CN1341149A

CN1341149A - 草酰乙酸水解酶缺陷型真菌宿主细胞

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Publication number: CN1341149A
Application number: CN00804167A
Authority: CN
Inventors: 卡斯滕·M·约尔特; 亨里克·佩德森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2002-03-20
Anticipated expiration: 2020-02-18
Also published as: JP2011101651A; DE60025467D1; EP1157100A1; WO2000050576A1; ATE315638T1; EP1157100B1; DE60025467T2; DK1157100T3; JP4741082B2; JP2002536993A; AU2658200A; CN1195058C

Abstract

本发明涉及编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列。本发明也涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞,以及重组产生这些多肽的方法。

Description

草酰乙酸水解酶缺陷型真菌宿主细胞

发明背景

发明领域

本发明涉及编码具有草酰乙酸水解酶(oxaloacetate hydrolase)活性的多肽的分离的核酸序列。本发明也涉及突变的宿主细胞，特别是真菌突变宿主细胞如曲霉属的细胞，其草酰乙酸水解酶活性缺陷并因此导致其草酸生成缺陷。本发明也涉及突变细胞产生预期化合物如多肽、初级和次级代谢物的应用，以及在本发明的突变细胞中产生这类化合物的方法。本发明也涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的重组方法。

相关技术说明

丝状真菌广泛地用于各种目标化合物的商业生产，包括同源化合物，如初级或次级代谢物和通常由指定真菌产生的多肽，或异源化合物，如由已插入到指定真菌中的外源DNA编码的异源多肽。这类产品由所述真菌发酵产生并收获。

真菌物种黑曲霉广泛地用于所需化合物，例如柠檬酸和工业用酶的商业生产。众所周知，这种生物产生大量的草酸。出于多种原因，当该种生物用于感兴趣化合物的商业生产时，人们不希望有草酸的产生。例如，草酸的产生需要许多碳，这样，与只生产预期化合物的需求相比，必须额外地向发酵培养基中加入昂贵的碳源。发酵液中草酸的存在使涉及目的产物回收的下游操作产生了问题，因为草酸和钙形成了沉淀，从而干扰了回收：而且草酸是一种毒性化合物，这意味着它的存在被认为是由黑曲霉生产食品级产品的主要问题。

黑曲霉中草酸生物合成的两条途径已经被提出了。第一条路线是草酰乙酸+水→草酸+乙酸，该反应受草酰乙酸水解酶催化(Kubicek，C.P.，G.Schreferl-Kunar，W.Whrer和M.Rhr(1988)应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)54，633-637)。第二条路线包括乙醛酸(glycoxylate)途径(Balmforth，A.J.，A.Thomson(1984)：生物化学杂志(Biochem.J.)218，113-118)。

人们企图通过在低pH值下发酵来控制商业黑曲霉发酵过程中的草酸生成，在低pH值下几乎不形成草酸。但是，在低pH值下发酵可能是不受欢迎的，因为通常这一pH值对于黑曲霉的生长以及预期发酵产物的产量都不是最佳的。

来自于黑曲霉的部分纯化的草酰乙酸水解酶已经有记述(Lenz等，来自于黑曲霉的草酰乙酸的部分纯化和一些性质(Partial purification and someproperties of oxaloacetate from Aspergillus niger)1976，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)65：225-236)，但是编码该酶的基因尚未有描述。

本发明的目的是提供细胞如丝状真菌细胞，特别是黑曲霉细胞的突变体，其草酰乙酸水解酶的产生有缺陷，由此其草酸的产生也有缺陷。

发明概要

本发明涉及编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列，它们选自：

(a)编码多肽的核酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少65％同一性的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO：1的DNA序列的编码部分(由SEQ ID NO：1的1157-1411，1504-1411和1764-2383位的核苷酸组成)有至少65％同源性的核酸序列；

(c)核酸序列，其在中等严格的条件下，与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)，(ii)或(iii)的互补链杂交；

(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽片段。

在一个更重要的方面，本发明涉及产生突变细胞的方法，其包括破坏或删除本发明的核酸序列或其调控序列，结果导致了产生比原细胞更少的草酰乙酸水解酶以及草酸的突变体。本发明也涉及通过该方法产生的突变体。

本发明也涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生所述多肽的重组方法。

附图说明

图1显示了在实施例4中描述的质粒pHP3的构建。

本发明的详细说明

编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列

“草酰乙酸水解酶活性”一词在此定义为催化如下反应的活性：草酰乙酸+水→草酸+乙酸。该酶被分类为属于EC 3.7.1.1。对本发明来说，根据在下面的“材料和方法”部分描述的程序确定草酰乙酸水解酶活性。一个单位的草酰乙酸水解酶活性定义为在37℃、pH7.5，每分钟产生1.0μmole草酸。

此处使用的“分离的核酸序列”一词指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如，根据琼脂糖凝胶电泳，至少有大约20％纯，优选至少有大约40％纯，更优选至少有大约60％纯，甚至更优选至少有大约80％纯，最优选至少有大约90％纯。例如，分离的核酸序列的获得可以是通过基因工程中使用的标准克隆程序，将该核酸序列由其自然位置放到一不同位置，在该位置其将得以复制。克隆程序可能包括，切割并分离含有编码该多肽的核酸序列的预期核酸片段，将该片段插入载体分子中，将该重组载体掺入到宿主细胞中，该核酸序列的多个拷贝或克隆将在该宿主细胞中复制。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成物、合成物或其任何组合物。

在第一个实施方案中，本发明涉及编码多肽的分离的核酸序列，该多肽具有与SEQ ID NO：2的1到341位氨基酸(即成熟多肽)在一定程度上相同的氨基酸序列：至少有大约65％相同，优选至少有大约70％相同，更优选至少有大约80％相同，甚至更优选至少有大约90％相同，最优选至少有大约95％相同，甚至最优选至少有大约97％相同，并具有草酰乙酸水解酶活性(下文中称“同源多肽”)。在优选的实施方案中，所述同源多肽具有和SEQ ID NO：2的1到341位氨基酸有5个氨基酸不相同的氨基酸序列，优选有4个氨基酸不相同，更优选有3个氨基酸不相同，甚至更优选有2个氨基酸不相同，最优选有1个氨基酸不相同。对本发明来说，两个氨基酸序列之间一致的程度通过使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)由Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)确定，该软件带有一致性列表和下列多重对比参数：空隙罚分为10，空隙长度罚分为10。成对对比参数为Ktuple＝1，空隙罚分＝3，窗口＝5，对角线(diagonals)＝5。

优选本发明的核酸序列编码这样的多肽：该多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位基因变体，或由它们组成；或编码该多肽的具有草酰乙酸水解酶活性的片段。

本发明也包含编码下述多肽的核酸序列：该多肽含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但由于遗传密码的简并性，该核酸序列不同于SEQ ID NO：1。本发明也涉及SEQ ID NO：1的亚序列，其编码SEQ ID NO：2的具有草酰乙酸水解酶活性的片段，或其长度足以灭活微生物细胞中的草酰乙酸水解酶基因(如在以“草酰乙酸水解酶活性的去除或减少”为标题的部分的描述)。

SEQ ID NO：1的亚序列是除了其5’和/或3’端一个或多个核苷酸已被删除之外，被SEQ ID NO：1所包含的核酸序列。优选亚序列包含至少2800个核苷酸，更优选至少3000个核苷酸，最优选至少3200个核苷酸。SEQ IDNO：2的片段是有一个或多个氨基酸从该氨基酸序列的氨基或羧基端删除了的多肽。优选片段包含至少270个氨基酸残基，更优选至少300个氨基酸残基，最优选至少320个氨基酸残基。

等位基因变体表示占据染色体同一位点的基因的两个或多个可选择形式之一。等位基因变体通过突变可自然发生，而且可以导致群体内的多态性。基因突变可能是沉默的(编码的多肽不发生变化)或可以编码改变了氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

