BR9708887B1 - "variante de uma alfa-amilase, uso da mesma, construção de dna, vetor de expressão recombinante, célula de bactéria ou fungo, aditivo e composição detergente". - Google Patents

Description

"VARIANTE DE UMA ALFA-AM IL ASE, USO DA MESMA, CONSTRUÇÃO DE DNA, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA DE BACTÉRIA OU FUNGO, ADITIVO E COMPOSIÇÃO DETERGENTE'1, CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se inter alia a novas variantes (imitam.es) de α-amilases semelhantes a Termamyl originárias, notavelmente variantes demonstrando alterações em uma ou mais propriedades (com relação ao originário), que são vantajosos com relação às aplicações das variantes e, particularmente, processamento de amido industrial (por exemplo liqueíaçio ou sacarificação de amido), ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As α-amilases (a-l,4-gIucano-4-glucano-hidrolases, EC 3.2.I.L) constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e outros oligo- e políssacarídeos l ,4-glucosídicos, lineares e ramificados, e se tem um corpo de patentes e literatura científica muito extensivo com relação a esta classe de enzimas industrial mente muito importante.

Dentre as descrições mais recentes com relação a Ot-amilases WO 96/23874 provê dados estruturais do cristal em raios-X, tridimensionais, para uma ot-amilase semelhante a Termamyl que consiste de 300 resíduos de aminoácido N-terminais de α-amilase de B, amyhliquefaciens, compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 4 aqui e os aminoácidos 301-483 de terminação C-terminal de α-amilase de B. íimyloiiquefaciem compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 aqui (a última sendo comercialmente disponível sob a marca comercial Termamyl ™), e que é assim intimamente relacionada com as a- amilases de Bcu illus industrialmente importantes (que no presente contexto são englobadas dentro do significado de termo tx-amilases semelhantes a Termamyl" e que incluem, inter alia, α-amilases de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, e B. stearothermophilus). WO 96/23874 ainda descreve a metodologia para projetar, com base em uma análise da estrutura de uma a- amilase semelhante a Termamyl originária, variantes de a-amilase semelhante a Termamyl originária que demonstram propriedades alteradas com relação ao originário.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Como indicado acima, a presente invenção refere-se, inter alia, a novas variantes α-amilolíticos (mutantes de α-amilase semelhante a Termamyl, particularmente variantes demonstrando propriedades alteradas que são vantaiosas em conexão com o processamento industrial de amido (liquefação de amido, sacarificação e outros).

As alterações nas propriedades que podem ser obtidas em mutantes da invenção são alterações em, por exemplo, especificidade do substrato, ligação do substrato, padrão de divagem do substrato, estabilidade térmica, perfil de pH/ atividade, perfil de pH/estabilidade (como aumentada estabilidade em valores baixos (por exemplo pH<6, particularmente pH<5), ou elevados (por exemplo pH>9, estabilidade para oxidação, dependência de Ca2+, atividade específica, e outras propriedades de interesse. Por exemplo, a alteração pode resultar em uma variante que, como comparado com a a- amilase semelhante a Termamyl originária, tem uma dependência de Ca2+ reduzida e/ou perfil de pH/atividade alterado.

A invenção ainda se refere, inter alia, a construções de DNA codificando variantes da invenção, a processos para preparar as variantes da invenção e ao uso das variantes da invenção, sozinhos ou em combinação com outras enzimas α-amilolíticas, em vários processos industriais, por exemplo liquefação de amido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A α-amilase semelhante a Termamyl S

Sabe-se bem que várias α-amilases produzidas por Bacillus spp. são altamente homólogas no nível de aminoácidos. Por exemplo, a a- amilase Bacillus licheniformis compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 (comercialmente disponível como Termamyl ™ foi verificada como sendo cerca de 89% homóloga com a α-amilase de B. amyloliquefaciens compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 4, e cerca de 79% homóloga com a α-amilase B. stearothermophilus compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 6. Outras α-amilases homólogas incluem uma a-amilase derivada de uma cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 ou DSM 9375, todos sendo descritos em detalhes em WO 95/26397, e a α-amilase descrita por Tsukamoto et al, Biochemial and Biophvsical Research Communications. 151 (1988), pp. 25-31. Ainda outras a-amilases homólogas incluem a α-amilase produzida por cepa B. licheniformis descrita em EP 025266 (ATCC 27811), e as α-amilases identificadas em WO 91/00353 e WO 94/18314. Outras α-amilases de Bacillus licheniformis semelhantes a Termamyl comerciais são Optitherm ™ e Takatherm ™ (da Solvay), Maxamyl ™ (disponível da Gist-Brocades- Genencor), Spezym AA ™ (disponível da Genencor) e Keistase ™ (disponível da Daiwa).

Devido à homologia substancial encontrada entre estas a- amilases, elas são consideradas como pertencendo à mesma classe de a- amilases, ou seja a classe de α-amilases semelhantes a Termamyl.

Consequentemente, no presente contexto, o termo "a-amilase semelhante a Termamyl" se destina a indicar uma α-amilase que, no nível de aminoácido, demonstra uma homologia substancial a Termamyl ™, isto é a α-amilase de B. licheniformis, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 aqui. Em outras palavras, uma α-amilase semelhante a Termamyl é uma α-amilase que tem a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO · 2, no. 4 ou no. 6 aqui, ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 1, de WO 95/26397 {cuja sequência de aminoácidos é mostrada na figura 1 ou figura 2 aqui) ou na SEQ. ID. NO.: 2, de WO 95/26397 (cuja sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 aqui), ou em Tsukamoto et al, 1988, (cuja sequência de aminoácidos é mostrada na figura 2 aqui), ou i), que mostra pelo menos 60%, como pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de homologia com pelo menos uma das referidas sequências de aminoácidos e/o ii) demonstra reatividade cruzada imunológica com um anticorpo crido contra pelo menos uma das referidas α-amilases , e/ou iii) é codificado por uma sequência de DNA que hibridiza para as sequências de DNA codificando as a-amilases acima especificadas que são aparentes da SEQ. ID. NO,: 1, 3 e 5 do presente pedido (cujas sequências de codificação codificam a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2, 4 e 6 aqui, respectivamente), da SEQ. ID. NO.: 4, de WO 95/26397 (cuja sequência de DNA, junto com o códon de parada TAA, é mostrado na figura 1, aqui e codifica a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 1 aqui), e da SEQ. ID. NO.: 5 de WO 95/ 26397, respectivamente.

