CN102292444A - 具有淀粉分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有淀粉分解增强活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有淀粉分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本文。

涉及生物材料保藏物

本申请含有对生物材料的保藏物的涉及，将所述保藏物通过提述并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有淀粉分解增强活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

淀粉是由两种主要成分组成的复杂糖类：支链淀粉(amylopectin)和直链淀粉(amylose)。直链淀粉是直链分子而支链淀粉是含支链的分子。直链淀粉由通过α-1，4-糖苷键连接的D-葡萄糖分子组成。支链淀粉由通过α-1，6-糖苷键连接的D-葡萄糖分子组成。所述α-1，6-糖苷连接导致支化。直链淀粉对支链淀粉的比例随着淀粉来源的变化而变化。

淀粉可由酸、多种酶或其组合水解为较简单的糖。转化程度通常通过葡萄糖当量(dextrose equivalency，DE)来量化，其涉及糖苷键在经切割的淀粉中的分数。用于将淀粉水解为较简单的糖的主要酶为内淀粉酶(endoamylase)、外淀粉酶(exoamylase)和脱支酶(debranching enzyme)，其水解直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉主要由淀粉酶水解，而支链淀粉还需要脱支酶如支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)以供完全水解。内淀粉酶，其中最常见的为α-淀粉酶(E.C.3.2.2.1)，对直链淀粉和支链淀粉的α-1，4-连接具有特异性。外淀粉酶具有水解直链淀粉和支链淀粉的α-1，4-连接和α-1，6-连接的能力。常见的实例为淀粉葡糖苷酶(E.C.3.2.1.20)。β-淀粉酶是具有水解直链淀粉的α-1，4-连接的能力的酶。脱支酶例如支链淀粉酶，水解支链淀粉中的α-1，6-连接。脱支酶的水解产物主要为麦芽三糖和麦芽糖。

由许多从淀粉产生的食品包含例如麦芽糊精，其为轻微水解的(DE 10-20)淀粉产物，用作味道缓和的填充剂和增稠剂；多种玉米糖浆(DE 30-70)，在多种加工食品中用作增甜剂和增稠剂的粘性溶液；右旋糖(DE 100)，即商品葡萄糖，由淀粉的完全水解制备；以及高果糖糖浆，其通过用酶葡萄糖(木糖)异构酶处理右旋糖溶液，直至相当部分的葡萄糖转化为果糖而制得。

在本领域中，改善含淀粉材料的酶转化是有利的。

本发明提供了具有淀粉分解增强活性的分离的多肽，和编码该多肽的多核苷酸，以及其使用方法。

发明内容

本发明涉及选自下组的具有淀粉分解增强活性的分离的多肽：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的核苷酸序列；

(d)多肽，其包含含有一个或多个选自下组的基序的多肽：N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]；和

(e)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

本发明还涉及选自下组的分离的多核苷酸，其编码具有淀粉分解增强活性的多肽：

(a)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)多核苷酸，其在至少中等严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的核苷酸序列；

(d)多核苷酸，其编码包含一种或多种选自下组的基序的多肽：N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]；和

(e)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，并涉及产生具有淀粉分解增强活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制细胞中具有淀粉分解增强活性的多肽表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及这样的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及在淀粉降解中使用具有淀粉分解增强活性的多肽的方法。

本发明还涉及包含编码具有淀粉分解增强活性的多肽的分离的多核苷酸的植物。

本发明还涉及产生具有淀粉分解增强活性的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下，培养包含编码所述具有淀粉分解增强活性的多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或SEQ ID NO：6的1至18，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或SEQ ID NO：6的1至18组成；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生蛋白的方法。

附图简述

图1显示pPH48的限制图谱。

图2显示具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)FGSC2489多肽的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1和2)。

图3显示pPH49的限制图谱。

图4显示具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSCA1000多肽的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：3和4)。

图5显示pHUda666的限制图谱。

图6显示具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽在pH 4.0和室温对由瓣环栓菌(Trametes cingulata)淀粉葡糖苷酶、黑曲霉(Aspergillus niger)酸性α-淀粉酶，和瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶与黑曲霉酸性α-淀粉酶的组合对支链淀粉进行的水解的作用。

图7显示具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉和粗糙脉孢菌多肽在pH 6.0和室温对由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)对直链淀粉进行的水解的作用。

图8显示具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽在pH 4.0和室温、40℃或50℃对由地衣芽孢杆菌α-淀粉酶对直链淀粉进行的水解的作用。

图9显示具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌和构巢曲霉多肽在pH 5.0和室温对由瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶和埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)淀粉葡糖苷酶对支链淀粉进行的水解的作用。

图10显示具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽在pH 5.0和室温对由瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶对玉米淀粉进行的水解的作用。

图11显示pMStr80的限制图谱。

图12显示具有淀粉分解增强活性的米曲霉(Aspergillus oryzae)IFO 4177多肽的cDNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：5和6)。

图13显示具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽在pH 5.0和室温对由瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶对玉米淀粉进行的水解的作用。

定义

淀粉分解增强活性：术语“淀粉分解增强活性”在本文中定义为增强具有淀粉分解活性的蛋白质对淀粉的水解的生物学活性。就本发明而言，淀粉分解增强活性是通过测定由于淀粉分解酶对淀粉在优选对所述淀粉分解酶为最适的pH和温度条件下进行的水解而导致的还原糖的增加来确定的。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的淀粉分解增强活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

所述具有淀粉分解增强活性的多肽通过将达到同等程度水解所需的淀粉分解酶的量减少优选至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，且更优选至少20倍来增强由具有淀粉分解活性的蛋白质催化的对含淀粉材料的水解。

含淀粉材料：术语“含淀粉材料”在本文中定义为任何包含淀粉的材料，淀粉是一种由大量葡萄糖单糖单元通过α-1，4-糖苷键或者α-1，4-糖苷键和α-1，6-糖苷键连接在一起组成的多糖(C₆H₁₀O₅)_n。淀粉尤其见于种子、球茎和块茎。在本发明的方法中，所述含淀粉材料可为任何含有淀粉的材料。淀粉通常从植物如玉米、小麦、高粱或稻的种子获得；并从植物如木薯、马铃薯、竹芋、树薯的块茎和根，以及西米棕榈(sago palm)的髓(pith)获得。适用于本发明方法的含淀粉起始材料的实例包括但不限于块茎、根、茎、全谷粒、玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、豌豆、豆或甘薯，或其组合，或谷类，含糖原材料，如糖蜜、水果材料、甘蔗或糖甜菜，马铃薯，和含纤维素材料如木或植物残余物，或其组合。涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。淀粉的主要商业来源是玉米，由其通过湿法磨制工艺提取淀粉。含淀粉材料还可为含有淀粉的木素纤维素。

在一个方面，所述含淀粉材料是玉米淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是小麦淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是高粱淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是稻淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是木薯淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是马铃薯淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是竹芋淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是树薯淀粉。在另一个方面，所述含淀粉材料是西米棕榈淀粉。

术语“粒状淀粉”意指未烹制的生淀粉，即，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为不溶于水的微小颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50℃-75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％且最优选至少99.5％纯，或其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包含非淀粉部分如胚残余物和纤维的经磨制的全谷粒。原材料如全谷粒可经磨制减小粒度以打开其结构以供进一步加工。优选两种磨制工艺，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨导致胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并常常用于使用淀粉水解物产生糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的。

所述含淀粉材料可优选地通过干磨或湿磨减少粒度以暴露更多表面积。在一个方面，粒度优选为0.05至3.0mm，更优选0.1至1.5mm，并最优选0.1至0.5mm，从而优选至少30％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，且最优选至少90％的含淀粉材料可穿过具有优选0.05至3.0mm筛网，更优选0.5至1.5mm筛网，且最优选0.1至0.5mm筛网的筛。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计是至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的多肽。在一个方面，基于预测SEQ ID NO：2的氨基酸1-18是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，所述成熟多肽是SEQ IDNO：2的氨基酸19-385。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO：4的氨基酸1-18是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，所述成熟多肽是SEQ ID NO：4的氨基酸19-385。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO：6的氨基酸1-18是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，所述成熟多肽是SEQ ID NO：6的氨基酸19-251。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有淀粉分解增强活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，基于预测SEQ ID NO：1的核苷酸1-54编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸55-1273。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO：3的核苷酸1-54编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：3的核苷酸55-1273。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO：5的核苷酸1-54编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：5的核苷酸55-753。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的残基x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)测定。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2的具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽或其成熟多肽，用SEQ ID NO：4的具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽或其成熟多肽，或用SEQ ID NO：6的具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中具有小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有淀粉分解增强活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的至少312个氨基酸残基，更优选至少330个氨基酸残基，并且最优选至少348个氨基酸残基。在另一个方面，片段含有SEQ ID NO：4的成熟多肽或其同源序列的至少312个氨基酸残基，更优选至少330个氨基酸残基，并且最优选至少348个氨基酸残基。在一个方面，片段含有SEQ ID NO：6的成熟多肽或其同源序列的至少200个氨基酸残基，更优选至少210个氨基酸残基，并且最优选至少220个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有淀粉分解增强活性的多肽片段。在一个方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少936个核苷酸，更优选至少990个核苷酸，并且最优选至少1044个核苷酸。在另一个方面，亚序列含有SEQ IDNO：3的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少936个核苷酸，更优选至少990个核苷酸，并且最优选至少1044个核苷酸。在一个方面，亚序列含有SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少600个核苷酸，更优选至少630个核苷酸，并且最优选至少660个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文中意指对由包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽，或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有淀粉分解增强活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的修饰的多核苷酸序列或其同源序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有淀粉分解增强活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性程度，所述多肽具有淀粉分解增强活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有淀粉分解增强活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸19至385，或其等位变体；或它们具有淀粉分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸19至385。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有淀粉分解增强活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸19至385或其等位变体，或它们具有淀粉分解增强活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ IDNO：2的氨基酸19至385组成。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有淀粉分解增强活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：4的成熟多肽。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸19至385，或其等位变体；或它们具有淀粉分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸19至385。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有淀粉分解增强活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸19至385或其等位变体，或它们具有淀粉分解增强活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ IDNO：4的氨基酸19至385组成。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有淀粉分解增强活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：6的成熟多肽。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸19至251，或其等位变体；或它们具有淀粉分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸19至251。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有淀粉分解增强活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：6的成熟多肽组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：4的氨基酸19至251或其等位变体，或它们具有淀粉分解增强活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ IDNO：6的氨基酸19至251组成。

在第二个方面，本发明涉及具有淀粉分解增强活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严格条件、更优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选非常高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有淀粉分解增强活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有淀粉分解增强活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA；其全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-rayfilm)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸55至1273。在另一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。

在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3的核苷酸55至1214。在另一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：4的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：3。

在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：5的核苷酸55至753。在另一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：5。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已切割并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严格性)，更优选在50℃(低严格性)，更优选在55℃(中严格性)，更优选在60℃(中-高严格性)，甚至更优选在65℃(高严格性)，并且最优选在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)计算得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算得出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有淀粉分解增强活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5的成熟多肽编码序列具有优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性程度、编码具有淀粉分解增强活性的多肽的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。参见本文多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及具有淀粉分解增强活性的分离的多肽，其包含一种或多种选自下组的基序：N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。在这些基序中采用了已接受的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含E-K-x-A-A-E-x-C-F，在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。

在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M和Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M和E-K-x-A-A-E-x-C-F。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D和E-K-x-A-A-E-x-C-F。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。

在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D和E-K-x-A-A-E-x-C-F。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。

在另一个优选的方面，所述具有淀粉分解增强活性的分离的多肽包含N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。

在第五个方面，本发明涉及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或几个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可选的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，淀粉分解增强活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有淀粉分解增强活性的多肽的来源

本发明的具有淀粉分解增强活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有淀粉分解增强活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有淀粉分解增强活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有淀粉分解增强活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolot)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有淀粉分解增强活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有淀粉分解增强活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomidium、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、Exidia、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、Holomastigotoides、腐质霉属(Humicola)、耙菌属(Irpex)、Lentinula、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝孢属(Verticillium)、Volvariella或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有淀粉分解增强活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusaruumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、Irpexlacteus、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌FGSC 2489多肽，例如，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)多肽。

在另一个更优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉FGSC A1000多肽，例如，包含SEQ ID NO：4的成熟多肽的多肽。

在另一个更优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有淀粉分解增强活性的米曲霉IFO4177多肽，例如，包含SEQ ID NO：6的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全阶段和不完全阶段，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白释放具有淀粉分解增强活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-576；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV  蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有淀粉分解增强活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸55至1273或由SEQ ID NO：1的核苷酸55至1273组成。本发明还涵盖编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有淀粉分解增强活性的SEQ ID NO：2的片段。

