CN111378584B - 脂肪酶生产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了脂肪酶生产菌株及其应用。具体地，本申请提供了甘油单‑二酰酯脂肪酶生产菌株，并提供了由该菌株制备甘油单‑二酰酯脂肪酶的方法及其应用。本申请提供的脂肪酶生产菌株稳定、蛋白产量高且产泡沫量少，具有极大的工业化生产价值。

Description

脂肪酶生产菌株及其应用

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及脂肪酶生产菌株及其应用，更具体地，涉及产泡沫量少的甘油单-二酰酯脂肪酶生产菌株及其应用。

背景技术

自1969年研究人员首次发现某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长并且可以进行高密度发酵以来，随着甲醇诱导启动子P_AOX1的发现和毕赤酵母分子操作方法的成熟，使用毕赤酵母表达外源蛋白得到广泛应用。

由于毕赤酵母既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白的翻译后修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点，同时它还避免了其他酵母如酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，该表达系统很快成为目前最优秀、应用最为广泛的外源基因表达系统之一。目前有超过5000种蛋白在毕赤酵母中成功表达，美国FDA于2006年将毕赤酵母认定为一般公认安全(GRAS)的菌株，用于生产作为动物饲料添加剂的磷脂酶C。

毕赤酵母基础菌株GS115来自化学法诱变原始菌NRRL-Y11430(ATCC 76273)，使之成为组氨酸营养缺陷型宿主(His^-)，便于进行克隆筛选。GS115的醇氧化酶基因AOX1是完整的，虽然其能够很好地利用甲醇表达大多数外源蛋白，但由于其本底AOX1依然会高效表达，因而会影响某些基因的产量。因此，后续毕赤酵母衍生菌株方向之一就是在GS115的基础上将AOX1基因敲除，替换成酿酒酵母ARG4基因，得到KM71(his4 arg4 aox1Δ::ARG4)，由于其AOX2基因保持完整，因此甲醇利用率很低，在甲醇作为唯一碳源的培养下生长很慢。进一步敲除AOX2基因后，得到了无法利用甲醇的宿主MC100-3(his4 arg4 aox1Δ::SARG4 aox2Δ::Phis4)。在GS115的基础上改造的另一个方向是失活宿主蛋白酶，包括敲除毕赤酵母液泡蛋白酶B(Proteinase B，prb1)，得到SMD1165(his4 prb1)；或者敲除用于激活其他液泡蛋白酶(包括羧肽酶Y(carboxypeptidase Y)和蛋白酶B)的液泡天冬氨酸蛋白酶(PEP4)，得到SMD1168(his4 pep4)。在SMD1168的基础上进一步敲除液泡蛋白酶B(Proteinase B，prb1)，得到SMD1163(his4 pep4 prb1)。

脂肪酶是酯酶的一种，可以催甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、其它小分子酯、多元醇酯和多元酸酯酯键的水解，脂肪为脂肪酶的天然底物，水解的过程中会产生甘油二酯和甘油单酯，水解最终产物为甘油和脂肪酸。脂肪酶水解条件温和，副产物少，不需要辅酶。脂肪多为疏水物质，因此水解反应发生在油水界面或者有机相中。

甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)是脂肪酶的一种，MDGL具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(MAG)和甘油二酰酯(DAG)，对甘油三酰酯不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。

甘油单酰酯(MAG)是一种优良的乳化剂，在食品、医药和化妆品工业中有广泛的应用。MAG的传统合成工艺是在高温下，以无机碱为催化剂，在氮气条件下通过油脂/甘油三酯(TAG)与甘油连续酯化进行生产，产物为MAG、DAG和TAG的混合物，通过蒸馏获得MAG，MAG的产率为40-50％。

Yamaguchi等(Purification and characterization of mono-anddiacylglycerol lipase isolated from Penicillium camembertii U-150，AppliedMicrobiology and Biotechnology,1991,34(6):720-725)首先利用卡门柏青霉获得了MDGL，MDGL有2种形态，分子量分别为37KDa和39KDa，MDGL有由26个氨基酸组成的信号肽，成熟肽包含279个氨基酸。Yamaguchi等以月桂酸乙烯酯为底物测定卡门柏青霉来源的MDGL酶活单位，经培养基过滤、乙醇纯化、硫酸铵沉淀、DEAE琼脂糖凝胶过滤、纤维素膜纯化和离子交换等纯化步骤后，MDGL的比酶活为6680U/mg。MDGL由mdlA编码，mdlA已经在毕赤酵母中获得表达。

与传统合成工艺不同，酶法合成MAG是以脂肪酸和甘油为底物，在温和条件下催化合成MAG，酶法催化中脂肪酸的转化率超过97％，MAG在产物中的占比超过74％。目前限制酶法应用的主要问题是酶的活力较低和酶的成本较高。