所述同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的区别可以是一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。优选氨基酸变化为较小的特性改变，即为保守氨基酸的取代，没有显著影响蛋白的折叠和/或活性；小缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的一个蛋氨酸残基；长达约20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或其他功能而有助于纯化的小的延伸，如多组氨酸序列、抗原表位或结合区。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L. Hill在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的蛋白中进行了描述。最常见互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

在另一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸序列，它和SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列(由SEQ ID NO：1的1157-1141、1504-1651和1764-2383位的核苷酸构成)的同源性至少约65％，优选约70％，优选约80％，更优选约90％，甚至更优选约95％，最优选约97％同源，它编码活性多肽或者为长度足以灭活微生物细胞中草酰乙酸水解酶基因的多肽(如在以“草酰乙酸水解酶活性的去除或减少”为标题的部分所述)；或为SEQ ID NO：1的等位基因变体和亚序列，其编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽片段，或者为长度足以灭活微生物细胞中草酰乙酸水解酶基因的多肽片段(如在以“草酰乙酸水解酶活性的去除或减少”为标题的部分的描述)。对本发明来说，两个核酸序列间的同源程度通过在Fasta程序包(v20u6版)中提供的计算机程序Align确定，将带有下列设置的空隙(GAP)用于核酸序列的比较：空隙产生罚分(对于第一个残基)为-16和空隙延伸(对于其他残基)罚分为-4。Align是E.Myers和W.Miller的程序的略微修订版。运算法则在E.Myers和W.Miller的“线性空间的最佳排列”(Optimal Alignments in LinearSpace)(CABIOS(1988)4：11-17)中有描述。

在第三个实施方案中，本发明涉及编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列，在中等严格的条件下，更优选在中高度严格的条件下，甚至更优选在高度严格的条件下，最优选在非常高度严格的条件下，该序列可以与这样的核酸探针杂交：该核酸探针在同样条件下，可以与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)，(ii)或(iii)的互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，纽约)。SEQ IDNO：1的亚序列至少有100个核苷酸或优选至少200个核苷酸。而且，该亚序列可以编码具有草酰乙酸活性的多肽片段。

SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可以用于设计核酸探针，以通过本领域中众所周知的方法、从不同种属的品系中鉴定和克隆编码具有草酰乙酸活性的多肽的DNA。具体地，这种探针可用于经标准Southern印迹程序与目的种属的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。这种探针能够比全序列短很多，但是其至少有15个，优选至少有25个，更优选至少有35个核苷酸的长度。更长的探针也可以使用。通常将探针标记以用于检测相应的基因(例如，用³²p，³H，³⁵S，生物素，或亲和素标记)。这种探针包含于本发明中。

因此，可从其它这类生物体中制备的基因组DNA或cDNA中筛选可以和上述探针杂交并编码具有草酰乙酸活性的多肽的DNA。从其它这类生物体中制备的基因组或其他DNA都可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术而分离。文库中的DNA或被分离的DNA可以被转移并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，可在Southern印迹中使用所述载体材料。对本发明来说，杂交指在从非常低到非常高度严格的条件下，所述核酸序列和这样的核酸探针杂交：该核酸探针与SEQ ID NO：1显示的核酸序列、其互补链、或其亚序列对应。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以用X线胶片检测。

在优选的实验方案中，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽或其亚序列的核酸序列。在另一个优选实验方案中，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一个优选实验方案中，核酸探针是编码由SEQ ID NO：2的123-205位氨基酸残基构成的片段或该片段的一部分的核苷酸。在另一个优选实验方案中，核酸探针是包含于质粒pHP 1中的核酸序列，该质粒包含于大肠杆菌DSM-12660，其中核酸序列编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽，特别是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。

对于至少有100个核苷酸长的长探针，非常低至非常高度严格的条件定义为按标准Southern印迹程序，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA，以及用于非常低和低严格条件的25％甲酰胺、用于中度和中高度严格条件的35％甲酰胺、或用于高度和非常高度严格条件的50％甲酰胺的溶液中，于42℃预杂交和杂交。

对于至少有100个核苷酸长的长探针，最后用2×SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃下(非常低严格)、更优选至少50℃(低严格)、更优选至少55℃(中等严格)、更优选至少60℃(中高度严格)、甚至更优选至少65℃(高度严格)、以及最优选至少70℃(非常高度严格)下，洗涤载体材料三次，每次15分钟。

对于有大约15到大约70个核苷酸长的短探针，严格条件定义为：在比使用根据Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院进展48：1390)的计算方法计算的T_m值低5至10℃的温度，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HClpH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠(Sodium Monobasic Phosphate)、0.1mM ATP、和0.2mg/ml酵母RNA中，按标准Southem印迹程序进行预杂交、杂交、以及杂交后的洗涤。

对于有大约15到大约70个核苷酸长的短探针，载体材料用6×SSC加0.1％SDS洗涤一次达15分钟，用6×SSC在比计算的T_m值低5至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

本发明也涉及通过以下方式产生的分离的核酸序列：(a)使DNA在中度、中高度、高度、或非常高度严格的条件下，与SEQ ID NO：1的序列、或其互补序列、或其亚序列杂交；和(b)分离该核酸序列。亚序列优选是至少有100个核苷酸的序列，如编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽片段的序列，或足够长可用于灭活微生物细胞中草酰乙酸水解酶基因的序列(如在以“草酰乙酸水解酶活性的去除或减少”为标题的部分的描述)。

由本发明的分离的核酸序列编码的多肽，具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的草酰乙酸水解酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少100％。

本发明的核酸序列可以从任何种类的微生物中得到。对本发明而言，此处所用的、与特定来源有关的“从……中得到”一词，意味着该核酸序列编码的多肽由该来源所产生，或由已插入了来自于该来源的核酸序列的细胞所产生。

所述核酸序列可以从细菌来源中得到。例如，这些多肽可以从下列细菌中得到：革兰阳性菌例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophisus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus 1icheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属(Streptomyces)菌株，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；或革兰阴性菌例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp)。

在优选的实施方案中，核酸序列从真菌细胞中得到。此处所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)(Hawksworth等在Ainsworth和Bisby真菌词典，第8版，1995，CAB国际，大学出版社，Cambridge，UK中进行了定义)、以及卵菌门(Oomycota)(被Hawksworth等引用，1995，出处同上，171页)和全部的产有丝分裂孢子的真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，出处同上)。

在更优选的实施方案中，真菌细胞是酵母细胞。此处所用的“酵母”包括产囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(Endomycetales)、产担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)、以及属于半知菌(Fungi Imperfecti)的酵母(Blastomycetes)。因为将来酵母的分类可能会有变化，就本发明而言，酵母应该按照酵母的生物学和活性(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中描述的那样定义。

更具体地，核酸序列可以来自酵母菌株，如假丝酵母属(Candida)、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia的菌株；或更优选，来自丝状真菌菌株，如支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium、或木霉属(Trichoderma)菌株。

在优选的实施方案中，所述核酸序列从卡尔斯伯糖酵母(Sccharomycescarlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、SaccharomycesKluyveri、Saccharomyces norbensis、或卵型糖酵母(Saccharomyces oviformis)菌株中得到。

在另一个优选实施方案中，核酸序列可以从下列菌株中得到：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxyspomm)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichodermaharzianum、康宁氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉(Trichoderma viride)。

在另一个优选实施方案中，核酸序列可以从黑曲霉中得到，最优选从例如黑曲霉BO1 DSM 12665中得到，SEQ ID NO：1列出了该核酸序列。在另一个优选实施方案中，核酸序列是包含于质粒pHP1中的序列，该质粒包含于大肠杆菌DSM-12660中。在另一个优选实施方案中，核酸序列是由SEQ ID NO：1的1157-1411、1504-1651和1764-2383位的核苷酸构成的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

