JP2001500381A - 新規な宿主細胞およびタンパク質生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.異種性タンパク質生産物の発現に有用な宿主細胞であって、親細胞に比べ て、メタロプロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ活性が有意に低下して発 現する様に遺伝的修飾を受けた前記細胞。 2.前記細胞が真菌細胞である、請求項1の宿主細胞。 3.前記細胞が酵母細胞である、請求項1の宿主細胞。 4.前記細胞が、サッカロミセス属の菌株、好ましくはサッカロミセス・セレ ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項3の宿主細胞。 5.前記細胞が糸状真菌である、請求項2の宿主細胞。 6.前記細胞が、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillu s)、カンジダ(Candida)、コクリオボラス(Cocliobolus)、エンドシア(Endothia )、フサリウム(Fusariu・)、ヒュミコラ(Humicola)、ニューロスポラ(Neurosp ora)、リゾムコール(Rhizomucor)、リゾプス(Rhizopus)、サーモミセス(Thermom yces)、トリコデルマ(Trichoderma)、ポドスポラ(Podospora)、ピリクラリア(Py ricularia)、およびペニシリウム(Penicillium)属の群中から選択される菌株で ある、請求項5の宿主細胞。 7.前記細胞が、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、ア スペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フェニキス( Aspergillus phoenicis)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonic us)、アスペルギルス・フィータス(Aspergillus foetus)、フサリウム・オキシ スポラム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・ソラニ(Fusarium solani)、ヒュ ミコラ・グリセア(Humicola grisea)、ニューロスポラ・クラサ (Neurospora crassa)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicilliumchrysogenum )、リゾムコール・メイヘイ(Rhizomucor meihei)、トリコデルマ・レセイ(Trich oderma reesei)、およびトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)の群中から 選択される菌株である、請求項6の宿主細胞。 8.前記細胞が、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae),アスペルギ ルス・ニガー(Aspergillus niger)およびATCC20334で同定されるフサリウム属の 種の群中から選択される菌株である、請求項6の宿主細胞。 9.前記メタロプロテアーゼが、フサリウム属のメタロプロテアーゼである、 請求項1−8の任意の1項の宿主細胞。 10.前記メタロプロテアーゼが、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxys porum)のp45メタロプロテアーゼである、請求項9の宿主細胞。 11.前記メタロプロテアーゼが、配列番号1の核酸配列、またはこれに相同な 配列を有するフサリウム・オキシスポラムのp45メタロプロテアーゼである、請 求項10の宿主細胞。 12.前記メタロプロテアーゼが、pH約6-8の範囲内で、至適タンパク質分解活 性を示す中性メタロプロテアーゼである、請求項1-11の任意の1項の宿主細胞。 13.前記メタロプロテアーゼが、アスペルギルス属のNpIまたはNpII類の中性 メタロプロテアーゼである、請求項12の宿主細胞。 14.前記メタロプロテアーゼが、アスペルギルス・オリゼの中性メタロプロテ アーゼI、好ましくは配列番号2の核酸配列またはこれの相同配列に由来するア ミノ酸配列を有するものである、請求項13の宿主細胞。 15.前記アルカリ性プロテアーゼが、アスペルギルス属のアルカ リ性プロテアーゼである、請求項1-14の任意の1項の宿主細胞。 16.前記アルカリ性プロテアーゼが、好ましくは、配列番号3の核酸配列また はこれの相同配列を含むcDNA配列によってコードされているものである、請求項 15の宿主細胞。 17.前記細胞が、前記メタロプロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ遺伝 子内にコードされている構造領域および制御領域において遺伝的に修飾される、 請求項1-16の任意の1項の宿主細胞。 18.前記細胞が、特異的またはランダム突然変異、PCRによる突然変異、部位 特異的DNAの欠失、挿入および/または置換、遺伝子破壊または遺伝子置換、ア ンチセンス法、あるいはこれらの組み合わせによって、遺伝的に修飾される、請 求項17の宿主細胞。 19.メタロプロテアーゼのレベルが、約50%より大きく、好ましくは約85%よ り大きく、好ましくは約90%より大きく、最も好ましくは約95%より大きく低下 する、請求項1-18の任意の1項の宿主細胞。 20.アルカリ性プロテアーゼ活性のレベルが、約50%より大きく、好ましくは 約85%より大きく、好ましくは約90%より大きく、最も好ましくは約95%より大 きく低下する、請求項1-18の任意の1項の宿主細胞。 21.メタロプロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ活性の低下が、請求項 19または20に示された低下の任意の組み合わせである、請求項1-18の任意の1項 の宿主細胞。 22.前記細胞が、本質的に任意のメタロプロテアーゼおよびアルカリ性プロテ アーゼ活性を含まない、請求項1-21の任意の1項の宿主細胞。 23.親細胞に比べて、メタロプロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ活性 が有意に低下して発現する様に、親細胞を修飾するこ とを含む、請求項1-22の任意の1項の宿主細胞を生産する方法。 24.前記細胞が、前記メタロプロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ遺伝 子内にコードされている構造領域および/または制御領域において遺伝的に修飾 されることを含む、請求項1-22の任意の1項の宿主細胞を生産する方法。 25.請求項1-22の任意の1項の宿主細胞において、異種性タンパク質生産物を 生産する方法であって、 (a)前記タンパク質生産物をコードする核酸配列を、前記細胞内に導入する工 程; (b)適当な増殖培地中で、工程(a)の宿主細胞を培養する工程; (c)前記異種性タンパク質生産物を単離する工程; を含んでいる前記方法。 26.前記タンパク質生産物が、治療活性のある遺伝子産物、例えばインスリン 、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフエロン、EPO、TPO、 PDGF、第VII因子、第VIII因子、ウロキナーゼ、キモシンまたは組織プラスミノ ーゲンアクチベーターまたは血清アルブミンである、請求項25の方法。 27.前記タンパク質生産物が、真菌由来のタンパク質である、請求項25の方法 。 28.前記タンパク質生産物が、真菌の酵素、特にデンプン分解酵素、例えばα アミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ、βガラクトシダーゼ、セルロー ス分解酵素、脂質分解酵素、キシラン分解酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元 酵素、例えばペルオキシダーゼまたはラッカーゼ、ペクチナーゼ、あるいはクチ ナーゼである、請求項27の方法。 29.前記タンパク質生産物が、細菌のタンパク質である、請求項 25の方法。 30.前記タンパク質生産物が、前駆体タンパク質、すなわちチモーゲン、ハイ ブリッドタンパク質、プロ配列またはプレプロ配列として得られるタンパク質、 あるいは任意の他の未成熟な型のタンパク質である、請求項25-29の任意の1項 の方法。
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