由于培养基中存在糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质，在通气发酵和微生物呼出二氧化碳的共同作用下，培养液会产生泡沫，泡沫的产生会影响搅拌、溶氧和细胞生长等，如果泡沫控制不当，泡沫溢出，会引起一系列问题，包括降低装料系数，增加染菌风险，造成原料的浪费以及产物的损失，最终导致发酵产率降低。

泡沫可通过1)调整培养基成分，改变发酵参数，调整发酵工艺，2)采用机械消泡器、超声波等物理手段消除，3)采用化学消泡剂，4)从微生物本身的特性着手，筛选不易产生泡沫的突变菌种，从内在因素上消除气泡。

微生物发酵过程中通常通过添加消泡剂来减少泡沫的产生，目前常用的消泡剂包括：烷氧基脂肪酸酯，聚丙烯乙二醇(PPG)，硅氧烷聚合物，矿物油和硅酸盐等。各种消泡剂在不同发酵液中的消泡效果各不相同，使用量也各有不同，如以谷氨酸发酵为例，产酸10％的发酵水平，每生产1t谷氨酸就要使用5kg GPE消泡剂；产酸12％以上的发酵水平，就要采用更大量消泡剂。消泡剂用量的增加，不但抑制微生物的活力，造成溶氧系数下降，还会影响发酵产物的质量(章冬梅等，泡沫对工业发酵的影响及控制，化工设计，2008，18(1)：17-20)。甲醇营养型巴斯德毕赤酵母常使用硅氧烷聚合物为消泡剂，一般需要10ppm的聚二甲基硅氧烷才能有效的抑制泡沫。对于降低发酵成本而言，减少消泡剂的使用是比较好的改进。

发明内容

因此，一方面，本申请提供了一种脂肪酶生产菌，其为经表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化的产泡沫量少的巴斯德毕赤酵母。

在一实施方案中，本申请提供的脂肪酶生产菌中的质粒包含如SEQ ID NO.:1所示的表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列。

在一实施方案中，本申请提供的脂肪酶生产菌中的质粒还包含如SEQ ID NO.:3所示的表达液泡天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列。

在一具体实施方案中，本申请提供的脂肪酶生产菌已于2018年11月05日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为Pichia pastoris mc1-2-MDGL-pep-28-3，其保藏编号为CGMCC16706。

另一方面，本申请提供了获得所述脂肪酶生产菌的方法，其包括利用表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化巴斯德毕赤酵母，并经筛选获得。

在一实施方案中，本申请提供的获得所述脂肪酶生产菌的方法中所使用的质粒包含如SEQ ID NO.:1所示的表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列。

在一实施方案中，本申请提供的获得所述脂肪酶生产菌的方法中所使用的质粒还包含如SEQ ID NO.:3所示的表达液泡天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列。

又一方面，本申请提供了所述脂肪酶生产菌在制备甘油单-二酰酯脂肪酶中的应用。

此外，本申请还提供了制备甘油单-二酰酯脂肪酶的方法，其包括发酵培养所述脂肪酶生产菌。

在一实施方案中，所述发酵培养所述脂肪酶生产菌还包括添加甲醇诱导脂肪酶生产菌表达甘油单-二酰酯脂肪酶的步骤。

在另一实施方案中，添加甲醇诱导脂肪酶生产菌表达甘油单-二酰酯脂肪酶的条件如下：甲醇用量1-5％(v/v)，优选2％(v/v)；温度25-35℃；以连续流加或每间隔8-12小时流加一次的方式添加。

在一实施方案中，发酵培养所述脂肪酶生产菌的条件如下：接种量5-15％(v/v)，C源10-100g/L，N源浓度1-20g/L、温度20-40℃、pH3.5-8.5、溶氧量10％-90％。在一实施方案中，发酵培养所述脂肪酶生产菌还包括添加消泡剂的步骤。

在另一实施方案中，所述消泡剂选自以下中的一种或多种：烷氧基脂肪酸酯，聚丙烯乙二醇，硅氧烷聚合物，矿物油和硅酸盐。在又一实施方案中，所述消泡剂的用量为1.3-4g/L发酵液。进一步地，本申请提供了甘油单-二酰酯脂肪酶，其通过发酵培养所述的脂肪酶生产菌制备。

此外，本申请还提供了制备甘油单酰酯的方法，其包利用所制备的甘油单-二酰酯脂肪酶催化合成甘油单酰酯。

可见，本申请以来源于卡门柏青霉(Penicillium camembertii)U-150的mdlA基因为基础，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性，对编码成熟蛋白的序列进行密码子优化，合成的基因以巴斯德毕赤酵母CICC32806为表达宿主，构建了MDGL生产菌株，并且在此基础上经过紫外诱变筛选，获得一株稳定、产泡沫少且蛋白产量高的甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)生产菌株。