应当理解，对于上述种类的生物，本发明既包括其完整状态也包括不完整状态，以及其他分类学的等价物，例如无性型，而不管它们已知的种属名称。本领域的技术人员可以轻易地认识适当等价物的一致性。例如，所述多肽可以从这些微生物体中得到：这些微生物体是由Benn和Klich定义的黑曲霉的分类学等价物(Benn J.W和M.A.Klich(1992)曲霉，生物学和工业应用Butterworth-Heinemann，美国)，而不管它们已知的种属名称，如棘孢曲霉、泡盛曲霉、炭黑曲霉(A.carboniarus)、椭圆曲霉(A.ellipticus)、无花果曲霉(A.ficuum)、臭曲霉、异型曲霉(A.heteromorphus)、日本曲霉、海枣曲霉(A.phoenicis)、A.Pulverulentus、塔宾曲霉(A.tubingensis)、A.helicothrix、紫黑曲霉(A.atroviolaceus)、枸橼曲霉(A.citricus)、A.acidicus、或A.fonsecaeus。

大众可以容易地在多个菌种保藏中心得到这些种类的细胞株，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)、以及农业研究事务处专利培养物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)、北方区研究中心(Northem Regional Research Center)(NRRL)。

而且，这些核酸序列可以用上述探针从其他来源，包括从自然界(如土壤、堆肥、水等)中分离的微生物中鉴定并获得。从自然生境中分离微生物的技术在本领域内是众所周知的。然后，该核酸序列可以通过类似地筛选另一微生物的基因组或cDNA文库而得到。一旦编码多肽的核酸序列被该探针检测到时，该序列可以通过利用本领域普通技术人员都知道的技术而分离和克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，出处同上)。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术在本领域内是已知的，包括从基因组DNA中分离，从cDNA制备，或它们的联合应用。从这些基因组DNA中克隆本发明的核酸序列可以通过众所周知的聚合酶链反应(PCR)或用抗体筛选表达文库以检测带有共同结构特征的克隆化DNA片段。参见，例如，Innis等，1990，PCR：方法与应用指南(PCR：A Guide to Methodsand Application)，学术出版社，纽约。对于PCR，使用一套跨越编码SEQ IDNO：2的123-205位氨基酸的核苷酸序列的引物可能是特别适当的。也可以使用其他核酸扩增程序，例如连接酶链反应(liase chain reaction)(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription)(LAT)和基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification)(NASBA)。该核酸序列可以从曲霉菌的菌株、或另一种或相关微生物等中克隆，并因此可以是该核酸序列多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

本发明的核酸序列的修饰对于合成与该多肽基本相似的多肽可能是必需的。与该多肽的“基本相似”指该多肽的非自然产生形式。这些多肽可以通过一些工程方式而与从其自然来源分离的多肽有所不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH值等方面不同的变体。变异序列可以根据SEQ IDNO：1的多肽编码部分的核酸序列如其亚序列来构建，和/或通过导入核苷酸取代而构建，该取代不会使该核酸序列编码出该多肽的另一氨基酸序列，但是它和要用于产生酶的宿主生物的密码子应用特点相一致，或通过导入可导致另一氨基酸序列的核苷酸取代来构建。有关核苷酸取代的一般描述可参见，例如，Ford等，1991，蛋白表达与纯化2：95-107。

对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的分离的核酸序列编码的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，科学244：1081-1085)。在后一技术中，突变被引入了分子中的每一个带正电荷的残基处。检测所得突变分子的草酰乙酸水解酶活性，以鉴定对该分子活性重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，其三维结构由如核磁共振分析、结晶学或光亲合标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，科学255：306-312；Smith等，1992，分子生物学杂志224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

产生突变的核酸序列的方法

本发明还涉及产生突变的核酸序列的方法，包括向SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其亚序列中导入至少一个突变，其中该突变的核酸序列编码包含SEQ ID NO：2的1至341位氨基酸的多肽，或其具有草酰乙酸水解酶活性的片段。

将突变导入核酸序列中，把一个核苷酸替换成另一个核苷酸，这可以使用本领域已知的任何方法通过定点诱变而完成。特别有用的是这一程序：该程序使用已插入了目的基因的超螺旋、双链DNA载体，和两个包含预期突变的合成引物。分别互补于所述载体的两个末端的寡核苷酸引物通过PfuDNA聚合酶在温度循环中延伸。通过加入引物可产生包含交错缺口的突变质粒。温度循环之后，用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理该产物，以消化亲代模板，并筛选出包含突变的合成DNA。本领域已知的其他程序也可以使用。

草酰乙酸水解酶活性的去除或减少

本发明也涉及产生亲代细胞的突变细胞的方法，其中包括破坏或删除本发明的核酸序列或其调控序列，从而导致突变细胞在同样培养条件下，产生比亲代细胞更少的、由该核酸序列编码的、具有草酰乙酸水解酶活性的多肽，以及相应更少的草酸。

构建草酰乙酸水解酶活性和草酸产量均已降低的菌株，可以方便地通过修饰或灭活细胞中表达具有草酰乙酸水解酶活性的多肽所必需的核酸序列而实现。被修饰或灭活的核酸序列可以是，例如，编码该多肽的核酸序列或其显示草酰乙酸水解酶活性所必需的部分，如在以“编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列”为标题的部分描述的本发明的核酸序列，或者该核酸序列可以具有从该核酸序列的编码区表达多肽所需要的调节功能。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足够影响多肽表达的部分。本节进一步描述了可能修饰的其他调控序列。

核酸序列的修饰或灭活可以通过使细胞突变，再选择或筛选草酰乙酸水解酶产生能力减少的细胞来进行。突变可以是特异的或随机的，可以通过例如使用适当的物理或化学诱变剂，使用适当的寡核苷酸，或对该DNA序列进行PCR突变等方法来进行操作。而且，可以任意联合使用这些诱变剂来产生突变。

适于本发明的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，可以按照如下典型操作产生突变，使要致突变的细胞在所选诱变剂的存在下、于适当条件下培养，然后选择呈现减少了草酰乙酸水解酶活性或产量的细胞。草酰乙酸水解酶活性的减少或消除，可以通过使用在下文实施例部分描述的试验而测定。

改变或灭活本发明核酸序列编码多肽的生成，可以通过导入、取代或去除核酸序列中的一个或多个核苷酸而实现，该核酸序列编码所述多肽或其转录或翻译所需要的调节元件。例如，可以插入或去除核苷酸以便导入终止密码子、去除启始密码子、或改变开放阅读框架。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR诱变而实现这种改变或灭活。虽然，原则上，这些修饰可以在体内进行，例如，直接在表达待修饰的核酸序列的细胞上进行，但是，优选在体外进行修饰，如以下示例。

消除或减少特定宿主细胞的产生可根据基因置换(gene replacement)或基因中断(gene interruption)的技术方便地实施。例如，在基因中断方法中，将与内源基因或目的基因片段相应的核酸序列在体外诱变以产生缺陷型核酸序列，然后再将该序列转化进宿主细胞中产生缺陷型基因。通过同源重组，使所述缺陷型核酸序列置换了内源基因或基因片段。优选所述缺陷型基因或基因片段也编码标记物，该标记物可用于选择其中编码多肽的基因已经被改变或破坏了的转化体。

另外，可以使用与该多肽编码序列互补的核苷酸序列、通过现有反义技术来实现核酸序列的修饰或灭活。更特别地，细胞中多肽的产生可以通过导入与编码该多肽的核酸序列互补的核苷酸序列而被减少或消除，所导入序列可以在细胞内转录，并能够与该细胞产生的多肽mRNA杂交。在允许互补反义核苷酸序列与多肽mRNA杂交的条件下，翻译出的多肽的数量因此而减少或消除了。

