA基因编码467个氨基酸(见图2)，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在第19位的Gly之后。来源于真菌的植酸酶是一种糖基化蛋白，在phyA编码的氨基酸序列上，发现了10个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)。根据氨基酸推断出的理论分子量约为52kD。不同来源生物的植酸酶氨基酸序列上述有其活性位点序列(Active-site sequence)：CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，其中RHGARYPT是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列(参考文献：Ullah AH，et al.，(1993)Biochem Biophys Res Commun 192(2)：754-759；Ullah AH，et al.，(1995)Ann N Y Acad Sci 750：51-57；)。

木发明以A.niger NRRL3135菌株的植酸酶基因phyA序列为模板，进行下列修改：①首先去掉原序列中的+1～+44、+147～+159共57个核苷酸序列的黑曲霉信号肽编码序列和+45～+146共102个核苷酸的真菌内含子序列。②在去掉上述序列的phyA基因片断，在5′端加入巴斯德毕赤酵母分泌信号肽的部分序列：GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，该序列含有EcoRI、XhoI两个限制性内切酶位点。③对A.nigerNRRL3135菌株的植酸酶结构基因序列的密码子进行替换，将在巴斯德毕赤酵母中高频使用的密码子替换下低频密码子，见图3。④在基因序列的3′端加上XbaI、KpnI两个限制性内切酶位点。全部修改完成后，设计出一个新的基因序列，见图4。

本发明所设计的新的基因序列与已报道的A.niger NRRL3135植酸酶原始成熟肽编码序列相比较，有152个核苷酸的差异，同源性为88.7％(见图5)；与已报道的A.niger963植酸酶基因phyA2(姚斌，范云六，王建华等，1998，中国科学(C缉)28(3)：237-243)相比较，有123个核苷酸的差异，同源性为91.8％；新设计的基因序列编码的氨基酸序列与phyA2编码的氨基酸有39个不同，同源性为91.6％；新设计的基因编码的蛋白上有10个潜在的糖基化位点，而phyA2有9个，其中8个位置相同，新设计的基因植酸酶活性位点中最保守序列为RHGARYPT。

本发明新设计的基因可以通过PCR人工合成。步骤如下：

根据新设计的基因序列设计并合成出19对引物(见图7)，包括正向引物9条、负向引物10条，它们分别是：F1～F9以及R1～R10。每条引物平均长80nt，其中F1/F2、F2/F3、F3/R1、R1/R2、R2/R3、R3/F4、F4/F5、F5/F6、F6/R4、R4/R5、R5/R6、R6/F7、F7/F8、F8/F9、F9/R7、R7/R8、R8/R9以及R9/R10；每对引物之间各有平均20nt的重复序列；F1引物的5′端加有XhoI位点，R1引物5′端加有KpnI位点。

PCR合成新设计的基因时，先以合成3个小片段为目标，然后不断加入新的引物，通过PCR延长小片断，最后将三个大片断合成为一条长链(见图6)。步骤如下：

首先由3对引物F3/R1、F6/R4和F9/R7进行延长反应，反应体系包括引物F3或F6、F9(0.1OD/μl)5μl、引物R1或R4、R7(0.1OD/μl)5μl、10xTaKaRa LA Buffer 10μl、dNTP 16μl、H₂O 63μl；于94℃作用15min，然后于55℃下加入TaKaRa LA Taq酶1μl，保温5min，再于72℃延长5min，最后酒精沉淀，溶于200μl TE中，分别得到片段A1、B1和C1(见图8)。

第二步则是以A₁、B₁和C₁为模板，分别用F2/R2、F5/R5和F8/R8引物对进行PCR反应，扩增得到较长的片段。反应体系为引物F2或F5、F8(0.01OD/μl)1μl、引物R2或R5、R8(0.01OD/μl)1μl、A₁或B₁、C₁ 1μl、dNTP 10μl、10×TaKaRa LA Buffer 10μl、10×Taq酶1μl、H₂O 76μl。于94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，共30个循环，获得的PCR产物溶于200μl TE中，分别得到BNA片段A2、B2和C2(见图9)。

