ES2317706T3 - Metodo para produicir polipeptidos en celulas mutantes de aspergillus. - Google Patents
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Abstract
Un método para la producción de un polipéptido de interés, que comprende: (a) cultivar un mutante de una célula progenitora de Aspergillus, donde (i) el mutante comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, y (ii) el mutante produce menos de al menos una toxina de interés que la célula progenitora de Aspergillus cuando se cultivan bajo las mismas condiciones; y (b) aislar el polipéptido del medio de cultivo.
Description
Métodos para producir polipéptidos en células
mutantes de Aspergillus.
La presente invención se refiere a métodos para
producir polipéptidos de interés en células mutantes de Aspergillus
deficitarias de toxinas. La presente invención también se refiere a
mutantes de células de Aspergillus y a métodos para obtener, dichas
células mutantes. Además la presente invención se refiere a una
dimetil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa aislada y a las secuencias de ácidos nucleicos que la
codifican.
El uso de células huéspedes recombinantes en la
expresión de polipéptidos heterólogos ha simplificado en los
últimos años inmensamente la producción de grandes cantidades de
polipéptidos comercialmente valiosos, tales como enzimas
industrialmente importantes y metabolitos secundarios, que de lo
contrario son obtenibles sólo a cantidades inferiores o por
purificación de sus fuentes nativas. Habitualmente, hay una
selección variada de sistemas de expresión para elegir para la
producción de cualquier polipéptido dado, incluyendo huéspedes
eubacterianos y eucarióticos. La selección de un sistema de
expresión apropiado frecuentemente depende no sólo de la capacidad
de la célula huésped para producir rendimientos adecuados del
polipéptido con la composición y conformación deseadas, pero, en
gran parte, puede también ser determinada por el extremo destinado
al uso de la proteína.
SU 1271068-A,(WPI AN
1994-271123) describe mutantes de Aspergillus
awamori que produce glucoamilasa como una proteína nativa de
interés. Estas cepas fueron obtenidas por selección genética y
fueron encontradas no tóxicas. La selección genética fue realizada
para conseguir un rendimiento más alto de glucoamilasa y no para
reducir la producción de cualquier toxina. WO 95/15391 y WO
95/15390 revelan un sistema de expresión "deficitario de
toxinas". No obstante, los documentos no hacen referencia
respecto a si el mutante produce menos toxina bajo las mismas
condiciones de cultivo en comparación con la cepa progenitora de
Aspergillus.
Un problema encontrado con respecto al uso de
ciertos sistemas de huéspedes es la producción de micotoxinas.
Varios hongos, que son usados como células huéspedes en la
producción de polipéptidos de interés poseen genes que codifican
enzimas implicadas en la biosíntesis de varias toxinas. Por
ejemplo, ácido ciclopiazónico, ácido kójico, ácido
3-nitropropiónico y aflatoxinas son toxinas
conocidas, que se forman en, p. ej., Aspergillus flavus. De
forma similar, los tricoticenos se forman en varios hongos, p. ej.,
en Fusarium sp. tal como Fusarium venenatum y en
Trichoderma. Una visión general detallada de la formación de
toxinas en diferentes hongos puede ser encontrada en Handbook of
Toxic Fungal Metabolites, Richard J Cole y Richard H. Cox, Academic
Press, 1981.
La formación de tales toxinas durante la
fermentación de los polipéptidos de interés es altamente indeseable
ya que puede representar un riesgo para la salud tanto para
operarios, clientes y para el medio ambiente.
Consecuentemente, se ha hecho un gran esfuerzo
al asegurar que tales toxinas no están formadas bajo las
condiciones usadas en las producciones pertinentes en niveles
considerados que afectan a la salud. Esto se realiza principalmente
por un programa analítico extensivo donde las toxinas son
analizadas directamente y por ensayos biológicos y/o estudios de
alimentación. En muchos casos estos programas extensivos son
realizados en cada lote de producción individual afectando tanto a
los costes de producción como al tiempo antes de que los productos
puedan ser vendidos.
Ácido ciclopiazónico (de ahora en adelante
también referido como "CPA") es un ácido débil (pK_{a}: 3.5)
y precipitado bajo condiciones acídicas. Forma quelatos metálicos,
que pueden ser divididos por ácido diluido. Es bastante tóxico lo
que conduce entre otras cosas a cambios degenerativos y necrosis en
muchos órganos, e inhibe selectivamente
Ca^{2+}-ATPasa. CPA es producido en una forma
\alpha y \beta, la forma (\beta siendo un precursor de la
forma a. CPA es producido por Aspergilli pero también por otros
hongos, tales como Penicilli.
El ácido kójico (de ahora en adelante también
referido como "KA") es producido por un gran número de
Aspergilli pero también por otros hongos, tales como Penicilli, e
incluso por algunas bacterias. Es débilmente alcalino (pK_{a}:
7.9; grupo fenólico), y forma complejos con muchos iones metálicos.
Tiene actividad antimicrobiana y es débilmente tóxico para animales.
Es un precursor de varios compuestos sintéticos como insecticidas,
tintes, etc.
Ácido 3-nitropropiónico (de
ahora en adelante también referido como
"3-NPA") es un compuesto nitro natural. Es
producido por algunos hongos, especialmente Aspergilli (a.
flavus, A. wentii) y Penicilli (P. atroventum). Ha sido
proporcionado en pocas bacterias. El ácido o sus ésteres son también
encontrados en algunas plantas. Es más bien tóxico en sí mismo
conduciendo a, p. ej., anemia. También, puede ser parcialmente
convertido en otro compuesto tóxico el nitrito en el tracto
gastrointestinal. Ácido 3-nitropropiónico afecta al
ciclo de Krebs inhibiendo la succinato deshidrogenasa
irreversiblemente y la isocitrato liasa, fumarasa y aspartasa
reversiblemente.
Las aflatoxinas son metabolitos secundarios
extremadamente activos biológicamente producidos por los hongos
Aspergillus flavus Link ex. Fries y Aspergillus
parasiticus Speare; véase R.W. Detroy et al. "Aflatoxin
and related compounds", en Microbial Toxins, Vol. 6 (A. Ciegler,
S. Kadis, y S.J. Ajl, eds.) Academic, New York, 1971, págs.
3-178. Las aflatoxinas más importantes son B_{1},
B_{2}, G_{1}, y G_{2}. Los metabolitos, particularmente la
aflatoxina B_{1}, no es sólo tóxica para animales al igual que
seres humanos pero son también los más cancerígenos de todos los
compuestos naturales conocidos.
Las malforminas y ocratoxinas son producidas por
A. Niger.
Eliminando o reduciendo la capacidad de los
organismos huéspedes para producir toxinas, el procedimiento de
aprobación regulador será mucho más simple y se puede ahorrar
tiempo y dinero en la fase de producción puesto que el programa
analítico puede ser reducido.
Habitualmente, hay una necesidad de células
mutantes de Aspergillus deficitarias de toxinas (es decir,
organismos salvos preferiblemente clasificados como GRAS), que son
adecuados para producir polipéptidos de interés de una manera
eficaz y económica. La presente invención satisface esta necesidad
suministrando la producción de polipéptidos de interés usando
células huéspedes mutantes de Aspergillus deficitarias de toxinas y
suministrando un método para construir este tipo células huéspedes
mutantes. Hay también una necesidad de suministrar células mutantes
de Aspergillus, que en su forma progenitora albergue (a)
gen(es) de toxinas, que no es(son)
expresado(s), es decir, gen(es)
silencioso(s).
silencioso(s).
Conforme a un aspecto de la presente invención,
se prevé un método para producir un polipéptido de interés por una
célula huésped mutante de Aspergillus, que comprende (a) cultivar
un mutante de una célula progenitora de Aspergillus, donde (i) el
mutante comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el polipéptido, y (ii) el mutante produce menos cantidad
de la toxina que la célula progenitora de Aspergillus cuando se
cultiva bajo las mismas condiciones; y (b) aislar el polipéptido
del medio de cultivo.
En una forma de realización preferida de la
invención, las células de Aspergillus mutantes producen al menos
aproximadamente un 90% menos de toxina que la célula progenitora
cuando se cultivan bajo las mismas condiciones. Preferiblemente, el
mutante produce menos de uno o más de ácido ciclopiazónico, ácido
kójico, ácido 3-nitropropiónico y aflatoxina que la
célula progenitora de Aspergillus cuando se cultivan bajo las mismas
condiciones.
Según otra forma de realización de la presente
invención se proveen células huéspedes mutantes de Aspergillus
deficitarias de toxinas útiles para la producción de un polipéptido
heterólogo de interés, esta célula ha sido modificada genéticamente
para producir menos de al menos una toxina en comparación con una
célula progenitora de Aspergillus, cuando se cultivan bajo las
mismas condiciones.
Las células mutantes de Aspergillus según la
invención son preferiblemente seleccionadas del grupo de A.
oryzae, A. aculeatus, A. nidulans, A. ficuum, A. flavus, A.
foetidus, A. soja, A. sake, A. niger, A. japonicus, A.
parasiticus, y A. phoenicus.
En otra forma de realización de la presente
invención un método está provisto para obtener una célula huésped
mutante de Aspergillus deficitaria de toxinas, que comprende (a)
introducir en una célula progenitora huésped de Aspergillus una
primera secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido
de interés y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que
comprende una modificación de al menos uno de los genes responsables
de la biosíntesis o secreción de al menos una toxina; y (b)
identificar el mutante de fase (a) que comprende las secuencias de
ácidos nucleicos.
En un aspecto la invención se refiere a células
mutantes de Aspergillus, adecuadas para la expresión de
polipéptidos heterólogos, donde uno o más genes de toxinas
silenciosos han sido eliminados.
Estas y otras formas de realización serán
perfiladas con más detalle en la descripción, que sigue a
continuación.
Figura 1 muestra la cartografía de restricción
genómica del gen DCAT-S de Aspergillus
oryzae realizada con las enzimas de restricción EcoRI, SalI,
BbuI, XhoI y XbaI, usando el fragmento de ADN BglII marcado en
^{32}P de 1 kb de pJaL499 conteniendo el gen
DCAT-S como una sonda.
Figura 2 muestra la construcción del plásmido de
ruptura p(DCAT-S-pyrG).
Para el propósito de la aplicación presente, los
términos siguientes son definidos para una mejor comprensión de la
invención.
\newpage
El término "vector(es)" significa
plásmido, cósmido, fago o cualquier otro vehículo para permitir
inserción, propagación y expresión de un gen o secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de interés incluyendo formas precursoras
del mismo.
El término "huésped(es)" significa
cualquier célula que permite la expresión de un polipéptido de
interés incluyendo formas precursoras del mismo.
El término "transformación" significa la
incorporación que permite la expresión de secuencias de ADN
heterólogas por una célula.
El término huésped (o cepa) "mutante"
significa una cepa genéticamente modificada, que incluye ambos
transformantes y mutantes de una cepa de tipo salvaje.
El término "toxina" significa un metabolito
de hongos con actividad fitotóxica, zootóxica y antibiótica. El
término "micotoxina" es normalmente definido como un
metabolito secundario producido por un hongo con el potencial de
causar un efecto adverso para la salud en seres humanos y animales
por niveles de exposición. En el presente contexto los términos
"toxina" y "micotoxina" pueden ser usados de forma
intercambiable.