Em conjunto com a propriedade i), a "homologia" pode ser determinada pelo uso de qualquer algoritmo convencional, preferivelmente pelo uso de programa GAP da versão de GCG 7.3 (junho 1993) usando valores de defeito para penalidades GAP (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, versão 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). A propriedade ii) de α-amilase, isto é, a reatividade cruzada imunológica pode ser testada usando um anticorpo criado contra, ou reativo com pelo menos um epítopo de α-amilase semelhante a Termamyl relevante. O anticorpo que pode ser ou monoclonal ou policlonal, pode ser produzido por processos conhecidos na arte, por exemplo como descrito por Hudson et al, 1989. A reatividade cruzada imunológica pode ser determinada usando testes conhecidos na arte, cujos exemplos são Western Blotting ou teste de imunodifusão radial, por exemplo como descrito por Hudson et al, 1989.

Neste aspecto, a reatividade cruzada imunológica entre as α-amilases tendo as sequências de aminoácidos SEQ. ID. NO.: 2, 4 e 6, respectivamente, foi verificada. A sonda de oligonucleotídeos usada na caracterização de a- amilase semelhante a Termamyl de acordo com a propriedade iii) acima pode ser preparada de modo apropriado com base no nucleotídeo total u parcial ou sequência de aminoácido de α-amilase em questão. As condições apropriadas para teste de hibridização envolvem o pré-embebimento em 5 x SSC e pré- hibridização durante 1 h a aproximadamente 40°C em uma solução de 20% formamida, 5x solução de Denhardt, 50 mM fosfato de sódio, pH 6,8, e 50 pg de DNA de timo de bezerro tratado com som desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução suplementada com 100 μΜ ATP durante 18 h a aproximadamente 40°C, ou outros processos descritos por, como exemplo, Sambrook et al, 1989.

No presente contexto, "derivado de" se destina não somente a indicar uma α-amilase produzida ou produtível por uma cepa de organismo em questão, mas também uma α-amilase codificada por uma sequência de DNA isolada desta cepa e produzida em um organismo hospedeiro transformado com referida sequência de DNA. Finalmente, o termo se destina a indicar uma α-amilase que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou cDNA e que tem características de identificação da a- amilase em questão. O termo também se destina a indicar que a a-amilase originária pode ser uma variante de uma α-amilase de ocorrência natural, isto é uma variante que é por resultado de uma modificação (inserção, substituição, deleção) de um ou mais resíduos de aminoácidos de α-amilase de ocorrência natural. α-amilases híbridas originárias A α-amilase originária pode ser uma α-amilase híbrida, isto é, uma α-amilase que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos parciais derivadas de pelo menos duas a-amilases. A α-amilase híbrida originária pode ser uma que com base em homologia de aminoácido e/ou reatividade cruzada imunológica e/ou hibridização de DNA (como definido acima) pode ser determinada para pertencer à família de α-amilase semelhante a Termamyl. Neste caso, a a- amilase híbrida é tipicamente composta de pelo menos uma parte de a-amilase semelhante a Termamyl e parte(s) de uma ou mais de outras a-amilases selecionadas dentre α-amilases semelhantes a Termamyl ou α-amilases não semelhantes a Termamyl de origem microbiana (bacteriana ou fungica) e/ou de mamíferos.

Assim, a α-amilase híbrida originária pode compreender uma combinação de sequências de aminoácidos parciais derivando de pelo menos duas α-amilases semelhantes a Termamyl ou de pelo menos uma a-amilase bacteriana semelhante a Termamyl e pelo menos uma não semelhante a Termamyl, ou de pelo menos uma semelhante a Termamyl. e pelo menos uma α-amilase fungica. A α-amilase semelhante a Termamyl da qual a sequência de aminoácido parcial deriva pode, por exemplo, ser qualquer uma dentre as a- amilases semelhantes a Termamyl específicas referidas aqui.

Por exemplo, a α-amilase originária pode compreender uma parte C-terminal de uma α-amilase derivada de uma cepa de B. licheniformis e uma parte N-terminal de uma α-amilase derivada de uma cepa de B. amyloliquefaciens ou de uma cepa de B. stearothermophilus . Por exemplo, a α-amilase originária pode compreender pelo menos 430 resíduos de aminoácidos de parte C-terminal de α-amilase de B. licheniformis , e pode por exemplo compreender a) um segmento de aminoácidos correspondendo a 37 resíduos de aminoácidos N-terminais de α-amilase de B. amyloliquefaciens, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 4, e um segmento de aminoácido correspondendo aos 445 resíduos de aminoácidos C- terminais de α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 ou b) um segmento de aminoácidos correspondendo aos 68 resíduos de aminoácidos N-terminais de α-amilase B. stearothermophilus tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 6 e um segmento de aminoácidos correspondendo aos 415 resíduos de aminoácidos C-terminais de α-amilase B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2. A α-amilase não semelhante a Termamyl pode, por exemplo, ser uma α-amilase fungica, uma α-amilase de mamíferos ou plantas, ou uma α-amilase bacteriana (diferente de α-amilases semelhantes a Termamyl).

Exemplos específicos destas α-amilases incluem a α-amilase TAKA de Aspergittus oryzae, a α-amilase de ácido de A. niger, a α-amilase de Bacillus subtilis, a α-amilase pancreática de suínos, e a α-amilase de cevada. Todas estas α-amilases tem estruturas elucidadas que são marcadamente diferentes da estrutura de uma α-amilase semelhante a Termamyl típica, como aqui referido.

As α-amilases fungicas, mencionadas acima, isto é, derivadas de A. niger e A. oryzae, são altamente homólogas no nível de aminoácidos e geralmente consideradas como pertencendo à mesma família de α-amilases. A α-amilase fungica derivada de Aspergillus oryzae é comercialmente disponível sob o nome comercial Fungamyl ™.

Além disso, quando uma variante particular de uma a-amilase semelhante a Termamyl (variante da invenção) é referida como - em um modo convencional - por referência a modificação (por exemplo deleção ou substituição) de resíduos de aminoácidos específicos na sequência de aminoácidos de uma α-amilase semelhante a Termamyl específica, isto é, entendido que variantes de outra α-amilase semelhante a Termamyl modificada na posição(s) equivalente(s) (como determinado do melhor possível alinhamento de sequência de aminoácidos entre as respectivas sequências de aminoácidos) são englobados aqui.

Uma forma de realização preferida de uma variante da invenção é uma derivada de uma α-amilase de B. licheniformis (como a-amilases semelhantes a Termamyl originárias), por exemplo uma como referida acima, como a α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2.

Construção de variantes da invenção A construção da variante de interesse pode ser obtida por cultivo de um microorganismo compreendendo uma sequência de DNA

codificando a variante sob condições que conduzem à produção da variante. A variante pode então subsequentemente ser recuperada do caldo de cultura resultante. Isto é descrito ainda em detalhes abaixo.