第二步则是以A₂、B₂和C₂为模板，分别用F1/R3、F4/R6和F7/R9引物对进行PCR反应，扩增更长的片段。反应体系和条件基本同第二步。分别得到DNA片段A3、B3和C3(见图10)。

第四步是在一个反应体系中，同时加入模板A₃、B₃和C₃，用F1/R10引物对进行PCR扩增，获得全长DNA片段。反应体系包括：F1(0.01OD/μl)1μl、R10(0.01OD/μl)1μl、A₃ 1μl、B₃ 1μl、C₃ 1μl、dNTP 10μl、10×TaKaRa LA Buffer 10μl、10×Taq酶1μl、H₂O 75μl。于94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，共30个循环，获得的PCR产物溶于200μlTE中，得到全长DNA片段。

该片断通过DNA全自动测序仪测序，结果与设计序列完全相同，见图11A、B、C。

基因的改造可利用已知的PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来实现。本发明除了基因设计和引物设计外，引物合成、新设计基因的PCR合成及测序等均可以通过专业生物技术公司(如大连宝生物技术公司)完成。

实施例2：含合成植酸酶基因的重组质粒pBlueScript的构建

在实施例1中得到的合成植酸酶基因必须克隆到适当的载体质粒上，以便保存利用。本发明选择大肠杆菌载体质粒pBlueScript，构建出含合成植酸酶基因的重组质粒pBlueScript。具体步骤如下：

1.菌株与载体：大肠杆菌菌株DH5α、JM109，质粒pBlueScript等购自美国Promega公司。

2.酶与试剂盒：限制性内切酶、各类修饰酶为日本TaKaRa公司产品。

3.生化试剂：IPTG、X-Gal等均为美国Sigma公司产品。

4.培养基：LB培养基。

5.将合成好后的基因用XhoI和KpnI双酶切，与同样经XhoI和KpnI双酶切的载体pBlueScript于15℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，涂板后挑选阳性重组子，得到含合成植酸酶基因的重组质粒pBlueScript(见图12、13)。

6.甘油保存阳性重组子，需用时扩增阳性重组子，提取重组质粒，用XhoI和KpnI双酶切重组质粒即可得到大量合成植酸酶基因。

实施例3：含合成植酸酶基因的重组表达质粒pPICZαA的构建

植酸酶是一种糖基化蛋白，因此，本发明实施例1中合成的植酸酶基因需要在真核表达系统中才能正确表达出糖基化的功能蛋白。由于巴斯德毕赤酵母是目前较为成功的表达系统，为此，需要构建出含合成植酸酶基因的重组表达质粒pPICZαA，以便在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶。具体步骤如下：

1、菌株与载体：酵母菌株Pichia pastoris X-33、质粒pPICZαA购自美国Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒：限制性内切酶、各类修饰酶为日本TaKaRa公司产品。

3、生化试剂：其它为国产分析纯。

4、将通过实施例2得到的重组质粒pBlueScript用KpnI+XhoI酶切，电泳回收约1.4kb的合成植酸酶基因DNA片段。同时用KpnI+XhoI双酶切空载体质粒pPICZαA，电泳回收3.6kb大片段。再将1.4kb小片段与3.6kb大片段相连，得到用于P.pastoris转化的含有植酸酶合成基因的重组表达载体pPICZαA(见图12、14)。带有部分分泌信号序列的目的基因插入到上述表达载体的信号肽序列下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建出能通过载体上的P.pastoris AOX部分基因序列与染色体基因组之间的同源重组，稳定整合到酵母染色体上的重组表达载体。

实施例4：巴斯德毕赤酵母的转化与基因工程菌的筛选

在实施例3中得到的含有植酸酶合成基因的重组表达载体pPICZαA，进一步转化P.pastoris，通过表型筛选和酶活力测定，筛选出高效表达植酸酶的基因工程菌。具体步骤如下：(参考文献：《分子克隆实验指南第二版》，科学出版社，北京，1998年)