El término "deficitario de toxinas" como se
ha usado con respecto a una célula mutante de la invención
significa que el mutante tiene una producción de toxinas incompleta
en comparación con su cepa progenitora, es decir, que el mutante
produce menos de al menos una y preferiblemente más de una toxina
que la célula progenitora.
El término "mismas condiciones" como se usa
en la fase a) del método de la invención está relacionado con la
producción de toxina del mutante a aquella de la célula progenitora
y se destina a indicar que condiciones similares, p. ej., respecto
al pH, temperatura, oxígeno, etc. son usadas para la fermentación
del mutante y la cepa progenitora. Las células progenitoras y
mutantes pueden ser comparadas con respecto a la producción de
la(s) toxina(s) en cuestión bajo condiciones
propicias para la producción de un polipéptido de interés o bajo
condiciones propicias para la producción de la(s)
toxina(s).
La presente invención proporciona mutantes de
células huéspedes de Aspergillus útiles para la expresión de
polipéptidos de interés, donde las células han sido genéticamente
modificadas para expresar niveles significativamente reducidos de
una o más toxinas en comparación con una célula progenitora. La
célula huésped es derivada de la célula progenitora, que puede ser
una célula de tipo salvaje.
Las cepas huéspedes pueden ser cualquier célula
huésped de Aspergillus usada de forma convencional para la
expresión de polipéptidos de interés.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped de Aspergillus útil para la producción de un polipéptido de
interés es seleccionada del grupo que consiste en los subgrupos de
Aspergillus Eurotium (p. ej., representado por las especies
de A. restrictus), Chaetosartorya (p. ej., representado por
las especies de A. cremeus), Sclerocleista (p. ej.,
representado por las especies de A. ornati), Satoia (p. ej.,
representado por las especies de A. niger), Neosartoria (p.
ej., representado por las especies de A. fumigatus, A.
cervinus), Hemicarpenteles (p. ej., representado por las
especies de A. clavatus), Petromyces (p. ej., representado
por las especies de A. flavus, A. candidus, A. sparsus),
Emericella (p. ej., representado por las especies de A. nidulans,
A. versicolor, A. ustus), y Fenellia (p. ej., representado por
las especies de A. terreus).
En una forma de realización particular
preferida, la célula huésped de Aspergillus es seleccionada del
grupo que consiste en A. oryzae, A. aculeatus, A. ficuum, A.
flavus, A. foetidus, A. soja, A. sake, A. niger, A. nidulans y
A. japonicus. Entre éstas, Aspergillus oryzae y
Aspergillus niger, A. parasiticus, y A. phoenicus son
más preferidas.
En los ejemplos anteriores de células huéspedes
de la invención son denominadas según la taxonomía actualmente
aceptada.
La toxina cuya producción debe resumirse o
eliminarse según la presente invención puede ser cualquier toxina
producida por Aspergilli o codificada por un gen albergado en
Aspergilli, pero no necesariamente expresado. Por ejemplo, se sabe
que los genes de aflatoxina están presentes en A. oryzae,
pero no expresados a partir de estas especies. No obstante, puede
además ser ventajoso eliminar genes de la ruta de aflatoxina aunque
no estén expresados. Esto se describirá adicionalmente más abajo y
se ilustrará en el Ejemplo 6.
En particular, la toxina para ser reducida o
eliminada es seleccionada del grupo que consiste en ácido
ciclopiazónico (CPA), p. ej., la forma alfa o beta de la misma,
ácido kójico (KA), ácido 3-nitropropiónico (NPA),
emodina, malforminas (p. ej., Malformina A o B), aflatoxinas,
ocratoxinas, flaviolina, y ácidos secalónicos (p. ej., secalónico
D). Para otra descripción de estas toxinas véase la sección
antecedentes de la presente invención al igual que el Handbook of
Toxic Fungal Metabolites al que se hace referencia en la
sección.
La presente invención también se refiere a las
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasas aisladas obtenidas de un hongo filamentoso, seleccionado
del grupo que consiste en (a) una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. (b)
una variante alélica de (a); y (c) un fragmento de (a) o (b), donde
el fragmento tiene actividad
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa.
Preferiblemente, las
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasas de la presente invención comprenden la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID NO: 2, o una variante alélica de la misma.
En una forma de realización más preferida, las
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasas de la presente invención comprenden la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID NO: 2. En otra forma de realización
preferida, una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID NO: 2 o fragmentos de la misma, donde el fragmento
tiene actividad
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa. Un fragmento de la SEC ID NO: 2 es un polipéptido que
tiene uno o más aminoácidos delecionado del término amino y/o
carboxi de esta secuencia de aminoácidos. En una forma de
realización más preferida, la
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.
Preferiblemente, un fragmento de la SEC ID NO:
mínimo 320 residuos aminoácidos, y de la forma más preferible al
menos 350 residuos aminoácidos.
Una variante alélica designa cualquiera de dos o
más formas alternativas de un gen que ocupa la misma localización
cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de la
mutación, y puede suponer polimorfismo fenotipico dentro de las
poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún
cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar
polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. El
término variante alélica de un polipéptido es un polipéptido
codificado por una variante alélica de un gen.
La secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o
una secuencia parcial de la misma puede ser usada para diseñar una
sonda de oligonucleótidos, o una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa de la presente invención, tal como la secuencia de ácidos
nucleicos de la SEC ID NO: 1, o una subsecuencia de la misma, puede
ser usada para identificar y clonar ADN que codifica
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasas de otras cepas fúngicas filamentosas según métodos bien
conocidos en la técnica. En particular, tales sondas pueden ser
usadas para la hibridación con el ADNc o genómico del género o
especie de interés, según procedimientos estándares de transferencia
de Southern, para identificar y aislar el gen correspondiente en su
interior. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que
la secuencia entera, pero deberían ser al menos 15, preferiblemente
al menos 25, y más preferiblemente al menos 40 nucleótidos en
longitud. Sondas más largas pueden también ser usadas. Ambas sondas
de ADN y ARN pueden ser usadas. Las sondas son normalmente marcadas
para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P,
^{3}H, ^{35}S, biotina, o avidina).
La hibridación indica que la secuencia de ácidos
nucleicos hibrida a la sonda de oligonucleótidos correspondiente al
polipéptido que codifica parte de la secuencia de ácidos nucleicos
mostrada en la SEC ID NO:1 o contenida en pJaL499, bajo condiciones
de astringencia bajas a altas (es decir, prehibridación e
hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y bien 25, 35 o 50%
formamida para astringencias bajas, medias y altas,
respectivamente), según procedimientos estándares de transferencia
de
Southern.
Southern.
Así, una biblioteca genómica, de ADNc o química
combinatoria obtenida a partir de otras cepas filamentosas fúngicas
pueden ser seleccionadas para ADN que se hibrida con las sondas
anteriormente descritas y que codifica una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa. El ADN genómico u otro de otras cepas filamentosas
fúngicas pueden ser separados por agarosa o electroforesis en gel
de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las
bibliotecas o el ADN separado pueden ser transferidos a e
inmovilizados en nitrocelulosa u otro material portador adecuado.
Para identificar un clon o ADN que es homólogo a la SEC ID NO:1, el
material portador se usa en una transferencia de Southern donde el
material portador es lavado finalmente tres veces durante 30
minutos usando cada uno 2 X SSC, 0.2% SDS preferiblemente al menos
50ºC, más preferiblemente al menos 55ºC, más preferiblemente al
menos 60ºC, más preferiblemente al menos 65ºC, incluso más
preferiblemente al menos 70ºC, y de la forma más preferible al
menos 75ºC. Las moléculas a las que la sonda de oligonucleótidos se
hibrida bajo estas condiciones son detectadas usando una película
radiográfica.
En una forma de realización preferida, una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa de la presente invención es obtenida de una cepa de
Aspergillus, y más preferiblemente de A. oryzae, p. ej., el
polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.
Tal y como se define aquí, una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa "aislada" es un polipéptido que está esencialmente
libre de otros polipéptidos, p. ej., al menos aproximadamente con
un 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40%
de pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60% de pureza,
incluso más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, de la
forma más preferible aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de
la forma más preferible aproximadamente un 95% de pureza, según ha
sido determinado por
SDS-PAGE.
SDS-PAGE.
La presente invención también se refiere a las
secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican las
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasas obtenidas de un hongo filamentoso, y en una forma de
realización más preferida, la secuencia de ácidos nucleicos es
obtenida de Aspergillus sp, p. ej., A. oryzae, en
particular la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEC ID
NO: 1. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de
ácidos nucleicos es la secuencia contenida en el plásmido pJaL499.
La presente invención también comprende secuencias de ácidos
nucleicos que difieren de la SEC ID NO: 1 en virtud de la
degeneración del código genético. La presente invención también se
refiere a subsecuencias de la SEC ID NO: 1 o a la parte codificante
del polipéptido de pJaL499, que codifica fragmentos del polipéptido
que tienen actividad
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa. Una subsecuencia de la SEC ID NO: 1 o de la parte
codificante del polipéptido de pJaL499 es una secuencia de ácidos
nucleicos comprendida por la SEC ID NO: 1 o la parte codificante
del polipéptido de pJaL499 a excepción de que uno o más nucleótidos
del extremo 5' y/o 3' han sido delecionados. Preferiblemente, una
subsecuencia de la SEC ID NO: 1 contiene al menos 870 nucleótidos,
más preferiblemente al menos 960 nucleótidos, y de la forma más
preferible al menos 1050 nucleótidos.
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser
obtenidas de microorganismos que son equivalentes taxonómicos de
Aspergillus oryzae.
Las técnicas usadas para aislar o clonar tales
secuencias de ácidos nucleicos están descritas aquí. El término
"secuencia de ácidos nucleicos aislada" según se utiliza en
este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está
esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p.
ej., al menos aproximadamente con un 20% de pureza, preferiblemente
al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente al
menos aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente
al menos aproximadamente un 80% de pureza, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente un 90% de pureza, según ha sido
determinado por electroforesis de agarosa. La secuencia de ácidos
nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN,
semisintético, sintético, o combinaciones cualquiera de estos.
La modificación de una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa de la presente invención puede ser necesaria para la
síntesis de enzimas sustancialmente similares al polipéptido. El
término "sustancialmente similar" a la
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa se refiere a formas de la enzima que no se producen
naturalmente. Estas
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasas pueden diferir en alguna vía creada genéticamente de la
enzima aislada de su fuente nativa. Por ejemplo, puede ser
interesante sintetizar variantes de la enzima donde las variantes
difieren en actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, o
similar usando, p. ej., mutagénesis sitio dirigida. La secuencia
análoga puede ser construida basándose en la secuencia de ácidos
nucleicos presentada como la parte codificante del polipéptido de
la SEC ID NO: 1, p. ej., una subsecuencia de la misma, y/o por
introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a
otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la
secuencia de ácidos nucleicos, pero que corresponde al uso del codón
del organismo huésped destinado a la producción del polipéptido, o
por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar
lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una
descripción general de sustitución de nucleótidos, véase, p. ej.,
Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:
95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica
que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones
fundamentales para la función de la molécula y además resultan en
una
dimetil,alil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa biológicamente activa. Los residuos de aminoácidos
esenciales para la actividad de la
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa codificada por una secuencia de ácidos nucleicos aislada de
la invención, y en consecuencia preferiblemente no sujetos a
sustitución, pueden ser identificados según procedimientos
conocidos en la técnica, tales como mutagénesis sitio dirigida o
mutagénesis de barrido de alanina (véase, p. ej., Cunningham and
Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta
técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado
positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes
son evaluadas por su actividad
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa para identificar residuos de aminoácidos que son
fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de
interacción de enzima sustrato pueden también ser determinados por
análisis de la estructura tridimensional según está determinado por
tales técnicas como análisis de resonancia magnética nuclear,
cristalografía o marcado por fotoafinidad (véase, p. ej., de Vos
et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith
et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:
899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters
309: 59-64).