Propriedades alteradas das variantes da invenção O seguinte discute a relação entre as mutações que podem estar presentes em variantes da invenção, e alterações desejáveis em propriedades (com relação às de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária) que podem resultar dai.

Dependência em Ca2+ diminuída r E altamente desejável ser capaz de diminuir a dependência em Ca2+ de uma α-amilase semelhante a Termamyl. Consequentemente, um aspecto da invenção se refere a uma variante de uma oc-amilase semelhante a Termamyl originária, cuja variante demonstra atividade α-amilase e tem uma diminuída dependência de Ca2+ como comparada com a α-amilase originária. A dependência em Ca2+ diminuída terá geralmente a consequência funcional de que a variante demonstra uma atividade amilolítica satisfatória na presença de uma concentração menor de íon cálcio no meio estranho que é necessário para a enzima originária. Isto ainda terá com frequência consequência que a variante é menos sensível do que o originário para condições exaurindo íon cálcio como os obtidos em meio contendo agentes complexantes de cálcio (como alguns reforçadores de detergentes). A dependência em Ca2+ diminuída de uma variante da invenção pode ser obtida com vantagem, por exemplo, por aumento da afinidade de ligação de Ca2+ com relação à de α-amilase semelhante a Termamyl originária, em outras palavras, quanto mais forte a ligação de Ca2+ na enzima, menor a dependência em Ca2+ Pode ser mencionado aqui que WO 96/23874 afirma que resíduos de aminoácidos localizados em 10A de um íon sódio ou cálcio podem estar envolvidos em, como se acredita, ou de importância para a capacidade de ligação de Ca2+ da enzima, e isto nesta conexão, a mutação N104D (de a- amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2, ou uma equivalente mutação (N para D) de uma posição equivalente em outra α-amilase semelhante a Termamyl) é contemplado como sendo de particular interesse com relação à diminuição de dependência em Ca2+ de uma α-amilase semelhante a Termamyl.

Outras mutações mencionadas em WO 96/23874 como sendo de possível importância em conexão com dependência de Ca2+ incluem mutações que são contempladas aqui para obter aumentada ligação de cálcio (e/ou termoestabilidade da enzima) via estabilização do domínio (como definido em WO 96/23874) da estrutura tridimensional de uma a-amilase semelhante a Termamyl via formação, por exemplo de pontes de cisteína ou pontes de sal. Assim, WO 96/23874 descreve que o domínio C de α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 pode ser estabilizada por introdução de uma ponte cisteína entre o domínio A e o domínio C (como definido em WO 96/23874) por introdução de seguintes mutações: A349C+I479C e/ou L246C+I430C. WO 96/23874 do mesmo modo descreve que uma ponte de sal pode ser obtida por introdução de uma ou mais das seguintes mutações na a- amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2: N457D, E

N457D, E + K385R

F350D, E +143OR, K

F 350D, E +141 IR, K e que o sítio de cálcio de domínio C pode ser estabilizado por substituição de resíduos de aminoácidos H408 e/ou G303 com qualquer outro resíduo de aminoácido, particularmente por introdução de uma das substituições: H408Q,E,N,D e/ou G303N, D, Q,E que são contemplados para prover melhor ligação de cálcio ou proteção de depleção de cálcio. (mutações similares em posições equivalentes de outras oc-amilases semelhantes a Termamyl sendo englobadas aqui).

Outras mutações de substituição (com relação a α-amilase de B. licheniformis da SEQ. ID. NO.: 2), que são descritas em WO 96/23874 como sendo de importância aparente, inter alia, no contexto de reduzir a dependência de cálcio incluem as seguintes: R23K, H156Y, A181T, A209V, R214, G310D e P345 (ou mutações equivalentes em posições equivalentes em outra a- amilase semelhante a Termamyl).

No contexto da presente invenção, outras mutações de substituição que parecem ser de importância, inter alia, em relação à redução de dependência de cálcio incluem as seguintes mutações em domínio B (como definido em WO 96/23874): A181E,D,Q,N,V (que parece resultar em abrigo do sítio de ligação de Ca2+ mais externo na região de junção entre o domínio A e domínio B na mesma extensão);

1201 (aminoácido mais volumoso), por exemplo I201W,F,L (que parece resultar em alterações leves na geometria da região na proximidade imediata de sítio(s) de ligação Ca2+ -Na+-Ca2+ na região de junção entre domínio A e domínio B, e na geometria e/ou tamanho de um furo/cavidade vizinho); e Y203E,Q (que se acredita resultam em ligação mais forte de íon Ca2~ mais externo em seu sítio de ligação na região de junção entre domínio A e domínio B); (ou mutações equivalentes, em posições equivalentes em outra a-amilase semelhante a Termamyl). pH ótimo alterado íperfil de pH alterado/atividade WO 96/23874 descreve o que é contemplado como sendo possível para mudar o pH ótimo de α-amilase semelhante a Termamyl, ou a atividade enzimática da mesma em um dado pH, por mudança do pKa dos resíduos de sítio ativo, e que isto pode ser obtido, por exemplo, por mudança de interação eletrostática ou interação hidrófoba entre grupos funcionais de cadeias laterais de aminoácidos de resíduo de aminoácido a ser modificado e de suas vizinhanças próximas.

No contexto da presente invenção, acredita-se com base nas considerações eletrostáticas [ver, por exemplo, Μ. K. Gilson, Current Opimon in Structural Biologv 5 (1995) pp. 216-223; e B. Honig e A. Nicholls, Science 268 (1995) pp. 1144-1149; e referências dadas aqui) e considerações de higroscopicidade em relação à estrutura tridimensional de a-amilase semelhante a Termamyl descrita em WO 96/23874 que mutações de relevância, inter alia, para alterar (aumentar ou diminuir) o ótimo de pH de uma α-amilase semelhante a Termamyl incluem as seguintes mutações ou equivalentes da mesma (referido aqui como a sequência de α-amilase de B. licheniformis (SEQ. ID. NO.: 2)]: Q9K, L, E; F11R, K, E; E12Q; D100N, L; V101H, R, K, D, E, F; V102A, T; I103H, K; N104R, K, D; H105R, K, D, E, W, F; L196R, K, D, E, F, Y; I212R, K, D, E; L230H, K, I; A232G, H, F, S, V; V233D; K234L, E; I236R, K, N, H, D, E; L241R, K, D, E, F; A260S; W263H; Q264R, D, K, E; N265K, R, D; A269R, K, D, E; L270R, K, H, D, E; V283H, D; F284H; D285N, L; V286R, K, H, D, E; Y290R, E; V312R, K, D, E; F323H; D325N; N326K, H, D, L; H327Q, N, E, D, F; Q330L, E; G332D; Q333R, K, Η, E, L; S334A, V, T, L, I, D; L335G, A, S, T, N; E336R+R375E; T337D, K; T338D, E; T339D; Q360K, R, E; D365N; G371D, R;