附图说明

图1为实施例1中构建的质粒pPIC9K-MDGL-pep4示意图。

图2为实施例3中mc1-2-MDGL-pep候选菌株的蛋白电泳结果图。

图3实施例5中mc1-2-MDGL-pep28-3菌株在7.5L发酵罐中不同时间蛋白产量和酶活产量。

图4实施例5中mc1-2-MDGL-pep28-3菌株在7.5L发酵罐中不同时间发酵液SDS-PAGE分析。

具体实施方案

在具体实施方案中，所使用的甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)编码基因序列来源于卡门柏青霉(Penicillium camembertii)U-150(genebank登录号：BAA14345.1)。具体地，本申请中所使用的MDGL编码基因经密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其编码的MDGL氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在具体实施方案中，所使用的液泡天冬氨酸蛋白酶(PEP4)编码基因序列来源于巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115(genebank登录号：CP014717.1)，同时包括编码基因上游1000bp和下游1000bp。具体地，本申请中所使用的PEP4编码基因的表达框核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，其编码的PEP氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在具体实施方案中，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性对来源于卡门柏青霉U-150的MDGL编码基因序列进行优化，并将密码子优化后基因克隆至表达载体pPIC9K中，生成质粒pPIC9K-MDGL，PCR方法获得线性化质粒，在AOX1终止子后方添加酶切位点AvrII，生成质粒pPIC9K-MDGL-AvrII，PCR获得液泡天冬氨酸蛋白酶(PEP4)完整表达框，克隆至pPIC9K-MDGL-AvrII的AvrII酶切位点处，生成质粒pPIC9K-MDGL-pep4，经BglII酶切后转入巴斯德毕赤酵母表达菌株CICC32806。

将转化物在不含组氨酸的筛选培养基上筛选，只有转化有外源基因片段的重组毕赤酵母才能在筛选培养基上生长。将筛选培养基上的菌落转接到含DAG的活性筛选平板上，挑选水解圈最大的转化子至新的DAG活性筛选平板上，挑取8个水解圈最大的单克隆进行三角瓶发酵测试，重组蛋白和酶活产量最高的菌株确定为MDGL生产候选菌株，命名为mc1-2-MDGL-pep28。

为了获得更好的蛋白表达菌株和降低生产成本，对菌株mc1-2-MDGL-pep28进行紫外诱变，经过DAG活性平板筛选，获得一株稳定的、产泡沫量少的生产菌株，命名为mc1-2-MDGL-pep28-3。使用RT-PCR方法确定该菌株中MDGL基因拷贝数为8，经过7.5L发酵罐测试，发酵142小时后蛋白产量超过8g/L，并且显著减少了发酵过程中消泡剂的用量，具有极大的工业化生产价值。

可见，本申请利用人工改造和随机诱变，通过大批量筛选获得MDGL生产菌株，适合大规模发酵生产和工业化应用。此外，本申请的方法可以为其它酶生产菌株的构建提供指导。

以下举出实施例具体地说明本发明，但是本发明并非仅限于这些实施例。

除非特别指明，以下实施例中所使用的仪器、设备和试剂均可通过商购获得。

实施例1：质粒的构建

MDGL编码基因序列来源于卡门柏青霉(Penicillium camembertii)U-150(genebank登录号：BAA14345.1)，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后的基因(具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2所示)由生工生物工程有限公司合成并克隆至表达载体pPIC9K中，生成质粒pPIC9K-MDGL。PEP4编码基因序列来源于巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115(genebank登录号：CP014717.1)，同时包括编码基因上游1000bp和下游1000bp(具体的表达框核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示)，基因由生工生物工程有限公司合成并克隆至表达载体pPIC9K中，生成质粒pPIC9K-pep4。

以pPIC9K-MDGL为模板，使用引物9K-F和9K-R进行PCR扩增，获得线性化并添加AvrII酶切位点的片段。

使用AvrII酶切，以pPIC9K-pep4为模板，使用引物pep-F和pep-R进行PCR扩增，获得pep4片段。

将获得的pep4片段与AvrII酶切的pPIC9K-MDGL连接，连接物通过热激法转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒，生成质粒pPIC9K-MDGL-pep4，并送交上海生工测序。

PCR反应体系为：水33μL，5×PrimeSTAR缓冲液10μL，dNTP混合物(各2.5mM)4μL，引物各1μL，质粒模板0.5μL，

HS(DRR010A)DNA聚合酶0.5μL(Takara公司)。

其中，引物序列分别如下：

9K-F(SEQ ID NO.:5)：

CCTAGGGCAGTCAGGCACCGTGTATG

9K-R(SEQ ID NO.:6)：

CCTAGGAAGCTTGCACAAACGAACTTCTC

Pep-F(SEQ ID NO.:7):