在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成。在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸55至1214或由SEQ ID NO：3的核苷酸55至1214组成。本发明还涵盖编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：3或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：3的亚序列，所述亚序列编码具有淀粉分解增强活性的SEQ ID NO：4的片段。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5组成。在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的核苷酸55至753或由SEQ ID NO：5的核苷酸55至753组成。本发明还涵盖编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：5或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：5的亚序列，所述亚序列编码具有淀粉分解增强活性的SEQ ID NO：6的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属或脉孢菌属菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性程度，所述多核苷酸编码具有淀粉分解增强活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的淀粉分解增强活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严格条件下，优选低严格条件，更优选中严格条件，更优选中-高严格条件，甚至更优选高严格条件，并且最优选非常高的严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。

本发明还涉及通过如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严格条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列或包含SEQID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有淀粉分解增强活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包含在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包含在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至18或由SEQID NO：2的氨基酸1至18组成。在另一个优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至54或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至54组成。

在另一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或由SEQID NO：4的氨基酸1至18组成。在另一个优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸1至54或由SEQ ID NO：3的核苷酸1至54组成。

在另一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸1至18或由SEQID NO：6的氨基酸1至18组成。在另一个优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：5的核苷酸1至54或由SEQ ID NO：5的核苷酸1至54组成。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前(多)肽通常是无活性的并且能够通过从前多肽催化或自催化切割所述前肽而转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，使前肽序列的位置紧接着(next to)多肽氨基末端，并且使信号肽序列的位置紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amds和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，其可操作地连接于一个或多个(几个)指导具有淀粉分解增强活性的多肽的产生的调控序列。将包含本发明的多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞从而将所述构建体或载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆4菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，NucleicAcids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用任何本领域已知的将DNA引入宿主细胞的方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary ofThe Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、Trametes villosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是脉孢菌属的。在更优选的方面，所述细胞是粗糙脉孢菌。在一个最优选的方面，所述细胞是粗糙脉孢菌FGSC 2489。在另一个优选的方面，所述细胞是曲霉属的。在另一个更优选的方面，所述细胞是构巢曲霉。在另一个最优选的方面，所述细胞是构巢曲霉FGSCA1000。在另一个更优选的方面，所述细胞是米曲霉。在另一个最优选的方面，所述细胞是米曲霉IFO 4177。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽或由SEQ ID NO：2、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有淀粉分解增强活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plantand Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology21：415-428所描述的。依据本公开所用的其他转化方法包括描述于美国专利6,395,966和7，151,204号的那些(两者均通过提述以其整体并入本文)。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有淀粉分解增强活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

在实施方案中，除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有本发明的构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码具有淀粉分解增强活性的多肽的构建体或其部分通过杂交而引入特定植物品种，而无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接重新生成的植物，还包括此类植物的后裔(progeny)。如用于本文，后裔可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后代(offspring)。此种后裔可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。在实施方案中，杂交导致本发明的转基因通过将起始种系与包含本发明的转基因的供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。

涵盖了包含本发明的具有淀粉分解增强活性的多肽的植物包括通过回交转化方法生成的植物。举例而言，本发明的植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

在实施方案中，可使用遗传标记以协助本发明的一个或多个转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变化导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后裔中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当本不(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景但具有所需性状的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有目标性状，但还具有相对较大比例所需种质的后裔。以此方式，将一个或多个性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

去除或减少淀粉分解增强活性

本发明还涉及产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞，所述方法例如，插入、破坏、替代或缺失。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其中对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

核苷酸序列的修饰或失活可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(几个)核苷酸或其转录或翻译所需的调节元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接对表达待修饰核苷酸序列的细胞进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方式的例子是基于基因替代、基因缺失、或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述互补序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变体细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无淀粉分解增强活性的蛋白质产物的方法，通过在发酵之前、过程中或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制淀粉分解增强活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及如下生产基本上无淀粉分解增强活性的蛋白质产物的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以实质上(substantially)减少淀粉分解增强活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与淀粉分解增强抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的淀粉分解增强活性。可使用此方法获得淀粉分解增强活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60-70℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无淀粉分解增强性的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。淀粉分解增强缺陷细胞(amylolytic enhancing-deficient cell)也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的多肽，例如酶。

在另外的方面，本发明涉及基本上无淀粉分解增强活性的蛋白质产物，其是通过本发明的方法产生的。

抑制具有淀粉分解增强活性的多肽表达的方法

本发明还涉及抑制具有淀粉分解增强活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对所述细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的双链体核苷酸。

dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(siRNA)。在另一个优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。

本发明还涉及这样的双链RNA (dsRNA)分子，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5成熟多肽编码序列的部分，用于抑制细胞中的多肽表达。虽然本发明不受限于任何特定作用机制，但dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述方法可以在体外、回体(ex vivo)或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于在细胞、器官或动物中产生功能丧失突变(loss-of-function mutation)。制备和使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中公知，参见，例如，美国专利号6,506,559；美国专利号6,511,824；美国专利号6,515,109；和美国专利号6,489,127。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的淀粉分解增强活性得到了增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

洗涤剂组合物

本发明具有淀粉分解增强活性的多肽可添加至洗涤剂组合物而成为洗涤剂组合物的组分。

本发明的洗涤剂组合物可配制为例如手洗或机洗的洗涤剂组合物，其包含适于预处理玷污的织物的洗涤添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂(softener)组合物，或可配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或可配制为用于手动或机械洗碗操作。

在一个具体方面，本发明提供了包含本发明多肽的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂以及所述洗涤剂组合物可包含一种或多种(几种)酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般而言所选酶的性质应与所选洗涤剂相容(即最适pH，与其他酶或非酶成分的相容性等)，且所述酶应以有效量存在。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如美国专利4,435,307、5,648,263、5,691,178、5,776,757号和WO 89/09259中公开的，由特异腐质酶、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有色彩维护(colour care)益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的例子有EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中记载的纤维素酶。其它例子有纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0 531 315、美国专利5,457,046、5,686,593、5,763,254号、WO 95/24471、WO 98/12307和WO 99/001544中记载的那些。

商业上可获得的纤维素酶包括CELLUZYME^TM和CAREZYME^TM(Novozymes A/S)、CLAZINASE^TM和PURADAX HA^TM(Genencor InternationalInc.)和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和WO 89/06270和WO94/25583中所述的镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体，特别是在下述一个或多个(几个)位置有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上可获得的蛋白酶包括ALCALASE^TM、SAVINASE^TM、PRIMASE^TM、DURALASE^TM、ESPERASE^TM和KANNASE^TM (NOVOZYMESA/S)；和MAXATASE^TM、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM、PURAFECT^TM、PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(Humicola)(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如记载于EP 258 068和EP305 216的来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)或来自记载于WO 96/13580的特异腐质霉的脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,024)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、脂肪酶假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)的脂肪酶，或芽孢杆菌属(Bacillus)的脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica acta 1131，253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它实例为脂肪酶变体，如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中记载的那些。

商业上可获得的脂肪酶包括LIPOLASE^TM、Lipex^TM和LIPOLASEULTRA^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括例如得自芽孢杆菌属例如在GB 1,296,839中更详细所述的地衣芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶。

有用的淀粉酶的实例为WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO97/43424中所述的变体，尤其是在一个或多个(多个)以下位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上可获得的淀粉酶有DURAMYL^TM、TERMAMYL^TM、FUNGAMYL^TM 和BAN^TM (Novozymes A/S)；和RAPIDASE^TM 和PURASTAR^TM (Genencor International Inc.)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程盖在的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、和WO98/15257中记载的那些。

商业上可获得的过氧化物酶包括GUARDZYME^TM(Novozymes A/S)。

可以通过添加分开的、含有一种或多种(几种)酶的添加剂或通过添加组合的、包含所有这些酶的添加剂将洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂，可配制为例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制物是颗粒，特别是非粉化颗粒、液体特别是经稳定化的液体，或浆料。

无粉尘的颗粒可以例如如US 4,106,991和4,661,452中公开的产生，并且可以任选地通过本技术领域已知的方法进行包覆。蜡质包覆材料的实例是具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。适于通过流化床技术施用的成膜包覆材料的实例在GB 1483591中给出。例如，可以通过根据已确立的方法添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来使液体酶制备物稳定。受保护的酶可根据EP 238,216中公开的方法来制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉末、颗粒(granule)、糊剂(paste)或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有多至70％水和0-30％有机溶剂，或是非水性的。

洗涤剂组合物包含一种或多种(几种)表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的(包括半-极性的)和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当包含于其中时，洗涤剂通常会含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸酯(linear alkylbenzenesulfonate)、α-链烯烃磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcohol ethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondary alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂类(soap)。

当包含于其中时，洗涤剂将通常含有约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acid monoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。

洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增效剂(builder)或络合剂例如沸石、二磷酸盐/酯、三磷酸盐/酯、膦酸盐/酯(phosphonate)、碳酸盐/酯、柠檬酸盐/酯、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种(几种)聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸盐/酯(polycarboxylate)例如聚丙烯酸盐/酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白体系，所述体系可包含H₂O₂源例如过硼酸盐或过碳酸盐，可将其与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可包含过氧酸，例如酰胺、二酰亚胺或砜型的过氧酸。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的酶稳定化，所述稳定剂例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenyl boronic acid)衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，并且所述组合物可按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分例如织物调节剂，包括粘土、泡沫促进剂(foam booster)、抑泡剂(suds suppressor)、抗腐蚀剂、悬污剂(soil-suspendingagent)、防污物再沉积剂(anti-soil redeposition agent)、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助水溶物(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料。

在洗涤剂组合物中，可以以相当于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液，优选0.05-5mg酶蛋白每升洗涤液，特别是0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量添加任何酶。

在洗涤剂组合物中，可以以相当于酶升洗涤液0.001-100mg蛋白、优选0.005-50mg蛋白，更优选0.01-25mg蛋白，甚至更优选0.05-10mg蛋白，最优选0.05-5mg蛋白，且甚至最优选0.01-1mg蛋白的量添加本发明具有淀粉分解增强活性的多肽。

还可将本发明具有此种水解增强活性的多肽并入WO 97/07202中公开的洗涤剂配制物，将WO 97/07202通过提述并入本文。

用途

本发明还涉及使用具有淀粉分解增强活性的多肽或其组合物的方法。本发明的具有淀粉分解增强活性的多肽与其他淀粉分解酶例如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶等组合，可用于多种应用。此类应用包括但不限于淀粉加工；湿法玉米磨制；醇类产生；酿酒；淀粉脱浆；洗涤剂应用；烘烤应用；饮料工业；石油钻井工艺；再循环纸的脱墨；和动物饲料。

在一个方面，本发明涉及用于降解含淀粉材料的方法，包括用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物在本发明具有淀粉分解增强活性的多肽存在下处理含淀粉材料。具有淀粉分解增强活性的多肽的存在与具有淀粉分解增强活性的多肽不存在时相比增加了含淀粉材料的降解。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收或纯化降解的含淀粉材料。所述降解的含淀粉材料可使用任何本领域已知方法回收或纯化。所述降解的含淀粉材料可为葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精或其组合。

在另一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生糖化产物的方法，包括(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；和(b)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物糖化经液化的含淀粉材料；其中步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和步骤(b)是在本发明具有淀粉分解增强活性的多肽存在下进行的。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收或纯化所述糖化产物。所述糖化产物可使用本领域任何已知方法来回收或纯化。所述糖化产物可为葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精或其组合。当所述糖化产物是葡萄糖的情况下，该方法可进一步包括用葡萄糖(木糖)异构酶将所述葡萄糖异构化为果糖。参见例如美国专利5,935,837号和美国专利4,687,742号。商业上可获得的木糖异构酶的实例为(Novozymes A/Z)。

在另一个方面，本发明涉及用于产生发酵产物的方法，包括：(a)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶在本发明具有淀粉分解增强活性的多肽存在下糖化含淀粉材料；和(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的含淀粉材料以产生发酵产物。具有淀粉分解增强活性的多肽的存在与具有淀粉分解增强活性的多肽不存在相比增加了含淀粉材料的糖化。在一个优选的方面，所述方法进一步包括(c)从发酵回收发酵产物。

在另一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括：(a)用α-淀粉酶液化含淀粉材料；(b)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物糖化经液化的含淀粉材料；和(c)在发酵生物存在下发酵经糖化的含淀粉材料；其中步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和(b)是在有效量的本发明具有淀粉分解增强活性的多肽存在下进行的。在一个优选的方面，所述方法进一步包括(d)从发酵回收发酵产物。

在本发明的方法中，可将具有淀粉分解增强活性的多肽与一种或多种(几种)淀粉分解酶在多种应用中，例如下述的那些中一同使用。可使用任何合适的含淀粉材料。起始材料一般基于应用和/或所需的产物进行选择。

高果糖玉米糖浆。淀粉至果糖的转化可由四个步骤组成：液化粒状淀粉，将所述经液化的淀粉糖化为右旋糖，纯化，和将右旋糖异构为果糖。使用淀粉酶产生高MW右旋糖糖浆(严格归类于约20000MW的寡糖)。大约20000MW的片段可通过葡糖淀粉酶和支链淀粉酶迅速并完全地转化为葡萄糖。参见例如WO 2004/091544。