按照本发明的方法进行修饰的细胞，优选微生物细胞，特别是在上文以“编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列”为标题的部分所列，作为本发明编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的核酸序列的来源的任何物种的细胞。优选，这一细胞是适于产生预期产物如多肽或初级或次级代谢物的真菌细胞株，无论其与原细胞是同源还是不同源。甚至更优选，该细胞是曲霉属，特别是黑曲霉的细胞。

本发明也涉及亲代细胞的突变细胞，其中编码多肽的核酸序列或其调控序列被破坏或缺失，结果导致突变细胞产生比亲代细胞更少的多肽。

所产生的多肽缺陷型突变细胞尤其可作为宿主细胞表达同源和/或异源产物，如同源或异源多肽或初级或次级代谢物。因此，本发明也涉及产生同源或异源产物的方法，包括(a)在有益于该产物产生的条件下培养突变细胞；和(b)回收该产物。

用于培养和纯化目的产物的方法可以按照本领域已知的方法进行，例如在下文以“生产方法”为标题的部分的描述。

本发明生产基本不含草酸的产物的方法尤其有利于初级代谢物的生产，特别是食品级产物，如柠檬酸和三羧酸循环的其他酸，以及同源或异源多肽，特别是真核细胞的多肽。

多肽可以是与突变细胞异源或同源的任何多肽。“多肽”一词在此处不指特定长度的编码产物，因此包括肽、寡肽和蛋白质。“异源多肽”一词在此处定义为，通过DNA重组技术对突变细胞操作产生的，突变细胞的非天然多肽、或经过修饰改变了天然序列的天然蛋白、或表达量改变了的天然蛋白。在所述突变细胞中编码同源或异源多肽的核酸序列有一个或多个拷贝。在优选实施方案中，异源多肽是细胞外分泌的多肽。

优选，要产生的多肽是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。酶可以选自，如，淀粉分解酶、脂解酶、蛋白水解酶、纤维素水解(cellulytic)酶、氧化还原酶、或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、haloperoxidase、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶水解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、谷氨酰胺转移酶、或木聚糖酶。草酰乙酸水解酶缺陷型细胞也可以用于表达药用异源蛋白，如激素、生长因子、受体等。

编码可以在本发明的突变细胞，特别是丝状真菌突变细胞中表达的异源蛋白的核酸序列，可以从任何原核细胞、真核细胞、或其他来源中得到。就本发明而言，此处所用的、与特定来源有关的“从……中得到”一词意味着该多肽是由该来源所产生，或由已插入了来自于该来源的基因的细胞所产生。

在本发明的方法中，突变细胞，特别是突变的丝状真菌细胞，也可以用于多肽或其他产物，如该细胞天然的(或“同源的”)初级或次级代谢物的重组生产。

用于分离或克隆编码异源多肽的核酸序列的技术在本领域内是已知的，包括从基因组DNA中分离，从cDNA制备，或它们的联合应用。从这些基因组DNA中克隆本发明的核酸序列可以使用众所周知的聚合酶链反应(PCR)实现。参见，例如，Innis等，1990，PCR：方法与应用指南(PCR：A Guideto Methods and Application)，学术出版社，纽约。克隆程序可以包括切割和分离含编码多肽的核酸序列的目的核酸片段，将该片段插入到载体分子中，以及将该重组载体掺入突变细胞中，在该突变细胞中，该核酸序列的多个拷贝或克隆将得以复制。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成物、合成物或其任何组合物。

在本发明的方法中，异源多肽也可以包括融合的或杂合的蛋白，其中另一个多肽融合到该多肽或其片段的N端或C端。融合多肽通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合而产生。产生融合多肽的技术在本领域内是已知的，包括连接多肽编码序列以便它们在同一框架内，而且融合蛋白的表达处于同样的启动子和终止子的调控下。杂合多肽可以包括至少来自两个不同多肽的部分或完整多肽序列的联合，这些多肽序列中一个或多个可以与突变细胞异源。

编码异源目的多肽的分离的核酸序列可以通过许多方式操作，从而为该多肽的表达作准备。应该理解，表达包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰，及分泌。不同表达载体可能优选或必需在核酸序列插入载体以前对其进行操作。利用克隆方法修饰核酸序列的技术在本领域内是众所周知的。

“核酸构建体”在此处定义为，从天然存在的基因中分离的、或经修饰而包含以自然界不存在的方式被结合和并列的核酸片段的核酸分子，不论其是单链或双链。当该核酸构建体包含编码序列的表达所需要的所有调控序列时，核酸构建体一词和表达盒一词是同义的。此处定义的“编码序列”一词是指可转录为mRNA并翻译为多肽的序列。编码序列的界线通常由ATG启始密码子和转录终止序列确定，前者紧邻mRNA5’端的开放阅读框架的上游，后者紧邻mRNA 3’端的开放阅读框架的下游。编码序列可以包括，但不限于，基因组、cDNA、RNA、半合成物、合成物、重组体、或其任何联合。此处所描述的核酸构建体的编码序列，可以是编码具有草酰乙酸活性的多肽(如在上文以“编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列”为标题的部分的详细说明)的本发明的核苷酸序列，在这种情况下，核酸构建体可用于产生上述章节所定义的具有草酰乙酸活性的多肽，或用于其他涉及所述核酸序列的操作；或者编码序列可编码本发明突变细胞中产生的异源多肽。

“调控序列”一词在此处定义为，包括对异源多肽的表达是必需或有利的所有元件。每一种调控序列既可以是编码该多肽的核酸序列天然具有的，也可以是外来的。这种调控序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。调控序列最少应包括启动子、以及转录和翻译终止信号。为了导入特异的限制性酶切位点以有助于调控序列和编码异源多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以制备带有接头的调控序列。“可操作的连接”一词在此处定义为这样的构型：其中调控序列被恰当地置于与该DNA序列的编码序列相关的位置，以便该调控序列指导异源多肽的产生。

调控序列可以是适当的启动子序列、核酸序列，它们可以被细胞特别是丝状真菌细胞识别而表达所述核酸序列。启动子序列包括介导异源多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的、及杂合的启动子，而且可以从编码细胞外或细胞内多肽的基因中得到，这些多肽可以与该细胞同源或不同源。

按照本发明的方法、指导核酸构建体在丝状真菌细胞中转录的适当启动子的实例，是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶(amdS)、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(美国专利号4,288,627)的基因中得到的启动子，以及其突变的、截短的和杂合的启动子。特别优选的启动子是NA2-tpi(编码黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)、葡糖淀粉酶、和TAKA淀粉酶的启动子。

调控序列也可以是适当的转录终止序列，即被本文所述的宿主细胞识别以终止转录的序列。该终止序列被可操作地连接到编码异源多肽的核酸序列的3’端。任何在宿主细胞中有功能的终止子都可以在本发明中使用。

优选的在丝状真菌细胞中有功能的终止子是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α葡糖苷酶，以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中得到的。

调控序列可以是适当的前导序列，即mRNA上对细胞的翻译很重要的非翻译区。前导序列被可操作的连接到编码异源多肽的核酸序列的5’端。任何在该细胞中有功能的前导序列都可以在本发明中使用。

优选的前导序列从编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因中得到。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，即该序列被可操作地连接到核酸序列的3’端，而且当转录时，被细胞作为信号识别，从而将聚腺苷酸残基加到转录出的mRNA上。任何在该细胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可以在本发明中使用。

在丝状真菌细胞中有功能的优选聚腺苷酸化序列，是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α葡糖苷酶的基因中得到的。

