CN1230986A - 新的宿主细胞和生产蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的宿主细胞和生产蛋白质的方法。具体地说,本发明涉及用于表达异源蛋白质的宿主细胞,其中宿主细胞已受到遗传修饰,从而表达显著降低水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶。再者,本发明涉及生产异源蛋白质的一种方法,该方法包括在适当的生长培养基中培养该宿主细胞,然后回收所要的蛋白质。

Description

新的宿主细胞和生产蛋白质的方法

发明领域

本发明涉及新的真菌宿主细胞和生产蛋白质的方法。更具体地说，本发明涉及适用于表达异源蛋白质的宿主细胞，其中宿主细胞已经过遗传修饰，从而可表达显著降低水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶。再者，本发明涉及使用本发明的真菌以高产率生产感兴趣的蛋白质的方法，其中所说的方法包括在适当的生长培养基中培养宿主细胞，然后回收所需的蛋白质。本发明还包括生产这样的真菌和将用于这些方法中的DNA构建体的方法。

发明背景

近年来，使用重组宿主细胞表达异源蛋白质已大大简化了大量生产以前只能从其天然来源纯化的有商业价值之蛋白质的手段。目前，已有多种不同的可供选择的表达系统可用于生产任何给定的蛋白质，其中包括真细菌宿主和真核细胞宿主。对适当表达系统的选择常常不只取决于宿主细胞以足够产率产生活性蛋白质的能力，而且还在很大程度上决定于蛋白质的预期使用目的。

常常遇到的一个问题是某些宿主细胞产生或培养基中存在有高水平的蛋白水解酶。已提示有可能使宿主生物体丧失产生特异性蛋白水解化合物的能力。例如，国际专利申请WO90/00192(Genencor)描述了不能分泌具有酶促活性的天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主，并且EP574347(CibaGeigy AG)也描述了枯草杆菌蛋白酶型丝氨酸蛋白酶有缺陷的曲霉属宿主。

已从许多真核细胞来源中分离出了金属蛋白酶。也已报导从曲霉属菌株中分离出了中性金属蛋白酶，即在中性pH时有最佳活性的金属蛋白酶。已在一系列研究中报导了从酱油曲霉(Aspergillus Soiae)分离出的二种中性金属蛋白酶NpⅠ和NpⅡ的物理化学性质(Sekine,H.1972，农业生物化学，36:198-206,207-216；Sekine,H.1972，农业生物化学，36:2143；h 2156)。已显示NpⅠ而不是NpⅡ的酶学和物理化学特征相似于Bacillus thermoproteolyticus产生出嗜热菌蛋白酶的性质。最近公开了得自米曲霉的中性金属蛋白酶NpⅡ的cDNA序列(Tatsumi H，等人，1991，分子普通遗传学，228:97-103)。但还没有公开属于米曲霉NpⅠ组的中性金属蛋白酶的cDNA序列。

碱性蛋白酶是有碱性最佳pH的丝氨酸蛋白酶(Nakagawa，Y.1970，酶学方法，19:581-591)。其为枯草杆菌蛋白酶的同系物，并且是米曲霉的主要细胞外碱性内肽酶。已分离了该基因并进行了性质鉴定(Murakami，等人，1991，农业生物化学，55:2807-2811)。另外两种曲霉，即黄曲霉和酱油曲霉则产生相同或密切相关酶。

迄今仍无金属蛋白酶和碱性蛋白酶在降低从曲霉中得到的蛋白质产物的稳定性中具有潜在作用这方面的报导。

发明概要

根据本发明，已发现中性金属蛋白酶Ⅰ和碱性蛋白酶，无论是单独或联合使用，其蛋白水解活性均可显著地降低由细胞产生的目的蛋白质产物的稳定性，导致所说蛋白质的产率降低。

因此，本发明提供了可用于表达异源蛋白质产物的宿主细胞，其中细胞已经过遗传修饰，从而与亲代细胞相比，其可表达显著低水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶。

另一个方面，本发明提供了在本发明的宿主细胞中生产异源蛋白质产物的方法，其中所说的方法包括在宿主细胞内导入编码该蛋白质的核酸序列，在适当的生长培养基中培养该宿主细胞，并回收异源蛋白质产物。

按照本发明的方法，由中性金属蛋白酶Ⅰ和碱性蛋白酶产生的蛋白水解活性显著降低，从而改善以该方法产生的蛋白质的稳定性和产率。另外，按本发明的方法得到的蛋白质可以是前体蛋白质，如酶原、杂合蛋白质，以前序列或前原序列或任何其他未成熟形式得到的蛋白质。

附图的简要说明

参考下列附图进一步举例描述本发明，其中：

图1是图解说明携带pyrG基因的质粒pJaL335的构建；

图2显示携带pyrG基因之5′和3′序列的质粒pSO5的构建；

图3显示其中pyrG编码序列已插入到alp基因的5′和3序列之间的质粒pJaL212的构建；

图4说明了其中NpⅠ编码序列已被破坏的质粒pJaL399的构建；

图5显示Candida antarctica脂酶B的N末端氨基酸序列，和由该序列衍生的两个寡核苷酸引物的序列；

图6图解说明携带C.antarctica脂酶B基因的质粒pMT1305的构建；

图7图解显示携带C.antarctica脂酶B基因5′末端部分序列的质粒pMT1329的构建；

图8图解显示携带C.antarctica脂酶B基因的质粒pMT1332的构建；

图9图解显示携带C.antarctica脂酶B基因的表达质粒pMT1335的构建。

发明的详细描述宿主细胞

本发明提供了可用于表达异源蛋白质的宿主细胞，其中细胞已受到遗传修饰，从而与亲代细胞相比，其可表达显著降低水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性。所说的宿主细胞衍生于可能是野生型细胞的亲代细胞。

本发明的宿主细胞可以是任何常规用于异源表达蛋白质的宿主细胞。

本发明的宿主细胞较好是能够产生所需蛋白质的酵母或丝状真菌。具体地说，酵母细胞可以是酵母菌株，优选酿酒酵母。具体地说，丝状真菌可以是选自枝顶孢属、曲霉属、假丝酵母属、旋孢腔菌属、内座壳属、镰孢霉属、腐质霉属、脉孢菌属、Rhizomucor、根霉属、Thermomyces、木霉属、柄孢壳属、Pyricularia和青霉属的菌株。

在一优选实施方案中，丝状真菌是选自构巢曲霉、泡盛曲霉、海枣曲霉、日本曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetus)、禾本科镰孢、尖镰孢、腐皮镰孢、Fusarium veienatum、灰腐质霉、粗糙脉孢菌、产黄青霉、Rhizomucor meihei、Trichoderma reesei和绿色木霉；特别是米曲霉、黑曲霉以及与ATCC20334有相同特征的镰孢霉。金属蛋白酶

在本发明的说明书中，金属蛋白酶是含有参与水解底物之肽骨架的催化活性锌金属中心的蛋白水解酶。该活性锌中心使这些蛋白酶区别于钙蛋白酶，后者的活性依赖于钙的存在。通过用1mM 1,10-菲咯啉除去锌中心后可逆地丧失蛋白水解活性，并在用Zn²⁺(0.1-100mM)滴定后恢复这一活性可以证实某种蛋白酶为金属蛋白酶。

在一优选的实施方案中，本发明预期的金属蛋白酶是镰孢霉金属蛋白酶，特别是尖镰孢金属蛋白酶。在一最优选的实施方案中，金属蛋白酶是具有SEQ.ID.No.1中所示核苷酸序列或与其同源的序列的尖镰孢p45金属蛋白酶(p45)。

在另一个优选实施方案中，本发明的金属蛋白酶是在中性pH范围内，即大约pH6-8范围内，较好在大约pH6.5-7.5，最好在大约pH7具有最佳蛋白水解活性的中性金属蛋白酶。更具体地说，本发明的金属蛋白酶是选自NpⅠ或NpⅡ组的曲霉属中性金属蛋白酶(Tatsumi，等人，1991，出处同前)。

在一优选实施方案中，金属蛋白酶是包含由SEQ.ID.No.2所示核苷酸序列或与其同源的一个序列衍生的氨基酸序列的米曲霉中性金属蛋白酶Ⅰ(NpⅠ)。碱性蛋白酶

在本发明的说明书中，碱性蛋白酶是在中性至碱性pH范围内有峰值活性的丝氨酸蛋白酶。对碱性蛋白酶的氨基酸序列分析表明其同源于枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的枯草菌酶(subtilase)亚组。如Siezen等人(1991，蛋白质工程，4:719-737)所总结的，已从包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在内的各种细菌到真菌及酵母，以至包括蠕虫、昆虫、植物和哺乳动物在内的高等真核生物中鉴定出了50种以上枯草茵酶。已确定了40种以上枯草菌酶的氨基酸序列，并揭示酶成熟区域长度为268至1775个氨基酸，并在N末端附近有含27至280个氨基酸的一个前原区域。在真菌和酵母中，变异明显较小，真菌中相应范围为279至281和105至121，酵母中相应范围为297到677和126至280。克隆并在酿酒酵母中表达了源于米曲霉的碱性蛋白酶之整个编码区的cDNA片段(Tatsumi,H.等人，1989，分子普通遗传学，219:33-38)。一级结构与其他已测序的枯草杆菌蛋白酶显示有29％至40％同源性，并且活性位点中的三个残基，即枯草杆菌蛋白酶BPN′中的Asp32、His64和Ser221是保守的。