Un uso preferido de la secuencia de ácidos
nucleicos de la invención u homólogos o fragmentos de los mismos es
eliminar o reducir la actividad
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa de una célula huésped dada, en particular una célula de
A. oryzae, de ese modo reduciendo o eliminando la producción
de CPA de dicha célula.
La presente invención también se refiere a
constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión
recombinantes, y células huéspedes que contienen la secuencia de
ácidos nucleicos de la SEC ID NO: 1 o a la parte codificante del
polipéptido de pJaL499, subsecuencias u homólogos de las mismas,
para la expresión de las secuencias. Los constructos y vectores
pueden ser construidos como se describe en este caso. La célula
huésped puede ser cualquier célula adecuada para la expresión de la
secuencia de ácidos nucleicos y puede ser seleccionada p. ej., de
las células progenitoras o mutantes descritas aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar niveles significativamente
reducidos de una o más toxinas, la célula huésped de la invención
es genéticamente modificada, lo que puede ser conseguido usando
tecnologías estándares conocidas por el experto en la materia. Las
secuencias génicas responsables de la producción de la actividad de
la toxina pueden ser inactivadas o eliminadas parcialmente o en su
totalidad. Así, una célula huésped mutante de Aspergillus según la
invención expresa niveles reducidos o no detectables de una o más
toxinas.
En una forma de realización particular, la
inactivación es obtenida por modificación de las regiones
estructurales o reguladoras respectivas (tales como genes)
implicadas en la formación o secreción de la toxina de elección.
Técnicas conocidas y útiles incluyen, pero no se limitan a,
mutagénesis específica o aleatoria, mutagénesis generada por PCR,
deleción inserción y/o sustitución de ADN específico del sitio,
interrupción génica o sustitución génica, técnicas antisentido, o
una combinación de las mismas.
La mutagénesis puede ser realizada usando un
agente mutagenizante químico o físico adecuado. Ejemplos de un
agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente
objetivo incluyen, pero no se limitan a, irradiación UV,
irradiación de ionización tal como irradiación de gamma,
hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano sulfonato (EMS), bisulfito sódico, y análogos de
nucleótidos. Cuando tales agentes son usados la mutagénesis es
normalmente realizada incubando la célula que debe ser mutagenizada
en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones
adecuadas, y seleccionando células que muestren una producción
significativamente reducida de la(s) toxina(s)
específica(s).
Reducción o eliminación de la producción de una
toxina dada por una célula huésped puede también ser conseguida por
modificación de una secuencia de nucleótidos implicada en o por el
contrario necesaria para la producción o secreción de la toxina.
Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede codificar un
producto genético que tenga una función necesaria en la ruta
conduciendo a la producción de toxina. La secuencia de nucleótidos
puede, p. ej., ser la primera mostrada en la SEC ID NO: 1 o la parte
codificante del polipéptido de pJaL499. La modificación puede ser
realizada por la introducción, sustitución o eliminación de uno o
más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos o un elemento
regulador requerido para la transcripción o traducción de la
secuencia. Por ejemplo, los nucleótidos pueden ser insertados o
eliminados para suponer la introducción de un codón de detención,
la eliminación de un codón de iniciación o un cambio del marco de
lectura abierto de la secuencia de nucleótidos. La modificación o
inactivación de la secuencia o un elemento regulador de la misma
puede ser realizado por mutagénesis dirigida o aleatoria o
mutagénesis generada por PCR conforme a métodos conocidos en la
técnica. Aunque, en principio, la modificación in vivo puede
ser realizada, es decir, directamente en la célula que expresa
el(los) gen(es) de toxina, es actualmente preferido
que la modificación se realice in vitro como está
ejemplificado más abajo.
Un ejemplo de un conveniente modo de inactivar o
reducir la producción de una toxina de interés, p. ej., CPA, de una
célula micótica filamentosa de elección se basa en técnicas de
sustitución génica, deleción génica, o interrupción génica. Por
ejemplo, en el método de interrupción génica, una secuencia de
ácidos nucleicos correspondiente al gen endógeno o fragmento de gen
de interés (p. ej., el gen DCAT-S de la invención)
es mutagenizado in vitro para producir una secuencia de
ácidos nucleicos defectuosa que es luego transformada en la célula
progenitora para producir un gen defectuoso. Por recombinación
homóloga, la secuencia de ácidos nucleicos defectuosa reemplaza el
gen endógeno o fragmento de gen. Puede ser deseable que el gen
defectuoso o fragmento de gen también codifique un marcador, que
puede ser usado para selección de transformantes donde la secuencia
de ácidos nucleicos ha sido modificada o destruida.
De forma alternativa, la modificación o
inactivación del gen puede ser realizada por técnicas antisentido
establecidas usando una secuencia de nucleótidos complementaria a
la secuencia de ácidos nucleicos del gen. Más específicamente, la
expresión del gen por una célula micótica filamentosa puede ser
reducida o eliminada introduciendo una secuencia de nucleótidos
complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos del gen, que puede
ser transcrito en la célula y es capaz de hibridar al ARNm
producido en la célula. Bajo condiciones que permiten la secuencia
de nucleótidos antisentido complementaria para hibridar al ARNm, la
cantidad de proteína traducida es por tanto reducida o
eliminada.
Después de la mutagénesis u otra modificación de
genes de una ruta de toxina los mutantes son seleccionados por su
producción de toxina reducida o eliminada. Ejemplos específicos de
cómo seleccionar toxinas están dados en los ejemplos abajo. De
forma alternativa, ensayos de selección útiles están descritos en
el "Handbook of Toxic Fungal Metabolites" o están disponibles
en instituciones que controlan normalmente el nivel de micotoxinas
en, p. ej., productos alimenticios.
En consecuencia, debido a la modificación
genética, la célula huésped mutante de Aspergillus según la
presente invención expresa niveles significativamente reducidos de
toxina(s). En una forma de realización preferida, el nivel
de esta(s) toxina(s) expresada(s) por la célula
huésped mutante ha sido reducido individualmente más de
aproximadamente el 50%, preferiblemente más de aproximadamente el
85%, más preferiblemente más de aproximadamente el 90%, y de la
forma más preferible más de aproximadamente el 95%, o incluso más
del 99%. En otra forma de realización preferida estas toxinas en la
célula huésped mutante según la invención pueden ser reducidas en
cualquier combinación. En una forma de realización adicional
preferida, el producto expresado por la célula huésped está
esencialmente libre de al menos una toxina del grupo de ácido
ciclopiazónico, ácido kójico, ácido
3-nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas,
ocratoxinas y ácidos secalónicos. En forma de realización
particularmente preferida, el producto expresado por la célula
huésped está esencialmente libre de al menos ácido ciclopiazónico,
más particularmente libre de al menos ácido ciclopiazónico y ácido
kójico o una aflatoxina, y de la forma más preferible libre de al
menos ácido ciclopiazónico, ácido kójico y ácido
3-nitropropiónico.
En una forma de realización preferida la célula
huésped es una cepa de A. oryzae que tiene una producción
reducida o eliminada de uno o más de NPA, CPA, ácido kójico (KA) o
maltorizina, preferiblemente al menos dos de estas toxinas tales
como NPA y CPA; NPA y KA; CPA y KA; o NPA, CPA y KA. Además, además
de la eliminación o reducción de una o más de estas toxinas,
preferiblemente un gen de una ruta de aflatoxina de elección es
inactivado de modo que la cepa resultante mutante es incapaz de
producir la aflatoxina. Los genes de aflatoxina de A. flavus
son conocidos y pueden ser usados para identificar los genes
correspondientes en A. oryzae, que pueden luego ser
inactivados por métodos conocidos en la técnica.
En otra forma de realización preferida la célula
huésped es una cepa de A. Niger o A. ficuum que tiene
una producción reducida o eliminada de una o más de malformina (por
ejemplo malformina A1 o B), una ocratoxina (p. ej., ocratoxina A),
y flaviolina, preferiblemente al menos dos de estas toxinas tales
como malformina y ocratoxina; malformina y flaviolina; ocratoxina y
flaviolina; y malformina, ocratoxina y flaviolina.
En otra forma de realización preferida la célula
huésped es una cepa de A. aculeatus que tiene una producción
reducida o eliminada de uno o más de uno de los ácidos secalónicos
(p. ej., ácido secalcónico D) o emodina (un precursor para
secalónico D), preferiblemente de ambos de estos tipos de
toxina.
\vskip1.000000\baselineskip
Por el método de la presente invención, la
cantidad de cierta(s) toxina(s) específica(s)
es significativamente reducida, mientras que las características de
la célula huésped mutante en cuanto a mantenimiento estable en la
célula de los genes genéticamente modificados que codifican el
polipéptido de interés, la capacidad de producción de la célula y
el rendimiento del polipéptido de interés es sustancialmente
mantenido. Más específicamente, por el método de la invención, la
célula huésped es genéticamente modificada dentro de regiones
estructurales y/o reguladoras necesarias para la producción o
secreción de una o más toxinas de interés de ese modo eliminando o
reduciendo la producción o secreción de dicha(s) toxina
(s).
En consecuencia, otro aspecto de la invención
proporciona un método para producir polipéptidos o proteínas en una
célula huésped mutante de Aspergillus según la invención,
incluyendo polipéptidos o proteínas heterólogos, dicho método
comprende introducir en dicha célula huésped mutante una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de interés,
cultivar la célula huésped mutante en un medio de crecimiento
adecuado, y recuperar dicho polipéptido de interés.
Así, la célula huésped mutante según la
invención debe contener regiones genéticas estructurales y
reguladoras necesarias para la expresión del polipéptido de interés.
La naturaleza de tales regiones estructurales y reguladoras depende
en gran parte del producto dirigido y de la cepa huésped de
Aspergillus particular. El diseño genético de la célula huésped
según la invención puede ser realizado por el experto en la técnica
usando la tecnología del ADN recombinante estándar para la
transformación o transfección de una célula huésped (véase, p. ej.,
Sambrook et al.).
Preferiblemente, la célula huésped es modificada
por métodos conocidos en la técnica para la introducción de un
vehículo de clonación apropiado, es decir, un plásmido o un vector,
que comprende un fragmento de ADN que codifica el polipéptido de
interés deseado. El vehículo de clonación puede ser introducido en
la célula huésped bien como un plásmido que se replica de manera
autónoma o integrado en el cromosoma. Preferiblemente, el vehículo
de clonación comprende una o más regiones estructurales
operativamente enlazadas a una o más regiones reguladoras
apropiadas.
Las regiones estructurales son regiones de
secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de interés.