Aumentada estabilidade em baixo pH (ácido) No contexto da presente invenção, mutações (substituições de aminoácidos) de importância com relação a obter aumentada estabilidade em baixo pH parecem incluir mutações correspondendo às seguintes mutações na α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ.ID.NO.: 2. mutações em posições H68, H91, H247, R305, K306, H382, K389, H405, H406, H450 ou R483; as mutações: H140Y; H142Y; H156Y; H159Y; H140D+H142R; H140K+H142D; ou H142Y+H156Y assim como combinações de duas ou mais destas mutações. i - Aumentada termoestabilidade e/ou ótimo de temperatura alterado (perfil de temperatura alterada/ atividade) Um outro aspecto da invenção se refere a uma variante de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária, cuja variante é o resultado de um ou mais resíduos de aminoácidos tenso sido deletados de, substituídos em ou adicionados à α-amilase originária, de modo a obter aumentada termoestabilidade da variante.

Isto pode ser mencionado com relação a obter aumentada termoestabilidade, WO 96/23874, descreve que uma variante particularmente interessante de uma α-amilase semelhante a Termamyl compreende uma mutação correspondendo a uma das seguintes mutações (usando a numeração de sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 de α-amilase de B. licheniformis: L61W, V, F; Y62W; F67W; K106R, F, W;

G145F, W

I212F, L, W, Y, R, E S151 substituído com algum outro resíduo de aminoácido e em particular com F, W, I ou L; R214W; Y150R, K; F143W; e/ou R146W. WO 96/23874 ainda descreve nesta conexão que mutações correspondendo;a uma ou mais das seguintes mutações na α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 são de interesse com relação para obter termoestabilidade aumentada com relação à de α-amilase originária: L241I, F, Y, W; e/ou I236L, F, Y, W

L7F, I,W

V259F, I, L

F284W

F350W

F343W

L427F, L, W

V481, F, I, L, W

No contexto da presente invenção, pode-se notar de um alinhamento das sequências de aminoácidos de α-amilases de várias espécies de Bacillus que a α-amilase de B. licheniformis e α-amilase de B. amyloliquefaciens contém, ambas, uma "inserção" de três aminoácidos com relação a por exemplo α-amilase de B. stearothermophilus.

De um modelo da estmtura de α-amilase de B. licheniformis construído com base na estmtura tridimensional de α-amilase semelhante a Termamyl descrita em WO 96/23784 (vide supra), tendo em conta a homologia de α-amilase de B. licheniformis para a α-amilase semelhante a Termamyl em questão, pode-se notar que a "inserção" acima mencionada repousa em parte da estrutura denotada "laço 8"em WO 96 /23784, tomando esta laço mais volumoso em α-amilase de B. licheniformis do que em a- amilase semelhante a Termamyl e resultando em um laço que está em saliência da estmtura, assim possivelmente estabilizando a estmtura. Assim, é contemplado que a deleção de um ou mais aminoácidos na região em questão em α-amilase de B. licheniformis ou B. amyloliquefaciens irá melhorar a termoestabilidade destas a-amilases.

Especialmente interessante nesta conexão é a deleção de três aminoácidos dentro da sequência parcial de T369 nara 1377 (com referência à sequência de aminoácidos de α-amilase de B. licheniformis mostrada na SEQ. ID. NO.: 2), isto é a sequência parcial: T369-K370-G371-D372-S373-Q374- R375-E376-I377 ou a sequência parcial correspondente de α-amilase B. amyloliquefaciens). Além destas deleções, a substituição de um ou mais dos aminoácidos não deletados dentro da última sequência parcial também pode ser vantajosa).

As deleções preferíveis de três aminoácidos na sequência parcial de T369 a 1377 (na α-amilase de B. licheniformis ) são deleção de K370+G371+D372 (isto é, K370*+G371*+D372*) ou deleção de D372+S373+Q374 (isto é, D372*+S373*+Q374*) (ou deleções equivalentes na sequência parcial correspondente na α-amilase de B. amyloliquefaciens).

Outro tipo de mutação que iria parecer como de valor para melhorar a termoestabilidade destas α-amilases é a substituição (troca) de sequência de aminoácido parcial completa de T369 para 1377 (com referência à sequência de α-amilase de B. licheniformis) com uma das seguintes sequências parciais de seis aminoácidos (numeração da sequência aumentando da esquerda para a direita): I-P-T-H-S-V; I-P-T-H-G-V; e I-P-Q-Y-N-I (ou uma das mesmas substituições da sequência parcial correspondente em a-amilase de B. amyloliquefaciens).

Outras mutações que podem aparentemente ser da mesma importância com relação a obter uma aumentada termoestabilidade incluem substituições de aminoácidos nas seguintes posições (com referência à SEQ. ID. NO.: 2): RI 69 (por exemplo, RI 691, L, F, T); RI 73 (especialmente RI 731, L, F, T); I201F; I212F; A209L, T; ou V208I assim como combinações de quaisquer duas ou mais destas mutações.

Aumentada termoestabilidade em pH ácido e/ou em baixa concentração de Ca2+ No contexto da invenção, as mutações que parecem ser de particular relevância com relação a obter variantes de acordo com a invenção tendo aumentada termoestabilidade em pH ácido (pH < 7) e/ou em baixa concentração em Ca2+ incluem mutações nas seguintes posições (com relação a α-amilase de B. licheniformis, SEQ. ID. NO.: 2). H156, NI 72, A181, N188, N190, H205, D207, A209, A210, E211, Q264, N265 Pode ser mencionado aqui que resíduos de aminoácidos N e E, respectivamente , em posições correspondendo a NI 09 e E211, respectivamente, na SEQ. ID. NO.: 2 constituem resíduos de aminoácidos que são conservados em numerosas α-amilases semelhantes a Termamyl. Assim, por exemplo, as posições correspondentes destes resíduos nas sequências de aminoácidos de várias α-amilases semelhantes a Termamyl que já foram mencionadas (vide supra) são como a seguir: α-amilase semelhante a Termamyl posição N posição E B. licheniformis (SEQ ID NO. 2) NI 90 E211 B. amyloliquefaciens (SEQ ID No. 4) NI 90 E211 B. stearothermophilus (SEQ ID No. 6) NI 93 E210 Bactilus NCIB 12512 (WO 95/26397) N195 E212 Bacillus NCIB 12513 (WO 95/26397) N195 E212 "Bacillus sp. #107" (Tsukamoto et al.) N195 E212 As mutações destes resíduos de aminoácidos conservados parecem ser muito importantes com relação a melhorada termoestabilidade em pH ácido e/ou em baixa concentração de cálcio, e as seguintes mutações são de particular interesse nesta conexão (com referência à numeração de sequência de aminoácidos de B. licheniformis mostrada na SEQ. ID. NO.: 2).