调控序列也可以是信号肽编码区，其编码与异源多肽的氨基端相连的氨基酸序列，并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径。核酸序列的编码序列的5’端可以天然包含信号肽编码区，该区天然地和编码分泌性多肽的编码区的片段在翻译阅读框架内连接在一起。或者，编码序列的5’端可以包含相对于该编码序列外来的信号肽编码区。在编码序列没有天然包含信号肽编码区的序列中，需要外来信号肽编码区。或者，可以简单地用外来信号肽编码区替代天然信号肽编码区以提高多肽的分泌。信号肽编码区可以从曲霉属的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、或从根毛霉(Rhizomucor)属的脂肪酶或蛋白酶基因中得到。然而，指导表达的异源多肽进入细胞分泌途径的任何信号肽编码区，都可以在本发明中使用。

丝状真菌细胞中的有效信号肽编码区，是从编码米曲霉TATA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和Humicola lanuginosa纤维素酶的基因中得到的信号肽编码区。

调控序列也可以是编码位于多肽氨基端的氨基酸序列的前肽编码区。所得多肽被称为酶原或多肽原。多肽原通常没有活性，可以通过催化或自身催化前肽(propeptide)从多肽原上裂解，转变为成熟的、有活性的多肽。前肽编码区可以从编码米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶的基因中得到(WO 95/33836)。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基端时，前肽区与多肽的氨基端紧邻，而信号肽区和前肽区的氨基端紧邻。

核酸构建体还可以包括一个或多个这样的核酸序列，这些核酸序列编码一个或多个有利于指导异源多肽表达的因子，例如，转录激活因子(如反式作用因子)、侣伴蛋白和加工型蛋白酶。任何在宿主细胞特别是丝状真菌细胞中有作用的因子都可以在本发明中使用。编码一个或多个这些因子的核酸不是必须和编码异源多肽的核酸序列串联。

还优选加入能调节与细胞生长相关的异源多肽表达的调控序列。调控系统的实例包括应答化学或物理刺激(包括在有调控化合物存在的情况下)而导致基因表达的开启或关闭的那些。TAKAα淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子可作为丝状真菌细胞中的调控序列使用。调控序列的其它实例包括允许基因(如借助重金属扩增的金属硫蛋白基因)扩增的那些。在这些情况下，编码异源多肽的核酸序列可与该调控序列可操作连接。

上述各种核酸和调控序列可以连接在一起，以产生重组表达载体，其中可以包含一个或多个便利的限制性内切酶位点，以便在这类位点插入或取代编码异源多肽的核酸序列。或者，通过将编码异源多肽的核酸序列序列或含有该序列的核酸构建体插入到适当的表达载体中，可以使该序列得以表达。在创建表达载体时，使编码序列在载体中可操作地与适当的调控序列连接在一起以表达并很可能分泌。

重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA操作并使编码异源多肽的核酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体和该载体导入的细胞的兼容性。该载体可以是线性或闭合环状质粒。该载体可以是自主复制型载体，即，以染色体外实体的形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒(一种染色体外元件)，微型染色体，或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何工具(means)。或者，载体也可以是这样的：当将其导入细胞后，它整合到基因组中而且随着它所整合的染色体一起复制。载体系统可以是单一载体或质粒或两个或多个载体或质粒(它们共同包含待导入细胞基因组中的全部DNA)，或是转座子。

优选载体包含一个或多个选择性标记，其可以允许容易地筛选转化的细胞。一种选择性标记是这样的基因：其产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型向营养缺陷型的转变，等。在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记可选自，但不限于，amds(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮酶素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤转移酶)(sulfffateadenyltransferase)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，及其等价物。优选用于丝状真菌细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amds和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

优选，载体包含允许该载体稳定整合入细胞基因组、或允许该载体在细胞中不依赖于该细胞的基因组而自主复制的元件。

“导入”意味着将包含核酸序列的载体导入细胞中，这样，该载体就作为染色体的整合体或自我复制的染色体外载体而被保持了。整合通常被认为有利，因为该核酸序列更可能被稳定地保持在这一细胞中。载体整合入染色体中，可以通过同源重组、非同源重组、或转座而发生。

表达载体导入细胞的过程可以包括由原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁以本身已知的方式再生等组成的过程。用于转化曲霉属宿主细胞的适当程序在EP 238 023和Yelton等，1984，美国国家科学院进展81：1470-1474中已有描述。转化镰孢属的适当方法由Malardier等在1989，基因78：147-156或WO 96/00787中进行了描述。

对于载体向细胞基因组的整合，该载体可以依赖编码异源多肽的核酸序列，或使该载体通过同源或非同源重组稳定整合入基因组的该载体的任何其他成分。或者，该载体可以包含指导该载体通过同源重组整合入细胞基因组的附加核酸序列。这些附加的核酸序列能够使该载体在染色体的精确位置整合入基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选包含足够数量的核酸，例如100至1500个碱基对，优选400至1500个碱基对，最优选800至1500个碱基对，它们与其相应的靶序列高度同源以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与细胞基因组中靶序列同源的任何序列。而且，这些整合元件可以是非编码或编码型核酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合入细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能在所述的丝状真菌细胞中自主复制的复制起点。

应该理解，本发明的方法不限于获得突变细胞的特定顺序。对参与具有草酰乙酸水解酶活性之多肽的产生的基因进行的修饰可以在构建产生异源多肽的细胞的任何步骤引入亲代细胞中。优选在导入编码异源多肽的基因前，已经用本发明的方法使细胞成为草酰乙酸水解酶缺陷型。

将此处所述的各元件连接起来以构建重组表达载体的方法是本领域的技术人员所熟知的(参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港，纽约)。

本发明也涉及获得草酰乙酸水解酶缺陷型突变细胞，特别是丝状真菌突变细胞的方法，其包含(a)将包含修饰了至少一个涉及草酰乙酸水解酶产生的基因的第一种核酸序列、以及编码异源多肽的第二种核酸序列导入亲代细胞，特别是亲代丝状真菌细胞；和(b)鉴别步骤(a)中的包含修饰型核酸序列的突变细胞，其中，在同样条件下培养时，该突变细胞产生比该突变细胞的亲代细胞更少的草酰乙酸水解酶。

本发明还涉及能产生异源多肽的草酰乙酸水解酶缺陷型突变细胞特别是丝状真菌细胞，其包含第一和第二种核酸序列，所述第一种序列包含对涉及具有草酰乙酸水解酶活性之多肽的产生的至少一个基因的修饰、所述第二种序列编码异源多肽，其中，在同样条件下培养时，该突变细胞产生比其亲代细胞更少的具有草酰乙酸水解酶的多肽。

在本发明的另一方面，该突变细胞可以另外包含对一个或多个核酸序列的修饰，这些核酸序列编码可能对预期产物如目标异源多肽的产生、回收和/或应用有害的蛋白。这些修饰减少或消除了一个或多个第三种核酸序列的表达，导致带有修饰的第三种核酸序列的突变细胞，当在同样条件下培养时，它们可以比不带有修饰的第三种核酸序列的突变细胞产生更多的异源多肽。第三种核酸序列可以编码任何蛋白或酶。例如，该酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶、和木聚糖酶。第三种核酸序列优选编码蛋白水解酶，如，氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。

另一方面，本发明涉及通过本发明方法产生的、基本没有草酰乙酸水解酶活性的蛋白产物。

本发明也涉及包含SEQ ID NO：1的核酸序列、其亚序列或其同系物的核酸构建体、重组表达载体、以及的宿主细胞(在以“编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列”为标题的部分进行了描述)，以表达该序列。这些构建体和载体可以如本文所述构建。宿主细胞可以是任何适于表达该核酸序列的细胞，特别是任何在以“编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列”为标题的部分作为本发明核酸序列的来源提及的细胞。特别地，该宿主细胞是丝状真菌细胞，例如曲霉属细胞，如黑曲霉或米曲霉，或镰孢属细胞。