Las regiones reguladoras incluyen regiones del promotor
comprendiendo la transcripción y secuencias de control de la
traducción, regiones del terminador comprendiendo señales de
detención, y regiones de poliadenilación. El promotor, es decir,
una secuencia de nucleótidos que presenta una actividad
transcripcional en la célula huésped de elección, puede ser uno
derivado de un gen que codifica una proteína extracelular o
intracelular, preferiblemente una enzima, tal como una amilasa, una
glucoamilasa, una proteasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa,
una oxidorreductasa, una pectinasa, una cutinasa, o una enzima
glicolítica. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de los constructos de ácidos nucleicos en los métodos
de la presente invención son promotores obtenidos de genes que
codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la
proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la
alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la
alfa-amilasa estable en ácido Aspergillus
niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o
Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei,
la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato
isomerasa de Aspergillus oryzae, la acetamidasa de
Aspergillus nidulans, la acetamidasa (amdS) de
Aspergillus oryzae, la proteasa de tipo tripsina de
Fusarium oxysporum (patente U.S. nº. 4,288,627), y,
promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos. Promotores
particularmente preferidos son los promotores de
NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes
que codifican la alfa-amilasa neutra de
Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de
Aspergillus oryzae), glucoamilasa, y promotores de TAKA
amilasa.
El vehículo de clonación también puede incluir
un marcador seleccionable. Un marcador seleccionable es un gen cuyo
producto proporciona resistencia a biocidas o vírica, resistencia a
metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Un marcador
seleccionable para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica
puede ser seleccionado del grupo que incluye, pero no se limita a,
amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar
(fosfinotricina acetiltransferasa), hygB (higromicina
fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG
(orotidina-5'-fosfato
decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato
sintasa), al igual que otras especies equivalentes. Preferido para
el uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de
Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen
bar de Streptomyces higroscopicus. Además, la selección
puede ser realizada por cotransformación, donde la transformación se
realiza con una mezcla de dos vectores y la selección se hace para
un sólo vector.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en vehículos de
clonación adecuados conteniendo la información necesaria para la
replicación, son conocidos por los expertos en la técnica (véase,
p. ej., Sambrook et al., 1989. ibid.).
La célula micótica filamentosa mutante es
cultivada en un medio nutritivo adecuado para la producción de un
polipéptido de interés usando métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en frasco de
agitación, fermentación a pequeña escala o gran escala (incluyendo
fermentaciones continuas, en flujo discontinuo, o en estado sólido)
en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un
medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido
heterólogo sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en
un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y de
carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la
técnica. Medios adecuados están disponibles por proveedores
comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas
(p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). El
polipéptido segregado puede ser recuperado directamente del
medio.
El polipéptido puede ser detectado usando
métodos conocidos en la técnica que son específicos para el
polipéptido. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de
anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, la
desaparición de un sustrato enzimático, o SDS-PAGE.
Por ejemplo, un ensayo enzimático puede ser usado para determinar
la actividad del polipéptido. Los procedimientos para determinar la
actividad enzimática son conocidos en la técnica para muchas
enzimas.
El resultante polipéptido puede ser aislado por
métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede
ser aislado del medio nutritivo por procedimientos convencionales
que incluyen, pero no se limitan a, centrifugado, filtración,
extracción, secado por atomización, evaporación, o precipitación.
El polipéptido aislado puede luego ser purificado adicionalmente
por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que
incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (p. ej., por
intercambio fónico, de afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfoque, y
exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej.,
isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej.,
precipitación de sulfato amónico), o extracción (véase, p. ej.,
Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH
Publishers, New York, 1989)).
\vskip1.000000\baselineskip
El producto final deseado, es decir, el
polipéptido de interés expresado por la célula huésped mutante de
Aspergillus, puede ser cualquier proteína o péptido homólogo o
heterólogo.
El polipéptido puede ser cualquier polipéptido
heterólogo a la célula micótica filamentosa mutante. El término
"polipéptido" no pretende aquí referirse a una longitud
específica del producto codificado y, en consecuencia, comprende
péptidos, oligopéptidos, y proteínas. El polipéptido heterólogo
puede también ser una variante de un polipéptido creada
genéticamente. El término "polipéptido heterólogo" está
definido aquí como un polipéptido, que no es nativo a la célula
micótica filamentosa. La célula micótica filamentosa mutante puede
contener una o más copias de la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el polipéptido heterólogo.
En los métodos de la presente invención, la
célula micótica filamentosa mutante puede también ser usada para la
producción recombinante de polipéptidos, que son nativos a la
célula. Los polipéptidos nativos pueden ser producidos
recombinantemente por, p. ej., colocación de un gen que codifica el
polipéptido bajo el control de un promotor diferente para aumentar
la expresión del polipéptido, para acelerar la exportación de un
polipéptido nativo de interés fuera de la célula usando una
secuencia señal, y para aumentar el número de copias de un gen que
codifica el polipéptido normalmente producido por la célula. La
presente invención también comprende, dentro del campo del término
"polipéptido heterólogo", tal producción recombinante de
polipéptidos homólogos, hasta tal punto que tal expresión implica
el uso de elementos genéticos no nativos a la célula, o el uso de
elementos nativos que han sido manipulados para funcionar en cierto
modo que normalmente no ocurre en la célula huésped.
En una forma de realización más específica, el
producto es un péptido o proteína terapéuticamente activo, tal como
una hormona, en particular insulina, hormona de crecimiento,
glucagón, o somatostatina; una interleuquina, en particular
interferón; un factor de crecimiento hematopoyético, en particular
PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), EPO
(eritropoyetina), o TPO (trombopoyetina); una proteasa, en
particular factor VII, factor VIII, uroquinasa, quimosina, o TPA; o
albúmina de suero.
En otra forma de realización preferida, el
producto es una enzima de origen fúngico o bacteriano. La enzima es
preferiblemente una enzima glicosidasa, p. ej., una amilasa, en
particular una \alpha-amilasa, una
\beta-amilasa o una glucoamilasa; una glucano
1,4-\alpha-glucosidasa; una
aminopeptidasa; una carbohidrasa; una carboxipeptidasa; una
catalasa; una celulasa, en particular una
endo-1,4-\beta-glucanasa
o una endo-1,3
(4)-\beta-glucanasa; una
celulosa-1,4-\beta-celobiosidasa;
una quitinasa; una cutinasa; una ciclodextrina glicosiltransferasa;
una desoxirribonucleasa; una galactanasa; una galactosidasa, en
particular una \alpha-galactosidasa o una
\beta-galactosidasa; una endoglucanasa, en
particular una
endo-1,3-\beta-glucanasa,
una
endo-1,3-\alpha-glucanasa,
una
endo-1,2-\beta-glucanasa,
o una
endo-1,6-\beta-glucanasa;
una glucosidasa, en particular una
\alpha-glucosidasa o una
\beta-glucosidasa; una invertasa; una lacasa; una
enzima lipolítica, en particular una lipasa, una esterasa, una
fosfolipasa, o una liso-fosfolipasa; una liasa o una
pectato liasa; una manasa; una manosidasa; una poligalacturonasa;
una mutanasa; una oxidasa o una oxidorreductasa, tal como una
peroxidasa o una polifenoloxidasa; una oxigenasa; una pectinasa,
una endo-peptidasa o una
exo-peptidasa; una fitasa; una poligalacturonasa;
una proteasa; una ribonucleasa; una transglutaminasa; y una
xilanasa, en particular una
endo-1,4-\beta-xilanasa
o una
xilan-endo-1,3-\beta-xilosidasa.
En otra forma de realización preferida el
producto es un polipéptido híbrido, tal como proquimosina y
proteasas tipo pro-tripsina. La proteína heteróloga
expresada por la célula huésped puede, bajo condiciones adecuadas,
p. ej., ausencia de actividades de proteasa sustanciales, también
ser una proteína precursora tal como un zimógeno, una proteína
híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o una
secuencia prepro, o cualquier otra forma inmadura.
La invención está posteriormente ilustrada con
referencia a los ejemplos siguientes, que no deberían de ninguna
manera ser interpretados como limitando el ámbito de la invención
tal y como se define en las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
La ruta biosintéica para aflatoxina ha sido
estudiada en las especies aflatoxinogénicas de Aspergillus
flavus y Aspergillus parasiticus. En ambas especies
varios genes han sido identificados y han mostrado que se asocian en
una gran agrupación (revisado por Woloshuk, C. P. y Prieto, R, FEMS
Microbiology Letter (1998) 160:169-176). Varios de
los genes, incluido aflR, que codifican un gen que codifica la
expresión de otros genes de rutas, y omtA, que codifica la
O-metiltransferasa, han sido clonados y
secuenciados.
Los genes de aflatoxina están presentes en el
genoma de A. oryzae, pero no está expresado a partir de
estas especies. Aunque ninguna aflatoxina es expresada es además
ventajoso eliminar uno o más de estos genes de la ruta de
aflatoxina silenciosos. Los mutantes de Aspergilli, p. ej., mutantes
de A. oryzae, que tienen genes de aflatoxina, tales como los
genes aflR y/o omtA, eliminados son ventajosos, porque luego nuevos
mutantes no necesitan ser evaluados para la producción de
la(s) aflatoxina(s) en cuestión.
Así, en un aspecto la invención se refiere a
células mutantes de Aspergillus, adecuadas para la expresión de
polipéptidos heterólogos, donde uno o más genes de toxina
silenciosos han sido eliminados.
El que el(los) gen(es) de toxina
silenciosos han sido "eliminados" significa que el(los)
gen(es) en cuestión han sido cambiados o eliminados, p. ej.,
por técnicas de sustitución o ruptura génica bien conocidas en la
técnica (véase, p. ej., Miller et al., 1985, Molecular and
Cellular Biology, p. 1714-1721), en cierto modo
dando como resultado que dicho(s)
gen(es) silencioso(s) no está(n) comprendido(s) en la célula mutante.
gen(es) silencioso(s) no está(n) comprendido(s) en la célula mutante.
El término gen(es) de toxinas
"silencioso(s)" significa que el(los)
gen(es) de toxina no está(n) expresado(s).
El(los) gen(s) de toxinas
puede(n) ser eliminado(s) por deleción o ruptura
irreversiblemente de todo o parte
del(los) gen(es) de toxinas.
del(los) gen(es) de toxinas.
El término "deleción o ruptura
irreversiblemente de todo o parte del(los) gen(es) de
toxinas" significa que el(los) gen(es) de toxinas
en cuestión han sido bien eliminados o cambiados de modo que dichos
genes no codifican una toxina y no pueden volver a mutar
naturalmente, p. ej., durante la producción a un gen que codifica
una toxina.
Las células de Aspergillus en cuestión son
cualquiera de las descritas anteriormente y pueden ser
seleccionadas del grupo que consiste en los subgrupos de
Aspergillus Eurotium, Chaetosartorya, Sclerocleista, Satoia,
Neosartorya, Hemicarpenteles, Petromyces, Emericella, y
Fenellia.
Gen(es) de toxina en cuestión que
codifica(n) una o más toxinas incluyen toxinas seleccionadas
del grupo que consiste en ácido ciclopiazónico, ácido kójico, ácido
3-nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas,
ocratoxinas y ácidos secalónicos.
Específicamente contemplado(s)
es(son) el(los) gen(es) de toxina que
codifica(n) una aflatoxina, en particular
gen(es) de toxina de la agrupación de aflatoxina de A. oryzae, en particular seleccionado(s) del grupo comprendiendo omtA aflR, pksA, Nor-1, fas-beta, fas-alfa, vber-1, avnA, ord-2.
gen(es) de toxina de la agrupación de aflatoxina de A. oryzae, en particular seleccionado(s) del grupo comprendiendo omtA aflR, pksA, Nor-1, fas-beta, fas-alfa, vber-1, avnA, ord-2.