H156Y, D

N172R,H, K

A181T

N188P

N190L, F

H205C

D207Y

A209L, Τ, V

A210S

E211Q 0264Α, Ε, L, Κ, S, Τ Ν265Α, S,T,Y assim como qualquer combinação de duas ou mais destas mutações.

Um exemplo de uma mutação dupla particularmente interessante nesta conexão é Q264S+N265Y.

Padrão de divagem alterado No processo de liquefação de amido, é desejável usar uma a- amilase que é capáz de degradar as moléculas de amido em oligossacarídeos longos, ramificados, em vez de α-amilase que dá lugar à formação de oligossacarídeos ramificados mais curtos (como α-amilases semelhantes a Termamyl convencionais). Em resumo, oligossacarídeos ramificados, curtos, (precursores de panose) não são hidrolisados satisfatoriamente por pululanases, que são usados após o tratamento com α-amilase no processo de liquefação, mas antes da adição de uma amiloglucosidases sacarificante (glucoamilase).

Assim, na presença de precursores de panose, a mistura de produto presente após o tratamento com glucoamilase contém uma proporção significante de dextrina limite, como assim chamada, ramificada, curta, viz. a panose de trissacarídeo. A presença de panose abaixa o rendimento de sacarificação de modo significante e assim é indesejável.

Assim, um objetivo da presente invenção é chegar a uma a- amilase mutante tendo características de degradação de amido apropriadamente modificadas, mas retendo a termoestabilidade da ct-amilase semelhante a Termamyl originária.

Pode ser mencionado aqui que de acordo com WO 96/23874, variantes compreendendo pelo menos uma das seguintes mutações são esperados para evitar a divagem próximo do ponto de ramificação: V54L, I, F, Y, W, R, K, Η, E, Q

D53L, I, F, Y, W

Y56W

Q333W resíduos de aminoácido possível G57all resíduos de aminoácido A52 maior do que A, por exemplo, A52W, Y, L, F, I.

Atividade específica aumentada Em um outro aspecto da presente invenção, mutações importantes com relação a obter variantes demonstrando aumentada atividade específica parecem incluir mutações correspondendo às seguintes mutações na α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2. mutações (substituições de aminoácidos) em posições SI87 (especialmente S187D) ou Q264 (por exemplo Q264R,K,S); mutações (substituições) em posição Y290 (especialmente Y290E,K), a mutação V541, assim como combinações de qualquer uma de duas ou mais das últimas mutações, ou combinações de uma, duas ou mais das últimas mutações com a seguinte mutação múltipla: Al *+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I

Mutações gerais em variantes da invenção Pode ser preferido que uma variante da invenção compreende uma ou mais modificações além das descritas acima. Assim, pode ser vantajoso que um ou mais resíduos prolina presentes na parte de variante de a- amilase que é modificado seja/ sejam substituídos com um resíduo não prolina que pode ser qualquer um dos resíduos não prolina, possíveis, de ocorrência natural, e que preferivelmente é uma alanina, glicina, serina, treonina, valina ou leucina.

De modo análogo, pode ser preferido que um ou mais dos resíduos cisteína presente dentre os resíduos de aminoácidos com o qual a a- amilase originária é modificada é/ são substituídos com um resíduo não cisteína, como serina, alanina, treonina, glicina, valina ou leucina.

Além disso, uma variante da invenção pode - ou como a única modificação ou em combinação com qualquer uma das modificações acima descritas - ser modificada de modo que um ou mais dentre Asp e/ou Glu presente no fragmento de aminoácido correspondente ao fragmento de aminoácido 185-209 da SEQ. ID. NO.: 2 é substituído por um Asn e/ou Gin, respectivamente. Também de interesse é a substituição, na a-amilase semelhante a Termamyl , de um ou mais dos resíduos Lys presentes em um fragmento de aminoácido correspondente ao fragmento de aminoácido 185- 209 da SEQ. ID. NO.: 2 por um Arg.

Será entendido que a presente invenção engloba variantes incorporando duas ou mais das acima modificações descritas.

Além disso, pode ser vantajoso introduzir mutações em pontos em qualquer um das variantes descritos aqui.

Processos para preparar variantes de a-amilase Vários processos para introduzir mutações em genes são conhecidos na arte. Após uma breve discussão da clonagem de sequências de DNA codificando α-amilase , processos para gerar mutações em sítios específicos dentro da sequência codificando α-amilase serão discutidos.

Clonagem de uma sequência de DNA codificando uma a-amilase A sequência de DNA codificando uma α-amilase originária pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo produzindo a a- amilase em questão, usando vários processo bem conhecidos dos versados na arte. Em primeiro lugar, um DNA genômico e/ou uma coleção de cDNA pode ser construída usando DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a α-amilase a ser estudada. Então, se a sequência de aminoácidos de α-amilase for conhecida, sondas de oligonucleotídeos rotuladas, homólogas, conhecidas, podem ser sintetizadas e usadas para identificar clones codificando α-amilases de uma coleção genômica preparada do organismo em questão.

Altemativamente, uma sonda de oligonucleotídeo rotulada contendo sequências homólogas a um gene de α-amilase conhecido pode ser usada como uma sonda para identificar clones codificando α-amilase, usando condições de hibridização e lavagem em menor estringência.

Ainda outro processo para identificar clones codificando a- amilase deve envolver a inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, como um plasmídeo, transformando bactérias negativas para α-amilase com a coleção de DNA genômica resultante, e então colocando em placas as bactérias transformadas sobre agar contendo um substrato para a- amilase, assim permitindo clones expressando a α-amilase a ser identificada.

Altemativamente, a sequência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por processos padrões estabelecidos, por exemplo o processo fosforoamidito descrito por S.L. Beaucage e M.H.

Camthers (1981), ou o processo descrito por Matthes et al, (1984). No processo fosforoamidito, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificado, recombinado, ligado e clonado em vetores apropriados.

Finalmente, a sequência de DNA pode ser de origem genômica ou sintética misturada, origem de cDNA e sintética mista, ou origem cDNA e genômica mista, preparados por fragmentos de ligação de origem cDNA ou genômica, sintética (como apropriado, os fragmentos correspondendo a várias partes de sequência de DNA completa), de acordo com as técnicas padrões. A sequência de DNA também pode ser preparada por reação de cadeia polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo como descrito em US 4 683 202 ou R.K. Saiki et al, (1988).