玉米湿法磨制。玉米湿法磨制是产生玉米油、谷蛋白粗粉、谷蛋白饲料和淀粉的工艺。碱性淀粉酶用于淀粉液化，而葡糖淀粉酶用于糖化以产生葡萄糖。示例性玉米油工艺包括浸渍、脱胚(de-germing)、脱纤维和谷蛋白分离，然后使用例如α淀粉酶液化，并使用例如葡糖淀粉酶糖化。参见例如WO 2004/091544。

干法磨制工艺。在干法磨制中，将全谷粒磨碎并与水混合。任选地通过浮选分离或等同技术去除胚。使用淀粉酶液化所得的包含淀粉、纤维、蛋白和谷粒其他组分的混合物。参见例如WO 2004/091544。

纺织品工业。脱浆从纺织品去除浆料(size)。在纺制纺织品之后，必须在进一步加工织物之前去除浆料包覆以确保均一和耐洗的结果。在纺制纺织品的过程中或之后，或在脱浆过程中，或在一个或多个(几个)其他织物加工步骤中施用淀粉酶。参见例如美国专利6,077,316号。

产生均一麦芽糊精的工艺。淀粉酶涉及产生均一麦芽糊精的工艺。均一麦芽糊精可用于广泛的食品、药物和包覆应用。产生的均一麦芽糊精具有均一的MW分布，且可用于多种包含麦芽糊精的产物，导致较低的粘性，清澈(无浑浊)的溶液，更佳的包覆性质，更佳的成膜性质等。参见例如WO 2004/091544。

烘烤产物的抗陈化(staling)工艺。烘烤产物例如面包的陈化，指对于消费者所述烘烤产物性质不合意的变化，如面包心硬度的增加，面包心弹性的减少和面包皮变得坚韧而革质。使用麦芽糖淀粉酶延缓陈化。参见例如美国专利6,197,352；2,615,810和3,026,205；Silberstein，1964，Baker’s Digest 38：66-72。

玉米纤维胶。高品质的玉米纤维胶可通过用淀粉酶处理玉米纤维接着用过氧化氢处理以获得磨制的玉米纤维的提取物来产生。参见例如美国专利6,147,206。

动物饲料和添加剂。用淀粉酶处理动物饲料和添加剂可导致容易消化和易于吸收的糖的释放，从而增加动物和鸟类的消化能力。可将淀粉酶作为用于动物的饲料添加剂而添加，或可在供动物食用之前用淀粉酶处理所述动物饲料。参见例如WO 2004/091544。

纸或纸浆处理。可使用淀粉酶修饰纸浆或纸中的淀粉，从而将其转化为液化形式。参见例如美国专利6,241,849；6,066,233；和5,582,681。还可将淀粉酶用于产生来自淀粉补强的废纸和纸板的木素纤维素材料如纸浆、纸和纸板(淀粉酶通过降解补强的淀粉而促进废物的崩解)。淀粉酶可用于供从淀粉包覆的经打印的纸产生造纸纸浆的工艺。参见例如WO 95/14807。

再循环纸浆的脱墨。脱墨工艺涉及将纸崩解以产生纸浆，在崩解之前、之中或之后用淀粉降解酶处理，并在崩解和酶处理之后将墨颗粒从纸浆分离。参见例如美国专利6,309,871号。

废物处理。淀粉酶可用于废物处理。在固体废物消化工艺中，可用淀粉酶处理所述固体废物以减少固体废物的质量和体积。参见例如美国专利5,709,796号。

口腔护理产品。淀粉酶可用于口腔护理产品。示例性口腔护理产品包括牙膏、牙科用乳膏(dental cream)、凝胶或牙粉、牙科用品(odontics)、口腔洗剂、刷牙前或后的漂洗制剂(pre-or postbrushing rince formulation)、口香糖、锭剂或小糖果。参见例如美国专利6,264,925号。

钻井和采矿操作。淀粉酶可用于井和钻井操作，例如气井、油井等。举例而言，淀粉酶可用于增加来自地下构造的产物流，并用于去除可对生产操作造成损害的粘性、含淀粉流。参见例如美国专利6,581,687号。

酿造。淀粉酶可用于酿造(例如发酵)啤酒的工艺。将含淀粉原材料崩解并加工以形成麦芽。淀粉作用的结果是可发酵还原糖的增加。参见例如美国专利5,762,991；5,536,650；5,405,624；5,021,246；4,788,066号。

淀粉分解酶

在实施本发明的方法中，所述一种或多种(几种)淀粉分解酶可为α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、产麦芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶或其组合。

α-淀粉酶。所述α淀粉酶可为任何可用于本发明方法的α-淀粉酶。在一个方面，所述α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指在优选3至7，更优选3.5至6，且最优选4-5的范围内的pH具有最佳活性的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。

细菌α-淀粉酶优选源自芽孢杆菌属。在一个优选的方面，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶源自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但也可源自其它芽孢杆菌属菌种。α-淀粉酶的实例包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 99/19467)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467)，和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(WO 99/19467)。在另一个方面，所述α-淀粉酶可为与WO 99/19467中所示任何序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的酶。

所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，如WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355中公开的变体和杂合体。其他α-淀粉酶变体的实例公开于美国专利6,093,562、6,297,038和6,187,576号。所述变体包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，优选WO 1996/023873公开的双缺失(参见，例如，第20页第1-10行)，优选与WO 99/19467公开的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或根据WO 99/19467缺失氨基酸R179和G180。甚至更优选的是下述芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO99/19467公开的野生型BSG α-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。

所述α-淀粉酶还可为杂合α-淀粉酶。在一个方面，所述杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基(WO 99/19467)，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基(WO99/19467)，并具有下列取代中的一个或多个(几个)，特别是全部：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (使用WO 99/19467中公开的地衣芽孢杆菌α淀粉酶编号方式)。还优选具有一个或多个(几个)下述突变(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)的变体：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(WO 99/19467)。

可使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。这种方法基于通过酶分解改性的(modified)马铃薯淀粉，并通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪此反应。起初，形成蓝黑色(blackish blue color)，但是在淀粉分解过程中，蓝色越来越浅，并逐渐变成红褐色(reddish-brown)，将其与有色玻璃标准相比较。一个Kilo Novo α淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；和pH 5.6)将5260mg淀粉干物质Merck Amylumsolubile糊精化的酶量。更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可从Novozymes A/S，Denmark索取获得。

细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS(干固体)，优选0.001-1KNU每g DS，如约0.050KNU每g DS的量添加。

所述α-淀粉酶还可为真菌α-淀粉酶。真菌α-淀粉酶包括从曲霉属菌株获得的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶。

优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选的方面，所述酸性真菌α-淀粉酶是作为“AMYA ASPNG”以登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3)的α-淀粉酶。一种源自黑曲霉的商业上可获得的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。

其它可用的野生型α-淀粉酶包括从根毛霉属(Rhizomucor)和亚灰树花菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO 2004/055178)或大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)菌株获得的那些。

在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等，1986，J.Ferment.Bioeng.81：292-298(1996)，并进一步作为EMBL：#AB008370公开。

所述真菌α-淀粉酶还可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个方面，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。

所述α淀粉酶还可为真菌杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括公开于WO 2005/003311、美国专利申请2005/0054071号或美国专利申请2006/0148054号中的那些。杂合α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。

杂合α-淀粉酶的具体实例包括美国专利申请2006/0148054号实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的米曲霉α-淀粉酶变体(美国专利申请2006/0148054号)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(美国专利申请2006/0148054号)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其公开于美国专利申请2006/0148054号的表5)，或作为WO2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(美国专利申请2006/0148054号)。其它可用的杂合α-淀粉酶为列于美国专利申请2006/0148054号和WO 2006/069290中表3、4、5、6中的那些。

杂合α-淀粉酶的其它具体实例包括美国专利申请2005/0054071号中公开的那些，包括其表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

包含α-淀粉酶的优选商业组合物包括来自DSM(Gist Brocades)的MYCOLASE^TM；BAN^TM、TERMAMYL^TM  SC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TM X、SAN^TM SUPER和SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)；CLARASE^TM L-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TM FRED、SPEZYME^TM AA、SPEZYME^TM DELTA AA和SPEZYME XTRA^TM (Genencor Int.)；FUELZYME^TM(Verenium Corp.)；以及称为SP288可从Novozymes A/S获得的酸性真菌α-淀粉酶。

酸性α-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定，其相对于酶标准确定。一AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。描述该分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可通过索取从Novozymes A/S，Denmark获得。

真菌α-淀粉酶单位(FAU-F)是相对于确定强度的酶标准测定的。描述该标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可通过索取从Novozymes A/S，Denmark获得。

在本发明的方法中，酸性α-淀粉酶可以以优选0.1至10AFAU/g DS，更优选0.10至5AFAU/g DS，且最优选0.3至2AFAU/g DS，或者，优选以0.001至1FAU-F/g DS，并更优选0.01至1FAU-F/g DS的量添加。

葡糖淀粉酶。所述葡糖淀粉酶可为可用于本发明方法的任何葡糖淀粉酶。所述葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的。真菌葡糖淀粉酶的实例为曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J.3：1097-1102)，或其变体，如公开于WO 92/00381，WO 00/04136和WO 01/04273中的那些；公开于WO 84/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等，1991，Agric.Biol.Chem.，55：941-949)，或其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301：275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，1997，Protein Eng.10：1199-1204)。

其它可用的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiym rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利4,727,026号和Nagasaka等，1998，Appl Microbiol Biotechnol50：323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是由埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利Re.32,153号)，杜邦踝节菌(Talaromycesduponti)和嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利4,587,215号)获得的葡糖淀粉酶。

其他可用的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)以及公开于WO 2006/069289的瓣环栓菌(Trametes cingulata)的葡糖淀粉酶。

同样杂合葡糖淀粉酶可用于本发明方法。所述杂合葡糖淀粉酶的实例公开于WO 2005/045018。具体实例包括实施例1表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。

商业上可获得的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TM B4U、SPIRIZYME ULTRA^TM和AMG^TM E (来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM 300、GC480^TM和GC147^TM(来自GenencorInt.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；以及G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990ZR(来自Genencor Int.)。

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃和pH 4.3，使用23.2mM麦芽糖在0.1M乙酸盐缓冲液中的溶液作为底物反应时间5分钟的标准条件下，每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。可使用自动分析仪系统，其中将变旋酶添加至葡萄糖脱氢酶试剂从而使得任何存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖淀粉酶与β-D-葡萄糖在上述反应中特异性进行反应，生成NADH，在340nm确定其量作为起始葡萄糖浓度的量度。描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可通过索取从NovozymesA/S，Denmark获得。

葡糖淀粉酶优选以0.0001-20AGU/g DS，更优选0.001-10AGU/g DS，0.02-10AGU/g DS，更优选0.1-10AGU/g DS，甚至更优选0.1-5AGU/g DS，且甚至最优选0.1-2AGU/g DS的量添加。

β-淀粉酶。β-淀粉酶可为任何可用于本发明方法中的β-淀粉酶。已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress inIndustrial Microbiology，1979，15：112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。商业上可获得的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYM^TM WBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYME^TM BBA 1500。

β-淀粉酶单位(BAMU)定义为每分钟降解一μmol麦芽己糖的酶量，或定义为由1mg纯β-淀粉酶代表的活性。一BAMU是相对于酶标准的BAMU定义的。描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0516.02/01)的文件夹可通过索取从Novozymes A/S，Denmark获得。

产麦芽糖α-淀粉酶。所述产麦芽糖α-淀粉酶可为任何可用于本发明方法的产麦芽糖α-淀粉酶。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可从Novozymes A/S获得。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利4,598,048，4,604,355和6,162,628号。

一MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)定义为在10mg麦芽三糖(Sigma M8378；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)底物每ml 0.1M柠檬酸pH 5.0缓冲液的浓度在37℃进行30分钟时每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。

所述产麦芽糖淀粉酶优选以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/gDS的量添加。

支链淀粉酶。所述支链淀粉酶可为任何可用于本发明方法的支链淀粉酶。支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)，也称作芽霉菌聚糖-6-葡聚糖水解酶(pullulanan-6-glucanohydrolase)，降解芽霉菌糖(pullulan)、支链淀粉和其他支化底物的α-1，6-连接。在谷物工业，使用细菌支链淀粉酶用于去除淀粉中的α-1，6键的目的，其可在糖化工艺中导致不受欢迎的潘糖形成。

已知多种细菌支链淀粉酶。Kelly等，1994，FEMSMicrobiology Letters 115：97-106描述了Bacillus acidopullulyticus的支链淀粉酶B基因。WO 96/35794描述了来自芽孢杆菌属菌种的支链淀粉酶。

可用于本发明方法的商业性支链淀粉酶产品的实例包括但不限于来自Novozymes A/S的

知

支链淀粉酶活性可相对于芽霉菌糖底物来确定。芽霉菌糖是基本上由通过1，6-α-连接的麦芽三糖单元组成的直链D葡萄糖聚合物。内支链淀粉酶随机水解1，6-α-连接，释放出麦芽三糖、63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖和63-α-(63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖基)-麦芽三糖。一个新支链淀粉酶单位Novo(NPUN)是内支链淀粉酶活性的单位，并为相对于Novozymes A/S