1、菌株与载体：酵母菌株Pichia pastoris X-33购自美国Invitrogen公司，含有植酸酶合成基因的重组表达载体pPICZαA来自实施例3。

2、酶与试剂盒：限制性内切酶、各类修饰酶为日本TaKaRa公司产品。

3、生化试剂：Zeocin为美国Sigma公司产品，其它为国产。

4、培养基：酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物(W/W)、2％蛋白胨(W/W)、2％葡萄糖(W/W))；酵母转化培养基为RDB(18.6％山梨醇(W/W)、2％葡萄糖(W/W)、1.34％Yeast(W/W))；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB(W/W)、0.00004％Biotin(W/W)、0.5％甲醇(V/V))、1.5％琼脂(W/W)糖)和MD(1.34％YNB(W/W)、0.00004％Biotin(W/W)、2％葡萄糖(W/W)、1.5％琼脂糖(W/W))；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物(W/W)、2％蛋白胨(W/W)、1.34％YNB(W/W)、0.00004％Biotin(W/W)、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成分相与BMGY相同)。

5、重组酵母发酵培养基为YPD；诱导培养基MMY(不含磷酸缓冲液的BMMY)。

6、重组表达载体pPICZαA DNA首先用内切酶SacI酶切(经PEG法纯化)，使之线性化，电泳检测酶切是否完全；线性化的pPICZαA用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。

7、将5ml X-33菌液接种于50ml YPD液体培养基30℃培养过夜。取过夜培养的菌液0.1～0.5ml接种于500ml新鲜YPD液体培养基，再30℃过夜培养至OD₆₀₀＝1.3～1.5。在+4℃，1500×g离心5分钟，用500ml 0℃无菌水重悬菌体。离心同上，再重悬于250ml 0℃无菌水。离心同上，重悬于20ml 0℃ 1M山梨醇溶液。离心同上，再重悬于1ml 0℃ 1M山梨醇溶液，置于冰上(当天使用)。

8、将上述7制备的细胞80μl和上述6制备的线性化DNA 5～90μg注入0℃电击池，混匀，置冰上5分钟。在电压：1500V；电容：25μF；电阻：200Ω的脉冲参数条件下脉冲处理。迅速加入1ml浓度为1Mol的山梨醇溶液(0℃)到电击池内，混匀。再将池内液体转置1.5ml EP管，30℃培养1-2小时。取150μl涂布含Zeocin^TM 100μg/ml的YPD固体培养基，30℃培养2-3天。

9、用无菌牙签从转化平板上挑取Zeo⁺重组子，首先接种到MM固体培养基上，同时再接种到MD固体培养基上，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子，即为Zeo⁺Mut^-表型的阳性重组子。

10、将上述9制备的Zeo⁺Mut^-表型的阳性重组子约110株进一步作植酸酶的酶活力测定。方法如下：

(1)标准曲线的制备：植酸和植酸盐在植酸酶的作用下，释放出无机磷，通过酸性钼-钒试剂与无机磷发生颜色反应，生成黄色合物，测定其在415nm的光吸收。以无机磷含量对其在钒钼显色剂下的吸光度(OD₄₁₅)建立标准曲线，根据反应体系组成及OD₄₁₅值计算酶活力(U/mL)。所需试剂：0.25mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)；65％(W/W)HNO₃.35％(W/W)HNO₃；4mol/L乙酸；25％(W/W)氨水；0.84％(W/W)植酸钠溶液(pH5.5)：10％(W/W)钼酸铵溶液：0.235％(W/W)钒酸铵溶液；C/T终止液的组成：钼酸铵溶液∶钒酸铵溶液∶65％HNO₃∶H₂O＝50∶50∶33∶67，现用现配；30ug/ml KH₂PO₄溶液，用作系列稀释的母液。

制备下述显色反应体系：

试管编号                  1      2       3       4       5       6

30ug/ml KH₂PO₄溶液(ml)  0      1       2       3       4       5

H₂O(ml)                  6      5       4       3       2       1

C/T终止液(ml)             4      4       4       4       4       4

OD₄₁₅值^*               -0.001  0.146   0.298   0.447   0.600   0.73

换算的磷含量(μmol)       0.9606 1.9372  2.9057  3.8743  4.8428  5.8114

^*线性回归分析，相关系数为 0.9993863。

(2)Zeo⁺Mut^-重组子发酵液的酶活力测定。取0.5ml上清液，视需要稀释10～3000倍，取2mL稀释液，加入到4mL预热至37℃的植酸钠溶液中，反应15min，再加入4mL的C/T液终止反应并显色。对照组除C/T液在反应开始时加入外，其余与实验组相同。以对照组作空白，测定各Zeo⁺Mut^-重组子OD₄₁₅值，根据回归方程求出反应体系的磷含量(μmol)，再根据下式计算酶活力：