Mutagênese dirigida ao sítio Uma vez que a sequência de DNA codificando α-amilase foi isolada, e sítios desejáveis para mutação identificados, as mutações podem ser introduzidas usando oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contém sequências de nucleotídeos flanqueando os sítios de mutação desejados, nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese de oligonucleotídeos. Em um processo específico, um gap de filamento único de DNA, unindo em ponte a sequência codificando α-amilase, é criado em um vetor transportando o gene de α-amilase. Então, o nucleotídeo sintético, contendo a mutação desejada, é recombinado em uma porção homóloga do DNA de filamento único. O gap restante é então cheio em com a polimerase de DNA I (fragmento Klenow), e a construção é ligada usando ligase T4. Um exemplo específico deste processo é descrito em Morinaga et al (1984). US 4 760 025 descreve a introdução de oligonucleotídeos codificando mutações múltiplas por realização de alterações menores do cassete. No entanto, uma variedade ainda maior de mutações pode ser introduzida uma de cada vez pelo processo Morinaga, devido a uma multitude de oligonucleotídeos, de vários comprimentos, pode ser introduzida.

Outro processo para introduzir mutações em sequências de DNA codificando α-amilase é descrito em Nelson e Long (1989). Ele envolve a geração em 3 etapas de um fragmento de PCR contendo a desejada mutação introduzida por uso de filamento de DNA quimicamente sintetizado como um dos iniciadores nas reações PCR. A partir do fragmento gerado por PCR, um fragmento de DNA contendo a mutação pode ser isolado por divagem com endonucleases de restrição e reinserido em um plasmídeo de expressão.

Mutagênese aleatória A mutagênese aleatória é apropriadamente realizada com como mutagênese aleatória localizada ou específica para região, em pelo menos três partes do gene traduzindo para a sequência de aminoácido em questão, ou dentro do gene completo. WO 96/23874 descreve que em conexão com a obtenção de melhorada ligação de um substrato (isto é melhorada ligação de uma espécie de carboidrato, como amilose ou amilopectina), por uma variante de a-amilase semelhante a Termamyl, a especificidade de substrato modificada (por exemplo maior) e/ou especificidade modificada (por exemplo maior) com relação a divagem (hidrólise) de substrato, as seguintes posições de códon para a sequência de aminoácido mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 (ou posições de códon equivalentes para outra α-amilase semelhante a Termamyl originária no contexto da invenção) parecem ser particularmente apropriados para marcação: 13-18 50-56 70-76 102-109 163-172 189-199 229-235 360-364 327-335 Melhora do desempenho de liquefação em baixo pH e baixa concentração em íon cálcio Para uma α-amilase ser usada em um processo de liquefação de amido, é de particular interesse que seja termoestável e capaz de funcionar em baixo pH e baixas concentrações de cálcio. A fim de melhorar estas propriedades de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária, particularmente α-amilase de B. licheniformis ou uma variante ou híbrido da mesma, mutagênese aleatória (preferivelmente pelo uso de iniciadores de oligonucleotídeos marcados por pontos ou dopados) seguido por seleção apropriada de enzimas mudadas resultantes pode ser realizada. A direção de seleções de regiões para randomizar e selecionar os aspectos de dopar são baseados primariamente na estabilização de íons cálcio já presentes, e na melhora de interações eletrostáticas resíduo/ resíduo ou domínio/ domínio em baixo pH. Além disso, as regiões que foram mostradas para incluir posições importantes para obter bom desempenho de liquefação de amido podem ser selecionadas. A fim de preparar uma variante de α-amilase semelhante a Termamyl originária tendo as propriedades acima, pelo menos uma das seguintes regiões pode ser com vantagem submetida a mutagênese aleatória (a numeração dos resíduos de aminoácidos sendo como na SEQ. ID. NO.: 2): Região Resíduo Descrição I: 153-163 região de cálcio entre domínio A. & B, também contendo H156 II: 178-192 região de cálcio entre domínio A & B III: 193-214 região de cálcio entre domínio A & B, também contendo A209 IV: 232-23 7 região de cálcio entre domínio A & B

V: 297-308 região de cálcio entre domínio A & C

VI: 403-409 região de cálcio entre domínio A & C

VII: 428-435 região de cálcio entre domínio A & C VIII: 131-136 região contendo H133 IX: 164-175 região em contato com a região H133 X: 262-278 região contendo Q264 Preferivelmente, duas, três ou quatro das regiões acima são submetidas a mutagênese aleatória na construção de um nova variante de a- amilase da invenção. Por exemplo, as seguintes combinações de regiões são submetidas de modo apropriado para mutagênese aleatória: VIII + IX

VIII + IX + II

II + III + IV

IV + I

Além disso, prefere-se que a mutagênese seja realizada por uso de oligonucleotídeos dopados ou salpicados. O fato de dopar é preferivelmente feito de modo a introduzir aminoácidos contribuindo para melhorada estabilidade em baixo pH e reduzida dependência de cálcio, em baixo pH da variante de α-amilase resultante. Além disso, quando selecionando o esquema de dopagem, a possibilidade de introduzir resíduos Asn e Gin deve geralmente ser evitada, porque resíduos Asn e Gin geralmente são associados com instabilidade em baixo pH. Preferivelmente, quando um resíduo Pro pode ser inserido com benefícios em potencial (por exemplo como avaliado de considerações estruturais de proteína), o esquema de dopagem é preparado para incluir uma preferência para introdução de um resíduo Pro. A α-amilase semelhante a Termamyl originária a ser submetida a mutagênese aleatória de acordo com o princípio acima pode quer4 qualquer α-amilase de tipo selvagem, ou uma variante da mesma, contendo uma ou mais mutações. O originário pode ser um híbrido entre pelo menos duas a-amilases como explicado em maiores detalhes aqui. Preferivelmente, a a-amilase originária é um mutante de α-amilase B. licheniformis tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ. ID. NO.: 2, contendo pelo menos uma mutação, e preferivelmente mutações múltiplas. A α-amilase originária pode altemativamente ser uma α-amilase híbrida que contém pelo menos uma parte da α-amilase de B. licheniformis (SEQ. ID. NO.: 2). Exemplos específicos de α-amilases originárias apropriadas para mutagênese de acordo com os princípios acima descritos incluem: variantes de α-amilase B. licheniformis (SEQ. ID. NO.: 2), que contém pelo menos um, dois, três, quatro ou todas as cinco dentre as mutações H156Y, A181T, N190F, A209V e Q264S, a- amilases híbridas que contém uma parte de α-amilase de B. licheniformis (SEQ. ID. NO.: 2), preferivelmente uma parte C-terminal da mesma, como aminoácidos 35-483 da mesma, e uma parte de outra α-amilase semelhante a Termamyl coo α-amilase de B. amyloliquefaciem (SEQ. ID. NO.: 4), preferivelmente uma parte N-terminal da mesma como os primeiros 38 resíduos de aminoácidos dos mesmos.