标准物测量的。标准条件为在40℃和pH 4.5的30分钟反应时间；并用0.7％芽霉菌糖作为底物。红色底物降解产物的量在510nm通过分光光度法测量，并与样品中的内支链淀粉酶活性成比例。一个NPUN等于在标准条件下每分钟释放具有与2.86微摩尔葡萄糖等同还原力的还原糖的酶量。

所述支链淀粉酶优选以0.05-5NPUN/g DS的量添加。

在本发明的方法中，可对具有淀粉分解增强活性的多肽和其他淀粉分解蛋白补充一种或多种(几种)其他酶活性以改善含淀粉材料的降解。优选的其他酶为纤维素酶、半纤维素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其组合。

在本发明的方法中，所述其他酶可在发酵之前或过程中添加，包括在发酵微生物的繁殖过程中或之后添加。

在本发明的方法中，具有淀粉分解增强活性的多肽和淀粉分解酶的最适量取决于几个因素包括但不仅限于淀粉分解酶的混合物、含淀粉材料、含淀粉材料的浓度、温度、时间和pH。

在一个方面，每g含淀粉材料具有淀粉分解增强活性的多肽的量优选为每g含淀粉材料约0.01至约50mg，更优选约0.1至约20mg，且最优选约1至约10mg。

在另一个方面，每g淀粉分解酶具有淀粉分解增强活性的多肽的量优选为每g淀粉分解酶约0.005至约20g，更优选约0.05至约20g，且最优选约0.5至约10g。

发酵

得自所述含淀粉材料的可发酵的糖可由一种或多种能够将所述糖直接或间接发酵为所需发酵产物的发酵微生物进行发酵。“发酵”或“发酵工艺”指任何发酵工艺或任何包含发酵步骤的工艺。发酵工艺亦包括用于可饮用醇类工业(例如，啤酒与葡萄酒)，乳制品工业(例如，发酵的乳制品)，皮革工业和烟草工业中的发酵工艺。发酵条件取决于所需的发酵产物和发酵生物，且可由本领域技术人员简单地确定。

在所述发酵步骤中，作为与酶水解结果自所述含淀粉材料释放的糖由发酵生物如酵母，发酵为发酵产物。发酵还可与酶法糖化在相同容器中，同样在受控pH、温度和混合条件下同时进行。当糖化和发酵在相同容器中同时进行时，该工艺一般称为同时糖化和发酵或SSF。

任何合适含淀粉材料可用于本发明的发酵工业。底物一般基于所需的发酵产物，即待从发酵获得的发酵产物，以及所采用的发酵工艺(如本领域所公知的)来进行选择。

术语“发酵培养基”应理解为指在添加发酵微生物之前的培养基，如由糖化工艺产生的培养基，以及用于同时糖化与发酵过程(SSF)的培养基。

“发酵微生物”指适用于所需发酵工艺的任何微生物。合适的发酵微生物能够将糖如葡萄糖、麦芽糖或麦芽糊精直接或间接发酵(即转化)为所需的发酵产物。

产生乙醇的细菌与真菌发酵生物的实例描述于Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642。

可发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌与真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)，优选为酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)的菌株。

在一个优选的方面，所述酵母是酵母属菌种。在更优选的方面，所述酵母为酿酒酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母为糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一个更优选的方面，所述酵母为葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，所述酵母属于克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，所述酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyverom marxianus)。在另一个更优选的方面，所述酵母为脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述酵母属于假丝酵母属。在另一个更优选的方面，所述酵母为博伊丁氏假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母为芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母为迪丹氏假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母为假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，所述酵母为产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，所述酵母属于棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，所述酵母为葡萄牙棍孢(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，所述酵母为仙人掌棍孢(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，所述酵母属于管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，所述酵母为嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，所述酵母属于毕赤氏酵母属。在另一个更优选的方面，所述酵母为树干毕赤氏酵母。在另一个优选的方面，所述酵母属于酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，所述酵母为克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，《Handbook on Bioethanol：Production andUtilization》，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。

可有效将己糖发酵为乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌与热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上)。

在一个优选的方面，所述细菌属于发酵单胞菌属。在更优选的方面，所述细菌为运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，所述细菌属于梭菌属(Clostridium)。在另一个更优选的方面，所述细菌为热纤维梭菌。

适用于产生乙醇的商业上可获得的酵母包括，例如，ETHANOL RED^TM酵母(可得自Fermentis/Lesaffre，USA)，FALI^TM(可得自Fleischmann’s Yeast，USA)，SUPERSTART^TM与THERMOSACC^TM新鲜酵母(可得自EthanolTechnology，WI，USA)，BIOFERM^TM AFT与XR(可得自NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation，GA，USA)，GERT STRAND^TM(可得自GertStrand AB，Sweden)，以及FERMIOL^TM(可得自DSM Specialties)。

所述发酵微生物通常添加至经降解的含淀粉材料或水解物，且将所述发酵进行约8到约96小时，如约24到约60小时。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，且在约pH3到约pH8，例如约pH4-5，6或7。

在一个优选方面，将所述酵母和/或另一种微生物施用于经降解的含淀粉材料，且所述发酵进行约12至约96小时，例如通常24-60小时。在优选方面，温度优选在约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，且pH通常为约pH3至约pH7，优选约pH 4-7。然而，其中一些发酵生物例如细菌具有较高的最佳发酵温度。酵母或其它微生物优选以每ml发酵培养液大约10⁵至10¹²，优选大约10⁷至10¹⁰，特别是大约2x 10⁸活细胞计数的量施用。关于使用酵母以供发酵的进一步指导可见于，例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversity Press，United Kingdom 1999)，将其通过提述并入本文中。

对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏经发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作例如燃料乙醇，饮用乙醇，亦即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。

发酵刺激剂(fermentation stimulator)可与任何本文所述的方法组合使用以进一步改善所述发酵工艺，并且特别是所述发酵微生物的性能，如提高速率和乙醇产量。“发酵刺激剂”指对所述发酵微生物特别是酵母生长的刺激剂。优选的针对生长的发酵刺激剂包括维生素与矿物质。维生素的实例包括多种维生素，生物素，泛酸，烟酸，内消旋肌醇，硫胺素，吡哆醇，对氨基苯甲酸，叶酸，核黄素和维生素A，B，C，D及E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin greding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，将其通过提述并入本文中。矿物质的实例包括矿物质与无机盐，其可供应包括P，K，Mg，S，Ca，Fe，Zn，Mn与Cu的营养物。

发酵产物：发酵产物可为任何源自发酵的物质。所述发酵产物可为，醇(例如，阿拉伯糖醇，丁醇，乙醇，甘油，甲醇，1，3-丙二醇，山梨醇与木糖醇)；有机酸(例如，乙酸，醋酮酸，己二酸，抗坏血酸，柠檬酸，2，5-二酮-D-葡萄糖酸，甲酸，富马酸，葡萄糖二酸，葡萄糖酸，葡糖醛酸，戊二酸，3-羟基丙酸，衣康酸，乳酸，苹果酸，丙二酸，草酸，丙酸，琥珀酸与木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，赖氨酸，丝氨酸和苏氨酸)；以及气体(例如，甲烷，氢气(H₂)，二氧化碳(CO₂)与一氧化碳(CO))，但不仅限于此。所述发酵产物亦可为作为高价值产物的蛋白质。

在一个优选方面，所述发酵产物为醇。应理解术语“醇”涵盖下述物质，即其包含一个或更多羟基部分(moiety)。在一个更优选方面，所述醇为阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，所述醇为丁醇。在另一个更优选方面，所述醇为乙醇。在另一个更优选方面，所述醇为甘油。在另一个更优选方面，所述醇为甲醇，在另一个更优选方面，所述醇为1，3-丙二醇。在另一个更优选方面，所述醇为山梨醇。在另一个更优选方面，所述醇为木糖醇。参见，例如Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，《Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology》，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.和Jonas，R.，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production ofxylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol byClostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World Journalof Microbiology and Biotechnology 19(6)：595-603。

在另一个优选方面，所述发酵产物为有机酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为乙酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为醋酮酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为己二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为抗坏血酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为柠檬酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为2，5-二酮-D-葡萄糖酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为甲酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为富马酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为葡萄糖二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为葡萄糖酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为葡糖醛酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为戊二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为3-羟基丙酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为衣康酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为乳酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为苹果酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为丙二酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为草酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为丙酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为琥珀酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为木糖酸。参见，例如，Chen，R.，和Lee，YY，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid productionfrom cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。

在另一个优选方面，所述发酵产物为酮。应理解术语“酮”涵盖含有一个或更多酮基团的物质。在另一个更优选方面，所述酮为丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上。

在另一个优选方面，所述发酵产物为氨基酸。在另一个更优选方面，所述有机酸为天冬氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为谷氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为甘氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为赖氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为丝氨酸。在另一个更优选方面，所述氨基酸为苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling的batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and othermicrobial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。

在另一个优选方面，所述发酵产物为气体。在另一个更优选方面，所述气体为甲烷。在另一个更优选方面，所述气体为H₂。在另一个更优选方面，所述气体为CO₂。在另一个更优选方面，所述气体为CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuousculture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，Water Science andTechnology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.《Biomass and Bioenergy》，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass for methaneproduction：A review。

回收所述发酵产物可任选地自所述发酵培养基使用任何本领域已知方法加以回收，所述方法包括但不仅限于，层析，电泳方法，差示溶解度(differential solubility)，蒸馏或提取。举例而言，醇自经发酵的材料分离并通过常规蒸馏方法纯化。可获取纯度高至约96vol.％的乙醇，其可用作，例如，燃料乙醇，饮用乙醇亦即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。

信号肽

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18，或SEQ ID NO：6的氨基酸1至18，或者，由SEQ ID NO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18，或SEQ ID NO：6的氨基酸1至18组成。在一个优选的方面，所述编码信号肽的分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至54，SEQ ID NO：3的核苷酸1至54，或SEQ ID NO：5的核苷酸1至54，或者，由SEQ ID NO：1的核苷酸1至54，SEQ ID NO：3的核苷酸1至54，或SEQID NO：5的核苷酸1至54组成。

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，其中所述基因对于所述编码信号肽的核苷酸序列是外源的。

本发明还涉及包含此类核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)在有助于产生所述蛋白质的条件下，培养包含编码蛋白质的基因的重组宿主细胞，所述基因可操作地连接于所述编码信号肽的多核苷酸，其中所述基因对于所述多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含从至少两种不同的蛋白质获得的部分或全部多肽序列的组合，其中一种或多种(几种)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。

蛋白质优选是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在一个更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以获得自任何原核、真核或其它来源。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商业产品。

菌株

将米曲霉JaL250菌株(WO 99/61651)用于表达具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽。将米曲霉JaL355菌株(WO 2005/070962)用于表达具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽。将米曲霉BECh2菌株(WO 2000/039322)用于表达具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽。

培养基

PDA平板由39克马铃薯右旋糖琼脂组成，并用去离子水加至1升。

每升基本培养基+蔗糖平板由6g的NaNO₃，0.52g的KCl，1.52gKH₂PO₄，1ml的COVE痕量元素溶液和342.3g蔗糖组成；将pH用1N NaOH溶液调整至6.5，然后添加20g的Agar Noble。然后将悬液高压灭菌，并使其冷却至55℃，然后添加20ml的50％葡萄糖溶液，20ml的0.02％生物素溶液C vn和2.5ml的20％MgSO₄·7H₂O溶液，然后铺板。

COVE痕量元素溶液由0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O，0.4g的CuSO₄·5H₂O，1.2g的FeSO₄·7H₂O，0.7g的MnSO₄H₂O，0.8g的Na₂MoO₂·2H₂O，10g的ZnSO₄·7H₂O和补至1升的去离子水组成。

MDU2BP培养基由45g的麦芽糖，1g的MgSO₄·7H₂O，1g的NaCl，2g的K₂HSO₄，12g的KH₂PO₄，2g的尿素，500μl的AMG痕量金属溶液和补至1升的去离子水组成；将pH调整至5.0，然后用0.22μm过滤单元过滤灭菌。

YPM培养基由10g的酵母提取物，20g细菌蛋白胨，20g的麦芽糖和补至1升的去离子水组成。

YP培养基由10g酵母提取物，20g细菌蛋白胨和补至1升的去离子水组成。

YEG培养基由5g的酵母提取物，20g的右旋糖和补至1升的去离子水组成。

AMG痕量金属溶液由14.3g的ZnSO₄·7H₂O，2.5g的CuSO₄·5H₂O，0.5g的NiCl₂·6H₂O，13.8g的FeSO₄·7H₂O，8.5g的MnSO₄·7H₂O，3g的柠檬酸和补至1升的去离子水组成。

SOC培养基由2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mMNaCl，2.5mMKCl，10mM MgCl₂和10mM MgSO₄组成；通过高压灭菌，然后添加20mM经过滤灭菌的葡萄糖。。

STC由1M山梨醇，50mM Tris-HCl pH 6.5和50mM CaCl₂组成。

PEG溶液由50％(w/v)PEG 4000，50mM Tris-HCl pH 6.5和50mM CaCl₂组成。

COVE选择培养基由342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10mM乙酰胺，0.03M CsCl，30g的Noble琼脂和补至1升的去离子水组成。