酶活力(U/mL)＝(A×D)÷T÷V

A：P含量(umol)

D：稀释倍数

T：反应时间(单位：分钟)

V：体系中加入的稀释液(单位：ml)

经过筛选，110株重组子均有酶活力，部分结果见表2。

重组子的甲醇利用缺陷型(Mut^-)表型说明外源基因已经准确整合到巴斯德毕赤酵母基因组中AOX1基因位点，从而破坏了该基因的功能，通过分子检测可以证实这一点。

通过酶解的方法破坏重组子的细胞壁，用SDS破坏细胞膜，释放出染色体DNA，再经过进一步的纯化处理就可以得到较纯的基因组DNA。然后取微量重组子基因组DNA进行PCR鉴定。结果表明，重组子SPAN-III的基因组DNA中有合成植酸酶基因整合(见图15)。

植酸酶基因在重组子中的诱导表达还可以通过对发酵液的蛋白质电泳分析来证实。取5uL无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)。所用分离胶浓度为8％(W/W)，浓缩胶浓度为5％(W/W)。电泳结束后凝胶用考马斯亮兰R250染色30分钟，接着用10％(W/W)的冰乙酸脱色。结果表明，植酸酶基因在重组子SPAN-III中得到诱导表达，表达的植酸酶分子量大小约为85～100kD(见图16)。

重组子SPAN-III已经于2000年四月十一日由武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M200005。

实施例5：巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005的诱导表达及表达产物植酸酶的特性研究

巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005的诱导表达：

巴斯德毕赤酵母基因工程菌CCTCC NO：M200005在摇瓶培养条件下培养，YPD培养基，接种量10％，30℃，240rpm/min，每隔2小时取1mL发酵液，测定活菌数，培养20～24小时后，菌体浓度可达1～9×10⁹cfu/mL(见图17)。

培养24小时后，换等体积MMY培养基，开始加入甲醇诱导，甲醇添加量0.5％(V/V)，每12小时添加一次。每隔12小时取2mL培养液用于测定植酸酶活性，结果见图18，在整个诱导培养期210小时之内，植酸酶的表达随诱导时间的延长而增加。

植酸酶的最适pH：

选择三种缓冲液体系，即：甘氨酸-HCL(pH1.0～2.0)、醋酸-醋酸钠(pH2.2～6.0)、Tris-HCL(pH6.5～8.0)，测定在不同pH值条件下工程菌CCTCC NO：M200005发酵液的植酸酶酶活力，测定结果表明，植酸酶的最适pH值为5.5，在2.5也有一个酶活力峰(见图19)。

植酸酶的最适温度：

选择25℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃不同温度条件下，测定工程菌CCTCC NO：M200005发酵液中植酸酶的酶活力，结果表明，植酸酶的最适温度为55℃(见图20)。

植酸酶的分子量：

SDS-PAGE电泳结果表明，工程菌CCTCC NO：M200005发酵液中植酸酶分子量大小约为85～100kD，分子量大小的差异可能是糖基化程度不同所致。用EndoH(Endo-B-N-acetylglycosaminidase H)脱糖基处理后(参考文献：Tai，T.，et al.，1975，J.Biol.Chem.，250，8569)，工程菌CCTCC NO：M200005发酵液中植酸酶分子量为50kD左右(见图16)，证明植酸酶基因不仅得到了表达、有效分泌，而且表达产物还能进行蛋白翻择后修饰-糖基化，而糖基化修饰也是植酸酶具备正常酶活性所必须的。

Claims (10)

1、一种编码植酸酶基因序列，其特征在于：在phyA全长结构基因序列中去除+45～+146位的核苷酸序列，去除+1～+44，+147～+159的黑曲霉信号肽编码序列，在5′端连接一段GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT序列，在3′端连接一个限制性内切酶位点。