La célula progenitora de Aspergillus puede ser
una célula de A. oryzae, en particular A. oryzae
A1560 (IFO 0417).
Aspergillus oryzae A1560 es igual a IFO
04177 (véase abajo).
IFO 4177 de Aspergillus oryzae:
disponible de institute for Fermentation, Osaka;
17-25 Juso Hammachi 2- Chome Yodogawaku, Osaka,
Japón; véase también WO 98/12300.
JaL228: cepa de Aspergillus oryzae donde
el gen para una metaloproteasa neutral, Npl, es interrumpido; la
construcción de esta cepa está descrita en la WO 98/12300.
BECh 1: la construcción de esta cepa de CPA
negativa de Aspergillus oryzae está descrita en el ejemplo
1.
BECh 2: la construcción de esta cepa de CPA
negativa y KA negativa de Aspergillus oryzae está descrita
en el ejemplo 1.
BECh 3: la construcción de esta cepa de CPA
negativa y KA negativa de Aspergillus oryzae está descrita
en el ejemplo 1.
BZ14: una cepa de Aspergillus oryzae
A1560 cotransformada, con ToC90 y fD450 como se describe en WO
92/17573.
JaL 250: la construcción de esta cepa de
Aspergillus oryzae está descrita en el ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cepa de E. coli que contiene el
plásmido pJaL499 fue depositada con DSMZ-Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg
1b, D-38124 Braunschweig el 13 de enero de 1999, y
obtuvo el número de depósito DSM 12622.
\vskip1.000000\baselineskip
DMAT-S: este gen codifica para
dimetilalil-L-triptófano sintasa,
una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloide del ergot.
DCAT-S: este gen codifica para
dimetilalil-ciclo-acetoacetil-L-triptófano
sintasa, una enzima implicada en la biosíntesis del ácido
ciclopiazónico (CPA).
pyrG: este gen codifica para
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa,
una enzima implicada en la biosíntesis de uridina.
\vskip1.000000\baselineskip
PAHL: este plásmido se describe en WO
97/07202.
pCaHj483: este plásmido se describe en WO
98/00529.
pCaHj493: este plásmido se describe en el
ejemplo 2.
pJaL335: este plásmido se describe en WO
98/12300.
pJaL499: este plásmido se describe en el ejemplo
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Productos químicos usados como tampones y
sustratos fueron productos comerciales de al menos grado
reactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
pH Final 5.0; antes de la
inoculación, se añade 1,0 ml de úrea al
50%.
pH final
5.0;
Antes de la inoculación, se añade 1,3 ml de 50%
úrea/100 ml de medio.
Para el uso en placas sólidas, medio KMZ es
solidificado con agar, 20 g/l.
Triton X-100 a 300 \mul/L se
añade como un agente de restricción del crecimiento de
colonias.
El pH final es ajustado a 6.4
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota de un ml de muestra es preparada
para análisis de electroforesis capilar (CE) por extracción de fase
sólida en un tubo Supelclean LC-18 SPE (columna de
3 ml preempaquetada de Supelco, cat. nº. 5-7012,
acondicionada con 2 ml de metanol y 2 ml de agua
Milli-Q). Un colector de succión se usa para forzar
los fluidos a través de la columna. Después del lavado con 3 ml de
agua Milli-Q, la muestra es eluida con 3 ml de
metanol. Sin un tratamiento adicional, el eluato es luego sometido
a análisis de CE. Ocasionalmente se forma un precipitado que es
eliminado por centrifugado.
El análisis de CE es realizado usando un aparato
de CE de red de fotodiodos Hewlet-Packard
(3D-CE). La muestra es inyectada bajo presión
hidrostática de 34 mbar durante 10 seg. Se usa un capilar de 50 mm
(56 cm de longitud eficaz) a 30ºC que ha sido acondicionado con
0,1M de NaOH durante 1 min, seguida de 100 mM de borato/NaOH pH 9.1
durante 5 min. El voltaje se fija a 17 kV. Espectros de UV son
siempre recogidos para identificar el pico, pero la realización es
continuada a 280 nm. Un ácido ciclopiazónico comercial se usa como
un estándar (Sigma Co., St. Louis MO, EEUU, catálogo no. C1530,
mínimo 98% de pureza). El límite inferior de sensibilidad del método
es aproximadamente 1 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Tapones de agar son analizados como se describe
en Filtenborg O., Frisvad J.C. y Svendsen J.A.: "Simple Screening
Method for Mold Producing Intracellular Mycotoxins in Pure
Cultures", Applied and Environmental Microbiology
(1983)45:581-585.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras de 10 \mul de sobrenadante son
aplicadas a ambos bordes opuestos de una placa de TLC (gel de
sílice Merck 60). Partes alícuotas de ácido ciclopiazónico, Sigma C
1530, disueltas y diluidas en una mezcla de metanol: cloroformo
(1:2 por volumen) a 50 ppm, 25 ppm, 5 ppm y 2.5 ppm son usadas como
estándares. La placa es primero desarrollada en CAP (cloroformo:
acetona: propan-2-ol = 85:15:20 por
volumen) durante 15 minutos, dejada secar, luego vuelta y la otra
media es posteriormente desarrollada en TEF (tolueno: acetato de
etilo: ácido fórmico = 5:4:1 por volumen) durante 15 minutos.
De forma alternativa la placa es desarrollada en
EMA (acetato etilo: metanol: 25% hidróxido amónico = 16:8:2 por
volumen) y TEF cada uno durante 15 minutos como se ha descrito
anteriormente.
La placa es dejada secar completamente (1 hora)
en una campana de humos, antes de rociarla con reactivo Ehrlich (2
g de 4-dimetilaminobenzaldehido en 85 ml de etanol
al 96% al que se le añadió posteriormente 15 ml de ácido
clorhídrico al 37%).
CPA es visto como manchas en forma de champiñón
de color violeta azulado con una migración baja típica en el
sistema de CAP (un sistema neutral) mientras que el sistema acídico
TEF proporciona un frotis típico prolongado a medio camino entre el
sitio de aplicación y el frente de desarrollador. En el sistema de
EMA (sistema básico/alcalino) el ácido ciclopiazónico está dirigido
a pequeñas manchas densas.
Por inspección visual directa de las placas,
concentraciones de CPA \geq2,5 ppm pueden ser vistas como frotis
o manchas de zonas moradas (dependiendo del sistema de desarrollo).
Escaneando la placa de TLC en un escáner de superficie plana de
sobremesa y luego procesando y aumentando la imagen electrónica en
un programa de tratamiento de imágenes adecuado (en este caso Paint
Shop Pro 4) la sensibilidad es mejorada con un factor 5 a 10.
La sensibilidad global de este análisis es (sin
extracción) aprox. 0,5 - 1 ppm de CPA; el uso de extractos mejora
la sensibilidad al menos 10 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota de 1 a 3 ml de muestra es preparada
para el análisis de CE por extracción de fase sólida en un tubo
Supelclean LC- 18 SPE (columna de 3 ml preempaquetada de Supelco,
cat. nº. 5-7012), acondicionado con metanol seguido
de 10 mM de borato/NaOH, 4M de KC1 pH 9.1. Un colector de succión
se usa para forzar los fluidos a través de la columna. Después del
lavado con 3 ml de 10 mM de borato/NaOH, 4M de KCI pH 9.1 y 0,3 ml
10 mM de borato/NaOH pH 9.1, la muestra es eluida con 7,5 ml 10 mM
borato/NaOH pH 9.1. Sin más tratamiento adicional, el eluato es
luego sometido a análisis de CE, siguiendo el procedimiento
anteriormente descrito para ácido ciclopiazónico. Ocasionalmente un
precipitado se forma que es eliminado por centrifugado. El límite
inferior de sensibilidad del método es aproximadamente 6 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota de muestra es aplicada a los lados
opuestos de placas TLC como se ha descrito anteriormente para CPA y
desarrollada usando los mismos sistemas de solvente como para CPA.
Las placas secas son pulverizadas con 1% FeCl_{3} en 0,1 M de
HCl. La presencia de ácido kójico en la muestra está indicada por
una mancha roja y comparada con la intensidad de la mancha roja
producida por ácido kójico puro aplicado como un control. El límite
inferior de detección es 50 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
La necesidad de purificación de la muestra
preparatoria para análisis por electroforesis capilar (CE) depende
de la conductividad de la muestra. Si la conductividad es inferior
a 10 mS, la muestra es purificada por intercambio iónico sobre un
intercambiador aniónico Varian SAX (Varian Instruments, Palo Alto
CA) usando 0,1 M de KCI como el tampón de elución. Si la
conductividad es mayor que 100 mS, la muestra es extraída usando
extracción de 2-butanol, donde una muestra de 2 ml
es extraída con 6 ml de butanol después de la precipitación con
acidificación/tratamiento alto en sal y disolviendo el precipitado
en 10 mM Tris/HCl pH 7.0.
Un aparato de HP-CE, detección
de red de diodos, usando un capilar de sílice no revestido a 50 pm
y una longitud eficaz de 56 cm a una temperatura de 30ºC y un
tampón de preparación de 25 mM borato/fosfato pH 7.6 son aplicados.
La muestra es inyectada bajo presión hidrodinámica sobre un periodo
de 20 seg. El voltaje se fija a 30 kV. El límite inferior de
sensibilidad del método es 6 ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Manchas de líquido de fermentación son aplicadas
a placas de TLC y desarrolladas como se describe para CPA. Luego
son rociadas con p-nitroanilina diazotizada como se
describe por W. Majak y R.J. Bose, "Chromatographic methods for
the isolation of miserotoxin and the detection of aliphatic nitro
compounds", Phytochemistry (1974) 13:1005-1010.
La intensidad y posición de las manchas con respecto a la sustancia
de control son una medida de las concentraciones de
3-NPA. Nivel de detección en placas de TLC: 25 - 50
ppm.
De forma alternativa, 3-NPA es
analizado espectrofotométricamente (= 540 nm) añadiendo 50 \mul
de NaOH 1M y 70 \mul de p-nitroanilina diazotizada
a 100 \mul de muestra. Nivel de detección 5-10
ppm.
\vskip1.000000\baselineskip
Esporas liofilizadas de una cepa de
Aspergillus oryzae, la cepa BZ14 fueron irradiadas con gamma
a una gama de dosis óptima de entre 1000 Gy - 1250 Gy, luego
colocadas en placas de medio de selección 1 en densidades de 25 -
50 colonias/placa de 9 cm. Las colonias que producían ácido
ciclopiazónico forman un lado inverso (el lado inverso de la
colonia) en el medio de selección 1 debido a un complejo rojo
insoluble CPA-Fe.