TTGTGCAAGCTTCCTAGACAGGGGACCTTTATCACGTTG

Pep-R(SEQ ID NO.:8):

GTGCCTGACTGCCCTAGTCCTCATCTATACCCCAGGACC

PCR反应程序为：98℃，10秒；68℃，1min；进行30个循环。

PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒(AP-PCR-50)纯化，使用NEB公司AvrII限制性内切酶酶切，并再次经过Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。

实施例2：MDGL生产菌株的获得

使用NEB公司BglII限制性内切酶酶切质粒pPIC9K-MDGL-pep4，获得MDGL和pep4的转化片段，酶切产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。

按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey J Letchworth，Highefficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreatedwith lithium acetate and dithiothreitol,Biotechniques,2004,36(1):152-4)，电击转化巴斯德毕赤酵母菌株CICC32806(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，涂布在MD筛选平板(1.34％酵母基础氮源，1mol/L山梨醇，1.8％琼脂糖)，于30℃培养3天。

将长出来的单菌落转接到MDGL筛选平板(0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH 6.0，1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％酵母基础氮源，1.25％若丹明B，2％甲醇，1.8％琼脂糖)，于30℃静置培养24h。

挑选水解圈最大的克隆至新的MDGL筛选平板，于30℃静置培养24h，再挑选8个水解圈最大的克隆至YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中，于30℃，240rpm摇床震荡培养24h，保存菌种。

实施例3：MDGL生产菌株的摇瓶发酵测试

将8个单克隆(分别命名为：mc1-2-MDGL-pep71，mc1-2-MDGL-pep 90，mc1-2-MDGL-pep 91，mc1-2-MDGL-pep 92，mc1-2-MDGL-pep 94，mc1-2-MDGL-pep 96，mc1-2-MDGL-pep97，mc1-2-MDGL-pep 28)分别接种至YPD培养基，于30℃，240rpm摇床震荡培养24h。

取500μL培养液接种至50mL的BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油，1.34％酵母基础氮源，0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH 6.0)中，于30℃，240rpm摇床震荡培养过夜。

利用无菌水梯度稀释培养液，测定600nm处吸光值(测定值介于0.2-0.8的结果认为准确)。根据稀释倍数计算每毫升菌液的OD₆₀₀值，取相应体积的培养液，使菌体的总OD₆₀₀值为300。离心收集该培养液，用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用50ml BMMY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％甲醇，1.34％酵母基础氮源，0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH 6.6)重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％(v/v)的甲醇，于30℃，240rpm摇床震荡培养诱导表达。每隔12h向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3天后，于8000rpm、4℃下离心发酵液，取发酵液上清进行酶活测定及蛋白电泳检测。

pNPP法测定甘油单-二酯脂肪酶酶活：

pNPP法甘油单-二酯脂肪酶酶活单位的定义：在温度为37℃，pH值4.8的条件下，1min催化底物释放出1μmol对硝基苯酚的酶量为1个甘油单-二酯脂肪酶活力单位(U)。

反应缓冲液的配制：0.3mg/mL pNPP，0.05M乙酸-乙酸钠，0.4％PVA，0.1％阿拉伯胶，pH 4.8。

终止液：0.2M Tris-Hcl，5％TritonX-100，pH 8.50

测定具体步骤：Broadford法测定蛋白浓度，使用水稀释酶液至蛋白浓度为0.01-0.02mg/ml，吸取400μL pNPP反应液至1.5ml离心管，置于37℃反应器上孵育3-5min，加入5μL稀释的酶液，混匀并立即计时，反应20min后加入400μL终止液，颠倒混匀。反应结束后于12000rpm下离心2min，取上清测定OD₄₀₅吸光值。

酶活计算方法：酶活单位＝0.1935×OD₄₀₅×酶液稀释倍数×反应体积(0.805)/反应时间(20)/添加酶液体积(0.005)

对这8个潜在MDGL生产菌株发酵结果进行分析，显示其中mc1-2-MDGL-pep28的蛋白产量最高，达到0.794mg/mL，酶活单位27.96U/mL，比酶活为35.21U/mg。以mc1-2为宿主仅转入MDGL的生产菌株，其最高蛋白产量为0.32mg/ml，酶活单位为11.61U/ml，比酶活为36.29U/mg。可见，菌株mc1-2-MDGL-pep28具有极大的大规模生产潜力。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：使用0.22μm滤膜过滤处理上清液，将等量上清液使用Milipore 10KDa超滤浓缩罐浓缩到相同体积后，取相同体积的浓缩酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。对8个潜在MDGL生产菌株进行的电泳结果如图2所示。