COVE顶层琼脂由342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10mM乙酰胺，0.03M CsCl，10g的低熔点琼脂和补至1升的去离子水组成。

COVE-2由30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10mM乙酰胺，30g的Noble琼脂和补至1升的去离子水组成。

COVE盐溶液由26g的KCl，26g的MgSO₄，76g的KH₂PO₄，50ml的COVE痕量金属溶液和补至1升的去离子水组成。

COVE-N-gly由218g的山梨醇，10g的甘油，2.02g的KNO₃，50ml的COVE盐溶液，25g的琼脂BA10和补至1升的去离子水组成。

MLC培养基由40g的葡萄糖，50g的大豆粉，4g的柠檬酸，几滴pluronic酸和补至1升的去离子水组成；将pH调整至5.0。

MSS培养基由70g的葡萄糖，100g的大豆粉，几滴pluronic酸和补至1升的去离子水组成；将pH调整至6.0。

MU--1培养基由260g的麦芽糊精，3g的MgSO₄·7H₂O，6g的K₂SO₄，5g的KH₂PO₄，几滴pluronic酸和补至1升的去离子水组成；将pH调整至4.5。

MU1-MLC/MSS为1000ml的MU-1培养基，40ml的50％尿素，100ml的MLC培养基和100ml的MSS培养基的混合物。

M410培养基由50g的葡萄糖，50g的麦芽糖，2g的MgSO₄7H₂O，2g的KH₂PO₄，4g的柠檬酸，8g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的CaCl₂，0.5ml的AMG痕量金属溶液和补至1升的去离子水组成；用氢氧化钠将pH调至6.0；通过0.22μm膜进行过滤灭菌。

实施例1：从粗糙脉孢菌和构巢曲霉分离基因组DNA

粗糙脉孢菌是从Fungal Genetics Stock Center(Kansas City，MO，USA)获得的FGSC 2489，将其维持在PDA平板上。将500ml烧瓶中的一百ml YEG培养基用来自PDA平板的琼脂栓接种，并在34℃以200rpm振荡生长2日。将生物质收获于Nalgene 281-5000玻璃纤维预滤器(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY，USA)上，并用10mM Tris-0.1mM EDTApH 7.4(TE)充分漂洗，在液氮中冷冻，并用研钵和杵磨碎成粉。将几克的粉末悬于20ml的20mM CAPS-NaOH pH 11.0，0.5％LDS，1mMEDTA中，并在60℃温育60分钟，其间周期性进行倒置混合。添加等体积的中性化苯酚∶氯仿(1∶1)，并在室内37℃持续抽提2小时，其间在Belly Dancer振荡器(Fotodyne Incorporated，Hartland WI，USA)上持续混合。在浮桶式转子中以1300xg离心10分钟之后去除水相，并通过与中性化的苯酚∶氯仿(1∶1)短暂振荡来重新抽提。重复离心，并将水相移至2.5M乙酸铵，冻结，解冻，并以13,000xg在6℃离心20分钟。向上清添加0.7体积的异丙醇，并通过以17,000xg离心20分钟沉积(pellet)沉淀的核酸。将所得的沉淀用70％乙醇漂洗两次，风干，并溶解于1.0ml的0.1X TE。RNA通过添加100μg RNase A(Promega，Madison，WI，USA)并在室温温育30分钟来消化。通过添加乙酸铵至2.0M和2体积乙醇，接着以13,000xg离心15分钟来沉淀并沉积DNA。将沉淀用70％乙醇漂洗两次，风干，并溶解于0.75ml的0.1X TE。

构巢曲霉野生型菌株是从Fungal Genetics Stock Center(FGSC A1000；Kansas City，MO，USA)获得的，并将其维持在PDA平板上。将500ml烧瓶中的一百ml YEG培养基用来自PDA平板的琼脂栓接种，并在37℃以200rpm振荡生长2日。将生物质收获于Nalgene 281-5000玻璃纤维预滤器上，并用TE充分漂洗，在液氮中冷冻，并用研钵和杵磨碎成粉。将几克的粉末悬于30ml的10mM CAPS-NaOH pH 11.0，0.5％LDS，1mM EDTA中，分至两个50ml离心管中，并在60℃温育30分钟，其间周期性进行倒置混合。添加等体积的中性化苯酚∶氯仿(1∶1)，并在室温持续抽提过夜，其间在Belly Dancer振荡器上持续混合。在浮桶式转子中以1300xg离心10分钟之后去除水相，并通过与中性化的苯酚∶氯仿(1∶1)短暂振荡来重新抽提。重复离心，并将水相移至2.5M乙酸铵，冻结，解冻，并以13,000xg在6℃离心20分钟。向上清添加0.8体积的异丙醇，并通过在室温以17,000xg离心20分钟沉积沉淀的核酸。将所得的沉淀用70％乙醇漂洗三次，风干，并溶解于2.0ml的0.5XTE。RNA通过添加100μg RNaseA并在37℃温育30分钟来消化。通过添加乙酸铵至2.0M和2体积乙醇，接着以13,000xg在4℃离心15分钟来沉淀DNA。将沉淀用70％乙醇漂洗三次，风干，并溶解于0.5ml的0.1X TE。当完全溶解之后，添加KCl至终浓度为20mM。

实施例2：克隆具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽基因(aepA)

基于粗糙脉孢菌基因组序列(基因名B24N4.140)中的预测基因，设计下示两个合成的寡聚核苷酸引物来PCR扩增来自实施例1中制备的基因组DNA的粗糙脉孢菌aepA基因。使用IN-FUSION^TM PCR Cloning Kit(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)将片段直接克隆入表达载体pAlLo2(WO2004/099228)，而无需限制性消化和连接。

NCB24N4140有义：

5′-ACTGGATTTACCATGAAGTTCTCCATCATCTCGGTT-3′(SEQ ID NO：7)

NCB24N4140反义：

5′-TCACCTCTAGTTAATTAACTACTTCCACGACGACTCAA-3′(SEQ ID NO：8)

粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。

将上述每种引物三十皮摩尔用于含有400ng的粗糙脉孢菌基因组DNA、1X pfx Amplification Buffer(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、1.7μl的10mMdATP，dTTP，dGTP和dCTP混合物、2.5单位Pfx DNAPolymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和1μl的50mM MgSO₄，终体积为50μl的扩增反应物。将扩增反应物在

5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)中温育，程序设定为1个循环96℃3分钟；和33个循环，每个在94℃50秒，60℃50秒和68℃2分钟。然后将加热块进行4℃的浸泡循环。

将反应产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液分离，其中将1.3kb产物条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的指示进行纯化。

然后将片段使用IN-FUSION^TM PCR Cloning Kit克隆入pAlLo2表达载体。将载体用Nco I和Pac I消化。将片段如上所述通过凝胶电泳和

Gel Extraction Kit进行纯化。将基因片段和消化的载体一同在反应中温育，得到表达载体pPH48(图1)，其中aepA基因的转录受NA2-tpi启动子(经修饰的启动子，包括编码黑曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由来自在构巢曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列替代)所调控。The IN-FUSION^TM反应物(50μl)由1XIN-FUSION^TM Buffer(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)、1X B SA(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)、1μl的IN-FUSION^TM酶(1∶10稀释)(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)、150ng的经Nco I和Pac I消化的pAlLo2和50ng的粗糙脉孢菌aepA纯化PCR产物组成。将反应物在室温温育30分钟。使用一μl反应物来转化大肠杆菌XL10

Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。含有pPH48质粒的大肠杆菌转化体通过限制性消化分析来检测，并使用9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。

实施例3：具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽基因(aepA)的表征

1.3kb PCR片段的DNA测序是用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model377XL Automated DNA Sequencer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal ofVirology Methods38：47-60)进行的。使用下述载体引物进行测序：

795(TPI)fw：

5’-CCACACTTCTCTTCCTTCCTC-3’(SEQ ID NO：9)

引物796rv：

5’-CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3’(SEQ ID NO：10)

仔细检查核苷酸序列数据的品质，并通过PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助将所有序列相互比较。所述序列与初始数据库序列(EMBL ID CAE75704)进行了比较和比对，且为100％匹配。

基于编码的蛋白与公共数据库中同源性预测的蛋白之间的相似性构建了粗糙脉孢菌基因组DNA序列的基因模型。粗糙脉孢菌基因组DNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)示于图2A和2B。1276bp的基因组片段(包含终止密码子)编码由两个58和60bp的内含子中断的385个氨基酸的多肽。该基因及成熟编码序列的％G+C含量分别为57.4％和59.1％。淀粉结合域(糖结合模块家族20，Prosite登录号PS51166)存在于该前多肽的残基278至385左右。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测出18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有367个氨基酸，具有39.2kDa的预测分子量和5.1的pI。

使用如以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵用EMBOS S的Needle程序实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定了氨基酸序列的比较性配对全局比对。该比对显示编码具有淀粉分解增强活性的成熟多肽的粗糙脉孢菌基因推导的氨基酸序列与来自粗糙脉孢菌的两个预测的假定多肽(分别为UniProt登录号Q6MWQ3和Q7SCE9)推导的氨基酸序列分享99.7％和97.8％同一性(排除缺口)。这两者均为与aepA相同的基因序列的替代(可能是不正确的)基因模型。下一个最具相关性的蛋白是来自矮棒曲霉(Aspergillus clavatus)的预测的假定多肽(Uniprot登录号A1CN59)，具有71.6％同一性。

实施例4：具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽(AepA)在米曲霉JaL250中的表达

米曲霉Jal250(WO 99/61651)原生质体是根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备的。使用总共2.71μg的pPH48来转化米曲霉JaL250原生质体。

用pPH48转化米曲霉JaL250(实施例2)得到约50个转化体。将八个转化体分离至单个PDA平板，并在34℃温育5日。

用3ml的0.01％80洗涤汇集的孢子平板，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基。将转化培养物在34℃以200rpm的恒定振荡进行温育。在接种后第五日，收集了每种培养物的1.5ml等分试样，并以12,000xg离心。将每个上清的7.5μl样品与等体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合，并加载于1.5mm 8％-16％Tris-GlycineSDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUE^TM Safe Stain(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色。培养液的SDS-PAGE概貌显示八个转化体中的七个具有大约50kDa的新蛋白条带。新蛋白条带的表见分子量约比预测的分子量39.2kDa大约10kDa。该大小差异可为由于翻译后修饰如糖基化所致。选择转化体2号以供进一步研究，并将其命名为米曲霉JaL250PH48。后续实验表明在该菌株中AepA蛋白的表达在YPM培养基中更高，并将该培养基用于后续表达。

实施例5：克隆具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽基因(aepA)。

基于构巢曲霉基因组序列(基因名AN5463.2)中的预测基因，设计下示两个合成的寡聚核苷酸引物来PCR扩增来自实施例1中制备的基因组DNA的构巢曲霉aepA基因。使用IN-FUSION^TM PCR Cloning Kit将片段直接克隆入表达载体pAlLo2，而无需限制性消化和连接。

AN5463有义：

5′-ACTGGATTTACCATGAAGTCTCTCCTCGCCCTTGTG-3′(SEQ ID NO：11)

AN5463反义：

5′-TCACCTCTAGTTAATTAACTACCGCCATGCACCACTCT-3′(SEQ ID NO：12)

粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的插入位点同源。

将上述每种引物三十皮摩尔用于含有400ng的构巢曲霉基因组DNA、1XPfx Amplification Buffer、1.7μl的10mM dATP，dTTP，dGTP和dCTP混合物、2.5单位

Pfx DNA Polymerase和1μl的50mM MgSO₄，终体积为50μl的扩增反应物。将扩增反应物在

5333中温育，程序设定为1个循环96℃3分钟；和33个循环，每个在94℃50秒，60℃50秒和68℃2分钟。然后将加热块进行4℃的浸泡循环。

将反应产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳使用TAE缓冲液分离，其中将1.2kb产物条带从凝胶切出，并使用

Gel Extraction Kit依照生产商的指示进行纯化。

然后将片段使用IN-FUSION^TM PCR Cloning Kit克隆入pAlLo2。将载体用Nco I和Pac I消化。将片段如上所述通过凝胶电泳和

GelExtraction Kit进行纯化。将基因片段和消化的载体一同在反应中温育，得到表达载体pPH49(图3)，其中aepA基因的转录受NA2-tpi启动子(经修饰的启动子，包括编码黑曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由来自在构巢曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列替代)所调控。IN-FUSION^TM反应物(50μl)由1X IN-FUSION^TM Buffer、1X BSA、1μl的IN-FUSION^TM酶(1∶10稀释)、150ng的经Nco I和Pac I消化的pAlLo2和50ng的构巢曲霉aepA纯化PCR产物组成。将反应物在室温温育30分钟。使用一μl反应物来转化大肠杆菌XL10

Gold细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。含有pPH49质粒的大肠杆菌转化体通过限制消化来检测，并使用