Aproximadamente 50.000 colonias de las esporas
irradiadas fueron seleccionadas y 154 colonias deficitarias de CPA,
caracterizadas por una apariencia de color crema/blanquecino,
fueron aisladas. Después del reaislamiento, 64 cepas retuvieron una
parte inversa no roja en placas de medio de selección 1. CPA no fue
detectada en 52 cepas por el ensayo con tapón de TLC. Estas cepas
fueron luego cultivadas en medio MDU-1 B bajo
toxina provocando (5 días a 34ºC, 250 rpm) condiciones de
fermentación en frasco de agitación. Treinta y seis cepas no
presentaron niveles detectables de CPA en el sobrenadante según fue
medido por TLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Esporas liofilizadas de JaL228 fueron
\gamma-irradiadas y seleccionadas como se ha
descrito anteriormente. Aislados sin CPA putativo fueron crecidos en
matraces de agitación en medio MDU-1 B bajo
condiciones provocando toxina (5 días a 34ºC, 250 rpm) y
sobrenadantes evaluados para CPA con el método de TLC. Los
sobrenadantes fueron evaluados como estaban o como extractos.
Para la extracción se acidificaron 50 ml de la
muestra entera con 10 ml de HCl 0,1 M. Esta mezcla fue luego
enérgicamente agitada durante 3-5 minutos con 70 ml
de metanol/cloroformo (1:2). Después de la fase de separación
(aprox. 3 horas), la fase de fondo (aproximadamente 25 ml) fue
transferida a un vaso de precipitación de 300 ml y el cloroformo
permitió su evaporación. El residuo fue redisuelto en 5 ml de
cloroformo, transferido a un vaso de precipitación de 25 ml y el
cloroformo se evaporó. El residuo fue disuelto en 100 \mul de
cloroformo.
Diez \mul de sobrenadante o extracto de
cloroformo fueron aplicados a los bordes opuestos de 20 cm x 20 cm
placas de TLC y procesados como se describe en el capítulo
precedente en los ensayos.
Tres cepas (aisladas) incluyendo BECh 1 no
produjeron CPA.
\vskip1.000000\baselineskip
BECh 1 fue crecido en un corte de Cove N. Las
esporas fueron suspendidas en 0,01% Tween a una densidad de
3-5 X 10^{6} y sometidas a irradiación UV de
ondas cortas (254 nm de lámpara germicida). Las esporas irradiadas
con dosis de UV dieron como resultado 1-5% de
supervivencia fueron usadas en la selección ulterior.
Esporas irradiadas fueron diluidas en medio de
KM2 hasta aprox. 0.7 espora/100 \mul, y 100 \mul fueron
inoculados en cada pocillo en placas de microtitulación de 96
pocillos. Los cultivos fueron incubados estáticamente en una cámara
húmeda a 34ºC durante 5-7 días. Luego 40 \mul de
FeCl_{3} al 1% en 0,1 M de HCl fueron añadidos hasta cada pocillo
con signos de crecimiento.
La emergencia de un color rojo fuerte indicó la
producción de ácido kójico (KA); la ausencia de color indicó una
colonia deficitaria en producción de ácido kójico.
De forma alternativa, se colocaron esporas en
placas en KM2 solidificado (crecimiento restringido con Triton
x-100) y cuando se vieron colonias maduras las
placas fueron sumergidas con 1% de FeCl_{3} en 0.1 M de HCl. La
ausencia de zonas rojas alrededor de las colonias indican
productores de ácido no kójico putativos.
Ciento treinta y dos colonias sin KA, es decir,
aquellas que dieron una reacción sin color con FeCl_{3}, fueron
aisladas de entre aproximadamente 7000 cultivos de microtitulación.
No obstante, cuando se evaluaron en las placas de agar de selección
de KM2 primario, ninguna de las colonias fue confirmada como siendo
KA negativa.
La repetición de la prueba ulterior en medio
líquido bajo KA provocando condiciones de las colonias negativas en
el medio sólido y en el medio líquido estático de KM2 (30º) redujo
el número de mutantes negativos de KA hasta 11. Cuando estas cepas
fueron evaluadas en matraces de agitación, KA fue producido por
ocho de las cepas. Las tres restantes no dieron una reacción de
color en un ensayo directamente en sobrenadante ni cuando se
comprobó por TLC. Según lo previsto, KA fue producido por la cepa
de control BECh 1, cuando creció en cultivos simultáneos paralelos.
Una de las cepas aisladas presentó una morfología aberrante. Los
dos aislados restantes fueron reevaluados para CPA y KA después del
crecimiento prolongado en MDU-1B. Ni CPA ni KA
fueron detectados. Las dos cepas fueron llamadas BECh 2 y BECh
3.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa BECh 2 y BECh 3, respectivamente, son
sometidas a mutagénesis por UV como se ha descrito anteriormente.
Las esporas irradiadas son diluidas a 0.7 espora viva/100 \mul
medio de Nakamura en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Incubación durante 5-7 días en cámara húmeda,
30ºC.
Muestras de caldo de fermentación de pocillos
con crecimiento son transferidas a una nueva placa de micropocillos
y analizadas espectrofotométricamente o aplicadas a placas de TLC.
Las cepas negativas para 3-NPA son recultivadas en
matraces de agitación con medio de Nakamura y analizadas para
3-NPA. Las cepas todavía negativas para
3-NPA son transformadas con pCaHj 493 como se
describe en el ejemplo 2 y los transformantes son tratados como se
describe en el ejemplo 3.
El plásmido PAHL de lipasa (WO 97/07202) fue
digerido con BamHI y SalI, y el fragmento resultante de 916 bp que
codificaba la lipasa fue aislado.
pCaHj 483, como se describe en WO 98/00529 fue
digerido con BamHI y XhoI, y el fragmento de vector de 6757 bp fue
ligado al fragmento de lipasa. La mezcla de ligadura fue usada para
transformar células DH 5\alpha de E. coli, y un
transformante que albergaba el plásmido previsto fue aislado. El
plásmido fue denominado pCaHj 493.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas JaL228 y BECh1 de Aspergillus
oryzae fueron transformadas con pCaHj493 usando selección en
acetamida como se describe en
EP-A-0531372. Se volvieron a aislar
dos veces las esporas de los transformantes. Las esporas de un
segundo reaislamiento de cada transformante fueron evaluadas para la
producción de lipasa en frascos de agitación y cultivos en platos
de microtitulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Dieciocho transformantes JaL228 y 30
transformantes BECh 1, preparados como se describe en el ejemplo 2,
fueron evaluados para la producción de lipasa en cultivos del
matraz de agitación.
Cortes de Cove N de los transformantes fueron
cosechados usando 10 ml de una solución del 0,1% Tween, y la
suspensión de esporas fue usada como el inóculo en 100 ml de medio
GI-Gly en matraces de agitación con dos tabiques de
500 ml. Los cultivos fueron incubados en un agitador giratorio a
250 rpm, 34ºC durante 24 horas. Luego 10 ml del cultivo
G1-Gly fueron transferidos a 100 ml
1/5MDU-2BP en matraces de agitación de 500 ml e
incubados adicionalmente a 34ºC, 250 rpm.
Se tomaron muestras después de 50 horas,
filtradas a través de Miracloth y centrifugadas (4000 x g).
Concentraciones de lipasa (expresadas en LU/ml) en los
sobrenadantes fueron detectadas usando el método de inmunodifusión
radial simple (Scand. J. Immunol. Vol. 17, suppl. 10,
41-56. (1983,) "Handbook of Immunoprecipitation
in Gel Techniques", N.H. Axelsen, ed., Blackwell Scientific
Publications, 1983).
Los 30 transformantes BECh 1 de CPA negativos
tuvieron rendimientos de lipasa tan altos como o mejores que los 18
transformantes JaL228 de CPA positivos. La Tabla 2 abajo da una
visión de conjunto de las distribuciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Diez cepas (preparadas en el ejemplo 1A) sin
producción de CPA detectable y tres cepas donde CPA fue detectable
fueron evaluadas para la producción de xilanasa. Los resultados
están resumidos en la tabla 1 abajo. La Columna 2 muestra la
cantidad de xilanasa, medida en unidades de xilanasa fúngica (FXU)
según fue evaluado por el método de inmunodifusión radial Simple
(Scand. J. Immunol. Vol 17, suppl. 10, 41-56, 1983,
manual de Técnicas de
inmunoprecipitación-en-gel, N.H.
Axelsen, ed., Blackwell Scientific Publications, producidas en
cultivos del matraz de agitación.
Los resultados muestran que las cepas de CPA
negativas pueden producir xilanasa en cantidades comparables a las
cepas de CPA positivas.
Las dos cepas BECh 2 y BECh 3 de A.
oryzae sin CPA ni KA fueron transformadas con el plásmido pCaHj
493 como se describe en el ejemplo 2. Se aislaron las esporas de
los transformantes dos veces. Las esporas del segundo reaislamiento
de cada transformante fueron evaluadas para la producción de lipasa
como se describe en el ejemplo 2.
La Tabla 2 muestra las distribuciones de
frecuencia de los rendimientos de lipasa de transformantes de estas
dos cepas. Los resultados muestran que no ocurrió ningún deterioro
en potencial de expresión en comparación con los valores dados para
las cepas BECh 1 y JaL228 de A. oryzae.
A partir de la misma suspensión de esporas usada
para los cultivos de producción de lipasa, los matraces de
agitación MDU1B para la producción de CPA fueron inoculados e
incubados durante 5 días como se ha descrito previamente. Análisis
de DPA fueron hechos según la sección 5B2. Ninguna de las cepas
BECh1 produjo CPA mientras que 17 de las 18 cepas JaL228 dieron más
de 25 ppm, la mayoría más de 100 ppm de CPA.
El clon de ADNc (pJaL499) alberga la secuencia
de ADN mostrada en la SEC ID NO: 1, que ha sido identificada para
intervenir en la biosíntesis de CPA por su homología a una
dimetilaliltriptófano sintasa (DMAT-S) de
Claviceps purpurea. La secuenciación del clon de ADNc de
A. oryzae mostró que fue de 1393 pares de bases en longitud
(SEC. ID. NO: 1) y codificó un polipéptido de 473 aminoácidos (SEC.
ID. NO: 2) que fue un 42,1% idéntica al DMAT-S de
Claviceps purpurea.
El polipéptido DCAT-S de A.
oryzae está implicado en la síntesis de (3- CPA de
ciclo-acetoacetil-L-triptófano
y dimetilalilpirofosfato, Nethling D.C. and R.M. McGrath, Can. J.
Microbiol. (1977) 23:856-872.
Se preparó ADN cromosómico de las cepas JaL228 y
BECh 1. El ADN fue digerido con BglII, NcoI, XhoI y SpeI y
analizado por transferencia de Southern, usando el fragmento de ADN
BglII marcado en ^{32}P de 1 kb de pJaL499 conteniendo el gen
DCAT-S como una sonda. El análisis de transferencia
de Southern mostró que la cepa JaL228 productora de CPA tiene un
gen DCAT-S, mientras que en BECh 1 el gen
DCAT-S ha sido delecionado del cromosoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Cartografía de restricción genómica del gen
DCAT-S de A. oryzae se realiza con las
enzimas de restricción siguientes: EcoRI, SalI, BbuI, XhoI, y XbaI,
usando el fragmento BglII de ADN marcado en ^{32}P de 1 kb de
pJaL499 conteniendo el gen DCAT-S como una sonda
(Fig. 1). Esto muestra que hay sólo una copia del gen
DCAT-S
ADN genómico de JaL228 es parcialmente digerido
bien con Tsp509l o bien realizado en un gel de agarosa al 0,7%. Los
fragmentos con un tamaño entre 7 y 10 kb son purificados.