在一优选实施方案中，碱性蛋白酶是米曲霉碱性蛋白酶(apl)，优选该蛋白酶由包含SEQ.ID.No.3所示核苷酸序列或与其同源的序列的cDNA序列所编码。序列同源性

本文使用的术语“DNA序列同源性”是指由第二序列衍生第一序列的两个序列间的同一性程度。可借助本领域熟知的计算机程序，如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package,Version8,1994年8月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison WI,USA；Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,1970，分子生物学杂志，48:443-453)中提供的GAP适当地确定同源性。使用下列GAP设置进行DNA序列比较：新增罚分5.0和延伸罚分0.3，类似DNA序列的编码区与所指出的DNA序列的编码区表现相同性程度至少为70％，较好至少80％，更好至少90％，还要更好是至少95％，最好是至少97％。

氨基酸序列同源性在本文中同样是指从第二序列衍生第一序列的两条序列间的同一性程度。可借助本领域熟知的计算机程序，如上文提到的(Needlman,S.B.和Wunsch,C.D.,1970，出处同前)GAP适当地确定同源性。使用有下述设置的GAP进行氨基酸序列比较：新增罚分3.0和延伸罚分0.1，由类似DNA序列编码的多肽与由包括结构蛋白质编码区的DNA序列编码的多肽表现有至少70％，较好至少80％，更好至少90％，还要更好是至少95％，最好是至少97％的同一性程度。

本发明还涉及金属蛋白酶和碱性蛋白酶的变体，与具有衍生于SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的氨基酸序列的成熟多肽相比，这些变体有不超过三个氨基酸，较好不超过二个氨基酸，最好不超过一个氨基酸的氨基酸序列差异。

本文所使用的术语“杂交”是指类似DNA序列与相应于由所指出的包含结构蛋白质编码区的DNA序列编码之多肽的寡核苷酸探针，在如下文详述的条件下结合。

确定核苷酸探针和同源性DNA或RNA序列之间杂交的适当条件包括，将含有待杂交的DNA片段或RNA的滤膜在5XSSC(标准柠檬酸盐缓冲液；参见Sambrook等人，1989，分子克隆，Cold Spring Harbor,NY,USA)预浸渍10分钟，并在5XSSC、5XDenhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理的鲑鱼精子DNA的溶液(Sambrook等人，1989，出处同前)中使滤膜预杂交，然后在含有随机引发的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.1983，生物化学分析，132:6-13)、³²p-dCTP标记的(比活性＞1×10⁹cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。然后于至少55℃(低严紧性)，较好至少60℃(中度严紧性)、更好至少65℃(中/高度严紧性)，最好至少70℃(高严紧性)，特别是至少75℃(很高严紧性)的温度下在2XSSC,0.5％SDS中将滤膜洗两次30分钟。将滤膜对X光胶片曝光以检测在这些条件下寡核苷酸探针与之杂交的分子。宿主细胞的遗传修饰

为了使本发明的宿主细胞表达显著降低水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性，可使用本领域技术人员已知的标准的重组DNA技术完成对宿主细胞的遗传修饰。可失活或者部分或完全消除分别负责金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性产生的基因序列。从而，使本发明的宿主细胞表达降低了的或不可检测水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶，或表达功能上失活的金属蛋白酶和碱性蛋白酶。

在一特定实施方案中，修饰感兴趣的金属蛋白酶和碱性蛋白酶基因内编码的各个结构或调节区域，以造成所说的失活。已知和有用的技术包括但不只限于特异性或随机诱变、PCR造成的诱变、位点特异性DNA缺失、插入和/或取代、基因破坏或基因置换、反义技术或这些技术的组合。

可使用适当的物理或化学诱变剂完成诱变。适于本发明目的的物理或化学诱变剂包括但不只限于紫外光(UV)照射、羟基胺、N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟基胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸氢钠、甲酸及核苷酸类似物。当使用这些试剂时，一般在适当条件下和选用的诱变剂存在下保温待诱变的细胞，并选择显著地降低了NpⅠ和alp产生量的细胞，以完成诱变。

也可以在转录或翻译结构序列所需的结构序列或调节元件中导入，取代或除去一个或多个核苷酸以完成修饰。例如，可插入或除去核苷酸从而导入终止密码子、除去起始密码子或改变结构序列的开放阅读框。可按本领域已知的方法，通过位点特异性诱变或PCR引起的诱变而修饰或失活结构序列或其调节元件。虽然原则上可在体内，即直接对表达金属蛋白酶和碱性蛋白酶基因的细胞进行修饰，但目前最好按下文举例说明的方法进行体外修饰。

在选定的宿主细胞中失活或降低金属蛋白酶和碱性蛋白酶产生量的便利方法是基于基因断裂技术。在该方法中，体外诱变相当于感兴趣的内源基因或基因片段的DNA序列。因此所述DNA序列编码有缺陷的基因，该基因然后被转化到宿主细胞中。通过同源重组，有缺陷的基因置换了内源基因或基因片段。可望使用也编码选择性标记的缺陷性基因或基因片段来选择其中编码金属蛋白酶和/或碱性蛋白酶的相应基因已被修饰或破坏的转化体。

Miller等人(1985，分子细胞生物学，5:1714-1721)、WO90/00192、May,G(1992，丝状真菌应用分子遗传学，J.R.Kinghorn和G.Turner编，Blackie Academic and Professional,pp.1-25)和Turner,G.(1994，用于基因操作的载体，S.D.Martinelli和J.R.Kinghorn,编，Elsevier,pp.641-665)特别描述了删除或破坏目的基因的方法。

另外，也可以使用与金属蛋白酶编码序列，如SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序列，或碱性蛋白酶编码序列，如SEQ.ID.No.4中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，通过已建立的反义技术修饰或失活DNA序列。美国专利No.5,190,931(纽约大学)中详细描述了反义技术和其应用。

因此，由于对本发明的宿主细胞的遗传修饰，使之大大降低了对金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性的表达水平。在一优选实施方案中，由宿主细胞表达的这些蛋白水解活性的水平各自地降低约50％以上，优选约85％以上，更优选约90％以上，并且最优选大约95％以上。在另一个优选实施方案中，本发明的宿主细胞中这些蛋白水解活性可按任何组合方式降低。在一个最优选的实施方案中，由宿主细胞表达的产物基本上没有由于金属蛋白酶和碱性蛋白酶导致的蛋白水解活性。生产蛋白质的方法

借助本发明的方法，使金属蛋白酶和碱性蛋白酶的蛋白水解活性显著降低，从而改善由本发明的宿主细胞合成的敏感性蛋白质产物的稳定性并增加其产率。更具体地说，借助本发明的方法，可在金属蛋白酶和碱性蛋白酶基因内编码的结构和/或调节区中，对宿主细胞进行遗传修饰。

因此，本发明的另一个方面是提供在本发明的宿主细胞中生产蛋白质，包括异源多肽的方法，其中该方法包括将编码感兴趣的蛋白质产物的核酸序列导入所说的宿主细胞中，在适当的生长培养基中培养宿主细胞，然后回收蛋白质产物。

为此，本发明的宿主细胞必须含有表达预期的产物所需的结构和调节基因区域。这些结构和调节区的性质很大程度上取决于所研究的产物和宿主细胞。本领域技术人员可以使用转化或转染宿主细胞的标准重组DNA技术(如参见Sambrook等人，出处同前)以完成对本发明宿主细胞的遗传设计。

较好按照本领域已知的方法修饰宿主细胞，以导入含有编码所需蛋白质产物的DNA片段的适当克隆载体，即质粒或载体。可作为自主复制质粒将克隆载体导入宿主细胞中，或整合到其染色体内。优选克隆载体包含与一个或多个适当的调节区域有效连接的一个或多个结构区域。

结构区域是编码所需蛋白质产物的核苷酸序列区域。调节区域包括含有转录和翻译控制序列的启动子区域、含有终止信号的终止子区域以及多聚腺苷酸化区域。启动子，即在选择的宿主细胞中表现有转录活性的核苷酸序列可衍生于编码细胞外或细胞内蛋白质，优选酶，例如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶、果胶酶、角质酶、糖酵解酶等的基因。适用于启动在真菌宿主细胞中转录的启动子包括衍生于下列基因的启动子：编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(GluA)、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、Rhizopus meihei天冬氨酸蛋白酶和Rhizopus meihei脂酶的基因。优选的启动子是衍生于米曲霉TAKA淀粉酶和泡盛曲霉GluA基因的启动子。

克隆载体还可包括选择标记，如罚分宿主细胞中缺陷，或赋予抗生素抗性的基因产物。可用作曲霉属选择标记的抗生素例子包括潮霉素、腐草霉素和basta。曲霉属选择标记的其他例子包括编码参与乙酰胺利用的酶的amdS、编码参与尿苷生物合成的酶的pyrG、编码参与精氨酸生物合成的酶的argB、编码参与硝酸盐同化途径的酶的niaD，和编码参与硫酸盐同化途径的酶的sC。用于曲霉属宿主细胞的优选选择标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记。此外，可通过共转化完成选择，其中转化是用两种载体的混合物进行的，并且只就一种载体进行选择。