实施例4：紫外诱变和筛选

挑取mc1-2-MDGL-pep28菌落至5mL YPD培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中，于30℃，240rpm摇床震荡培养过夜，检测菌液OD₆₀₀值。

吸取总OD₆₀₀值为200的菌液，于4000rpm下室温离心后去除上清，使用无菌水洗涤细胞2次，最后重悬菌液浓度至20OD/mL。

取2mL菌液均匀分散在培养皿表层，置于超净工作台紫外灯下照射90秒，取100μL涂布于MDGL筛选平板上，30℃培养箱避光培养(全过程在红光下操作，防止回复突变)4天。

挑取水解圈最大的突变子，使用KOD-FX酶和毕赤酵母表达测序通用5’AOX和3’AOX引物，对该突变子菌落进行PCR扩增，按照该酶的使用说明进行PCR，PCR产物送上海生工进行测序。

结果显示，人为转入酵母中的核酸部分：AOX启动子、信号肽、MDGL基因、转录终止子等都未发生突变，因此该突变子的改变为菌株自身的突变，将该菌株命名为mc1-2-MDGL-pep28-3。

对该菌株进行摇瓶发酵测试(具体条件同实施例3)，结果发现该菌株的蛋白产量(0.802mg/ml)与mc1-2-MDGL-pep28(0.794mg/ml)基本一致，但泡沫量明显减少。将此菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC16706。

实施例5：mc1-2-MDGL-pep28-3菌株7.5L发酵罐中发酵测试

为了测试mc1-2-MDGL-pep28-3菌株在高密度发酵条件下产MDGL的能力，利用mc1-2-MDGL-pep28-3菌株在7.5L发酵罐中进行了发酵测试。

发酵培养基及发酵条件参考Berend Tolner等报道的方法(Berend Tolner等,Production of recombinant protein in Pichia pastoris by fermentation,Natureprotocol,2006,1:1213-1222)。

发酵结束后，取菌液于8000rpm下离心10分钟，取上清进行蛋白产量、酶活产量和十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，使用实施例3描述的方法测定蛋白浓度和脂肪酶活力。

结果显示，mc1-2-MDGL-pep28-3菌株46h后蛋白开始逐渐产生并不断积累。发酵142h后，mc1-2-MDGL-pep28-3菌株蛋白产量为8.89g/L，酶活产量为118.81U/mL，结果如图3所示；而mc1-2-MDGL-pep28菌株的蛋白产量为7.79g/L，酶活产量为100.32U/mL。

mc1-2-MDGL-pep28-3菌株的发酵过程中(142h)消泡剂的总使用量为3.4g/L，而相同湿重mc1-2-MDGL-pep28菌株在相同条件下发酵142h需要添加消泡剂量为5.0g/L。

可见，mc1-2-MDGL-pep28-3菌株明显降低了消泡剂的使用量。此外，根据章冬梅等(同前)的报道，泡沫的减少可以增加发酵罐的装液系数，提高发酵罐的使用效率，降低了发酵泡沫溢出的风险，提高了溶氧和搅拌效率。综合来看，泡沫的减少提高了发酵的效率，降低了发酵能耗。

对不同时间的发酵液进行SDS-PAGE分析，结果如图4，不同时间发酵液均在45kDa-55kDa之间出现了2条明显的目的条带，且随着时间的延长有明显的增加趋势。

实施例6mc1-2-MDGL-pep28-3菌株中MDGL拷贝数测定

为了测试菌株mc1-2-MDGL-pep28-3中MDGL编码基因在基因组中的数量，使用荧光定量PCR的方法测定菌株中MDGL编码基因的拷贝数，以gap基因(甘油三磷酸脱氢酶编码基因)为内参基因，引物序列如下：

MDGL-F(SEQ ID NO.:9):TTGCTGATGCTACTTTCGTCCA

MDGL-R(SEQ ID NO.:10):AGATGGATAACCTTTACCACGCA

GAP-F(SEQ ID NO.:11):GGTATTAACGGTTTCGGACGTATTG

GAP-R(SEQ ID NO.:12):GATGTTGACAGGGTCTCTCTCTTGG

使用酚氯仿异戊醇法提取DNA，使用Bio-rad公司的通用型SYBR Green预混液(货号：172-5120)进行PCR，反应体系为：SYBR Green预混液10μL，DNA模板1μL，引物1(10μM)1μL，引物2(10μM)1μL，双蒸水7μL；反应条件为：95℃2min，95℃15s，60℃30s。通过郭晋霞等报道的2^-ΔCt方法(郭晋霞等,荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母工程菌的外源基因拷贝数,重庆理工大学学报(自然科学),2018,30(2)：77-83)计算拷贝数。