真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁以本身已知的方式再生等的过程而被转化。用于转化曲霉属宿主细胞的适当方法在EP 238 023和Yelton等，1984，美国国家科学院进展81：1470-1474中已有描述。用于转化镰孢属细菌的适当方法如Malardier等，1989，基因78：147-156和WO 96/00787所述。酵母转化可如Bercker和Guarente，在Ableson，J.N.和Simon，M.I.编辑的酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法，194卷，182-187页，学术出版公司，纽约；Ito等在1983，细菌学杂志153：163；和Hinnen等在1978，美国国家科学院进展75：1920，所述。

生产方法

本发明也涉及生产本发明核酸序列编码的多肽的方法，其包括(a)在适于产生该多肽的条件下，培养含有本发明核苷酸序列的宿主细胞；和(b)回收该多肽。

本发明也涉及生产本发明的肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞含有在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区有至少一个突变的突变型核酸序列，其中该突变型核酸序列编码由SEQ ID NO：2的1至341位氨基酸组成的多肽；和(b)回收该多肽。

在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法，在适于生产该多肽的营养培养基中培养这些细胞。例如，该细胞可以在实验室或工业发酵罐中，用适当的培养基，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批、或固态发酵)进行培养。使用本领域已知的方法，在含有碳和氮源以及无机盐的适当培养基中进行培养。适当的培养基可以从供应商处得到，或者可以根据已经公布(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)的组成来制备。如果该多肽分泌至营养培养基中，可直接从该培养基回收多肽。如果该多肽未被分泌，可从细胞裂解物回收。

这些多肽可以用本领域已知的、对所述多肽特异的方法来检测。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可以用酶试验测定此处所述的多肽的活性。

产生的多肽可以通过本领域已知的方法进行回收。例如，该多肽可以通过传统程序从培养基中回收，包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥(spray-drying)、蒸发、或沉淀。

该多肽可以通过本领域已知的各种方法进行纯化，包括但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解(difierential solubility)(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见，例如，蛋白纯化，J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH出版社，纽约，1989)。

用途

本发明还涉及利用具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的方法。

本发明的多肽也可以用作诊断用酶，例如，用于检测食品或其他产品中的草酸。

本发明的核苷酸序列也可以用于改变细胞，例如正常产生水解酶的微生物细胞中草酰乙酸水解酶的产生，并因此改变草酸的产生。特别地，这些核苷酸序列可以用于减少或消除所述细胞中草酰乙酸水解酶的产生，并因此减少或消除草酸的产生。

本发明进一步通过以下实例说明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例

用作缓冲液和底物的化学试剂是至少为试剂级的商业产品。

细胞株：

黑曲霉BO1(DSM 12665)

大肠杆菌DH5αD.M.Woodcock等(1989)核酸研究17，3469-3478

培养基和试验

缓冲液A：50mM Tris/HCl pH 7.5，2mM MnCl₂，20mM DTT，5％蔗糖。

草酰乙酸水解酶活性试验：1000ml 0.1mM MOPS，pH 7.5，2mMMnCl₂，25ml 40mM草酰乙酸，5至100ml样品。在255nm处测量吸收值。从草酰乙酸的吸光度和吸收系数的减小速度来测量其活性(1.1mM^-1cm^-1，Lenz等，黑曲霉中草酰乙酸酶的部分纯化和一些性质，1976，欧洲生物化学杂志，65：225-236)。该试验在30℃进行。

蛋白试验：用BioRad(Hercules，CA，美国)的BioRad Protein Assay(批号：500-0006)，按照生产厂商介绍，并用牛血清白蛋白作标准，测定蛋白浓度。

实施例1

草酰乙酸水解酶(EC 3.7.1.1)的纯化

黑曲霉BO1于30℃在摇瓶中发酵，其中培养基为：蔗糖20g/L，NaNO₃15g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O 1g/L，NaCl 1g/L，CaCl₂.2 H₂O 0.1g/L，痕量溶液0.5ml/L。痕量缓冲液：ZnSO₄.7H₂O 14.3g/L，CuSO₄.5H₂O 2.5g/L，NiCl₂.6H₂O 0.5g/L，FeSO₄.7H₂O 13.8g/L，MnCl₂ 6g/L。其pH值为2.5，直到生物量浓度达到大约0.5 g/L。然后通过加入2M NaOH使pH值变为6，这些细胞生长直到生物量浓度达到大约5g/L。通过过滤收集这些细胞，并用0.9％(w/v)的NaCl洗涤，然后在液氮中冷冻。在液氮存在下，在研钵中使这些冷冻细胞破裂，然后悬于缓冲液A中。离心悬浮液(15分钟，40.000×g，4℃)，分离上清夜。加入硫酸铵直到为45％饱和度(277g/L)，离心形成的悬浮液(15分钟，40.000×g，4℃)，弃掉上清。使沉淀溶于缓冲液A中，并通过0.45μm的滤膜过滤。

在该样品中加入硫酸铵，直到导电率为50mS/cm。然后，按照生产厂商介绍，将该样品加到已用溶于缓冲液A的0.5M硫酸铵平衡了的苯琼脂糖凝胶高效(Phenyl Sepharose High Performance)柱(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala)上。用同样的缓冲液洗涤柱子，然后用从0.5M溶于缓冲液A的硫酸铵到纯缓冲液A的线性盐梯度进行洗脱。

合并具有草酰乙酸水解酶活性的部分。用2mM MnCl₂、20mM DTT、5％蔗糖稀释该溶液，直到导电率为4mS/cm，然后，将其应用于经缓冲液A平衡的Q琼脂糖凝胶高效柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)。用缓冲液A洗涤该柱，然后用溶于缓冲液A的0M到0.5M NaCl的线性梯度溶液进行洗脱。合并具有草酰乙酸水解酶活性的部分。

将该样品上样至已用10mM pH 7.2的NaH₂PO₄、0.1mM MnCl₂、5％蔗糖、10mM DTT平衡了的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)，并用同样的缓冲液洗脱。将该样品上样至已用10mM pH 7.2的NaH₂PO₄、0.1mM MnCl₂、5％蔗糖、10mM DTT平衡了的Econo-Pac HTP柱(BioRad，Hercules，CA，美国)。用10mM pH 6.8的NaH₂PO₄、0.1mMMnCl₂、5％蔗糖、10mM DTT洗涤该柱，然后用从10mM pH 6.8的NaH₂PO₄、0.1mM MnCl₂、5％蔗糖、10mM DTT到400mM pH 6.8的NaH₂PO₄、0.1mMMnCl₂、5％蔗糖、10mM DTT的线性梯度溶液进行洗脱。对具有草酰乙酸水解酶活性的样品实施SDS-PAGE。

实施例2

草酰乙酸水解酶片段的蛋白序列的测定

用标准方法，对实施例1的纯化草酰乙酸水解酶在12.5％的凝胶上进行SDS-PAGE电泳(Laemmli，U.K.1970.T4噬菌体头部装配中结构蛋白的切割，自然，227：680-685)。通过电印迹，将该蛋白印迹到PVDF膜上，按Plough等描述的方法，用考马斯亮蓝R-250对该膜进行染色(Plough M，Jensen AL和Barkholt V.1989：生物化学年鉴(Anal Biochem)181，33-39)。将在38至40 KD的明显分子量范围内的4条蛋白带切割下来，使用PerkinElmer-Applied Biosystems，Norwalk，CT，美国，的Procise-494蛋白测序仪，按照生产厂商的介绍，对这些蛋白进行氨基端测序。得到下列序列：

1. MKVDTPDSASTISMTN(SEQ ID NO：3)

2. TNTITITVEQDGIYE(SEQ ID NO：4)

3. VEQDGIYEIN(SEQ ID NO：5)

4. GARQEPVVNLNMVTG(SEQ ID NO：6)

实施例3

编码草酰乙酸水解酶的基因的克隆

将在实施例2中测定的蛋白序列用于数据库检索，检索到黑曲霉EST序列(EMBL，T82752，AN752)。该EST编码与实施例2的四条序列排列对比呈100％一致性的蛋白序列。用该EST序列设计下列PCR引物：