用于将本发明的DNA构建体分别与启动子、终止子及其他元件连接的方法，以及将它们插入到含有复制所需信息的适当克隆载体中的方法是本领域技术人员熟知的(如参见Sambrook等人，1989，出处同前)。

所使用的培养液或培养基可以是适于培养本发明的宿主细胞，并按已知原则配制的任何常规培养基。优选的培养基含有碳和氮源及其他无机盐。可从商业供应商处购得，或可按照已公开的配方(参见菌株目录，美国典型培养物保藏中心，Rokville MD,USA,1970)制备适当的培养基，如基本培养基或复合培养基。

发酵的适当pH常常取决于待用宿主细胞的性质、生长培养基的组成成分、欲表达的多肽的稳定性等因素。因此，尽管可以在任何pH条件下使用任何发酵方法培养本发明的宿主细胞，但发酵过程中的pH最好是使宿主细胞的酸性和/或中性蛋白酶活性基本上消除或至少显著地降低。据此，也可提高发酵pH以除去如WO90/00192中所述的天冬氨酸蛋白酶活性，而且对于在碱性pH范围培养的宿主细胞中预期蛋白质的产率不存在任何其他有利影响。

如果发酵过程的pH在5至11，如6至10.5,7至10或8至9.5范围内，则将会降低或阻断酸性蛋白酶如天冬氨酸和丝氨酸蛋白酶，以及pH范围在7以上的中性蛋白酶的活性。在碱性发酵条件下产生的酶的例子包括内切葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白质二硫键异构酶。

然而，碱性pH范围将支持未被修饰的宿主细胞中的碱性蛋白酶活性，其本身则很可能导致有用多肽产物的降解。因此，在这些情况下失活编码碱性蛋白酶的基因是特别有利的。

失活本发明的碱性蛋白酶基因对于某些宿主细胞也是特别有利的，因为酸性、中性和碱性蛋白酶活性的水平在种与种之间是不同的。例如，米曲霉内碱性蛋白酶的活性水平高于黑曲霉。

培养后，以常规蛋白质分离和纯化方法从培养液中回收所需的蛋白质。已知的纯化方法包括从培养基中离心或过滤分离细胞、使用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质成分，以及离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等层析方法。产物

所需的终产物，即由本发明的宿主细胞表达的异源蛋白质可以是任何一种真细菌或真核细胞的蛋白质或肽。

本文限定的术语“异源蛋白质”是指非宿主细胞固有的蛋白质或多肽基因产物，或者是已经过人工修饰而改变了天然序列的固有蛋白质，或者通过操纵为表达天然蛋白质所需的如启动子、核糖体结合位点等固有调节序列，或以重组DNA技术对宿主细胞进行其他操作而改变了表达量的天然蛋白质。

在一特定实施方案中，产物是有治疗活性的肽或蛋白质，如激素，特别是胰岛素、生长激素、胰高血糖素或促生长素抑制素；白细胞介素，特别是干扰素；造血生长因子，特别是PDGF(血小板衍生生长因子)、EPO(红细胞生成素)，或TPO(血小板生成素)；蛋白酶，特别是因子Ⅶ、因子Ⅷ、尿激酶、凝乳酶或组织纤溶酶原激活物；或血清白蛋白。

在另一个优选实施方案中，产物是真菌或细菌来源的酶。

优选的酶是糖苷酶，如淀粉酶，特别是α淀粉酶(EC3.2.1.1)或β淀粉酶(EC3.2.1.2)；葡聚糖1,4-(α-葡糖苷酶(EC3.2.1.3)，纤维素酶，特别是内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特别是内切-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖-内切-1,3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；葡糖苷酶，特别是α葡糖苷酶(EC3.2.1.20)或β葡糖苷酶(EC3.2.1.21)；半乳糖苷酶，特别是α半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)或β半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)；内切葡聚糖酶，特别是内切-1,3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)、内切-1,3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)、内切-1,2-β-葡聚糖酶(C3.2.1.71)或内切-1,6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)；以及纤维素-1,4-β-纤维二糖苷酶(EC3.2.1.91)。

在另一个优选实施方案中，酶是脂水解酶，特别是脂酶、酯酶、磷脂酶，或溶血磷脂酶。

在另一个优选实施方案中，酶是肌醇六磷酸酶，特别是3-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.26)。

在另一个优选实施方案中，酶是蛋白水解酶。

在另一个优选实施方案中，酶是漆酶、果胶酶、角质酶或氧化还原酶，如过氧化物酶。

在另一个优选实施方案中，产物是杂合多肽，特别是凝乳酶原和胰蛋白酶原样蛋白酶。

由于没有金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性，所以由宿主细胞表达的异源蛋白质也可以是前体蛋白质如酶原、杂合蛋白质，作为前序列或前原序列或者任何其他未成熟形式得到的蛋白质。

实施例

参照下列实施例进一步举例描述本发明，这些实施例不应以任何方式构成对本发明待批权利要求中限定的范围的限制。材料和方法菌株

米曲霉IFO4177：可得自发酵研究所，Osaka；17-25 JusoHammachi2-Chome Yodogawaku,Osaka,Japan。

尖镰孢DSM2672：按照国际公认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，已于1983年6月6保藏在德意志微生物保藏中心(DSM),Mascheroder Weg 1b,DE-3300 Braunschweig,Germany。

How B101：实施例1中描述了该菌株的构建。

JaL125：实施例1中描述了该菌株的构建。

JaL151：实施例1中描述了该菌株的构建。

JaL228：实施例1中描述了该菌株的构建。基因

alp：该基因编码SEQ.ID.No.3中所示的碱性蛋白酶。

NpⅠ：该基因编码SEQ.ID.No.2中所示的中性金属蛋白酶。

pyrG：该基因编码参与尿苷生物合成的乳清苷-5＇-磷酸脱羧酶。

p45：该基因编码SEQ.ID.No.1中所示的中性金属蛋白酶Ⅰ。质粒

pSO2：实施例1中描述了其制备。

pSO5：实施例1中描述了其制备。

pSRe403：实施例1中描述了其制备。

pSRe403ΔSacⅡ：实施例1中描述了其制备。

pJaL173：实施例1中描述了其制备。

pJaL212：实施例1中描述了其制备。

pJaL335：实施例1中描述了其制备。

pJaL389：实施例1中描述了其制备。

pJaL399：实施例1中描述了其制备。

pToC65:EP 531 372 B中描述了其制备。

pToC68:WO91/17243中描述了其制备。

pToC90:p3SR2(Corrick等人，1987，基因，53:63-71)的亚克隆，在

pUC19载体(Yannisch-Perron等人，1985，基因，

33:103-119)上携带作为2.7Kb XbaⅠ片段的构巢曲霉

amdS基因，按WO91/17243中所述方法制备该质粒。

pDM115：实施例1中描述了其制备。

pMT1303：实施2中描述了其制备。

pMT1305：实施例2中描述了其制备。

pMT1329：实施例2中描述了其制备。

pMT1330：实施例2中描述了其制备。

pMT1332：实施例2中描述了其制备。

pMT1335：实施例2中描述了其制备。蛋白水解酶检测法

在0.1M Tris、2mM CaCl₂、pH7(在低pH范围时使用100mM硼酸盐、10mM DMG、2mM CaCl₂)中25℃预保温30-60分钟后，测定作为所释放的胰蛋白酶活性的金属蛋白酶活性。在微量滴定板中检测胰蛋白酶活性；将100ml样品与100ml L-BAPNA底物(贮备浓度87mg/mlDMSO，在缓冲液中稀释50倍，Sigma Aldrich Corp.,St.Louis MO.USA)混合并使用Molecular Devices Corp.(Sunnyvale CA,USA)的Thermomax微量滴定板读数仪测定405nm的吸收值。

在1ml的总反应体积中，使用20mM Tris-HCl(pH8.0)中的1mM合成底物N-琥珀酰Ala-Ala-Pro-Phe-N-酰对硝基苯胺(p-nitroanilide)(Sigma Aldrich Corp.)，在25℃测定碱性蛋白酶活性。在410nM上监测对硝基苯胺的释放(Ramesh,MV.等人，1994，感染与免疫，62:79-85)。实施例1：

米曲霉碱性蛋白酶(alp)基因和米曲霉中性金属蛋白酶Ⅰ(NpⅠ)基因的基因组缺失

使用米曲霉pyrG基因作为选择标记，在pyrG-米曲霉菌株中，以两个连续周期的一步骤基因置换法(Miller,B.L.,等人，1985，分子细胞生物学，5:1714-1721，和May,G.,丝状真菌的应用分子遗传学，PP.1-25,J.R.Kinghorn和G.Turner，编；Blackie Academic and Professional,1992)缺失alp和NpⅠ基因。米曲霉pyrG基因的克隆

通过与黑曲霉pyrG基因交叉杂交来克隆米曲霉pyrG基因(vanHortingsveldt,W.,等人，1987，分子普通遗传学，206:71-75)。用得自黑曲霉pyrG基因的1kb DNA片段以低严紧性探查得自Sau3A部分消化的米曲霉IFO4177 DNA的λ噬菌体文库。将其中一个阳性克隆的DNA亚克隆到pUC118载体中。所得到的质粒pSO2显示含有互补于黑曲霉pyrG突变体的pyrG基因。pyrG质粒pJaL335的构建