结果显示，菌株mc1-2-MDGL-pep28-3中MDGL编码基因的拷贝数为8，并且在无甲醇培养基中连续转接5代未发现拷贝数变化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 脂肪酶生产菌株及其应用

<130> 18C13679CN

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgtctcca cttccgaact ggaccagttc gagttctggg ttcaatacgc agccgcctct 60

tactacgagg ctgattacac cgcacaggtt ggtgataagc tgtcctgctc taagggtaac 120

tgcccagaag ttgaagcaac cggtgcaact gtgtcttacg acttctccga ttccacgatc 180

actgacaccg caggttacat cgcagttgat cacaccaact ccgcagtggt actggcattc 240

cgtggttctt actccgtacg taactgggtt gctgatgcta ctttcgtcca taccaaccca 300

ggtctgtgtg atggttgtct ggctgagctg ggtttctggt cttcctggaa gctggttcgt 360

gatgatatta tcaaagaact gaaagaagtg gtggcacaga acccaaacta tgaactggtg 420

gtcgtgggcc actccctggg tgctgctgtg gctactctgg ctgctaccga cctgcgtggt 480

aaaggttatc catctgctaa actgtacgct tacgcttccc ctcgtgttgg caacgcagcc 540

ctggccaaat atatcaccgc ccagggcaac aacttccgtt tcacccacac caatgaccca 600

gtacctaaac tgccactgct gtctatgggc tatgtacatg tttctcctga atattggatc 660

acctctccta acaacgccac tgtttctacc tctgacatca aagtcattga cggcgacgta 720

tcttttgacg gcaataccgg cacgggcctg cctctgctga cggactttga agcccacatt 780

tggtactttg tacaggttga cgccggcaaa ggtcctggcc tgccattcaa acgtgtttaa 840

<210> 2

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln Tyr

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp

20 25 30

Lys Leu Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Ala Thr Gly

35 40 45

Ala Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala

50 55 60

Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr Phe Val

85 90 95

His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe

100 105 110

Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys

115 120 125

Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His

130 135 140

Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly

145 150 155 160

Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe

180 185 190

Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser

195 200 205

Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn

210 215 220

Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val

225 230 235 240

Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe

245 250 255

Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro

260 265 270

Gly Leu Pro Phe Lys Arg Val

275

<210> 3

<211> 3666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtacgttaa gaatgaaatt tctacttcca ttatagaaaa tagtgtatca ctgccagcat 60