9600制备质粒DNA。

实施例6：具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽基因(aepA)的表征

1.2kb PCR片段的DNA测序是如实施例3中所述进行的。将所述1.2kb序列序列与初始数据库序列(GenBank登录号NT 107010)进行了比较和比对，且为100％匹配。

基于构巢曲霉基因组DNA序列(UniProt登录号Q5B1W7)的预测基因模型构建了该DNA序列的基因模型。构巢曲霉基因组DNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)示于图4A和4B。1217bp的基因组片段(包含终止密码子)编码由一个59bp的内含子中断的385个氨基酸的多肽。该基因及成熟编码序列的％G+C含量分别为53.3％和53.8％。淀粉结合域(糖结合模块家族20，Prosite登录号PS51166)存在于该前多肽的残基278至385左右。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测出18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有367个氨基酸，具有39.1kDa的预测分子量和5.1的pI。

使用如以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵用EMBOSS的Needle程序实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定了氨基酸序列的比较性配对全局比对。该比对显示编码具有淀粉分解增强活性的成熟多肽的构巢曲霉基因推导的氨基酸序列与来自构巢曲霉和Neosartorya fischeri的两个预测的假定多肽(分别为UniProt登录号Q5B1W7和A1D1F9)推导的氨基酸序列分享100％和80.0％同一性(排除缺口)。

实施例7：具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽(AepA)在米曲霉JaL355中的表达

米曲霉Jal250原生质体是根据Christensen等，1988，见上的方法制备的。使用2.71μg的pPH49(描述于实施例5)来转化米曲霉JaL355原生质体。

用pPH49转化米曲霉JaL355得到约40个转化体。将八个转化体分离至单个PDA平板，并在34℃温育五日。

用MDU2BP培养基中的3ml的0.01％

80洗涤汇集的孢子平板，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基。将转化培养物在34℃以200rpm的恒定振荡进行温育。在接种后第五日，收集了每种培养物的1.5ml等分试样，并以12,000x g离心。将每个上清的7.5μl样品与等体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合，并加载于1.5mm8％-16％Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUE^TM Safe Stain(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色。

培养液的SDS-PAGE概貌显示八个转化体中的七个具有大约55kDa的新蛋白条带。新蛋白条带的表见分子量约比预测的分子量39.1kDa大约14kDa。该大小差异可为由于翻译后修饰如糖基化所致。选择转化体5号以供进一步研究，并将其命名为米曲霉JaL250PH49克隆#5。

实施例8：米曲霉JaL355PH49克隆#5的单孢子分离

为了确保基因型均一性并确定纯分离株是否会产生更多的具有淀粉分解增强活性的重组构巢曲霉多肽(ApeA)，从起始米曲霉Jal250PH49克隆#5生成了单孢子培养物。将两百微升MDU2BP培养基中的0.01％

80添加至米曲霉Jal250PH49克隆#5汇集孢子平板的小区域。将该区域的孢子用灭菌的Arber涂布器(Arber Bioscience，Rochester，NY，USA)重悬，从而使得重悬区域直径不大于13mm。收集了该孢子悬浮物的100μl等分试样，并将其稀释于5ml的0.01％80溶液。孢子浓度是应用血细胞计数器(HausserScientific，Horsham，PA，USA)通过在腔室(chamber)两侧的中央平方毫米的5个0.2²mm方格(四个角加上中间的一个)来确定孢子浓度。确定了这些计数的平均值，并将其乘以5以确定每平方毫米的孢子总数，然后乘以10⁴以获得每微升的孢子数。然后将孢子在MDU2BP培养基中的0.01％

80中稀释至终浓度每微升0.1孢子。将三百微升的含有30个孢子的孢子悬液置于150mm基本培养基+蔗糖平板上，并在34℃温育2至3日。一旦菌落明显可见，随机选择10个菌落，并将其分别转移至100mm PDA平板，并在34℃温育五日。

实施例9：米曲霉JaL355PH49克隆#5单孢子分离株的表达分析

将来自米曲霉JaL355PH49克隆#5的全部十个单孢子分离株的汇集孢子平板用MDU2BP培养基中的3ml 0.01％

80洗涤，并使用孢子悬液接种125ml玻璃摇瓶中的25ml的MDU2BP培养基。将转化培养物在34℃以200rpm的持续振荡进行温育。在接种后第五日，将每个培养物的1.5ml等分试样收集并以12000xg离心。将每个上清的7.5μl样品与等体积的等体积的2X上样缓冲液(10％β-巯基乙醇)混合，并加载于1.5mm 8％-16％Tris-Glycine SDS-PAGE凝胶上，并用SIMPLYBLUE^TM Safe Stain染色。

培养液的SDS-PAGE概貌显示所有十个转化体具有与起始米曲霉JaL355PH49克隆#5类似的蛋白样式。十个中有四个具有大约55kDa的更深的蛋白条带，表明这些分离株能够生成更多构巢曲霉AepA。从这四个分离株中，选择了分离株#8以供进一步研究，并将其命名为米曲霉JaL355PH49。

实施例10：在米曲霉Jal250PH48中表达的具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽的大摇瓶培养

将米曲霉Jal250PH48孢子涂布于PDA平板上，并在34℃温育五日。用5ml的0.01％

20洗涤两次汇集的孢子平板以最大化收集到的孢子数。然后将孢子悬液用于接种500ml烧瓶中的100ml YPM。将转化培养物在34℃以200rpm持续振荡进行温育。在接种后第四日，通过经由0.22μmEXPRESS^TM Plus Membrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤来收集培养液。如上所述通过SDS-PAGE分析该培养液的5μl样品以确证蛋白样式与之前获得的相同。一旦通过SDS-PAGE显示该培养液含有预期的大约55kDa的蛋白条带，对该培养液进行纯化和酶表征。

实施例11：在米曲霉Jal355PH49中表达的具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽的大摇瓶培养

将米曲霉JaL250PH49孢子涂布于PDA平板上，并在34℃温育5日。如实施例10中所述生成培养液。

实施例12：用于瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶的pHUda666表达载体的构建

编码来自瓣环栓菌的淀粉葡糖苷酶的基因是如WO2006/069289中所述克隆自基因组DNA，随后亚克隆入表达载体，并转化入米曲霉。将所得的米曲霉表达株NC000651以麦芽糖为唯一碳源在摇瓶中发酵3日以诱导基因表达。收获了菌丝体，并使用

Mini Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离总RNA。淀粉葡糖苷酶基因的cDNA是使用3’RACE系统(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)依照生产商的实验方案和下示引物合成的。

正向引物：

5’-tttggatccaccatgcgtttcacgctcctcacc-3’(SEQ ID NO：13)

反向引物：

5’-tttctcgagctaccgccaggtgtcgttctg-3’(SEQ ID NO：14)

将扩增出的1.7kb片段用Bam HI和Xho I消化，并连接至质粒pT7Blue(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的Bam HI和Xho I位点。然后将连接混合物转化入大肠杆菌DH12α(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。使用

SpinMiniprep Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的指示制备质粒DNA样品以供测序。分离了携带含有瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶cDNA基因的质粒的单一克隆。将该插入物通过用Bam HI和Xho I的消化切出，并连接入经Bam HI和Xho I消化的pJaL790(WO 2007/045248)。分离了携带含有瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶cDNA基因的质粒的单一克隆，并将其命名为pHUda6661(图5)。

图13：表达在黑曲霉中表达的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶

将黑曲霉菌株BO1接种入含有2％葡萄糖和1M蔗糖的25ml的YP培养基，并在30℃以150rpm的振荡生长过夜。通过经由0.2μm STERICUPEXPRESS^TM Plus膜(Millipore Corporation，Billerica，MA，USA)的过滤收集菌丝体，将其用250ml的1M山梨醇漂洗，并再次过滤。将菌丝体悬于125ml烧瓶中的含有每ml 20mg的

200G(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)和0.33mg的几丁质酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)的30ml的1M山梨醇中，并在34℃以100rpm温育45分钟。将溶液在冰上冷却，经过两层(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)过滤，并用1M山梨醇稀释至50ml，并在Sorvall 7500浮桶式转子中以1500rpm离心5分钟。将沉淀重悬于1M山梨醇，并将离心和重悬重复三次。将最终沉淀以每ml3x10⁷个原生质体的浓度悬于STC∶PEG溶液∶DMSO(2.7∶0.5∶0.035)中，并储藏于-80℃。对于转化，将5-10μg的pHUda666质粒DNA与等体积的肝素溶液(每ml 50mM CaCl₂-1.2M山梨醇5mg)混合，并如上所述制备100μl的原生质体。将溶液轻柔地混合，并在冰上温育20分钟。添加一ml的40％PEG 4000，0.8M山梨醇，50mM CaCl₂，并在室温温育20分钟。然后在50℃添加7-10ml的COVE顶层琼脂，并将溶液倾至COVE选择培养基平板上，允许其硬化，并在34℃温育3-7日。将来自每个菌株的五十个转化体亚培养至COVE-2培养基，并将单菌落分离株转移至COVE-N-gly培养基并在32℃温育大约3周。将孢子收集于3-5ml的0.01％20并冻结于10％甘油。然后解冻孢子悬液，并将每个悬液40μl接种入14ml圆底管中的4ml MU1-MLC/MSS培养基，并在30℃以200rpm温育多至10日。通过SDS-PAGE就大约70kDa条带的表达对组织上清进行分析。选取最佳转化体(CKle43)以供放大发酵。

每升烧瓶培养基是由70g的蔗糖和100g的大豆浓缩物组成的。将一百ml的烧瓶培养基添加至500ml烧瓶。将烧瓶用来自甘油孢子储液的300μl接种，并在30℃在定轨振荡器上以220rpm温育72小时。将来自四个单独的摇瓶的每一个的五十ml摇瓶培养液用于接种3升发酵容器。

分批发酵培养基由50g的麦芽糊精，8.5g的(NH₄)₂SO₄，2g的KH₂PO₄，2g的MgSO₄.7H₂O，3g的K₂SO₄，0.8g Na₂HPO₄，1.1g的柠檬酸，0.5ml的消泡剂，1ml的痕量金属溶液#1，0.5ml的痕量金属溶液#2和补至1升的去离子水组成。所述痕量金属溶液#1由13.8g的FeSO₄·7H₂O，14.3g的ZnSO₄·7H₂O，11.6g的MnSO₄·H₂O，2.5g的CuSO₄·5H₂O，0.5g的NiCl₂·6H₂O，3.3g的一水合柠檬酸和补至1升的去离子水组成。所述痕量金属溶液#2由400g的CaCl₂·2H₂O，10g的NaNO₃和补至1升的去离子水。每kg发酵补料培养基由690g的葡萄糖，1.5g的一水合柠檬酸，0.9ml的痕量元素溶液#2和1ml的消泡剂组成。

将总共2升的分批发酵培养基添加至Applikon Biotechnology两升玻璃夹套(glass jacketed)发酵器(Applikon Biotechnology，Schiedam，Netherlands)。将发酵补料培养基以0至5.4g/l/hr的速率剂量添加185小时的时间。将发酵容器维持在34℃的温度，并使用Applikon 1010控制系统(ApplikonBiotechnology，Schiedam，Netherlands)控制pH至4.85+/-0.1的设定点。将空气以1.2vvm的速率添加至容器，并通过以1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌该培养液。在8日之后，从容器收获全培养液，并以3000x g离心以去除生物质。将上清过滤灭菌并储藏于5至10℃。

实施例14：具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽的纯化

将根据实施例10获得的含有具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽的培养液上清通过加载50ml所述培养液上清至4个串联连接的26/10柱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)上，每个柱具有13ml的体积，然后用20mM Tris pH 8.0洗脱来脱盐。收集8ml的级分，并基于使用8-16％Tris-HCl凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)对级分进行SDS-PAGE分析来汇集级分1-8。然后使用20ml MonoQ16/10柱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)进一步纯化汇集的级分。将50ml体积的汇集级分上样于MonoQ

16/10柱之上，然后使用20柱体积20mM Tris-HCl pH 8.0中从0至0.25M NaCl的梯度洗脱。收集5ml的级分，并对级分33至37进行SDS-PAGE分析。用考马斯蓝染色8-16％Tris-HCl凝胶上的SDS-PAGE显示样品超过95％纯。

实施例15：具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽在水解支链淀粉中的作用

对具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽就其增强黑曲霉酸性α-淀粉酶和瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶各自或组合对支链淀粉水解的能力进行衡量。支链淀粉的水解是用每升1.75mM CaCl₂-50mM柠檬酸钠，pH 4.0中，5g的支链淀粉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA；Sigma A8515，lot102k3775)进行的。将瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶以每升1.3mg的最终蛋白质浓度添加。将以每升50mM柠檬酸钠，pH 4.0缓冲液中的10g的浓度溶解的黑曲霉酸性α-淀粉酶(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark；SP288)以每升20mg的终浓度添加。将水解反应物在室温与或不与每升7.6mg具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽在室温温育过夜。对于每个反应，制备800μl的单一反应混合物，然后一式三份等分于