使用下列两个寡核苷酸引物，以PCR方法扩增位于米曲霉pyrG编码序列之5′端479个核苷酸上游的431bp片段：

引物A:5′-GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC-3′；SEQ.ID.No.4；和

引物B:5′-GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC-3′；SEQ.ID.No.5。

划下线区域表示存在于米曲霉pyrG基因5’区中的序列。在各引物的5′末端插入限制性位点，以利于克隆；引物A含有Bg1Ⅱ位点，引物B含有与HindⅢ限制性位点相邻的EcoRⅠ位点。

在PCR反应中使用质粒pSO2作为模板。在含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl₂的反应缓冲液中，在含有2.5单位Taq聚合酶、100ng pSO2、各250nM的每种dNTP和每种各10pmol的两种引物的100μl反应体积中进行PCR反应。

在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal480中进行下列扩增：94℃，3分钟一个循环；然后是94℃1分钟，55℃30秒钟，和72℃1分钟，进行25个循环。PCR反应产生长度为430bp的单一DNA片段。用Bg1Ⅱ和EcoRⅠ消化该片段，并经凝胶电泳分离并纯化后将所得片段克隆到质粒pSO2的相应位点中，得到称为pJaL335的质粒。因此，pJaL335携带侧冀连有431bp重复区的pyrG基因。图1中总结了构建pJaL335的诸步骤。pyrG缺失质粒pSO5的构建

用NheⅠ消化质粒pSO2，从中除去约1.1Kb的基因编码序列，重新连接后留下各约1kb的pyrG5′和3′侧翼序列，从而构建得到pyrG缺失质粒pSO5。图2中图解说明了这一构建程序。米曲霉pyrG-菌株HowB101的构建

使用得自含有米曲霉pyrG基因之5′和3′侧翼序列的pSO5的2.2KbHindⅢ片段转化米曲霉IFO4177菌株。根据抗5-氟-乳清酸抗性(用于选择pyrG突变体的表型)选择转化体。经Southern分析显示，其中一个转化体HowB101在pyrG座位有预期的缺失。因为HowB101是尿苷依赖型的，所以可用野生型pyrG基因转化之，并可根据在无尿苷培养基中生长的能力选择转化体。alp缺失质粒pJaL212的构建

从用Sau3A部分消化的米曲霉IFO4177中得到基因组DNA文库。将所得片段连接到BamHⅠ消化的pUC19中。使用与米曲霉碱性蛋白酶的已知蛋白质序列片段互补的简并寡核苷酸探针筛选文库。该筛选得到含有3.9Kb Sau3A片段的质粒并将其称为pSRe403。

用SacⅡ消化pSRe403，然后重新连接以产生其中已删除了长度约1Kb的alp基因片段的质粒。所得质粒被称为pSRe403ΔSacⅡ。

用HindⅢ部分消化pSRe403ΔSacⅡ，使用Klenow聚合酶填充末端，然后重新连接以除去pUC19序列中的HindⅢ位点，得到称为pJaL173的质粒。

将用HindⅢ消化pSO2得到的含有pyrG基因的3.8Kb片段插入pJaL173中的HindⅢ位点内，得到含有pyrG基因的HindⅢ片段的质粒，其中所说的片段分别在上游和下游位置侧接有alp基因的5′和3′序列。图3中总结了称为pJaL212的质粒的构建。米曲霉alp^-菌株JaL125的构建

使用标准方法，用得自pJaL212的6.8Kb SacⅠ/SphⅠ片段转化HowB101。该片段由1.5kb alp启动子、pyrG基因和alp基因3′末端的1.5kb组成。根据它们在没有尿苷的培养基中的生长能力选择转化体。

以Southern印迹法分析转化体，其中以得自pJaL173之携有部分alp基因的599bp PstⅠ/SacⅡ片段作为放射活性标记的探针。根据野生型PstⅠ带从1.0kb到1.9kb带的移动来识别带有alp基因缺失的菌株。鉴定出四个这样的转化体，并将其中一个定名为JaL125。米曲霉NpⅠ基因的克隆

完全按照供应商(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA,USA)推荐的方法，使用SuperCosl粘粒载体试剂盒构建米曲霉的粘粒文库。

从按标准方法(如参见Christensen,T.,等人，1988，生物技术，6:1419-1422)分离的原生质体中制备米曲霉IFO 4177的基因组DNA。分离后，在Labofuge T(Heto)中以2500rpm离心5分钟以沉淀原生质体。然后将沉淀团块悬浮于含10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA的缓冲液中，采用100μg/ml蛋白酶K和0.5％SDS处理。按照SuperCosl粘粒载体试剂盒供应商推荐的方法完成该步骤和DNA制备中的所有后继步骤。

使用BioRad(Hercules,CA,USA)的CHEF凝胶装置以电泳法分析基因组DNA的大小。简单地说，在外加10-50秒脉冲的200伏电压下，将1％琼脂糖凝胶电泳20小时。用溴乙锭对凝胶染色并在UV下曝光以进行照相，显示出长度范围为50至100Kb以上的DNA。然后用Sau3A部分消化该DNA。按上述方法经CHEF凝胶分析，测知所得DNA片段的大小范围为20至50Kb。

按照试剂盒供应商提供的方法制备CsCl梯度分带的SuperCosl载体，连接并包装。测定文库滴度后，将单一连接和包装得到的所有包装混合物转染到随载体试剂盒提供的宿主细胞XL1-Blue MR中，并铺板于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。得到大约3800个菌落。对得自10个茵落的粘粒制剂的分析表明，所有粘粒均具有预期大小的插入片段。单个挑取各菌落并接种于每个孔含有100μl LB和100μg/ml氨苄青霉素的96孔微量滴定板上，然后37℃保温过夜。向各孔内加入100μl 50％甘油，并于-80℃冻存整个文库。贮存总共3822个菌落，它们代表大约4.4倍扩增的米曲霉基因组。尖镰孢p45金属蛋白酶探针的制备

按照专利申请WO95/30757(Novo Nordisk Biotech,Inc.；1995年11月16日公布)中所述的方法克隆尖镰孢p45金属蛋白酶基因。

从上述cDNA文库中选择出一个克隆并定名为pDM115。从含有编码一部分p45基因之1.76kb尖镰孢cDNA片段的pDM115中制备探针。用SalⅠ消化该质粒，并在1％琼脂糖凝胶上分离所得片段。目的条带是1.5kb片段，从该条带中洗脱DNA。以随机引发法用³²P-dATP标记该片段并用作Southern分析的探针，也用来筛选米曲霉粘粒文库。米曲霉文库的筛选

为了用尖镰孢p45探针筛选米曲霉粘粒文库，使用为适合96孔微量滴定皿的一半而设计的6排8针格局排布的多针装置，将文库中各自冷冻的菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。将含有得自文库中所有克隆之菌落的平板37℃保温过夜。将切割成平皿大小的灭菌的Whatman 540滤膜放在菌落上，然后于37℃继续保温2小时。将滤膜转移到含有200μg/ml氯霉素的LB平板上，并将平板于37℃保温过夜。第二天将滤膜在0.5M NaOH中洗2次，每次5分钟，然后在0.5M Tris-HCl(pH7.4)中洗两次，每次5分钟，最后在2XSSC中洗两次，每次5分钟。用乙醇浸湿滤膜，然后风干。

将滤膜与pDM115中的1.5kb ³²p标记的DNA片段杂交。在含10xDenhart′s溶液、5XSSC、0.02M EDTA、1％SDS、0.15mg/mlpolyA RNA和0.05mg/ml酵母tRNA的标准杂交缓冲液中于65℃杂交16小时。杂交后在2XSSC、0.1％SDS中于65℃将滤膜洗两次，并对X光胶片曝光。三个菌落3E8、3C1和2A5显示与探针杂交。粘粒克隆的表征

限制性酶切分析表明，三个粘粒克隆中有两个，即3E8和3C1均含有衍生于米曲霉基因组中同一区域的插入片段。用EcoRⅠ消化3μg粘粒DNA并以琼脂糖凝胶电泳分级分离之。将DNA转移到Immobilan-N滤膜(Millipore)上并与放射性标记的pDM115探针杂交。结果显示，探针与两粘粒克隆中的4Kb EcoRⅠ片段杂交。对此4.0Kb EcoRⅠ片段进行进一步分析。NpⅠ缺失质粒pJaL399的构建

用SacⅠ消化EP531372中所述的质粒pTOC65，按制造商(Boehringer Mannhei)推荐的方法用细菌碱性磷酸酶处理，以除去5′磷酸基团，然后用苯酚抽提并沉淀之。以凝胶电泳法分离粘粒克隆3E8中含有米曲霉NpⅠ基因的5.5Kb SacⅠ片段并纯化之。混合并连接两个片段。转化到大肠杆菌中后，用限制性酶消化小质粒制剂以鉴定携带正确质粒的菌落；将回收的质粒定名为pJaL389。对该亚克隆的一部分进行DNA序列分析，以证实米曲霉NpⅠ基因编码区的存在。