Com relação ao acima, um outro aspecto da presente invenção se refere a um processo para gerar uma variante de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária, cuja variante demonstra aumentada estabilidade em baixo pH e baixa concentração de cálcio com relação ao originário, o processo compreendendo: (a) submeter uma sequência de DNA codificando a a-amilase semelhante a Termamyl originária a mutagênese aleatória, (b) expressar a sequência de DNA mudada obtida na etapa (a) em uma célula hospedeira, e (c) triar para células hospedeiras expressando uma a-amilase mudada que tem aumentada estabilidade em baixo pH e baixa concentração em cálcio com relação à α-amilase originária. A etapa (a) do último processo da invenção é preferivelmente realizada usando iniciadores dopados, como descrito nos exemplos de trabalho aqui (vide infra).

Processo de realização de mutagênese aleatória A mutagênese aleatória da sequência de DNA codificando uma α-amilase originária a ser realizada de acordo com a etapa a) do processo acima mencionado da invenção pode ser realizada de modo conveniente pelo uso de qualquer processo conhecido na arte.

Por exemplo, a mutagênese aleatória pode ser realizada pelo uso de um agente mutagenizante físico ou químico apropriado, pelo uso de um oligonucleotídeo apropriado, ou submetendo a sequência de DNA a mutagênese gerada por PCR. Além disso, a mutagênese aleatória pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes mutagenizantes. 0 agente mutagenizante pode, por exemplo, ser um que induz transições, transversões, inversões, remeximento, deleções, e/ou inserções.

Exemplos de agente mutagenizante físico ou químico apropriado para o presente fim incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfato de etil metano (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeos.

Quando se usam estes agentes, a mutagênese é tipicamente realizada por incubação da sequência de DNA codificando a enzima originária para ser mutageneizada na presença de um agente mutagenizante de escolha sob condições apropriadas para a mutagênese ocorrer, e selecionando o DNA mudado tendo as propriedades desejadas.

Quando a mutagênese é realizada pelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou salpicado com os três nucleotídeos não originários durante a síntese de oligonucleotídeo nas posições que devem ser mudadas. A dopagem ou salpico podem ser feitos de modo que os códons para aminoácidos não desejados sejam evitados. O oligonucleotídeo dopado ou salpicado pode ser incorporado no DNA codificando a enzima amilolítica por qualquer técnica publicada, usando por exemplo PCR, LCR ou qualquer polimerase de DNA e ligase.

Preferivelmente, a dopagem é realizada usando "dopagem aleatória constante", em que a porcentagem de tipo selvagem e mutação em cada posição é pré-definida. Além disso, a dopagem pode ser dirigida para termoestabilidade uma preferência para a introdução de alguns nucleotídeos, e assim uma preferência para introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos. A dopagem pode, por exemplo, ser feita de modo a permitir a introdução de 90% tipo selvagem e 10% mutações em cada posição. Uma consideração adicional em escolha de esquema de dopagem é por limitações genéticas assim como estruturais de proteína. O esquema de dopagem pode ser feito por uso de programa DOPE (ver os exemplos de trabalho aqui) que, inter alia, assegura que a introdução de códons de parada é evitada.

Quando se usa mutagênese gerada por PCR, ou um gene quimicamente tratado ou não tratado codificando uma enzima a-amilase originária é submetida a PCR sob condições que aumentam a má-incorporação de nucleotídeos (Deshler 1992, Leung et al, Technique, vol. 1,1989, p. 11-15).

Uma cepa de mudança de E. coli (Fowler et al, Molec. Gen.

Genet., 133, 1974, p. 179-191), S. cereviseae ou qualquer outro organismo microbiano pode ser usado para a mutagênese aleatória de DNA codificando a enzima amilolítica por exemplo transformando um plasmídeo contendo a enzima originária na cepa de mudança, cultivando a cepa de mudança com o plasmídeo e isolando o plasmídeo mudado da cepa de mudança. O plasmídeo mudado pode ser subsequentemente transformado em organismo de expressão. A sequência de DNA a ser mutageneizada pode estar convenientemente presente em uma biblioteca de cDNA ou genômica preparada a partir de um organismo expressando a enzima amilolítica originária. Altemativamente, a sequência de DNA pode estar presente em um vetor apropriado como um plasmídeos ou um bacteriófago, como que pode ser incubado com ou de outra forma exposto ao agente mutagenizante. O DNA a ser mutageneizado pode também estar presente em uma célula hospedeira ou ao ser integrado no genoma da referida célula ou ao estar presente em um vetor abrigado na célula. Finalmente, o DNA a ser mutageneizado pode estar em forma isolada. Será entendido que a sequência de DNA a ser submetida a mutagênese aleatória é preferivelmente uma sequência de cDNA ou DNA genômico.

Em alguns casos, pode ser conveniente amplificar a sequência de DNA mudada antes da etapa de expressão (b) ou a etapa de triagem (c) ser realizada. Esta amplificação pode ser realizada de acordo com os processos conhecidos na arte, o processo atualmente preferido sendo amplificação gerada por PCR usando iniciadores de oligonucleotídeos preparados com base em sequência de DNA ou aminoácido da enzima originária.

Subsequente à incubação com ou exposição a agente mutageneizante, o DNA mudado é expresso por cultivo de uma célula hospedeira apropriada transportando a sequência de DNA sob condições que permitem a ocorrência da expressão. A célula hospedeira usada para este fim pode ser uma que foi transformada com a sequência de DNA mudada, opcionalmente presente em um vetor, ou uma que transportou a sequência de DNA codificando a enzima originária durante a o tratamento com mutagênese.

Os exemplos de células hospedeiras apropriadas são os seguintes: bactérias gram-positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus·, e bactérias gram-negativas como E. coli. A sequência de DNA mudada pode ainda compreender uma sequência de DNA codificando funções permitindo a expressão de sequência de DNA mudada.

Mutagênese aleatória localizada . A mutagênese aleatória pode com vantagem estar localizada como uma parte da α-amilase originária em questão. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso com algumas regiões da enzima foram identificadas para serem de importância particular para uma dada propriedade da enzima, e quando modificadas são esperadas para resultar uma variante tendo melhoradas propriedades. Estas regiões podem normalmente ser identificadas quando estrutura terciária da enzima originária foi elucidada e relacionada com a função da enzima. A mutagênese aleatória localizada é convenientemente realizada pelo uso de técnicas de mutagênese gerada por PCR como descrito acima, ou qualquer outra técnica apropriada conhecida na arte.

