CN101182499B - 一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，采用以毕赤酵母做载体的产植酸酶基因工程菌的发酵生产工艺，其特征在于以甘油为碳源，取适量生产用菌种，在种子培养基中摇瓶培养，再经一级种子培养、二级种子培养、发酵培养工序，在种子培养及发酵产酶前的菌体生长阶段的唯一碳源为甘油；发酵培养时，在基础发酵培养基液中甘油消耗完全后，开始流加50％甘油溶液至培养基中，待甘油耗尽后，开始流加甲醇诱导产植酸酶，在生产阶段甲醇还充当碳源。积极效果是：甘油作为碳源使最终产植酸酶量增加20-30％，酶活力提高20％-30％，发酵液颜色浅不需脱色处理，降低生产费用，本方法比传统工艺降低成本1/3左右。
Description
技术领域
本发明涉及微生物制品的发酵技术，以甘油为碳源的制备植酸酶的方法。
背景技术
传统生产植酸酶的方法是利用葡萄糖作碳源。葡萄糖作为碳源在灭菌过程中，产生焦糖化反应，使得发酵培养基溶液呈褐色或酱油色。其弊端是：第一，焦糖化反应产生有害物，不利于酵母菌的生长；第二，深色发酵液的后处理工作需要脱色，增加生产工序和费用。
发明内容
本发明的目的是提供一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，可显著增加植酸酶产量达20％-30％，不需脱色，降低生产成本。
以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，以毕赤酵母做载体，其特征在于以甘油为碳源，菌种采用摇瓶培养，然后经一级种子培养、二级种子培养和发酵培养，在产酶前的生长培养过程中以甘油为唯一碳源；在生产的诱导表达阶段，以甲醇诱导基因工程菌产植酸酶。
本发明方法以甘油代替传统的葡萄糖为碳源，以毕赤酵母做载体产植酸酶基因工程菌所产生的积极效果是：
a.甘油作为碳源在生产中的应用，产生乙醇乙酸代谢阻遏物比以葡萄糖为碳源时显著减少；
b.由于代谢阻遏物减少，从而使甘油生产工艺生产植酸酶的酶活力提高10％-30％；
c.甘油作为碳源在生产中的应用，对发酵液的颜色有了很大改观，甘油作为碳源在高温灭菌过程中不会产生焦糖化反应，酵母菌正常生长，发酵液颜色浅不需脱色处理，减少发酵液处理费用；降低生产费用，本方法比传统工艺降低成本1/3左右。
具体实施方式
一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，采用以毕赤酵母做载体的产植酸酶基因工程菌的发酵生产工艺，其特征在于以甘油为碳源，作为碳源的甘油在发酵阶段分两步加入：第一步随基础发酵培养基加入，第二步是在生产发酵中以50％甘油溶液流加加入。
具体工序如下：
一、培养基
1.种子培养基：甘油0.5～5％，蛋白胨0.5～5％，酵母粉0.1～2％，按溶积百分比计，其余是水；
2.发酵培养基：甘油1～10％，磷酸二氢钾1～8％，氯化钾1～2％，硫酸铵0.3～3％，氢氧化钾0.5～5％，生物素0.02～0.2％，其余是水；
3.微量元素为PTM1型，添加量分别为上述培养基容积的0.2～2％。
二、种子培养
菌种的摇瓶培养：
a.取适量生产用产植酸酶菌种培养斜面，分别接入3～4只1000ml三角瓶中，内装500ml种子培养基；
b.摇瓶培养条件：30～32℃，250～350pm，生长20～30小时。
三、种子发酵工艺：
1.一级发酵即一级种子培养：
a.在0.5吨不锈钢种子罐中装入种子培养基约占发酵罐容积的70～75％，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；
b.养好的摇瓶菌种接入一级发酵罐中，培养：30℃，200～300pm，生长20～30小时；
2.二级发酵即二级种子培养：
a.在3吨不锈钢种子罐中有发酵培养基占容积的70～75％，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；
b.将一级发酵罐中的菌种液无菌状态下接入二级种子罐中；
c.培养：30℃，200～300pm，ph恒定5.0～6.0，生长20～30小时；
四、生产发酵：
a.在20吨容积不锈钢发酵罐中投入相当于罐容积的35～40％的发酵培养基，经消毒、接种、流加等工序，至停止发酵时发酵液体积增加到罐体积的70-75％。
b.无菌状态接入二级种子，培养发酵：30℃，180～250pm，恒定ph 5.0，通气量1～2vvm。
c.流加甘油当发酵培养基中甘油利用完全后，用甘油检测方法测定甘油含量为0时，再进行下步补料流加工序：以10-50ml/h/l的流速，流加甘油水溶液至发酵培养基中。
(1)配制浓度为50％甘油水溶液，其中含0.2～2％PTM1，灭菌降温备用；
(2)甘油匀速流加时间为4h或更长时间，至细菌生产量为200～250g湿重/L发酵液无可见的重组蛋白的产生；
d.诱导
(1)诱导剂：甲醇，添加0.2-2PTM1；
(2)当流加的甘油利用完全后，采用甘油检测方法测定甘油含量为0时，再进行下步补料流加工序；
(3)启用浓度99％以上甲醇，添加0.2-2％PTM1流加饲喂，速度为1-10ml/h/L起始发酵液体积；
(4)在开始3-5小时，酵母对碳源的适应期中甲醇在发酵液中累积，当培养物适应甲醇后，将消耗甲醇；
(5)甲醇作为毕赤酵母工程菌的诱导剂，诱导其产植酸酶；
(6)随着培养的持续及目的产物的快速生成，应相应增大发酵液中的溶氧，溶氧值大于30％；
(7)整个甲醇流加过程持续约70-100小时。
五、生产发酵过程结束：当细菌镜检发现细菌开始自溶时，酶活力降至3000u/g以下，停止发酵。
六、本发明方法与传统工艺的效果对比实验：
传统工艺与本发明方法的效果对比表
说明：
1.从上表中可以看出连续6批对比发酵，甘油型的优势大于葡萄糖型；
2.甘油型发酵最终酶活力比葡萄糖型发酵最终酶活力要高出10-30％不等；