用BalⅠ消化质粒pJaL389，以缺失NpⅠ基因的内部1.1Kb片段。用Klenow聚合酶处理余下的7.1Kb片段以造成钝末端，然后进行凝胶电泳分离并纯化。然后用细菌碱性磷酸酶处理该DNA片段，用苯酚提取并沉淀之。用HindⅢ消化质粒pJaL335以得到含有米曲霉pyrG基因的3.5Kb片段，然后用Klenow聚合酶相似地处理，经凝胶电泳分离并纯化之。混合并连接两个片段。转化到大肠杆菌中之后，用限制性酶消化小质粒制剂以鉴定携带正确质粒的菌落。图4中总结了这一称为pJaL399的质粒的构建。

因此，质粒pJaL399含有pTOC65载体携带NpⅠ基因的一个片段，其中内部1.1Kb BalⅠ片段已被编码米曲霉pyrG基因的3.5Kb DNA片段取代。pyrG^-米曲霉菌株JaL151的分离

根据抗5-氟-乳清酸抗性筛选米曲霉alp^-菌株JaL125，以鉴定自发pyrG突变体。一个称为JaL151的菌株被鉴定为alp^-和pyrG^-。正如How B101一样，JaL151也是尿苷依赖性的，因此可用野生型pyrG基因转化之，并根据其在没有尿苷条件下生长的能力选择转化体。米曲霉NpⅠ^-菌株JaL228的构建

按照标准方法用pJaL399的7.9Kb SacⅠ片段转化JaL151。然后根据其在没有尿苷条件下生长的能力选择转化体。再次分离后从12个转化体中制备染色体DNA。用BalⅠ消化各转化体的DNA，并使用上述得自pJaL389中含有NpⅠ基因的5.5Kb ³²p标记的DNA SacⅠ片段作为探针，以Southern印迹法分析之。根据其中没有1.1Kb BalⅠ杂交片段(表明NpⅠ基因的破坏)，以及显示改变了侧翼5′和3′序列的迁移率来鉴定有用的菌株。将得自这些转化体之一的菌株称为JaL228。实施例2C.antarctica脂酶B的克隆

制备pBR322中Sau3A部分消化的Candida antarctica基因组文库，并用根据clb的N末端氨基酸序列设计的两个寡核苷酸引物，即NOR929(SEQ.ID.No.4)和NOR930(SEQ.ID.No.5)筛选复制膜(图5)。鉴定出8个菌落。分析这些质粒表明其中存在重叠的插入片段。进一步分析其中一个含有7.8kb插入片段的质粒pMT1303。通过删除SalⅠ片段来构建含有2.1Kb插入片段的质粒pMT1305(图6)。使用NOR929作为模板，测定pMT1305的核酸序列以证实其编码clb(C.antarctica脂酶B)。使用Promega Erase-a-Base系统(Promega Corp.,Madison WI,USA)制成pMT1305中的一系列缺失，以测定整个基因的双链序列。编码序列如SEQ.ID.No.6所示。部分CLB质粒pMT1329的构建

从pMT1305中分离编码CLB之N末端序列的788bp SalⅠ-HindⅢ片段。从该片段中分离出两个较小的片段，即170bp HindⅢ-BanⅠ和204bp BanⅠ-填平了的Sau3A。将这两个片段克隆到已用EcoRV和HindⅢ消化的质粒pIC19R中。如此在相邻于clb的ATG密码子9bp的EcoRV和填平了的Sau3A处造成一个BclⅠ位点，得到称为pMT1329的质粒(图7)。部分CLB质粒pMT1332的构建

从pMT1305中分离出作为670bp HindⅢ-Xmn1片段的编码CLB之C末端区域的基因序列，并插入到已用HindⅢ-NruⅠ消化的质粒pIC7中，得到pMT1330。由pMT1329中的3.0Kb HindⅢ-NarⅠ片段和pMT1330中的0.7Kb HindⅢ-ClaⅠ片段组装成完整基因，得到pMT1332(图8)。CLB表达质粒pMT1335的构建

使用表达载体pToC68在曲霉中表达clb基因。将得自pMT1332的1Kb BclⅠ-BglⅡ片段插入已用BamHⅠ消化的pToC68中，得到pMT1335(图9)。因此，构建质粒pMT1335产生用于表达C.antarctica脂酶B基因的真菌表达质粒。在米曲霉菌株中表达C.antarctica脂酶B

通过与pToC90共转化，用pMT1335转化米曲霉菌株IFO4177和JaL228(需要限定pToC90)。

根据在含有10mM乙酰胺的基本培养基上的生长来选择转化体，并根据产生CLB的能力筛选存在pMT1335的转化体。从米曲霉野生型菌株IFO4177和alp^-、NpⅠ^-菌株JaL228中选择一个转化体以进行93小时罐发酵。将分生孢子接种到30℃含1.2升20％麦芽糖液和8％尿素的2升Keiler发酵罐中。连续加入20％麦芽糖液和8％尿素的混合物；必要时加入磷酸以将pH维持在7。

下列表1中总结了与IFO4177相比较的JaL228的CLB活性产率，其中一个脂酶单位(LU)定义为在pH7.0和30℃条件下每分钟从三丁酸甘油酯释放1μmol丁酸所需要的酶量。该表的数据表明JaL228中的产生量比IFO4177中的产生量高1.8倍，证明alp和NpⅠ的缺失可显著地改善对这些蛋白酶的活性敏感的蛋白质的稳定性。

         表1．罐发酵93小时后IFO4177和JaL228的CLB产生量

小时	IFO4177LU/g	JaL228LU/g
			93	575	1041

                              序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

    (A)姓名：Novo NordiskA/S

    (B)街道：Novo Alle

    (C)城市：Bagsvaerd

    (E)国家：Denmark

    (F)邮编：DK-2880

    (G)电话：+45 4444 8888

    (H)传真：+45 4449 3256

(ⅱ)发明名称：新的宿主细胞和生产蛋白质的方法

(ⅲ)序列数：6

(ⅳ)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30B(EPO)(2)SEQ.ID.No.1的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：2052个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：基因组DNA

(ⅵ)最初来源：

    (A)生物体：尖镰孢

    (B)菌株：DSM2672

    (C)单个分离物：p45

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：成熟肽

    (B)位置：785..2049

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：信号肽

    (B)位置：55..784

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：内含子

    (B)位置：364..415

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：内含子

    (B)位置：802..854

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：内含子

    (B)位置：1821..1868

(xi)序列描述：SEQ.ID.No.1：ATGCGTTTCT CCGACTCTCT CCTCCTCATC GGCCTATCCA GCCTCGCTGG TGCTCATCCC                 60AGCAGAAGGG CTCCTAATCC TTCACCGCTG AGCAAGCGTG GCCTCGACCT GGAAGCTTTT                120AAGCTTCCTC CCATGGCCGA GTACGTTCCT CAGGACGAGG TTCCTGATGA TGTCAGTGCC                180AAGGTCGTCA CCAAGCGCGC TGATTACACC GAGACTGCCA AGGACTTGGT TAAGTCGACT                240TTCCCCAAGG CTACTTTCCG TATGGTCACG GATCACTATG TTGGTAGCAA CGGAATTGCG                300CATGTAAACT TTAAGCAGAC TGTCAACGGT ATTGATATCG ACAATGCTGA TTTCAACGTC                360AACGTGGGTA TTCTCAAGAC TTTGGGGAGT TTGGAATGTG CTGACATGGA TACAGATTGG                420CGCTGACGGC GAGGTCTTCT CCTACGGAAA CAGCTTCTAC GAGGGCAAGA TTCCCGGTCC                480TCTTACCAAG CGTGACGAGA AAGACCCCGT CGACGCTCTC AAGGACACCG TTGATGTTCT                540TTCTCTCCCC GTTGAGGCTG ACAAGGCCAA GGCTGAGAAG AAGAGCAAGA ACCACTACAC                600CTTCACTGGT ACCAAGGGTA CCGTCAGCAA GCCCGAGGCT AAGCTCACCT ACCTTGTTGA                660TGAGAACAAG GAGCTCAAGC TCACATGGAG AGTTGAGACT GATATTGTTG ACAACTGGCT                720GTTGACTTAT GTCAATGCTG CCAAGACTGA TGAGGTTGTT GGTGTTGTTG ACTACGTCAA                780TGAGGCGACA TACAAGGTCT AGTACGTATT TCCATAAATT GACGATTGGG AAAGAATTGA                840CCGTTGTATT ATAGTCCTTG GGGTGTCAAT GATCCCTCCA AGGGATCTCG CTCCACTGTT                900GAGAACCCCT GGAATCTCGC GGCCTCCGAG TTCACCTGGC TCAGCGACGG CTCAAACAAC                960TACACCACAA CCCGCGGGAA CAATGGAATT GCACAGGTGA ATCCTTCAGG GGGCTCCACG               1020TATCTGAACA ATTACCGTCC TGATAGCCCG TCGCTGAAGT TCGAGTATGA TTACTCCACC           1080AGCACCACTA CACCCACCAC CTACCGCGAT GCTTCCATCG CTCAGCTTTT CTACACAGCC           1140AACAAGTACC ACGACCTCCT CTACCTTCTT GGCTTTACCG AACAGGCTGG TAACTTCCAG           1200ACCAACAACA ATGGCCAGGG TGGTGTAGGA AACGATATGG TTATCCTCAA CGCTCAGGAC           1260GGAAGCGGCA CCAACAACGC CAACTTCGCT ACACCCGCTG ACGGTCAGCC CGGCCGCATG           1320CGAATGTATC TCTGGACATA CAGCACACCC CAGCGTGACT GCAGTTTCGA CGCTGGCGTT           1380GTTATCCACG AGTACACTCA CGGTCTCTCC AACCGTCTCA CAGGTGGCCC TGCCAACTCG           1440GGTTGTCTTC CCGGTGGTGA ATCCGGTGGC ATGGGTGAGG GCTGGGGTGA CTTCATGGCT           1500ACTGCCATTC ACATCCAATC CAAGGATACC CGCGCTAGCA ACAAGGTCAT GGGTGACTGG           1560GTGTACAACA ACGCAGCTGG TATCCGAGCT TATCCTTACA GTACAAGCCT ACCACTAAC            1620CCTTACACTT ACAAGAGTGT TAACAGTCTC AGTGGAGTCC ATGCTATTGG TACTTACTGG           1680GCTACTGTTC TGTATGAGGT TATGTGGAAC CTCATCGACA AGCATGGGAA GAATGATGCG           1740GATGAGCCCA AATTCAACAA CGGCGTTCCT ACAGATGGCA AATATCTTGC TATGAAGTTA           1800GTAGTGGATG GCATGTCGCT GTAAGTTGTC CCTTGGATTT GTAGGAGTTC TTATCTAACG           1860TTTAATAGGC AACCTTGCAA CCCCAACATG GTCCAGGCCC GAGACGCCAT CATCGACGCC           1920GACACCGCTC TTACCAAGGG AGCTAACAAG TGCGAGATCT GGAAGGGCTT TGCCAAGCGT           1980GGTCTTGGAA CTGGTGCCAA GTATAGTGCT TCCAGCCGTA CTGAGAGCTT TGCTCTTCCT           2040TCTGGATGTT AA                                                               2052(3)SEQ.ID.No.2的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：2968个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：基因组DNA