cttttactca caagcaatta aacaaagtaa caatggtctc taagcaattg gaatcaccac 120

aggggacctt tatcacgttg aatctagttg aaaattcagt gtccaagttc ggtgcagtac 180

acataccaca aggaaaaacc ccatttgttg ttggtagaga ttcatcttgt gactggttga 240

tcaaagaaga aagaatttcc aaaatacact gcatgattgc caaaaaaagg catcctactg 300

ctaatccttc catatttgag tcacctgctt tagggctgga agatatttgg ttactagatt 360

ttagtacaaa ctcttgcttt gtcaatgaca ttaaaatagg caagaatcgc aaaactcaaa 420

tatttcatgg agatgagata tgcttgttca aagatgccca gaaaaaagag caactcgttt 480

atagggttca tattgatgat ggaacaggcc ttttccaggg aggtgaaaga acccaagcca 540

attctgatga cattctggat attgatgagg ttgatgaaaa gttaagagaa ctattgacaa 600

gagcctcaag gaaacggcat atcacccctg cattggaaac tcctgataaa cgtgtaaaaa 660

gagcttattt gaacagtatt actgataact cttgatggac cttaaagatg tataatagta 720

gacagaattc ataatggtga gattaggtaa tcgtccggaa taggaatagt ggtttggggc 780

gattaatcgc acctgcctta tatggtaagt accttgaccg ataaggtggc aactatttag 840

aacaaagcaa gccacctttc tttatctgta actctgtcga agcaagcatc tttactagag 900

aacatctaaa ccattttaca ttctagagtt ccatttctca attactgata atcaatttaa 960

agatgatatt tgacggtact acgatgtcaa ttgccattgg tttgctctct actctaggta 1020

ttggtgctga agccaaagtt cattctgcta agatacacaa gcatccagtc tcagaaactt 1080

taaaagaggc caattttggg cagtatgtct ctgctctgga acataaatat gtttctctgt 1140

tcaacgaaca aaatgctttg tccaagtcga attttatgtc tcagcaagat ggttttgccg 1200

ttgaagcttc gcatgatgct ccacttacaa actatcttaa cgctcagtat tttactgagg 1260

tatcattagg tacccctcca caatcgttca aggtgattct tgacacagga tcctccaatt 1320

tatgggttcc tagcaaagat tgtggatcat tagcttgctt cttgcatgct aagtatgacc 1380

atgatgagtc ttctacttat aagaagaatg gtagtagctt tgaaattagg tatggatccg 1440

gttccatgga agggtatgtt tctcaggatg tgttgcaaat tggggatttg accattccca 1500

aagttgattt tgctgaggcc acatcggagc cggggttggc cttcgctttt ggcaaatttg 1560

acggaatttt ggggcttgct tatgattcaa tatcagtaaa taagattgtt cctccaattt 1620

acaaggcttt ggaattagat ctccttgacg aaccaaaatt tgccttctac ttgggggata 1680

cggacaaaga tgaatccgat ggcggtttgg ccacatttgg tggtgtggac aaatctaagt 1740

atgaaggaaa gatcacctgg ttgcctgtca gaagaaaggc ttactgggag gtctcttttg 1800

atggtgtagg tttgggatcc gaatatgctg aattgcaaaa aactggtgca gccatcgaca 1860

ctggaacctc attgattgct ttgcccagtg gcctagctga aattctcaat gcagaaattg 1920

gtgctaccaa gggttggtct ggtcaatacg ctgtggactg tgacactaga gactctttgc 1980

cagacttaac tttaaccttc gccggttaca actttaccat tactccatat gactatactt 2040

tggaggtttc tgggtcatgt attagtgctt tcacccccat ggactttcct gaaccaatag 2100

gtcctttggc aatcattggt gactcgttct tgagaaaata ttactcagtt tatgacctag 2160

gcaaagatgc agtaggttta gccaagtcta tttaggcaag aataaaagtt gctcagctga 2220

acttatttgg ttacttatca ggtagtgaag atgtagagaa tatatgttta ggtatttttt 2280

tttagttttt ctcctataac tcatcttcag tacgtgattg cttgtcagct accttgacag 2340

gggcgcataa gtgatatcgt gtactgctca atcaagattt gcctgctcca ttgataaggg 2400

tataagagac ccacctgctc ctctttaaaa ttctctctta actgttgtga aaatcatctt 2460

cgaagcaaat tcgagtttaa atctatgcgg ttggtaacta aaggtatgtc atggtggtat 2520

atagtttttc attttacctt ttactaatca gttttacaga agaggaacgt ctttctcaag 2580

atcgaaatag gactaaatac tggagacgat ggggtcctta tttgggtgaa aggcagtggg 2640

ctacagtaag ggaagactat tccgatgatg gagatgcttg gtctgctttt ccttttgagc 2700

aatctcattt gagaacttat cgctggggag aggatggact agctggagtc tcagacaatc 2760

atcaactaat ttgtttctca atggcactgt ggaatgagaa tgatgatatt ttgaaggagc 2820

gattatttgg ggtcactgga gaggctgcaa atcatggaga ggatgttaag gagctttatt 2880

attatcttga taatacacct tctcactctt atatgaaata cctttacaaa tatccacaat 2940

cgaaatttcc ttacgaagaa ttgatttcag agaaccgtaa acgttccaga ttagaaagag 3000

agtacgagat tactgactct gaagtactga aggataacag atattttgat gtgatctttg 3060

aaatggcaaa ggacgatgaa gatgagaatg aactttactt tagaattacc gcttacaacc 3120

gaggtcccac ccctgcccct ttacatgtcg ctccacaggt aacctttaga aatacctggt 3180

cctggggtat agatgaggaa aaggatcacg acaaacctat agcttgcaag gaataccaag 3240

acaacaacta ttctattcgg ttagatagtt ggaagtatgg ctcaaataga ttggtatttg 3300

ctccttcgcc cgccttcagt gaagaatcat cagacattga acctaagctt cttttcacta 3360

ataatgaaag taataaacaa aaactatgga atcaaaaaaa tgcgtcaccc tacaccaagg 3420

atgctttcca tgagtacatt gtcaatgaag atagctctgc aattaaccca caacaaaagg 3480

gtacgaaggc ctgtgcctgg ttttcttttg atgaaaatgg tggtgttccc cctggtgatt 3540

atgtaactat ccgttacaga ttcacaagaa cagatagtga ccagcctgta attgatgaag 3600

aggctttcga taaagtattt gctcgtagac aactagaggc tgacgagttt tattggagga 3660

tttctc 3666

<210> 4

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ile Phe Asp Gly Thr Thr Met Ser Ile Ala Ile Gly Leu Leu Ser