1ml深孔板(AxygenScientific，Union City，CA，USA；#P-DW-11-C，lot 080102-112)中每孔200μl中。将每升50mM柠檬酸钠pH 4.0缓冲液中100、75、50、25、12.5和0mg的葡萄糖标准以每孔200μl重复添加。然后使用ALPS-300平板密封器(ABgene，Rochester，NY，USA)热密封所述平板，并在室温静置过夜。

在过夜温育之后，对平板就还原糖浓度使用PHBAH(4-羟基-苯甲酰肼)测定法进行测定。将五十微升的0.5M NaOH添加至板上的每个孔中(含有葡萄糖标准)以终止反应。将含支链淀粉的样品稀释40倍于由一份0.5M NaOH与4份50mM柠檬酸钠，pH 4.0缓冲液组成的稀释剂中，即将12.5μl样品与87.5μl稀释剂混合，然后将20μl的8倍稀释的样品与80μl稀释剂混合。两个稀释液均在Thermowell V-底96-孔板(Corning，Inc.，Oneonta，NY，USA；Corning#6511)中中制备。将每个葡萄糖标准的100μl样品(含NaOH)添加至最终稀释板的孔中，然后将50μl的0.5M NaOH中的1.5％(w/v)PHBAH(Sigma H9882，lot#054k1344)添加至每个孔。然后将平板在Omega CN76000加热块(AmeriTechnology Group，Inc.，Sacramento，CA，USA)上在95℃加热10分钟。在加热之后，将50μl去离子水添加至每个孔，并将每个样品100μl转移至透明的平底96孔板(Corning，Inc.，Oneonta，NY，USA；Corning#9017)上。然后使用

340pc分光光度平板读数器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，USA)测量在410nm的吸光度。葡萄糖浓度是从葡萄糖浓度对葡萄糖标准在410nm吸光度的直线拟合而确定的。

示于图6的结果表明具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽增强了瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶、黑曲霉α-淀粉酶和所述淀粉葡糖苷酶和α-淀粉酶的组合对支链淀粉的水解。所述具有淀粉分解增强活性的多肽本身不产生可测量的支链淀粉水解。

实施例16：具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽的纯化

将根据实施例11获得的含有具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽的培养液上清通过加载50ml所述液上清至4个串联连接的

26/10柱(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)上，每个柱具有13ml的体积，然后用20mM Tris pH 8.0洗脱来脱盐。收集8ml的级分，并基于使用8-16％Tris-HCl凝胶对级分进行SDS-PAGE分析来汇集级分3-8。然后进一步使用20ml MonoQ

16/10柱纯化汇集的级分。将48ml体积的汇集级分上样于MonoQ16/10柱之上，然后使用20柱体积20mMTris-HCl pH 8.0中从0至0.5M NaCl的梯度洗脱。收集5ml的级分，并对级分50和53至59进行SDS-PAGE分析。用考马斯蓝染色的8-16％Tris-HCl凝胶上的SDS-PAGE显示样品超过95％纯。

实施例17：具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽和具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽在水解直链淀粉中的作用

对具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉和粗糙脉孢菌多肽就其增强地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark，TERMAMYL^TMstandard，batch 19-1197)对直链淀粉水解的能力进行衡量。直链淀粉的水解是用每升1.75mM CaCl₂-50mM柠檬酸钠pH 4.0或1.75mM CaCl₂-50mM柠檬酸钠pH 6.0中5g的来自马铃薯的III型直链淀粉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)进行的。所述直链淀粉基本上不含支链淀粉。将以每升50mM Tris HCl pH 8.0缓冲液中5g的浓度溶解的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，以每升20mg的最终蛋白质浓度添加。将水解反应物在室温与或不与每升7.6mg的具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌多肽或3.6mg的具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽温育过夜。对于每一个反应，制备1300μl的单一反应混合物，然后一式三份等分于

1ml深孔板中每孔125μl中。对于pH 4.0平板，将每升50mM柠檬酸钠pH 4.0缓冲液中100、75、50、25、12.5和0mg的葡萄糖标准以每孔125μl重复添加。对于pH 6.0平板，将每升50mM柠檬酸钠pH 6.0缓冲液中100、75、50、25、12.5和0mg的葡萄糖标准以每孔125μl重复添加。然后使用ALPS-300平板密封器热密封所述平板，并在室温、40℃或50℃静置过夜。

在过夜温育之后，将所述平板就还原糖浓度使用实施例15中所述的PHBAH测定法进行测定，只是将31.3μl的0.5M NaOH添加至板上的每个孔(含有葡萄糖标准)以终止反应，且将含有直链淀粉的样品稀释20倍于由一份0.5M NaOH与4份50mM柠檬酸钠pH 4.0缓冲液组成的稀释剂中，即将5μl样品与95μl稀释剂混合。

图7中所示的结果表明来自构巢曲霉和粗糙脉孢菌的具有淀粉分解增强活性的多肽均在pH 6.0和室温增强了地衣芽孢杆菌α-淀粉酶对直链淀粉的水解。图8中所示的结果表明来自粗糙脉孢菌的具有淀粉分解增强活性的多肽在pH4.0和室温、40℃和50℃增强了地衣芽孢杆菌α-淀粉酶对直链淀粉的水解。

实施例18：具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉和粗糙脉孢菌多肽在用埃默森踝节菌和瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶水解支链淀粉中的作用

对具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉和粗糙脉孢菌多肽就其增强瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶或埃默森踝节菌淀粉葡糖苷酶对支链淀粉水解的能力进行衡量。支链淀粉的水解是用每升1.75mM CaCl₂-50mM柠檬酸钠pH 5.0中5g的支链淀粉来进行的。将如实施例13中所述获得的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶以每升1.3mg的最终蛋白质浓度添加。将埃默森踝节菌淀粉葡糖苷酶(NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark；

Fuel，batch NAP00204)稀释8250倍于1.75mM CaCl₂-50mM柠檬酸钠pH 5.0中，然后进一步稀释20倍至最终反应混合物。将水解反应物在室温与或不与每升7.6mg的具有淀粉分解增强活性的粗糙脉孢菌或构巢曲霉多肽温育过夜。对于每一个反应，制备800μl的单一反应混合物，然后一式三份等分于

1ml深孔板中每孔200μl中。将每升50mM柠檬酸钠pH 5.0缓冲液中100、75、50、25、12.5和0mg的葡萄糖标准以每孔200μl重复添加。然后使用A硅氧烷96孔板盖(Nalgene，Rochester，NY，USA)密封所述平板，并在室温静置过夜。

在过夜温育之后，将所述平板就还原糖浓度使用实施例15中所述的PHBAH测定法进行测定。

图9中所示的结果表明每个来自粗糙脉孢菌和构巢曲霉的具有淀粉分解增强活性的多肽均增强了瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶和埃默森踝节菌淀粉葡糖苷酶对支链淀粉的水解。

实施例19：具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽对玉米淀粉水解的作用

对具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽就其增强瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶对玉米淀粉水解的能力进行衡量。玉米淀粉的水解是用每升1.75mMCaCl₂-50mM柠檬酸钠，pH 5.0中，50g的玉米淀粉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)进行的。将实施例13中所述获得的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶以每升2.0mg的最终蛋白质浓度添加。将水解反应物在室温与或不与每升10mg具有淀粉分解增强活性的构巢曲霉多肽在室温温育过夜。对于每个反应，制备800μl的单一反应混合物，然后一式三份等分于

1ml深孔板中每孔200μl中。将每升50mM柠檬酸钠pH 5.0缓冲液中1000、500、250、125、62.5和0mg的葡萄糖标准以每孔200μl重复添加。然后使用ALPS-300平板密封器热密封所述平板，并在室温静置过夜。

在过夜温育之后，对平板就葡萄糖使用葡萄糖氧化酶测定法进行测定。将一百微升的0.5M NaOH添加至板上的每个孔中(含有葡萄糖标准)以终止反应。然后将来自每个孔的20μl转移至含有每孔200μl液体葡萄糖氧化酶试剂(Pointe Scientific，Canton，MI，USA，#G7521，lot # 815601-182)的透明的平底96孔板上。并在室温温育7分钟。然后用

340pc分光光度平板读数器测量在490nm的吸光度。葡萄糖浓度是从葡萄糖浓度对葡萄糖标准在490nm吸光度的直线拟合而确定的。

示于图10的结果表明来自粗糙脉孢菌的具有淀粉分解增强活性的多肽增强了瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶对玉米淀粉的水解。

实施例20：克隆具有淀粉分解增强活性的多肽的编码基因的米曲霉cDNA序列

具有淀粉分解增强活性的米曲霉IFO4177多肽的编码基因(aepA)的cDNA序列的克隆和测序是如WO 2000/56762中所述进行的。通过用两个下示的合成寡核苷酸引物由克隆NN00055-12-D05-045PCR扩增蛋白质编码序列而将米曲霉aepA cDNA亚克隆入曲霉属表达载体pMStr57(WO 2004/032648)。

AoPL2.1：

5’-CGAGGATCCAACATAATGAAGGTCTTCG-3’(SEQ ID NO：15)

AoPL2.2：

5’-AGCAAGCTTCAGTGACGAAATGCCAT-3’(SEQ ID NO：16)

所述引物具有适当的限制性位点添加至其5’端以便于PCR产物的亚克隆。使用Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix(ABgene，Surrey，U.K.)依照生产商的指示，使用20个循环的50℃的退火温度，60℃的延伸温度和1分钟的延伸时间进行PCR扩增。

将PCR片段用Bam HI和Hind III限制性酶切并使用标准技术克隆入pMStr57以产生pMStr80(图11)。

实施例21：具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽的编码基因的表征

编码具有淀粉分解增强活性的米曲霉基因(aepA)的cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)示于图12。756bp的cDNA序列(包含终止密码子)编码251个氨基酸的多肽。该基因及成熟编码序列的％G+C含量分别为55.4％和55.6％，使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，见上)，预测出18个残基的信号肽。预测的成熟蛋白含有233个氨基酸，具有25.7kDa的预测分子量和4.16的pI。

使用如以缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EBLOSUM62矩阵用EMBOSS的Needle程序实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定了氨基酸序列的比较性配对全局比对。该比对显示编码具有淀粉分解增强活性的成熟多肽的米曲霉基因的推导的氨基酸序列与来自米曲霉和黄曲霉两个预测的假定多肽(分别为UniProt登录号Q2U8Y3和B8NDE4)推导的氨基酸序列分享100％和99.6％同一性(排除缺口)。

实施例22：米曲霉MSTR212的构建

根据Christensen等，1988，见上和WO 2004/032648将米曲霉菌株BECh2(WO 2000/39322)用pMStr80转化。通过在含有0.01％ Triton X-100的amdS选择培养基(Christensen等，1988，见上)上稀释划线分生孢子以限制菌落大小来分离二十个转化体，并在30℃在10ml的YPM培养基中以275rpm振荡进行培养。在1和2日之后取样，并通过SDS-PAGE监视具有淀粉分解增强活性的多肽的表达。十三个转化体产生大约34kDa的新蛋白条带。通过在含有0.01％Triton X-100的相同选择培养基上稀释划线分生孢子以限制菌落大小来重新分离这些转化体中的九个，并随后在30℃在带挡板的500ml烧瓶中的100ml YPM培养基中以275rpm振荡进行培养。在3日后取样，并通过SDS-PAGE监视具有淀粉分解增强活性的多肽的表达。选取最高产率的转化体以供进一步表征，并将其命名为米曲霉MSTR212。

实施例23：在米曲霉MSTR212中表达的具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽的大摇瓶培养

将米曲霉MSTR212孢子涂布于PDA平板上，并在34℃温育五日。用5ml的0.01％20洗涤两次汇集的孢子平板以最大化收集到的孢子数。然后将孢子悬液用于接种五个500ml烧瓶中每个烧瓶的100ml的M410培养基。将培养物在34℃以250rpm持续振荡进行温育。在接种后第五日，通过经由0.22μm EXPRESS^TM Plus Membrane过滤来收集培养液。如上所述通过SDS-PAGE分析该液的5μl样品以确证蛋白样式具有预期的大小。一旦通过SDS-PAGE显示该培养液含有预期的大约37kDa的蛋白条带，对该液进行纯化和评价。

实施例24：具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽的纯化

将根据实施例23获得的含有具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽的约250ml的培养液上清通过使用具有10kDa的名义截留分子量的超滤膜(Millipore Corporation，Billerica，MA，USA)浓缩至50ml来脱盐。然后加回250ml的20mM Tris pH 8.5。然后将所得的混合物浓缩至25ml。

将经缓冲液交换的样品使用20ml MonoQ

16/10柱纯化。将25ml体积的经缓冲液交换的样品加载于MonoQ

16/10柱。用2柱体积的20mM Tris pH 8.0洗涤柱，然后用20柱体积20mM Tris-HCl pH 8.0中从0至0.6M NaCl的梯度洗脱。在洗涤步骤收集10ml的级分，并从洗脱步骤收集6ml的级分。对级分40至54进行SDS-PAGE分析。8-16％Tris-HCl无染色凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)上的SDS-PAGE显示样品超过95％纯。