(ⅵ)最初来源：

    (A)生物体：米曲霉

    (B)菌株：IFO 4177

    (C)单个分离物：NpⅠ

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：458..817

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (A)位置：868..1262

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (A)位置：1320..1870

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：1930..2344

(ix)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：2404..2587

(xi)序列描述：SEQ.ID.No.2：CCCCCGATTG GGAAGACCTT GAATCCAATC TATCGGAGAG CCGACGGAAC GGGTTTTCTT                    60GAACCCAATG TCCCAATTGC TTTGAGAAAA TGGATATTAT TCAATGCCCC TGATCATTAT                   120TGGCATACTC TTCACGGAGT GGTCTGCCCC TGGGCGATTG CTCCACCATG AGGTGCATGA                   180AGGTAACCCC GAGCTGCTAT AGATGAAGTG TGTCGGATAT TGCAGGAGTC TGAATGCGCA                   240GCTGATTGCC CTTTTCCCAC CATGATGAAT GGGACACAAT ATGTCTAGCT CCGGGTTGTC                   300TCGGGCCAAG AAGAAATGCT TCTTTGCGTT GATCCAGCGC GTCGAAATCT CCAATTGAAC                   360CGGTATAAAT AACAGCTGAG CGTCGCAGCA TTCAAGGCAG AACCATTCCA CAGATCATCT                   420TCTATCATTT GCATTGAGTC CAACGCCCTG GCAGTTCATG ATGCGGGGTC TTCTACTAGC                   480TGGAGCCCTT GGCCTACCTT TGGCCGTCCT TGCGCATCCG ACCCATCATG CACATGGACT                   540TCAACGTCGC ACAGTTGACT TGAACTCATT CCGTTTGCAC CAGGCAGCGA AGTATATCAA                   600TGCGACTGAG TCTTCGAGTG ATGTTTCATC TTCTTTCTCT CCCTTCACCG AGCAAAGCTA                   660CGTGGAGACG GCCACTCAGC TCGTGAAGAA TATCCTGCCA GATGCTACCT TCCGTGTCGT                   720CAAGGATCAT TACATTGGTA GCAATGGGGT CGCTCATGTC AATTTTCGTC AGACGGTCCA                   780TGGCCTTGAC ATTGACAATG CGGACTTCAA TGTCAATGTA CGCTGCAGTC CACCTATACT                   840ATGTTCGGTG CTAACCACTT CATTTAGGTT GGGAAAAATG GAAAGATCTT TTCCTATGGC                   900CACTCATTTT ATACGGGCAA AATCCCCGAT GCCAATCCTT TGACGAAGCG GGATTATACC                   960GACCCTGTAG CGGCTCTCAG AGGAACCAAC GAAGCTTTAC AGCTTTCTAT CACTCTAGAT                  1020CAAGTGTCTA CTGAGGCTAC CGAGGACAAA GAGTCCTTCA ATTTCAAGGG AGTCTCTGGC                  1080ACCGTTTCGG ATCCCAAGGC TCAGTTGGTC TACTTGGTAA AGGAAGATGG CAGCCTTGCT                  1140TTGACCTGGA AGGTGGAGAC AGATATTGAC AGCAACTGGC TGTTGACCTA CATCGATGCC      1200AATACCGGCA AAGATGTCCA TGGTGTGGTT GACTACGTAG CCGAGGCAGA TTACCAAGTA      1260TAGTGAGTAT TTTAAGAATG TGACTTGGAC TGTAGAATGA AGCTGACACA CCACCACAGT      1320GCATGGGGTA TTAATGATCC CACGGAGGGC CCTCGCACCG TCATCAGCGA TCCATGGGAT      1380TCGTCCGCAT CTGCGTTCAC CTGGATCAGT GACGGAGAAA ACAACTATAC CACAACTCGC      1440GGCAACAACG GTATCGCGCA GTCGAACCCT ACCGGTGGAT CGCAGTACTT GAAGAACTAC      1500CGGCCTGATA GCCCCGATTT GAAATTCCAA TACCCCTATT CGCTCAACGC CACACCCCCA      1560GAGTCCTATA TTGATGCGTC TATCACTCAG CTTTTCTACA CTGCCAACAC GTACCACGAC      1620CTACTCTACA CTCTGGGCTT CAACGAGGAG GCCGGTAATT TCCAGTACGA TAACAATGGA      1680AAAGGAGGTG CTGGAAACGA CTACGTGATC CTCAATGCTC AGGACGGTTC TGGCACCAAT      1740AACGCCAACT TCGCTACGCC CCCGGATGGA CAGCCCGGCC GCATGCGCAT GTACATTTGG      1800ACCGAGTCCC AGCCTTACCG TGACGGCTCC TTCGAGGCTG GTATTGTGAT TCACGAGTAT      1860ACTCACGGTC GTATGTATCC CTTATGAACC CCAAGATAAG GCAGTCTGAA CTAACACCAT      1920GGTACACAGT CTCTAACCGG CTCACTGGAG GACCTGCTAA CTCTCGCTGC TTGAATGCCC      1980TTGAATCCGG CGGAATGGGT GAAGGTTGGG GAGACTTCAT GGCCACGGCA ATTCGGCTCA      2040AGGCCGGCGA TACTCACTCG ACCGATTATA CCATGGGTGA ATGGGCTGCA AACAAGAAAG      2100GTGGCATCCG TGCTTACCCA TTCTCAACCT CCCTGGAAAC CAACCCTCTC ACCTACACCA      2160GTCTCAATGA ATTGGACGAA GTGCATGCCA TCGGCGCGGT GTGGGCTAAC GTATTGTACG      2220AGCTGTTGTG GAACTTGATC GATAAGCACG GCAAGAATGA CGGGCCAAAG CCCGAGTTCA      2280AGGATGGAGT TCCGACTGAC GGCAAGTATC TCGCCATGAA GCTGGTGATT GATGGCATAG      2340CATTGTAAGT GCCAACCTCG TTTCCTCTTT CTACCTATCG CAGGGGCTAA CCTTGACTTT      2400TAGGCAACCT TGCAACCCCA ACTGTGTCCA GGCTCGCGAC GCCATCCTCG ATGCCGATAA      2460GGCTCTCACC GATGGTGCTA ACAAGTGCGA GATTTGGAAG GCGTTTGCTA AGCGTGGTTT      2520GGGTGAAGGC GCTGAATACC ATGCGTCTCG TCGGGTGGGC AGTGATAAGG TGCCCTCTGA      2580TGCTTGCTAG AGTTTGTGTA TATTCTTTCA GCTAGGTGAT TGGGGAGATC CTGTAGGCTG      2640ACTATAGTTT GAATTTAACA ACATTTCTTA ATTCTTACTG TCAGGTAACT TGCACTGCAC      2700AATAGCATGA ATAGGTTATG GCACTCTGGC CCTTATGTCG GATTTCTACA CAATGATTTG      2760TCCTTAAGAA ATACTATCTC AACTCATCAC CCCTCTCATC GTCCGCCGCT TCGAATTCAG      2820GGTCATTCTT CCCCGTCTTC CTGGCCCCCT TGGCCGTCCT GACCCTCTGC TTGCTCTCCA      2880TCTCCCCCTC CACCCTGATC ATAGGTCACG GTGGCCGCCG GTCCCACCAG GTGGTTGGGG      2940CAATAGTTGT TTATAGCACG GGGCTGCT                                         2968(4)SEQ.ID.No.3的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：3922个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅵ)最初来源：