2、根据权利要求1所述的序列，其特征在于：编码植酸酶基因序列为：

GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTGGCAGTCCCAGCCTCTAGAAATCAATCCTCTTGTGATACTGTCGATCAGGGTTATCAATG

TTTCTCCGAGACTTCTCATCTTTGGGGTCAATACGCACCATTCTTCTCTCTGGCAAACGAATCTGTCATCTCCCCTGAGGTGCCAGCCGGA

TGTAGAGTCACTTTCGCTCAGGTCCTTTCCAGACATGGAGCTAGATATCCAACCGACTCCAAGGGTAAGAAATACTCCGCTCTTATTGAGG

AGATCCAGCAGAACGCTACCACCTTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGAAGACATACAACTACTCTTTGGGTGCAGATGACCTGACTCCATT

CGGAGAACAGGAGCTTGTCAACTCCGGTATCAAGTTCTACCAGAGATACGAATCTTTGACAAGAAACATCGTTCCATTCATCAGATCCTCT

GGTTCCTCTAGAGTTATCGCCTCCGGTAAGAAATTCATCGAGGGTTTCCAGAGCACTAAGCTGAAGGATCCTAGAGCCCAGCCAGGTCAAT

CTTCTCCAAAGATCGACGTTGTCATTTCCGAGGCCTCTTCATCCAACAACACTCTTGACCCAGGTACTTGTACTGTCTTCGAAGACTCTGA

ATTGGCCGATACTGTCGAAGCCAATTTCACTGCCACTTTCGTCCCATCCATTAGACAAAGACTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTTACTCTT

ACTGACACTGAAGTTACTTACCTTATGGACATGTGTTCCTTCGACACTATCTCCACTTCTACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCATTCTGTG

ACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACTTGCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGTCATGGTGCAGGTAACCCATTGGGTCC

AACCCAGGGTGTCGGTTACGCTAACGAGTTGATCGCCAGACTGACCCACTCTCCTGTCCACGATGACACCTCTTCCAACCACACTTTGGAC

TCTTCTCCAGCTACCTTTCCATTGAACTCTAC竹TGTACGCTGACTTTTCTCATGACAACGGTATCATCTCCATTTTGTTTGCTTTAGGTC

TGTACAACGGTACTAAGCCATTGTCTACCACTACCGTTGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCTTCTGCTTGGACTGTTCCATTTGC

TTCTAGATTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCTGAGCAGGAGCCACTGGTCAGAGTCTTGGTTAATGATAGAGTTGTCCCACTGCAT

GGTTGTCCTGTTGATGCTTTGGGTAGATGTACCAGAGATTCTTTTGTTAGAGGTTTGTCTTTTGCTAGATCTGGTGGTGATTGGGCTGAGT

GTTTTGCTTAAGGTACC

3、一种权利要求1所述的序列的重组质粒，其特征在于：通过在5′端及3′端的限制性酶切位点将编码植酸酶基因序列连接入载体。

4、根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：载体为pBlueScript。

5、根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：载体为pPICZαA。

6、一种采用权利要求3所述的重组质粒而形成的植酸酶酵母基因工程菌，其特征在于：将重组质粒转化入巴斯德毕赤酵母。

7、一种含有权利要求2所述序列的植酸酶巴斯德毕赤酵母基因工程菌，其特征在于：载体为pPICZαA。

8、一种权利要求7所述的基因工程菌的筛选方法，其包括：在表型筛选的基础上，通过酶活力测定进行植酸酶表达的功能筛选；其特征在于：以系列浓度无机磷及其在钒钼显色剂下的吸光度建立标准曲线，根据标准曲线计算发酵液在相同反应体系、相同反应条件下的酶活力，进行筛选。

9、一种采用权利要求8所述方法筛选出的巴斯德毕赤酵母基因工程菌，其特征在于：经甲醇诱导210小时以下，工程菌发酵液的植酸酶活力可达到0～250U/mL；甲醇浓度为0.25～0.75％，诱导培养条件是摇瓶转速230～250rpm/min，培养温度28～30℃。

10、一种从权利要求9所述的巴斯德毕赤酵母基因工程菌中得到的基因工程植酸酶，其特征在于：工程菌经发酵培养、甲醇诱导，编码植酸酶基因序列表达并将植酸酶分泌到发酵液中。

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