草酸EST有义链：5’ AAA GTT GAT ACC CCC GAT TCT 3’ (SEQ IDNO：7)

草酸EST反义链：5’ ATG GCA ATA CGG GGA CAG ACC 3’ (SEQID NO：8)

使用Perkin Elmer(Norwalk，CT，美国)的Amplitaq taq聚合酶，按照生产厂商的介绍，用这些引物从基本按照Leach等描述的方法(J.Leach，D.B.Finkelstein和J.A.Rambosek(1986)，Fungal gent.Newsl.，33，32-33)制备的黑曲霉BOl中扩增DNA。以10μl的体积，在MJ PCT 150毛细PCR循环仪(MJ research，Watertown，美国)中进行PCR反应，以94℃的变性温度10秒，55℃的退火温度10秒，72℃的延伸温度30秒，从变性到退火的温度梯度为-0.5℃/秒，运行30个循环。

按照生产厂商的介绍，将获得的219bp的片段连接入pCR II载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)中，并按Sambrook描述的方法(J.Sambrook等，(1989)分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港出版社)将其转化入大肠杆菌DH5α中。用下列引物测定包含预期大小插入片段的克隆的序列：

M13反向引物：5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’ (SEQ ID NO：9)

M13正向(-20)引物：5’ GTA AAA CGA CGG CCA G 3’ (SEQ IDNO：9)

使用ABI PRISM 377 DNA测序仪和ABI PRISM BigDye终止子循环测序快速反应试剂盒(Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(PerkinElmer Applied Biosystems，Foster city，CA，美国)，按照生产厂家的介绍，进行DNA序列分析。测序证实该片段为所需序列。

用该219bp的插入片段作为探针，按照Sambrook等的方案，通过Southem印迹分析，建立限制性酶切图谱。从该限制图谱可以推断出该基因位于一个5kb的BglII片段上。

然后，通过反向PCR克隆该基因：用Bgl II消化黑曲霉BO 1的基因组DNA，从琼脂糖凝胶中回收4kb至6kb的片段。使用T4 DNA连接酶在16℃将该DNA连接起来。将该连接混合物作为使用下列引物的PCR反应的模板：

OXEST1 5’ GAC GGT CTG TCG CCG TAT TGC 3’ (SEQ ID NO：11)

OXEST2 5’ GGA AGC AGA ATC GGG GGT ATC 3’ (SEQ ID NO：12)

用Expand高保真聚合酶(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)按照生产厂家介绍进行扩增。反应中MgCl₂的浓度为1mM。其他条件同上。产生了一个5kb的片段。用BglII消化该片段，并将该消化后的片段连接到用BamH I和Hinc II消化过的pUC 19(C.Yanisch-Perron等(1985)基因33，103-119)上。将该连接混合物转化入大肠杆菌DH 5α中。得到含有1.3kb和3.7kb大小的插入片段的菌落。使用M13反向引物和M13正向(-20)引物，对每一种的一个菌落进行测序。通过这种方法，测定了Bgl II相邻序列，设计下列用于PCR的引物以扩增该5kb的BglII片段：

侧序1：5’ GCG GCC GCG CGC CAA TAA CGT CCG ATT C 3’(SEQ ID NO：13)

侧序2：5’ GCG GCC GCC TAC AAA TAC ATT GAC CTC CC 3’(SEQ ID NO：14)

使用与反向PCR相同的条件，用这些引物扩增黑曲霉BO1的基因组DNA。将产生的5kb片段连接到pCR II中构成pHP I。用pHPI作模板，以下列序列为引物，测定草酰乙酸水解酶基因的序列：

Oxalac EST有义链：5’ AAA GTT GAT ACC CCC GAT TCT 3’(SEQID NO：15)

Oxalac EST反义链：5’ATG GCA ATA CGG CGA CAG ACC 3’(SEQID NO：16)

OXEST 1：5’ GAC GGT CTG TCG CCG TAT TGC 3’(SEQ ID NO：17)OXEST 2： 5′ GGA AGC AGA ATC GGG GGT ATC 3′ (SEQ IDNO：18)OXEST 3： 5′ GCC GGA GTC GCG GGA TTC CAC 3′ (SEQ IDNO：19)OX EST 4： 5′ GGC GGA CTA TGA TTT GTG CC 3′ (SEQ IDNO：20)OX5： 5′ TGA TGG TCG CCC GTT CCG TT 3′ (SEQ IDNO：21)OX6： 5′ TGC CAT TCA ATT TTC TTG GCC 3′ (SEQ IDNO：22)OX7： 5′ TGA TCT TCG ATG TGG AAT CCC 3′ (SEQ IDNO：23)OX8： 5′ GAT GGC GTC GAT TGA CCA TTT 3′ (SEQ IDNO：24OX9： 5′ GGA GAT GGG TTT GCT AAT GGT GTT 3′(SEQID NO：25)OX10： 5′ TTA GCA AAC CCA TCT CCA CC 3′ (SEQ IDNO：26)OX11： 5′ CGA ATT ACT GGT CAT TAG CCC 3′ (SEQ IDNO：27)OX12： 5′ CGA GAG AAG TAT TCT AGA CCC 3′ (SEQ IDNO：28)OX13： 5′ TGA CTG TCG ATC AGG GTG TT 3′ (SEQ IDNO：29)OX14： 5′ GTG TGC GGA TTG ATG GAC TC 3′ (SEQ IDNO：30)OX15： 5′ CAA CCC AAC TCA ACA ACT CT 3′ (SEQ IDNO：31)FLANKE1： 5′ GCG GCC GCG CGC CAA TAA CGT CCG ATT C 3′(SEQ ID NO： 32)FLANKE2： 5′ GCG GCC GCC TAC AAA TAC ATT GAC CTC CC3′(SEQ ID NO：33)

该DNA序列示于SEQ ID NO：1中。用计算机软件Netgene 2分析该序列的编码序列并分析内含子的存在(S.M.Hebsgaard，P.G.Koming，N.Tolstrup，J.Engelbrecht，P. Rouze，S.Brunak(1996，核酸研究24：3439-3452)，表明存在3个外显子(参见SEQ ID NO：1的注释))。从这3个内含子推断出的341个残基的蛋白序列示于SEQ ID NO：2中。

用该蛋白序列(oah)作为查询序列搜索数据库，表明该序列与构巢曲霉(Swiss prot P28298)和粗糙链孢霉(Swiss prot P28299)的异柠檬酸盐裂合酶(Isocitrate lyase)以及吸水链霉菌的羧乙烯基-羧基膦酸酯磷酰基变位酶(carboxyvinyl-carboxyphosphonate phosphorylmutase)(Swiss prot P11435)和枯草芽孢杆菌的假拟(hypothetical)蛋白(Swiss prot P54528)同源。

oah P28298 P28299 P11435 P54528oah 100.0 20.2 21.0 29.7 29.1P28298 20.2 100.0 74.3 17.6 19.3P28299 21.0 74.3 100.0 18.1 18.6P11435 29.7 17.6 18.1 100.0 36.5P54528 29.1 19.3 18.6 36.5 100.0

将含有质粒pHP1的大肠杆菌菌株送交保藏，名为DSM 12660。

实施例4

草酰乙酸水解酶基因的破坏

用Nru I和BstE II消化pHP I，分离6.6kb的片段。用Nco I消化含有黑曲霉pyrG基因的质粒pJRoy 10(图1)，并用DNA聚合酶I的Klenow片段补平其5’凹端，然后用BstE II消化。分离2948 bp的片段，并与pHP I片段连接。将该连接混合物转化大肠杆菌DH5α。鉴定含有预期质粒的菌落，并将该质粒称为pHP 3(图2)。将含有质粒pHP3的大肠杆菌菌株送交保藏，名为DSM 12661。