    (A)生物体：米曲霉

    (B)菌株：A01560

    (C)单个分离物：alp

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：2310..2634

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：2684..3129

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：3188..3276

(ⅸ)特征：

    (A)名称/关键词：外显子

    (B)位置：3333..3686

(xi)序列描述：SEQ.ID.No.3：GGATCCATAA TGAGCACACT TGAACCTCGC ATGAGTGCTC CATATCTTAG ATCCATTTGA                  60GTCACGAGCG TCGAAGCCAA GGCTAAAAGA AAAGGGACCA AGACCGCCGC ATATCGGGGT                 120GGCTGAACAA TCGCTGCTAG TGTGTACACA GGATACATAA ATTAATCAAG AGCCAATGAC                 180GTTATCGAAG ACATGATATT ACTTACTTGA TTTGTTGCGG TGCTCCGACT CAACTGGATT                 240CAGATGGAAG GGAAGGGATT CTTGATCAGG CTCGTCCCGG GATGACCATT GCTCCTCTCG                 300AATCGAGACA ATGTTGAATG CCCAGGATGA CGATTGAGAG CGAGATATTA AAAAAGAGAT                 360TAAGGGTTGA CGATTGCCAA CGGAAGCCCG ATGGAAGAAG AAATGCCAAG AATTTGGCTG                 420CCTGGATGTT AGTGCCGTTT AGCCTCAGGC CCCAGCTGAA TCCCTGCCAA TCACGAGGCA                 480GGGCTCACCA CCTCCAACCC TTACACAAGA CTCGCCCTCG CTCTTTCCTG CAGGTCCTCT       540GCTTACTTTC CCCTCTTTTC CCTCCTGAAA TGCCCCGAGA ATGCCGTCCG GAGCTTAGGA       600AAGCTACGAC GGCTTAATGT TCTAATTTCC CCCACCGACC TGCCCTGGCC AGTTAGACCG       660CCGGACCCAT CGAATGCAAC ATCACCAACA CTAATTTACC TGCATCTCTG TCAGCCCACT       720GGGTTTAACT AGATATGCCA AGGACTTGCT TGGCTGGTTT ATGCATGAAG AGAGATGGGC       780ACTAGTGCGT GCGGGACCAC AAACCTCACC TGCAGAGGGC TCATGCACCT GAAAGACTGC       840CAATGATCAT TTGACTGGTT AGGTCAAGGG GTTAGGCTTA GAGCCCTTTG CTAATGCCGA       900TGCCGCCTCT TTGACTGCCA CATTTCTTGG CTTCCCCTCT TGGCCCCTCC CGTCCCTTGA       960TGCCAAGGGC CTTGGTGGCT CGGACTCCCG GCGGTAGGCT GGCCACCTAC TCATGGCGTG      1020CGGAGATGGG CCATTCAGGT TGTGCCTAAT GACATACTCT GATGCCGACG GGAAGGCCGG      1080CTGCTTGCTG GTGTCATTGG CTTCTCGAAT GACTCGGAGG ATTGTCGTCT TGCAGGACTT      1140TTGTGTAACA ACAGGGGCCG ACAGTTGGCG TGGCTGCCGT GGATATGCTT TTGCTGCGAG      1200CCATGGTTAT TCTGCGGAAC GAAACCACCC TCCCACCCAA ACAGGGCTAA TGTGCCCAGG      1260TCCTGATACC ATCAGAAGAC CTCCAGGAGC ACATGCCTGT TCGCATAACC GTGGTGTAGC      1320ACCAGGAATT GCTTAGCTTA GCTTCTTCGA CTGGGGGGCC AGAAAGTGCT TATCGCAAAG      1380ATCCCACTTC TTTGTGTGAT AGCCCCTCCC GCGGCCCTTG ATCAAGCCGT TCTCGCTCGC      1440CCATACCGAA ACCGCGATAT TATAGGTGCA GATGGTTATT ATTCTTTTTC TTTTTCTTTT      1500TCTTTGCTTC TCATGCAGCC CCATACGTTG CCGAATTTGG CTACACCTTG GGGCTCATTC      1560TTCGAAGTTT AGATTCCGAC AAGACCTCAG CACCCAATCA AAACCCTTGA TTCCTGATAA      1620AAGACGTGGA AAAAAGCGGA TATCGCGTGA GGATGCCAAG CAAAGGGAAT GGGTCACATT      1680GATCTCTGTC GCGCTGTTAG GATGATCTTC ACTCCTAAAG CATCGCCGCG GCATTAGGC       1740CCTTCCCTGT CCAAGATATC GGTTACTCCT CTCATTATGG CGAGCTACTT TGTGAATTAA      1800TTGACTGAGG GATATACCAC CTTCCCTTTG AAGGTACCGA GCCACTACCT TGAGCGTTAG      1860TTACTTTTTC GAGGAAAGCA TCCTATGCTA GTCTCTGCCA ATCACTGCAG CGTCGACAAC      1920TTGCCATAGC CTTGTGTTCT TCACGGTCTA TCGGAACACC CGTTCATGAC TGAAAGGGGT      1980CAGCGTCCGT GGTGGTCAAC ATCATTCTCA TCTTTCATCA TGCCCGCTGA TTGATAGAGT      2040AATTTCCGGT GGAGCACAAC GCCGTCCTCT GAGATGCAAT GTCACCCTGT AAGTTTCAAC      2100TACAATCTGT AGTACAGAGC ATCCTTGTAC TTGCATGCTG TGCAAGTGAT CCAAATCCGT      2160AGAACTTGCT CGAGAACAGG GAAATATAGA ACTCCTGAAG GTTATAAATA CCACATGCAT      2220CCCTCGTCCA TCCTCACTTC CATCATCAAG CCAGCGGTTT CTATCCTCCG ACTTGAGTTG      2280TTCTTGCGCA TCTTTACAAT CTTCTCATCA TGCAGTCCAT CAAGCGTACC TTGCTCCTCC      2340TCGGAGCTAT CCTTCCCGCG GTCCTCGGTG CCCCTGTGCA GGAAACCCGC CGGGCCGCTG      2400AGAAGCTTCC TGGAAAGTAC ATTGTCACAT TCAAGCCCGG CATTGACGAG GCAAAGATTC      2460AGGAGCATAC CACCTGGGCT ACCAACATTC ACCAGCGCAG TCTGGAGCGT CGTGGCGCCA     2520CTGGCGGTGA TCTTCCTGTC GGTATTGAGC GCAACTACAA GATCAACAAG TTCGCCGCCT     2580ATGCAGGCTC TTTCGACGAT GCTACCATTG AGGAGATTCG CAAGAACGAA GATGTTTGTG     2640GTCATCCGCT CGCATTTTTG AATGACAGCT AACTCGCGCC CAGGTTGCCT ACGTCGAGGA     2700GGACCAGATC TACTACCTCG ATGGCCTGAC TACCCAGAAG AGTGCCCCCT GGGGTCTGGG     2760CAGCATTTCC CACAAGGGCC AGCAGAGCAC CGACTACATC TACGACACTA GTGCCGGCGA     2820GGGCACCTAT GCCTACGTGG TGGATAGCGG TGTCAATGTC GACCATGAGG AGTTCGAGGG     2880CCGCGCCAGC AAGGCCTACA ACGCTGCCGG TGGTCAGCAT GTGGACAGCA TTGGCCATGG     2940CACCCACGTT TCCGGCACCA TTGCTGGCAA GACTTATGGT ATCGCCAAGA AGGCCAGCAT     3000CCTTTCGGTC AAAGTTTTCC AGGGTGAATC GAGCAGCACT TCCGTCATTC TTGACGGCTT     3060CAACTGGGCT GCCAACGACA TTGTTAGCAA GAAGCGTACC AGCAAGGCTG CAATCAACAT     3120GAGCTTGGGT GAGTTTACAT TGTTCTTCTC TACTTGGAAC GCGCGAGCGC TAATTTCAAA     3180AACACAGGCG GTGGCTACTC TAAGGCTTTC AACGATGCGG TCGAGAACGC ATTCGAGCAG     3240GGTGTTCTCT CGGTTGTCGC TGCCGGTAAC GAGAACGTAC GTCTCCCCTC CATCGCGCAA     3300AGACGAATTC GTAACTGACT TGATTTTCTT AGTCTGATGC CGGCCAAACC AGCCCTGCCT     3360CTGCCCCTGA TGCCATCACT GTTGCCGCTA TCCAGAAGAG CAACAACCGC GCCAGTTTCT     3420CCAACTTTGG CAAGGTCGTT GACGTCTTCG CTCCCGGTCA AGATATCCTT TCTGCCTGGA     3480TTGGCTCTTC CTCTGCCACC AACACCATCT CTGGTACCTC CATGGCTACT CCCCACATTG     3540TCGGCCTGTC CCTCTACCTC GCTGCCCTTG AGAACCTCGA TGGCCCCGCT GCCGTGACCA     3600AGCGCATCAA GGAGTTGGCC ACCAAGGACG TCGTCAAGGA TGTTAAGGGC AGCCCTAACC     3660TGCTTGCCTA CAACGGTAAC GCTTAAGTAC CAGGAGTACG TCGCAGGATT CTACCATTGT     3720TACTGGAATA CAATGATGAT TAGAAAACGA AGAGCGTTAT GATTCGGACG GATATATGCA     3780TGGCACCCAT ACAGCGTGAT ACATAGGCTG TTTGCTCAAG AATTAGGATT TTATCTGAAT     3840CCATGTACAG AGTATACTTA TGTTAGTAGT CAATAAAATC TTGGCTTTCT AATTTTGTCC     3900CATCTACAAG GGGTCGTCGA TC                                              3922(5)SEQ.ID.No.4的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：36个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ.ID.No.4