实施例25：具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽对玉米淀粉水解的作用

对具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽就其增强瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶对玉米淀粉水解的能力进行衡量。玉米淀粉的水解是用每升1.75mMCaCl₂-50mM柠檬酸钠，pH 5.0中，5g的玉米淀粉进行的。将实施例13中所述获得的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶以每升2.0mg的最终蛋白质浓度添加。将水解反应物与或不与每升45mg具有淀粉分解增强活性的米曲霉多肽在室温温育过夜。对于每个反应，制备800μl的单一反应混合物，然后一式三份等分于1ml深孔板中每孔200μl中。将每升50mM柠檬酸钠pH 5.0缓冲液中1000、500、250、125、62.5和0mg的葡萄糖标准以每孔200μl重复添加。然后用硅氧烷96孔板盖(Nalgene，Rochester，NY，USA)密封所述平板，并在室温静置过夜。

在过夜温育之后，对平板就葡萄糖使用葡萄糖氧化酶测定法进行测定。将一百微升的0.5M NaOH添加至板上的每个孔中(含有葡萄糖标准)以终止反应。然后将来自每个孔的20μl转移至含有每孔200μl液体葡萄糖氧化酶试剂的透明的平底96孔板上。并在室温温育7分钟。然后用

340pc分光光度平板读数器测量在490nm的吸光度。葡萄糖浓度是从葡萄糖浓度对葡萄糖标准在490nm吸光度的直线拟合而确定的。

示于图13的结果表明来自米曲霉的具有淀粉分解增强活性的多肽增强了瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶对玉米淀粉的水解。

本发明进一步由下述编号的段落描述：

[1]一种具有淀粉分解增强活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性；

(d)多肽，包含一种或多种选自下组的基序：N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]；和

(e)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

[2]段落1的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。

[3]段落2的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少65％序列同一性的氨基酸序列。

[4]段落3的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

[5]段落4的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。

[6]段落5的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

[7]段落6的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

[8]段落7的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

[9]段落8的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

[10]段落9的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的成熟多肽具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。

[11]段落1的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其具有纤维素分解增强活性的片段，或者由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其具有纤维素分解增强活性的片段组成。

[12]段落11的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。

[13]段落1的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽，或者由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽组成。

[14]段落1的多肽，其是由在至少中等严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码的：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[15]段落14的多肽，其是由在至少中等-高严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码的：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[16]段落15的多肽，其是由在至少高严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码的：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[17]段落16的多肽，其是由在至少非常高严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码的：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[18]段落1的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[19]段落18的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少65％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[20]段落19的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[21]段落20的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[22]段落21的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[23]段落22的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[24]段落23的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[25]段落24的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[26]段落25的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少97％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[27]段落1的多肽，其是由如下多核苷酸编码的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或其编码具有纤维素分解增强活性的片段的亚序列组成。

[28]段落27的多肽，其是由如下多核苷酸编码的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列，或由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列组成。

[29]段落1的多肽，其是由如下多核苷酸编码的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，或由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列组成。

[30]段落1的多肽，包含一种或多种选自下组的基序：N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]。

[31]段落1的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

[32]段落1-31任一所述的多肽，其中所述成熟多肽为SEQ ID NO：2的氨基酸19到385，SEQ ID NO：4的氨基酸19到385或SEQ ID NO：6的氨基酸19到251。

[33]段落1-32任一所述的多肽，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ IDNO：1的核苷酸55到1273，SEQ ID NO：3的核苷酸55到1214或SEQ ID NO：5的核苷酸55到753。

[34]一种分离的多核苷酸，其包含编码段落1-33任一所述的多肽的核苷酸序列。

[35]段落34的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽。

[36]一种核酸构建体，其包含段落34或35的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列在表达宿主中指导该多肽的产生。

[37]一种重组表达载体，其包含段落34或35的多核苷酸。

[38]一种重组宿主细胞，其包含段落34或35的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导具有淀粉分解增强活性的多肽的产生。

[39]一种产生段落1-33任一所述多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。

[40]一种产生段落1-33任一所述多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所得多肽。

[41]一种产生亲本细胞的突变体的方法，包括破坏或缺失编码段落1-33任一所述多肽的核苷酸序列或其一部分，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

[42]一种突变体细胞，其是由段落41的方法产生的。

[43]段落42的突变体细胞，进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。

[44]一种产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于产生所述蛋白质的条件下培养段落43的突变体细胞；和(b)回收该蛋白质。

[45]段落34或35所述的分离的多核苷酸，通过下述方法获取：(a)在至少中等严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所得杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

[46]段落45的分离的多核苷酸，通过下述方法获取：(a)在至少中等-高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所得杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

[47]段落46的分离的多核苷酸，通过下述方法获取：(a)在至少高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所得杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

[48]段落47的分离的多核苷酸，通过下述方法获取：(a)在至少非常高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1或3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所得杂交的多核苷酸，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。

[49]段落45-48任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸55到1273，SEQ ID NO：3的核苷酸55到1214或SEQ ID NO：5的核苷酸55到753。

[50]一种产生包含突变体核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突变体核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽，所述方法包括：(a)将至少一种突变导入SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列中，其中所述突变体核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽组成的多肽；和(b)回收包含所述突变体核苷酸序列的多核苷酸。

[51]一种由段落50的方法产生的突变体多核苷酸。

[52]一种产生多肽的方法，包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含编码所述多肽的段落51的突变体多核苷酸的细胞；和(b)回收所述多肽。

[53]一种产生段落1-33任一所述多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

[54]一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其使用编码段落1-33任一所述的多肽的多核苷酸转化的。

[55]一种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落34或35的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。

[56]段落55的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

[57]一种在细胞中抑制具有纤维素分解增强活性的多肽表达的方法，其包括对所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含段落34或35的多核苷酸的亚序列。

[58]段落57的方法，其中所述dsRNA在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

[59]一种分离的多核苷酸，编码信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或SEQ ID NO：6的氨基酸1至18，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或SEQ ID NO：6的氨基酸1至18组成。

[60]一种核酸构建体，其包含与段落59的多核苷酸可操作地连接的编码蛋白质的基因，其中所述基因对于编码所述信号肽的核苷酸序列为外源的。

[61]一种重组表达载体，其包含段落59的多核苷酸。

[62]一种重组宿主细胞，其包含段落59的多核苷酸。

[63]一种产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于产生所述蛋白质的条件下培养包含与段落59的多核苷酸可操作地连接的编码蛋白的基因的重组宿主细胞，其中所述基因对于编码所述信号肽的核苷酸序列为外源的；和(b)回收所述蛋白质。

[64]一种组合物，其包含段落1-33任一项所述的多肽。

[65]一种洗涤剂组合物，包含段落1-33任一项具有淀粉分解增强活性的多肽，一种或多种(几种)淀粉分解酶和表面活性剂。

[66]一种降解含淀粉材料的方法，包括：用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物在段落1-33任一项具有淀粉分解增强活性的多肽的存在下处理所述含淀粉材料。

[67]段落66的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶选自下组：α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、淀粉葡糖淀粉酶、支链淀粉酶及其组合。

[68]段落66或67的方法，进一步包括回收降解的含淀粉材料

[69]段落68的方法，其中所述降解的淀粉材料是葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精或其组合。

[70]段落66-69任一项所述的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶和/或具有淀粉分解增强活性的多肽是含或不含细胞的发酵液的形式。

[71]一种从含淀粉材料产生糖化产物的方法，包括：

(a)用α-淀粉酶液化含淀粉材料；和

(b)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物糖化经液化的含淀粉材料；

其中步骤(a)，步骤(b)，或步骤(a)和(b)是在段落1-33任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽存在下进行的。

[72]段落71的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶选自下组：α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、淀粉葡糖淀粉酶、支链淀粉酶及其组合。

[73]段落71或72的方法，进一步包括(c)从经糖化的含淀粉材料回收糖化产物。

[74]段落73的方法，其中所述糖化产物是葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精或其组合。

[75]一种产生发酵产物的方法，包括：

(a)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物在段落1-33任一项所述具有淀粉分解增强活性的多肽存在下糖化含淀粉材料；和

(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的含淀粉材料以产生发酵产物。

[76]段落75的方法，进一步包括(c)从所述发酵回收发酵产物。

[77]段落75或76的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶选自下组：α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、淀粉葡糖淀粉酶、支链淀粉酶及其组合。

[78]段落75-77任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

[79]段落75-78任一项所述的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶和/或具有淀粉分解增强活性的多肽为含或不含细胞的发酵液的形式。

[80]段落75-79任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时或顺序进行。

[81]一种从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括：

(a)用α-淀粉酶液化含淀粉材料；

(b)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物糖化经液化的含淀粉材料；和

(c)在一种或多种(几种)发酵生物存在下发酵经糖化的含淀粉材料以生成发酵产物；

其中步骤(a)，步骤(b)，或步骤(a)和(b)是在段落1-33任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽存在下进行的。

[82]段落81的方法，其中步骤(b)和(c)是同时或顺序进行的。

[83]段落81或82的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶选自下组：α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、淀粉葡糖淀粉酶、支链淀粉酶及其组合。

[84]段落81-83任一项所述的方法，进一步包括(d)从所述发酵回收发酵产物。

[85]段落81-84任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

[86]段落81-85任一项所述的方法，其中所述一种或多种(几种)淀粉分解酶和/或具有淀粉分解增强活性的多肽为含或不含细胞的发酵液的形式。

在本文中描述和要求保护的发明在范围上并不受本文公开的具体方面所限，这是因为这些方面旨在说明本发明的数个方面。任何等同的方面应认为在本发明的范围内。事实上，除本文中显示和描述的那些之外，数种对本发明的修改从前述的描述而言对本领域技术人员会是显而易见的。上述修改亦意欲落入所附权利要求的范围内。在出现冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。

Claims (23)

1.一种具有淀粉分解增强活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或包含SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性的核苷酸序列；

(d)多肽，其包含含有一个或多个选自下组的基序的多肽：N-G-D-H-G-G-M、Q-T-x-Q-x-Y-L-x-C-A-D、E-K-x-A-A-E-x-C-F和Y-N-A-R-x(3)-D-Y-N-[FQVP]；和

(e)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

2.权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的成熟多肽，或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的成熟多肽组成。

3.权利要求1的多肽，其由包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5的成熟多肽编码序列的多核苷酸，或由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列组成的多核苷酸所编码。

4.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-3中任一项所述的多肽的核苷酸序列。

5.一种重组宿主细胞，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)指导具有淀粉分解增强活性的多肽产生的调控序列。

6.一种产生权利要求1-3中任一项所述的多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。

7.一种产生权利要求1-3中任一项所述的多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码该多肽的核苷酸序列的核酸构建体；和(b)回收所述多肽。

8.一种产生亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-3中任一项所述的多肽或其部分的多核苷酸，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

9.一种产生权利要求1-3中任一项所述的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

10.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其是用编码权利要求1-3中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的。

11.一种双链抑制性RNA (dsRNA)分子，其包含权利要求4的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。

12.一种在细胞中抑制具有淀粉分解增强活性的多肽表达的方法，包括对所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含权利要求4的多核苷酸的亚序列。

13.一种分离的多核苷酸，编码信号肽，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或SEQ ID NO：6的氨基酸1至18，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸1至18，SEQ ID NO：4的氨基酸1至18或SEQ ID NO：6的氨基酸1至18组成。

14.一种产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于产生所述蛋白质的条件下培养包含与权利要求13的多核苷酸可操作地连接的编码蛋白的基因的重组宿主细胞，其中所述基因对于所述编码信号肽的多核苷酸为外源的；和(b)回收所述蛋白质。

15.一种洗涤剂组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽，一种或多种(几种)淀粉分解酶和表面活性剂。

16.一种降解含淀粉材料的方法，包括：用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物在权利要求1-3中任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽的存在下处理所述含淀粉材料。

17.权利要求16的方法，进一步包括回收降解的含淀粉材料。

18.一种从含淀粉材料产生糖化产物的方法，包括：

(a)用α-淀粉酶液化含淀粉材料；和

(b)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物糖化经液化的含淀粉材料；

其中步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和(b)是在权利要求1-3中任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽存在下进行的。

19.权利要求18的方法，进一步包括(c)从经糖化的含淀粉材料回收糖化产物。

20.一种产生发酵产物的方法，包括：

(a)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物在权利要求1-3中任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽存在下糖化含淀粉材料；和

(b)用一种或多种(几种)发酵微生物发酵经糖化的含淀粉材料以产生发酵产物。

21.权利要求20的方法，进一步包括(c)从所述发酵回收发酵产物。

22.一种从含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括：

(a)用α-淀粉酶液化含淀粉材料；

(b)用包含一种或多种(几种)淀粉分解酶的酶组合物糖化经液化的含淀粉材料；和

(c)在一种或多种(几种)发酵生物存在下发酵经糖化的含淀粉材料以生成发酵产物；

其中步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和(b)是在权利要求1-3中任一项所述的具有淀粉分解增强活性的多肽存在下进行的。

23.权利要求22的方法，进一步包括(d)从所述发酵回收发酵产物。

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