3.发酵液的后处理过程中，脱色成本则更显甘油型发酵的优势，降低成本至葡萄糖型发酵的1/3左右。
Claims (4)
1.一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，采用以毕赤酵母做载体的产植酸酶基因工程菌的发酵生产工艺，其特征在于该发酵生产工艺的步骤包括：以甘油为碳源，取适量生产用菌种，在种子培养基中摇瓶培养，再经一级种子培养、二级种子培养以及生产发酵的工序；其中种子培养基的配方为：甘油0.5～5％，蛋白胨0.5～5％，酵母粉0.1～2％，其中甘油按体积百分比计，其余按重量百分比计，其余是水；其中生产发酵工序的步骤为：
a.在20吨容积的不锈钢发酵罐中投入相当于罐容积的35～40％的发酵培养基，经消毒、接种、流加等工序，至停止发酵时发酵液体积增加到罐体积的70-75％；
b.无菌状态接入二级种子，培养发酵：30℃，180～250pm，恒定pH 5.0，通气量1～2vvm；
c.流加甘油
当发酵培养基中甘油利用完全后，采用甘油检测方法测定甘油含量为0时，再进行下步补料流加工序：
(1)配制甘油水溶液，按体积百分比计，浓度为50％，再添加微量元素PTM1，为培养基体积的0.2～2％，灭菌降温备用；
(2)以10-50ml/h/l的流速流加体积百分比为50％的甘油水溶液至发酵培养基中；
(3)甘油匀速流加时间为4h或更长时间，至细菌生产量为200～250g湿重/L发酵液无可见的重组蛋白的产生；
d.诱导
(1)配制诱导剂：在浓度99％以上的甲醇中添加0.2-2％PTM1，按体积百分比计；
(2)当流加的甘油利用完全后，再进行流加甲醇；
(3)诱导剂流加饲喂，速度为1-10ml/h/L起始发酵液体积；
(4)在开始3-5小时，酵母对碳源的适应期中甲醇在发酵液中累积，当培养物适应甲醇后，将消耗甲醇；
(5)甲醇作为毕赤酵母工程菌的诱导剂，诱导其产植酸酶；
(6)随着培养的持续及目的产物的快速生成，应相应增大发酵液中的溶氧，溶氧值大于30％；
(7)整个甲醇流加过程持续约70-100小时；
e.生产发酵过程结束：当细菌镜检发现细菌开始自溶时，酶活力降至3000u/g以下，停止发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于一级种子培养的步骤为：
a.在0.5吨不锈钢种子罐中装入种子培养基约占种子罐容积的70～75％，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；
b.养好的摇瓶菌种接入一级种子罐中；培养：30℃，200～300rpm，生长20～30小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基的成分为：甘油1～10％，磷酸二氢钾1～8％，氯化钾1～2％，硫酸铵0.3～3％，氢氧化钾0.5～5％，生物素0.02～0.2％，其中甘油按体积百分比计，其余按重量百分比计，其余是水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于二级种子培养的步骤为：
a.在3吨不锈钢种子罐中发酵培养基占容积的70～75％，蒸汽灭菌121℃，15min，冷却至30℃；
b.将一级种子罐中的菌种液无菌状态下接入二级种子罐中；
c.培养：30℃，200～300rpm，pH恒定5.0～6.0，生长20～30小时。
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| CN114908109B (zh) * | 2022-06-14 | 2023-11-10 | 中农华威生物制药(湖北)有限公司 | 一种适用于饲料中酸性蛋白酶表达菌株构建及分批发酵工艺 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1333363A (zh) * | 2000-07-12 | 2002-01-30 | 广东省农业科学院畜牧研究所 | 一种植酸酶基因序列及其在酵母中的应用 |
| WO2003095653A1 (de) * | 2002-05-10 | 2003-11-20 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Promotoren mit veränderter transkriptionseffizienz aus der methylotropen hefe hansenula polymorpha |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1333363A (zh) * | 2000-07-12 | 2002-01-30 | 广东省农业科学院畜牧研究所 | 一种植酸酶基因序列及其在酵母中的应用 |
| WO2003095653A1 (de) * | 2002-05-10 | 2003-11-20 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Promotoren mit veränderter transkriptionseffizienz aus der methylotropen hefe hansenula polymorpha |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吴康华等.基因工程菌pichia pastoris连续培养的生长及抑制动力学.华东理工大学学报27 7.2001,27(7),605-609. |
| 吴康华等.基因工程菌pichia pastoris连续培养的生长及抑制动力学.华东理工大学学报27 7.2001,27(7),605-609. * |
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