CCCTCGGGCT CGGACCCCGC CTTCTCGCA GCCCAAG(6)SEQ.ID.No.5的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：41个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ.ID.No.5CCCTCGTTCG TCAGGCCCGC GTCCAGCACC GACTTGGGCT G(7)SEQ.ID.No.6的信息：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：1029个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅵ)来源：

    (A)生物体：Candida antarctica

    (C)单个分离物：clb

(xi)序列描述：SEQ.ID.No.6ATGAAGCTAC TCTCTCTGAC CGGTGTGGCT GGTGTGCTTG CGACTTGCGT TGCAGCCACT                  60CCTTTGGTGA AGCGTCTACC TTCCGGTTCG GACCCTGCCT TTTCGCAGCC CAAGTCGGTG                 120CTCGATGCGG GTCTGACCTG CCAGGGTGCT TCGCCATCCT CGGTCTCCAA ACCCATCCTT                 180CTCGTCCCCG GAACCGGCAC CACAGGTCCA CAGTCGTTCG ACTCGAACTG GATCCCCCTC                 240TCAACGCAGT TGGGTTACAC ACCCTGCTGG ATCTCACCCC CGCCGTTCAT GCTCAACGAC                 300ACCCAGGTCA ACACGGAGTA CATGGTCAAC GCCATCACCG CGCTCTACGC TGGTTCGGGC                 360AACAACAAGC TTCCCGTGCT TACCTGGTCC CAGGGTGGTC TGGTTGCACA GTGGGGTCTG                 420ACCTTCTTCC CCAGTATCAG GTCCAAGGTC GATCGACTTA TGGCCTTTGC GCCCGACTAC                 480AAGGGCACCG TCCTCGCCGG CCCTCTCGAT GCACTCGCGG TTAGTGCACC CTCCGTATGG                 540CAGCAAACCA CCGGTTCGGC ACTCACCACC GCACTCCGAA ACGCAGGTGG TCTGACCCAG                 600ATCGTGCCCA CCACCAACCT CTACTCGGCG ACCGACGAGA TCGTTCAGCC TCAGGTGTCC                 660AACTCGCCAC TCGACTCATC CTACCTCTTC AACGGAAAGA ACGTCCAGGC ACAGGCCGTG                 720TGTGGGCCGC TGTTCGTCAT CGACCATGCA GGCTCGCTCA CCTCGCAGTT CTCCTACGTC                 780GTCGGTCGAT CCGCCCTGCG CTCCACCACG GGCCAGGCTC GTAGTGCAGA CTATGGCATT                 840ACGGACTGCA ACCCTCTTCC CGCCAATGAT CTGACTCCCG AGCAAAAGGT CGCCGCGGCT                 900GCGCTCCTGG CGCCGGCAGC TGCAGCCATC GTGGCGGGTC CAAAGCAGAA CTGCGAGCCC                 960GACCTCATGC CCTACGCCCG CCCCTTTGCA GTAGGCAAAA GGACCTGCTC CGGCATCGTC                1020ACCCCCTGA                                                                        1029

Claims (30)

1．用于表达异源蛋白质产物的宿主细胞，其中所说的细胞已受到遗传修饰，以便与亲代细胞相比，表达显著降低水平的金属蛋白酶活性和碱性蛋白酶活性。

2．根据权利要求1的宿主细胞，其为真菌细胞。

3．根据权利要求1的宿主细胞，其为酵母细胞。

4．根据权利要求3的宿主细胞，其为酵母属的菌株，特别是酿酒酵母。

5．根据权利要求2的宿主细胞，其为丝状真菌。

6．根据权利要求5的宿主细胞，其为选自枝顶孢属、曲霉属、假丝酵母属、旋孢腔菌属、内座壳属、镰孢属、腐质霉属、脉孢菌属、Rhizomucor、根霉属、Thermomyces、木霉属、柄孢壳属、Pvricularia和青霉属的一个菌株。

7．根据权利要求6的宿主细胞，其为选自构巢曲霉、泡盛曲霉、海枣曲霉、日本曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetus)、尖镰孢、腐皮镰孢、灰腐质霉、粗糙脉孢菌、产黄青霉、Rhizomucor meihei、Trichoderma reesei和绿色木霉的一个菌株。

8．根据权利要求6的宿主细胞，其为选自米曲霉、黑曲霉和具有ATCC 20334的鉴定特征的镰孢的一个菌株。

9．根据权利要求1-8中任何一项的宿主细胞，其中金属蛋白酶是镰孢属金属蛋白酶。

10．根据权利要求9的宿主细胞，其中金属蛋白酶是尖镰孢金属蛋白酶。

11．根据权利要求10的宿主细胞，其中金属蛋白酶是具有SEQ.ID.No.1所示核苷酸序列或其同源序列的尖镰孢p45金属蛋白酶。

12．根据权利要求1-11中任何一项的宿主细胞，其中金属蛋白酶是在大约pH6-8范围内有最适蛋白水解活性的中性金属蛋白酶。

13．根据权利要求12的宿主细胞，其中金属蛋白酶是NpⅠ或NpⅡ组的曲霉属中性金属蛋白酶。

14．根据权利要求13的宿主细胞，其中金属蛋白酶是米曲霉中性蛋白酶Ⅰ，特别是包括衍生于SEQ.ID.No.2所示核苷酸序列或其同源序列的氨基酸序列的中性金属蛋白酶Ⅰ。

15．根据权利要求1-14中任何一项的宿主细胞，其中碱性蛋白酶是曲霉属碱性蛋白酶。

16．根据权利要求15的宿主细胞，其中碱性蛋白酶较好是由包括SEQ.ID.No.3所示核苷酸序列或其同源序列的cDNA序列编码的碱性蛋白酶。

17．根据权利要求1-16中任何一项的宿主细胞，其已在金属蛋白酶和碱性蛋白酶基因中编码的结构或调节区域内受到遗传修饰。

18．根据权利要求17的宿主细胞，其已通过特异性或随机诱变，PCR造成的诱变，位点特异性DNA缺失、插入和/或取代，基因破坏或基因置换技术、反义技术或联合使用的这些技术而受到遗传修饰。

19．根据权利要求1-18中任何一项的宿主细胞，其内金属蛋白酶的水平降低了约50％以上，优选在约85％以上，更优选在大约90％以上，最优选在大约95％以上。

20．根据权利要求1-18中任何一项的宿主细胞，其内碱性蛋白酶活性的水平降低了约50％以上，优选约85％以上，优选约90％以上，最优选约95％以上。

21．根据权利要求1-18中任何一项的宿主细胞，其中金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性的降低是根据权利要求19或20的任何组合。

22．根据权利要求1-21中任何一项的宿主细胞，其中细胞基本上没有任何金属蛋白酶和碱性蛋白酶活性。

23．生产根据权利要求1-22中任何一项的宿主细胞的方法，其中亲代细胞受到修饰以表达与亲代细胞相比显著降低了活性水平的金属蛋白酶和碱性蛋白酶。

24．生产根据权利要求1-22中任何一项的宿主细胞的方法，其中所说的细胞已在金属蛋白酶和碱性蛋白酶基因中编码的结构和/或调节区域内受到遗传修饰。

25．在权利要求1-22中任何一项的宿主细胞内生产异源蛋白质产物的方法，其中该方法包括：

(a)将编码所说的蛋白质产物的核酸序列导入所说的宿主细胞中；

(b)在适当的生长培养基中培养步骤(a)的宿主细胞；并且

(c)分离所说的异源蛋白质产物。

26．根据权利要求25的方法，其中蛋白质产物是治疗上有活性的基因产物，如胰岛素、生长激素、胰高血糖素、促生长素抑制素、干扰素、EPO、TPO、PDGF、因子Ⅶ、因子Ⅷ、尿激酶、凝乳酶、组织纤溶酶原激活物或血清白蛋白。

27．根据权利要求25的方法，其中蛋白质产物是真菌来源的蛋白质。

28．根据权利要求27的方法，其中蛋白质产物是真菌酶，特别是淀粉水解酶，如α淀粉酶、β淀粉酶、葡糖淀粉酶、β半乳糖苷酶、纤维素水解酶、脂水解酶、木聚糖水解酶、蛋白水解酶、氧化还原酶如过氧化物酶或漆酶、果胶酶或角质酶。

29．根据权利要求25的方法，其中蛋白质产物是一种细菌蛋白质。

30．根据权利要求25-29中任何一项的方法，其中蛋白质产物是前体蛋白质，即酶原、杂合蛋白质，作为前序列或前原序列得到的或呈未成熟形式的蛋白质。

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