El ADN purificado es luego clonado en lambda ZAP
II usando protocolos proporcionados por el fabricante
(Stragtagene®). La escisión in vivo y recircularización de
cualquier inserto de clon contenido dentro del vector lambda para
formar un fagémido conteniendo el inserto clonado es realizado para
las bibliotecas de ADN, según las instrucciones proporcionadas por
el fabricante. La selección para los clones que codifican el gen
DCAT-S es realizada por hibridación de colonias
usando el fragmento BglII de ADN marcado en ^{32}P de 1 kb de
pJaL499 conteniendo el gen DCAT-S como una sonda,
según se destaca en los libros de texto de metodología estándar (p.
ej., J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, Eds. (1989) "
Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen DCAT-S es interrumpido
por el método de sustitución génica de una sola fase (B.L. Miller
et al., mol. Cell. Biol. (1985) 5:1714-1721,
y G. May, en Applied Molecular Genetics of Filamentous
Fungi, pp. 1-25; J.R. Kinghorn y G. Turner,
eds.; Blakie Academic and Professional, 1992) en una cepa pyrG
menos de A. oryzae, usando el gen pyrG de A. oryzae
como un marcador de selección.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pJaL499 es digerido con SacII y
tratado con polimerasa Klenow para crear extremidades redondeadas,
y con fosfatasa alcalina bacteriana según instrucciones del
fabricante (Boehringer Mannheim) para eliminar los grupos 5'
fosfato, y luego el fenol es extraído y precipitado.
El plásmido pJaL335, descrito en WO 98/12300, es
digerido con HindIII para obtener un fragmento de 3,5 kb que
comprende el gen pyrG de A. oryzae, tratado con polimerasa
Klenow para crear extremidades redondeadas, aislado por
electroforesis en gel, y purificado. Los dos fragmentos fueron luego
mezclados entre sí y ligados. Después de la transformación en E.
coli, las colonias portadoras del plásmido correcto fueron
identificadas por digestión de la enzima de restricción de
preparaciones de miniplásmidos. La construcción del plásmido de
ruptura (pDCAT-S-pyrG) está resumida
en Fig. 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de A. oryzae JaL228 es
seleccionada para resistencia al ácido
5-fluoro-orótico para identificar
mutantes de pyrG espontáneos. Una cepa, denominada JaL250, es
identificada como siendo pyrG menos. El mutante es dependiente de
uridina, en consecuencia éste puede ser transformado con el gen
pyrG tipo salvaje y los transformantes son seleccionados por la
capacidad para crecer en la ausencia de uridina.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento NotI-EcoRI de 4,9
kb del plásmido pDCAT-S-pyrG es
purificado en gel y usado para transformar la cepa de A.
oryzae JaL250 como se describe por Christensen et al.,
Biotechnology (1988) 6:1419-1422. Los
transformantes son luego seleccionados por su capacidad para crecer
en ausencia de uridina. Después de reaislar dos veces los
transformantes son seleccionados para su capacidad para producir
CPA, como se describe en el ejemplo 1.
Para confirmar que el gen DCAT-S
es interrumpido ADN cromosómico es obtenido a partir de
transformantes que no producen CPA. El ADN es digerido con EcoRI y
analizado por transferencia de Southern, usando el fragmento BglII
de ADN marcado en ^{32}P de 1 kb de pJaL499 conteniendo el gen
DCAT-S como una sonda. Los transformantes que llevan
una ruptura del gen DCAT-S son reconocidos por el
cambio de la banda EcoRI de tipo salvaje en 6,3 kb a una banda
EcoRI en 9,8 kb.
La presencia de los genes de aflatoxina aflR y
omtA de la agrupación de la ruta biosintética de aflatoxina en
A. oryzae IFO4177 y varios derivados de los mismos ha sido
investigada. El homólogo de aflR de A. oryzae IFO4177 fue
aislado por PCR de ADN genómico con los cebadores 5956
(5'-GGATCCAGGGCTCCCTGGAG-3') (SEC ID
Nº: 3) y 5955
(5'-CCTGACCAGCCAGATCTCCT-3') (SEC ID
Nº: 4). Un fragmento de PCR de 0,9 kb se obtuvo y clonó en el
vector pCR2 de Invitrogen. La identidad del fragmento clonado fue
confirmada por secuenciación del plásmido resultante, pToC280, con
los cebadores M13 directo (-40) e inverso. El homólogo de omtA fue
también aislado de ADN genómico de IFO4177 por PCR con los cebadores
6120 (5'-AGTGAGAGAACTCCCTCCTC-3')
(SEC ID Nº: 5) y 6121
(5'-CCATATCTTCTCAGTCTCCA-3') (SEC ID
Nº: 6). Un fragmento de 1,2 kb se obtuvo y clonó en el vector pCR2
de Invitrogen y el plásmido resultante, pToC276, fue secuenciado
con los cebadores M13 directos (-40) e inversos para confirmar la
identidad del fragmento clonado.
Los fragmentos clonados de aflR y omtA fueron
usados como sondas marcadas en ^{32}P en un experimento de
hibridación. ADN genómico de IF04177, JaL228, BECh1 y BECh2 fueron
digeridos con la enzima de restricción EcoRI y los fragmentos
generados fueron separados en gel de agarosa al 0,7%. El ADN fue
transferido sobre una membrana e hibridado bajo condiciones
rigurosas con las dos sondas marcadas en ^{32}P de una en una (los
métodos están descritos en J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis,
Eds (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York). La transferencia mostró señales de hibridación positivas con
ambas sondas de IFO4177 y JaL228, mientras que ninguna banda fue
visible en las vías que contienen ADN de BECh1 y BECh2. En las vías
de IF04177 y JaL228 un fragmento de aproximadamente 3,8 kb podría
ser visto con la sonda de omtA y dos bandas de aproximadamente 0,5
y 4,3 kb podrían ser vistas con la sonda de aflR.
Consecuentemente, A. oryzae IF04177
contiene al menos dos genes de la ruta biosintética de aflatoxina,
es decir los genes aflR y omtA. En A. flavus y A.
parasiticus los dos genes son separados por aproximadamente 32
kb (Woloshuk, C. P. y Prieto, R, FEMS Microbiology Letter (1998)
160:169-176). Ninguno de estos genes están
presentes en los derivados de IFO4177 BECh1 y BECh 2.
La invención descrita y reivindicada aquí no
debe ser limitada en su alcance por las formas de realización
específicas aquí descritas, puesto que estas formas de realización
están previstas como ilustraciones de diferentes aspectos de la
invención. Cualquier forma de realización equivalente están
destinadas a estar dentro del campo de esta invención. De hecho,
varias modificaciones de la invención además de las mostradas y
descritas aquí se volverán aparentes para los expertos en la
técnica a partir de la descripción precedente. Tales modificaciones
están también previstas dentro del campo de las reivindicaciones
anexas.
Un método está provisto para producir un
polipéptido de interés por (a) cultivo de un mutante de una célula
progenitora de Aspergillus, donde (i) el mutante comprende una
primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido y
una segunda secuencia de ácidos nucleicos que comprende una
modificación de al menos uno de los genes responsables de la
biosíntesis o secreción de al menos una toxina, y (ii) el mutante
produce menos toxina que la célula progenitora de Aspergillus
cuando se cultiva bajo las mismas condiciones; y (b) aislamiento
del polipéptido del medio de cultivo. También, están provistos los
mutantes de células de Aspergillus, al igual que métodos para
obtener las células mutantes.
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\vskip1.000000\baselineskip
SU 1271068 A [0003]
WO 9515391 A [0003]
WO 9515390 A [0003]
US 4288627 A [0068]
WO 9812300 A [0093] [0093] [0099] [0154]
WO 9217573 A [0093]
WO 9707202 A [0096] [0134]
WO 9800529 A [0097] [0135]
EP 0531372 A [0136]
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletRICHARD J COLE RICHARD
H. COX Handbook of Toxic Fungal Metabolites Academic Press
1981. [0004]
\bullet Aflatoxin and related compounds R.W.
DETROY et al. Microbial Toxins Academic
1971. vol. 6, 3-178 [0010]
\bulletFORD et al. Protein
Expression and Purification, 1991, vol. 2,
95-107 [0049]
\bulletCUNNINGHAM WELLS
Science, 1989, vol. 244, 1081-1085
[0050]
\bulletDE VOS et al.
Science, 1992, vol. 255, 306-312
[0050]
\bulletSMITH et al. Journal
of Molecular Biology, 1992, vol. 224,
899-904 [0050]
\bulletWLODAVER et al. FEBS
Letters, 1992, vol. 309, 59-64 [0050]
\bulletProtein Purification VCH
Publishers 1989. [0073]
\bulletWOLOSHUK, C. P. PRIETO,
R FEMS Microbiology Letter, 1998, vol. 160,
169-176 [0081] [0160]
\bulletMILLER et al.
Molecular and Cellular Biology, 1985,
1714-1721 [0084]
\bullet W. MAJAK R.J. BOSE
Chromatographic methods for the isolation of miserotoxin and the
detection of aliphatic nitro compounds Phytochemistry,
1974, vol. 13, 1005-1010 [0118]
\bulletScand. J. Immunol.,
1983, vol. 17, no. 10. 41-56 [0139]
[0141]
\bulletHandbook of
Immunoprecipitation-in-Gel
Techniques Blackwell Scientific Publications 1983.
[0139]
\bulletHandbook of
Immunoprecipitation-in-Gel
Techniques Blackwell Scientific Publications [0141]
\bullet Molecular Cloning: A Laboratory
Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. [0151]
[0159]
\bullet B.L. MILLER et al.
Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 5,
1714-1721 [0152]
\bullet G. MAY Applied Molecular
Genetics of Filamentous Fungi Blakie Academic and
Professional 1992. 1-25 [0152]
\bulletCHRISTENSEN et al.
Biotechnology, 1988, vol. 6, 1419-1422
[0156]
<110> Novo Nordisk A/S
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\vskip0.400000\baselineskip
<120>
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\vskip0.400000\baselineskip
<130>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(1328)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus oryzae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador 5956
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador 5955
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de secuencia artificial:
cebador 6120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de secuencia artificial:
cebador 6121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm22
Claims (21)
1. Un método para la producción de un
polipéptido de interés, que comprende:
(a) cultivar un mutante de una célula
progenitora de Aspergillus, donde (i) el mutante comprende una
primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido,
y (ii) el mutante produce menos de al menos una toxina de interés
que la célula progenitora de Aspergillus cuando se cultivan bajo
las mismas condiciones; y
(b) aislar el polipéptido del medio de
cultivo.
2. El método según la reivindicación 1, donde el
mutante produce menos toxina(s) como una consecuencia de
modificación de al menos uno de los genes responsables de la
biosíntesis o secreción de la toxina(s).
3. El método según la reivindicación 1 o 2,
donde el mutante produce al menos aproximadamente el 90% menos de
dicha toxina que la célula progenitora cuando se cultivan bajo las
mismas condiciones.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde la toxina es
seleccionada del grupo que consiste en ácido ciclopiazónico, ácido
kójico, ácido 3-nitropropiónico, emodina,
malformina, aflatoxinas, ocratoxinas y ácidos secalónicos.
5. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la célula de Aspergillus es
seleccionada del grupo que consiste en los subgrupos de
Aspergillus Eurotium, Chaetosartorya, Sclerocleista, Satoia,
Neosartorya, Hemicarpenteles, Petromyces, Emericella, y
Fenellia.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el polipéptido de interés es
nativo de la célula huésped de Aspergillus.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el polipéptido de interés es
heterólogo a la célula huésped de Aspergillus.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el polipéptido es seleccionado
del grupo que consiste en una hormona o una forma precursora de la
misma, una enzima o una variante enzimática o una forma precursora
de la misma, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, un
receptor o un fragmento funcional del mismo, y un indicador.