1 5 10 15

Thr Leu Gly Ile Gly Ala Glu Ala Lys Val His Ser Ala Lys Ile His

20 25 30

Lys His Pro Val Ser Glu Thr Leu Lys Glu Ala Asn Phe Gly Gln Tyr

35 40 45

Val Ser Ala Leu Glu His Lys Tyr Val Ser Leu Phe Asn Glu Gln Asn

50 55 60

Ala Leu Ser Lys Ser Asn Phe Met Ser Gln Gln Asp Gly Phe Ala Val

65 70 75 80

Glu Ala Ser His Asp Ala Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asn Ala Gln Tyr

85 90 95

Phe Thr Glu Val Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gln Ser Phe Lys Val Ile

100 105 110

Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Lys Asp Cys Gly

115 120 125

Ser Leu Ala Cys Phe Leu His Ala Lys Tyr Asp His Asp Glu Ser Ser

130 135 140

Thr Tyr Lys Lys Asn Gly Ser Ser Phe Glu Ile Arg Tyr Gly Ser Gly

145 150 155 160

Ser Met Glu Gly Tyr Val Ser Gln Asp Val Leu Gln Ile Gly Asp Leu

165 170 175

Thr Ile Pro Lys Val Asp Phe Ala Glu Ala Thr Ser Glu Pro Gly Leu

180 185 190

Ala Phe Ala Phe Gly Lys Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Asp

195 200 205

Ser Ile Ser Val Asn Lys Ile Val Pro Pro Ile Tyr Lys Ala Leu Glu

210 215 220

Leu Asp Leu Leu Asp Glu Pro Lys Phe Ala Phe Tyr Leu Gly Asp Thr

225 230 235 240

Asp Lys Asp Glu Ser Asp Gly Gly Leu Ala Thr Phe Gly Gly Val Asp

245 250 255

Lys Ser Lys Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Trp Leu Pro Val Arg Arg Lys

260 265 270

Ala Tyr Trp Glu Val Ser Phe Asp Gly Val Gly Leu Gly Ser Glu Tyr

275 280 285

Ala Glu Leu Gln Lys Thr Gly Ala Ala Ile Asp Thr Gly Thr Ser Leu

290 295 300

Ile Ala Leu Pro Ser Gly Leu Ala Glu Ile Leu Asn Ala Glu Ile Gly

305 310 315 320

Ala Thr Lys Gly Trp Ser Gly Gln Tyr Ala Val Asp Cys Asp Thr Arg

325 330 335

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Thr Leu Thr Phe Ala Gly Tyr Asn Phe Thr

340 345 350

Ile Thr Pro Tyr Asp Tyr Thr Leu Glu Val Ser Gly Ser Cys Ile Ser

355 360 365

Ala Phe Thr Pro Met Asp Phe Pro Glu Pro Ile Gly Pro Leu Ala Ile

370 375 380

Ile Gly Asp Ser Phe Leu Arg Lys Tyr Tyr Ser Val Tyr Asp Leu Gly

385 390 395 400

Lys Asp Ala Val Gly Leu Ala Lys Ser Ile

405 410

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctagggcag tcaggcaccg tgtatg 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctaggaagc ttgcacaaac gaacttctc 29

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgtgcaagc ttcctagaca ggggaccttt atcacgttg 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcctgact gccctagtcc tcatctatac cccaggacc 39

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgctgatgc tactttcgtc ca 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatggataa cctttaccac gca 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtattaacg gtttcggacg tattg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatgttgaca gggtctctct cttgg 25

Claims (10)

1.脂肪酶生产菌，其为经表达甘油单-二酰酯脂肪酶的质粒转化的产泡沫量少的巴斯德毕赤酵母，保藏编号为CGMCC16706，其中所述表达甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述质粒还包含如SEQ ID NO:3所示的表达液泡天冬氨酸蛋白酶的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的脂肪酶生产菌在制备甘油单-二酰脂肪酶中的应用。

3.制备甘油单-二酰酯脂肪酶的方法，其包括发酵培养权利要求1所述的脂肪酶生产菌。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述发酵培养包括添加甲醇诱导脂肪酶生产菌表达甘油单-二酰酯脂肪酶的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述添加甲醇诱导脂肪酶生产菌表达甘油单-二酰酯脂肪酶的条件如下：甲醇用量1-5％v/v；温度25-35℃；以连续流加或每间隔8-12小时流加一次的方式添加。

6.如权利要求5所述的方法，其中甲醇用量为2％v/v。

7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，所述发酵培养条件如下：接种量5-15％v/v，碳源10-100g/L，氮源浓度1-20g/L，温度20-40℃，pH 3.5-8.5，溶氧量10％-90％。

8.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其还包括添加消泡剂的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述消泡剂选自以下中的一种或多种：烷氧基脂肪酸酯、聚丙烯乙二醇、硅氧烷聚合物、矿物油和硅酸盐。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述消泡剂的用量为1.3-4g/L发酵液。

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