用欧洲专利EP 0 531 372 B1中描述的方法，用pHP3中5kb的EcoR I-Not I片段转化PyrG缺陷型黑曲霉BO 1的衍生物JRoy3(通过用pyrG基因区的缺失片段转化并在FOA上筛选，使BO1成为pyrG阴性)。将275个转化体重新分离两次，然后于34℃、pH 6.0在96孔微滴板中生长48小时，其中培养基为葡萄糖20g/L，NaNO₃ 15g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O1g/L，NaCl 1g/L，CaCl₂.2 H₂O 0.1g/L，痕量溶液0.5ml/L。痕量溶液：ZnSO₄.7H₂O 14.3g/L，CuSO₄.5H₂O 2.5g/L，NiCl₂.6H₂O 0.5g/L，FeSO₄.7H₂O13.8g/L，MnCl₂ 6g/L。用Sigma(St.Louis，MO，美国)草酸(批号591-C)试剂盒分析上清液中的草酸。得到8个不产生草酸的转化体。将这其中6个进行Southem印迹分析，并同时用2个产生草酸的转化体BO1和JRoy3作为阳性对照。用在实施例3中描述的219bp的EST PCR片段作为探针。对另一份同类样品，用pJRoy 10的Nco I-BstE II片段作探针，进行不同的印迹分析。Southern印迹表明，这6个草酸阴性菌株的草酰乙酸基因被破坏了，而那些阳性对照则含有完整的草酰乙酸基因。

实施例5

草酸阴性菌株的发酵

使其中一株草酸阴性菌株在能摇动、温度控制、pH控制和通气的分批发酵罐中生长。培养基为葡萄糖16g/L，(NH₄)₂SO₄ 7.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O 1g/L，NaCl 1g/L，CaCl₂.2 H₂O 0.1g/L，痕量溶液0.5ml/L。痕量溶液：ZnSO₄.7H₂O 14.3g/L，CuSO₄.5H₂O 2.Sg/L，NiCl₂.6H₂O 0.5g/L，FeSO₄.7H₂O 13.8g/L，MnCl₂ 6g/L。其pH值为2.5，直到生物量达到0.5g/L的浓度。这时，使该pH值变为6.0。分析发酵液中的草酸、柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、乙酸、甘油、乙醇和葡萄糖(Nissen，T.L，U.Schulze，J.Nielsen，和J.Villadsen，1997，酿酒酵母在厌氧、限量葡萄糖连续培养中的流动分布，微生物学，143：203-218)。副产品中，只能检测到柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸和甘油，这些副产品的最大浓度分别为0.74g/L，0.18g/L，0.14g/L和0.13g/L。基于葡萄糖的生物量产量为0.58g/g，比生产速率为0.23h^-1。

生物材料的保藏

根据布达佩斯条约的规定将以下生物材料保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心，并得到以下保藏号：保藏人所指定的编号保藏号保藏日NN049454 DSM 12660 1999-02-03NN049455 DSM 12661 1999-02-03NN049047 DSM 12665 1999-02-03

菌株保藏条件是，确保在本专利申请等待专利及商标委员会的委员根据37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122而授予专利期间，公众能得到所述培养物。该培养物为所保藏菌株的基本纯培养物。在提交了本主题申请的副本或其后续申请的国家中，根据国外专利法的需要，也可以得到本保藏物。但应该理解，提供本保藏物并不意味着因此得到实施本主题发明的许可而损害政府授予的专利权。

本文所述和所要求的发明不限于本文所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在举例说明本发明的几个方面。任何等价的实施方案均可包括在本发明的范围内。事实上，除了本文所示和所述的以外，本领域技术人员可根据上述说明很容易地对本发明进行各种修饰。这些修饰也包含在所附权利要求的范围内。冲突将由包含定义的本公开文本控制。

本文引用了各种参考文献，其公开内容均全文引入作为参考。

Claims

1.编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的分离的核酸序列，其选自：

(a)编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的核酸序列，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1至341位氨基酸至少有65％的同源性；

(b)核酸序列，其与由SEQ ID NO：1的1157-1411、1504-1651和1764-2383位核苷酸构成的核苷酸序列至少有65％的同源性；

(c)核酸序列，其在中等严格的条件下，与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；

(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的亚序列，其中该亚序列编码具有草酰乙酸水解酶活性的多肽片段；

2.权利要求1的核酸序列，其编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。

3.权利要求1的核酸序列，其与SEQ ID NO：1的核酸序列至少有65％的同源性。

4.权利要求1的核酸序列，其含有SEQ ID NO：1的核酸序列。

5.权利要求1的核酸序列，其包含于质粒pHP 1中，后者又包含于大肠杆菌DSM12660中。

6.分离的核酸序列，其产生方法包括(a)在中等严格的条件下，使DNA与(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；和(b)分离该核酸序列。

7.核酸构建体，其包括与一个或多个调控序列相连接的权利要求1至6中任一项的核酸序列，其中这些调控序列指导该多肽在适当表达宿主中的产生。

8.重组表达载体，其包括权利要求7的核酸构建体、启动子、和转录及翻译终止信号。

9.重组宿主细胞，其包含权利要求7的核酸构建体。

10.产生具有草酰乙酸水解酶活性的多肽的方法，其包括(a)在适于该多肽产生的条件下培养权利要求9的宿主细胞；和(b)回收该多肽。

11.产生突变细胞的方法，其包括使权利要求1至6中任一项的核酸序列或其调控序列被破坏或缺失，从而产生比该细胞更少的草酰乙酸水解酶的突变细胞。

12.权利要求11的方法，其包括：

(a)将包含产生草酰乙酸水解酶的至少一个基因的修饰的核酸序列导入亲代细胞，特别是亲代丝状真菌细胞中；和

(b)鉴定步骤(a)得到的突变细胞，其中在同样条件下培养时，该突变体产生比其亲代细胞更少的草酰乙酸水解酶。

13.通过权利要求11或12的方法产生的突变细胞。

14.根据权利要求13的突变体，其为丝状真菌细胞。

15.根据权利要求14的突变体，其为曲霉属如黑曲霉，支顶孢属，短柄霉属，隐球菌属，Filibasidium，镰孢属，赤霉属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉菌，毁丝霉属，漆斑菌属，Neocallimastix，链孢霉属，拟青霉属，青霉属，Piromyces，裂褶菌属，踝节菌属，热子囊菌属，草根霉属，Tolypocladium，或木霉属菌株的细胞。

16.根据权利要求11至15中任一项的突变体，其中在同样条件下培养时，该突变细胞产生比其亲代细胞至少少大约25％的草酰乙酸水解酶或草酸。

17.权利要求16的突变体，其中该突变细胞不产生草酰乙酸水解酶或草酸。

18.权利要求11至17中任一项的突变体，其中该突变细胞进一步包括一个或多个第三种核酸序列的一个或多个修饰，其中该修饰减少或消除了所述一个或多个第三种核酸序列的表达。

19.权利要求18的突变体，其中所述第三种核酸序列编码一种酶，该酶选自：氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶、和木聚糖酶。

20.权利要求11至19中任一项的突变体，其中该突变细胞进一步包含一个或多个蛋白酶编码基因的修饰。

21.产生同源产物的方法，其包括(a)在有益于产生该产物的条件下，培养权利要求11至20中任一项的突变体，和(b)回收该产物。

22.根据权利要求21的方法，其中该同源产物是柠檬酸。

23.权利要求11至20中任一项的突变体，其进一步包含编码异源多肽的核酸序列。

24.产生异源多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养权利要求23的突变体；和(b)回收该多肽。

25.根据权利要求24的方法，其中该异源多肽是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。

26.权利要求25的方法，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶，优选为氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶、或木聚糖酶。

27.将权利要求1至6中任一项的核酸序列编码的草酰乙酸水解酶作为诊断用酶的用途。

28.大肠杆菌DSM 12660或DSM 12661的基本纯的培养物。