9. El método según la reivindicación 8, donde
la enzima es seleccionada del grupo que consiste en aminopeptidasa,
amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa,
quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa,
desoxirribonucleasa, esterasa, galactanasa,
\alpha-galactosidasa,
\beta-galactosidasa, glucoamilasa,
\alpha-glucosidasa,
\beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa,
liasa, pectato liasa, manasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa,
oxigenasa, pectinasa, endopeptidasa, exo-peptidasa,
peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, proteasa, ribonucleasa,
transglutaminasa, y xilanasa.
10. Una célula huésped mutante de Aspergillus
deficitaria de toxinas útil para la producción de un polipéptido
heterólogo de interés, dicha célula ha sido modificada
genéticamente para producir menos de al menos una toxina en
comparación con una célula progenitora de Aspergillus, cuando se
cultivan bajo las mismas condiciones.
11. La célula mutante según la reivindicación
10, que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el polipéptido de interés y una segunda secuencia de
ácidos nucleicos que comprende una modificación de al menos uno de
los genes responsables de la biosíntesis o secreción de la
toxina.
12. La célula mutante de cualquiera de las
reivindicaciones 10 u 11, donde la toxina es seleccionada del grupo
que consiste en ácido ciclopiazónico, ácido kójico, ácido
3-nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas,
ocratoxinas y ácidos secalónicos.
13. Un método para obtener una célula huésped
mutante de Aspergillus deficitaria de toxinas tal y como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, dicha célula es
deficitaria en la producción de al menos una toxina de interés,
dicho método comprende (a) sometimiento de una célula progenitora a
mutagénesis y (b) selección para células mutantes que tienen una
producción reducida o eliminada de la(s) toxina(s) de
interés.
14. El método según la reivindicación 13, que
además comprende la introducción en la célula huésped progenitora
de Aspergillus de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido de interés.
15. Un método para obtener una célula huésped
mutante de Aspergillus deficitaria de toxinas tal y como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que
comprende (a) introducción en una célula huésped progenitora de
Aspergillus una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica
un polipéptido de interés y una segunda secuencia de ácidos
nucleicos que comprende una modificación de al menos uno de los
genes responsables de la biosíntesis o secreción de al menos una
toxina; y (b) identificación del mutante de fase (a) que comprende
las secuencias de ácidos nucleicos.
16. Una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa como está representado en la SEC ID NO: 2.
17. Uso de la secuencia de ácidos nucleicos
reivindicada en la reivindicación 16, o un fragmento activo de la
misma, para la ruptura de genes homólogos en cepas huéspedes
fúngicas filamentosas.
18. El uso según la reivindicación 17, donde la
cepa huésped fúngica filamentosa es seleccionada del grupo que
consiste en Aspergillus, Trichoderma, Penicillium y Fusarium
spp.
19. Una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa aislada obtenible de una cepa de Aspergillus oryzae,
seleccionada del grupo que consiste en:
(a) una
dimetilalil-cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2;
(b) una variante alélica de (a); y
(c) un fragmento de (a) o (b), que tiene
actividad de dimetilalil-
cicloacetoacetil-L-triptófano
sintasa.
20. Una célula de Aspergillus mutante adecuada
para la expresión de polipéptidos heterólogos, donde uno o más
genes de toxina silenciosos han sido eliminados.
21. El mutante según la reivindicación 20, donde
el(los) gen(es) de toxina codifica(n) una o
más toxina(s) seleccionada(s) del grupo que consiste
en ácido ciclopiazónico, ácido kójico, ácido
3-nitropropiónico, emodina, malformina,
aflatoxinas, ocratoxinas y ácidos secalónicos.
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AU2006207463B2 (en) | 2005-01-24 | 2011-03-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for producing a compound of interest in a filamentous fungal cell |
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WO2007045248A1 (en) | 2005-10-17 | 2007-04-26 | Novozymes A/S | Use of fungal mutants for expression of antibodies |
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WO2009051152A1 (ja) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Noda Institute For Scientific Research | ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子 |
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AU2010206181B2 (en) | 2009-01-21 | 2015-01-15 | Novozymes A/S | Polypeptides having esterase activity and nucleic acids encoding the same |
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AU2010241099A1 (en) | 2009-04-22 | 2011-10-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Process for the production of a recombinant polypeptide of interest |
WO2010122141A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Dsm Ip Assets B.V. | Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof |
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US8586829B2 (en) | 2009-09-30 | 2013-11-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
WO2011057140A1 (en) | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Novozymes, Inc. | Compositions for saccharification of cellulosic material |
BR112012008260A2 (pt) | 2009-11-06 | 2015-09-15 | Novozymes Inc E Novozymes As | polipeptídeo, polinucleotídeo, métodos para produzir o polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte da planta ou célula da planta,e, molécula de rna inibitória de filamento duplo. |
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AU2011214324B2 (en) | 2010-02-11 | 2014-11-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Host cell capable of producing enzymes useful for degradation of lignocellulosic material |
CA2787719A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Polypeptide having cellobiohydrolase activity and uses thereof |
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AU2011273690C1 (en) | 2010-06-29 | 2015-07-30 | Versalis S.P.A. | Polypeptide having or assisting in carbohydrate material degrading activity and uses thereof |
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ES2576062T3 (es) | 2010-06-29 | 2016-07-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa y usos del mismo |
EP3318574B1 (en) | 2010-06-29 | 2021-04-21 | DSM IP Assets B.V. | Polypeptide having beta-glucosidase activity and uses thereof |
WO2012000888A1 (en) | 2010-06-29 | 2012-01-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Polypeptide having acetyl xylan esterase activity and uses thereof |
WO2012003379A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Novozymes A/S | Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same |
EA201300074A1 (ru) * | 2010-07-01 | 2013-06-28 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | Способ получения представляющего интерес соединения |
WO2012021399A1 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Novozymes, Inc. | Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a nitrogen-containing compound and uses thereof |
US9267126B2 (en) | 2010-08-30 | 2016-02-23 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2012030811A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
US9139823B2 (en) | 2010-11-12 | 2015-09-22 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
WO2012103322A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same |
MX337913B (es) | 2011-01-26 | 2016-03-28 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
WO2012103350A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
DK2668267T3 (da) | 2011-01-26 | 2018-01-29 | Novozymes Inc | Polypeptider med cellobiohydrolaseaktivitet og polynukleotider, som koder for dem |
MX337919B (es) | 2011-01-26 | 2016-03-28 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
EP3339442B1 (en) | 2011-03-09 | 2022-05-11 | Novozymes A/S | Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide |
MX2013012325A (es) | 2011-04-28 | 2013-11-01 | Novozymes Inc | Polipeptidos que tienen actividad de endoglucanasa y polinucleotidos que codifican los mismos. |
MX2013011827A (es) | 2011-04-29 | 2014-01-08 | Novozymes Inc | Metodos para mejorar la degradacion o conversion de material celulosico. |
EP2527448A1 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-28 | Novozymes A/S | Simultaneous site-specific integrations of multiple gene-copies in filamentous fungi |
CN102321700A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-01-18 | 无锡赛德生物工程有限公司 | 一种曲酸发酵工艺及发酵设备 |
EP2748314B1 (en) | 2011-08-24 | 2016-12-28 | Novozymes, Inc. | Aspergillus fumigatus cellulolytic enzyme compositions and uses thereof |
WO2013064075A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
DK3219794T3 (da) | 2011-11-21 | 2019-12-16 | Novozymes Inc | GH61-polypeptidvarianter og polynukleotider, som koder for dem |
DK3279320T3 (da) | 2012-04-27 | 2020-03-16 | Novozymes Inc | GH61-polypeptidvarianter og polynukleotider, som koder for dem |
MX369726B (es) | 2012-09-05 | 2019-11-20 | Novozymes As | Polipéptidos con actividad proteasa. |
EP2898068A2 (en) | 2012-09-19 | 2015-07-29 | Novozymes, Inc. | Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material |
DK2903412T3 (da) | 2012-10-08 | 2019-12-16 | Novozymes As | Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem |
WO2014066141A2 (en) | 2012-10-24 | 2014-05-01 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
EP2931885A1 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
DK2964760T3 (da) | 2013-03-08 | 2021-07-26 | Novozymes Inc | Cellobiohydrolasevarianter og polynukleotider, der koder for dem |
DK2994529T3 (en) | 2013-05-10 | 2019-03-04 | Novozymes As | Polypeptides with xylanase activity and polynucleotides encoding them |
EP3594335B1 (en) | 2014-09-05 | 2024-05-01 | Novozymes A/S | Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same |
MX2017007127A (es) | 2014-12-19 | 2017-08-18 | Novozymes As | Composiciones que comprenden polipeptidos que tienen actividad xilanasa y polipeptidos que tienen actividad arabinofuranosidasa. |
WO2016138167A2 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
US10519520B2 (en) | 2015-05-27 | 2019-12-31 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
EP3353195B1 (en) | 2015-09-22 | 2021-11-10 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
WO2018226171A2 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | Ptt Global Chemical Public Company Limited | Mutant strain aspergillus aculeatus for producing cellulase and xylanase and preparation method thereof |
AU2018319349B2 (en) | 2017-08-25 | 2024-02-29 | Novozymes A/S | Enzyme assisted crude palm oil extraction |
DK3775222T3 (da) | 2018-03-26 | 2024-02-19 | Novozymes As | Chaperoneproteiner fra svampe |
CN108753748B (zh) * | 2018-06-08 | 2021-12-10 | 中国中医科学院中药研究所 | 大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用 |
CN108795903B (zh) * | 2018-06-08 | 2020-12-15 | 南京林业大学 | 一种高酶活淀粉酶的表达方法 |
CN108823178B (zh) * | 2018-06-08 | 2021-12-10 | 中国中医科学院中药研究所 | 大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT73BE5及其编码基因与应用 |
WO2020123463A1 (en) | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same |
EP3898985B1 (en) | 2018-12-21 | 2023-02-08 | Novozymes A/S | Tandem protein expression |
CN110218750B (zh) * | 2019-04-24 | 2023-04-11 | 郑州轻工业学院 | 杂色曲霉菌株在发酵生产曲酸中应用 |
CN110106152B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-08-17 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 杂交瘤细胞株ytt-2及其产生的抗环匹阿尼酸单克隆抗体 |
CN110108874B (zh) * | 2019-04-30 | 2022-09-20 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用 |
CN114391038A (zh) | 2019-07-25 | 2022-04-22 | 诺维信公司 | 丝状真菌表达系统 |
CN111139189B (zh) * | 2020-01-14 | 2022-04-19 | 浙江工业大学 | 曲霉wbx-38及其在生产环匹阿尼酸中的应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0730656A1 (en) * | 1993-12-01 | 1996-09-11 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | $i(ASPERGILLUS FOETIDUS) EXPRESSION SYSTEM |
CN1139457A (zh) * | 1993-12-01 | 1997-01-01 | 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 | 曲霉表达系统 |
WO1998011203A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide |
DE69734936T2 (de) * | 1996-09-19 | 2006-08-24 | Novozymes A/S | Wirtszellen und methoden für die produktion von proteinen |
-
1999
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