Altemativamente, a sequência de DNA codificando a parte da sequência de DNA a ser modificada pode ser isolada, por exemplo ao ser inserida em um vetor apropriado, e referida parte pode subsequentemente ser submetida a mutagênese pelo uso de qualquer um dos processos de mutagênese discutidos acima.

Com relação à etapa de triagem no processo acima mencionado da invenção, esta pode ser convenientemente realizada pelo uso de um teste como descrito em conjunto com o exemplo 2 aqui.

Com relação à triagem em geral, um teste de filtro com base no seguinte é geralmente aplicável: Um microorganismo capaz de expressar a enzima amilolítica mudada de interesse é incubado em um meio apropriado e sob condições apropriadas para a enzima a ser secretada, o meio sendo provido com um filtro duplo, compreendendo um primeiro filtro de ligação a proteína e no topo deste um segundo filtro demonstrando uma baixa capacidade de ligação a proteína. O microorganismo está localizado no segundo filtro. Subsequente à incubação, o primeiro filtro compreendendo enzimas secretadas do microorganismo é separado do segundo filtro compreendendo os microorganismos. O primeiro filtro é submetido a triagem para a desejada atividade enzimática e as colônias microbianas correspondentes presentes no segundo filtro são identificadas. O filtro usado para ligação da atividade enzimática pode ser qualquer filtro de ligação de proteína, por exemplo náilon ou nitrocelulose. O filtro de topo transportando as colônias do organismo de expressão pode ser qualquer filtro que tem pouca ou nenhuma afinidade para proteínas de ligação, por exemplo acetato de celulose ou Durapore ™. O filtro pode ser pré-tratado com qualquer uma das condições a serem usadas para triagem ou pode ser tratado durante a detecção da atividade enzimática. A atividade enzimática pode ser detectada por um corante, fluorescência, precipitação, indicador de pH, absorvância de IV ou qualquer outra técnica conhecida para detecção de atividade enzimática. O composto de detecção pode ser imobilizado por qualquer agente imobilizante, por exemplo agarose, agar, gelatina, poliacrilamida, amido, papel de filtro, pano; ou qualquer combinação de agentes imobilizantes. A atividade α-amilase é detectada por amilopectina rotulada com vermelho Cibacron, que é imobilizada em agarose. Para triagem para variantes com aumentada estabilidade de pH elevado e térmica, o filtro com variantes de α-amilase ligados é incubado em um tampão em pH 10,5 e 60°C ou 65 °C durante um tempo especificado, enxaguado brevemente em água deionizada e colocado na matriz de amilopectina-agarose para detecção de atividade. A atividade residual é vista com lise de vermelho Cibacron por degradação de amilopectina. As condições são escolhidas como sendo tais que a atividade devido a α-amilase tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 pode apenas ser detectada. As variantes estabilizados mostrados, sob as mesmas condições, aumentada intensidade de cor devido a aumentada liberação de vermelho Cibacron.

Para triagem de variantes com uma atividade ótima em uma menor temperatura e/ou'em uma faixa de temperatura mais ampla, o filtro com variantes ligados é colocado diretamente na placa de substrato de vermelho Cibacron de amilopectina e incubado na temperatura desejada (por exemplo 4°C, 10°C ou 30°C ) durante um tempo especificado. Após este tempo, a atividade devido a α-amilase tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ. ID. NO.: 2 raramente pode ser detectada, enquanto variantes com atividade ótima em menor temperatura irão mostrar aumentada lise de amilopectina. Antes da incubação sobre a matriz de amilopectina, a incubação em todos os tipos de meio desejado - por exemplo soluções contendo Ca2+ , detergente, EDTA e outros aditivos relevantes - pode ser realizada a fim de triar para mudada dependência ou para reação das variantes em questão com estes aditivos.

Teste de variantes da invenção O teste de variantes da invenção pode ser apropriadamente realizado por determinação da atividade de degradação de amido da variante , por exemplo ao cultivar células hospedeiras transformadas com uma sequência de DNA codificando uma variante em uma placa de agarose contendo amido e identificando as células hospedeiras degradando amido. Além do teste como para propriedades alteradas (incluindo atividade específica, especificidade de substrato, padrão de divagem, termo-ativação, ótimo de pH, dependência de pH, ótimo de temperatura e qualquer outro parâmetro) podem ser realizados de acordo com os processos conhecidos na arte.

Expressão de variantes de a-amilase De acordo com a invenção, uma sequência de DNA codificando variante produzido pelos processos descritos acima, ou por qualquer processo alternativo conhecido na arte, pode ser expresso, em forma de enzima, usando um vetor de expressão que tipicamente inclui sequências de controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de iniciação de tradução, e opcionalmente um gene repressor ou vários genes ativadores. O vetor de expressão recombinante transportando a sequência de DNA codificando variante de α-amilase da invenção pode ser qualquer vetor que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinantes, e a escolha do vetor irá com frequência depender da célula hospedeira em que ele deve ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo um plasmídeo, um bacteriófago, ou um elemento extracromossômico, minicromossoma ou um cromossoma artificial.

Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma de célula hospedeira e replicado junto com o cromossomo(s) em que foi integrado.

No vetor, a sequência de DNA deve ser ligada de modo operativo a uma sequência de promotor apropriada. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostra atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteínas ou homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira. Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição de sequência de DNA codificando uma variante de α-amilase da invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do operon lac de E. coli, os promotores de dagA do gene agarose Streptomyces coelicolor, os promotores do gene a-amilase Bacillus licheniformis (arnyL), os promotores do gene amilase maltogênico Bacillus stearothermophilus (amyM), os promotores de α-amilase Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes Bacillus subtilis xylA e xllB etc. Para transcrição em uma hospedeira fungica, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene codificando a amilase A. oryzae TAKA, proteinase aspártica Rhizomucor miehei, α-amilase neutra A. niger, a-amilase estável de ácido A. niger, glucoamilase A. niger, lipase Rhizomucor miehei, protease alcalina A. oryzae, isomerase de fosfato triose A. oryzae ou acetamidase A. nidulans. O vetor de expressão da invenção também pode compreender um terminador de transcrição apropriado e, em eucariotos, sequências de poliadenilação ligadas de modo operativo à sequência de DNA codificando a variante de α-amilase da invenção. As sequências de terminação e poliadenilação podem ser derivadas, de modo apropriado, de mesmas fontes que o promotor.

O vetor pode ainda compreender uma sequência de DNA permitindo o vetor replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos destas sequências são as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBllO, pE194, pAMBl e pIJ702. O vetor também pode compreender um marcador selecionável, por exemplo um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira, como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um que confere resistência a antibiótico como ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou resistência a tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus como amdS, argB, niaB, e sC, um marcador dando lugar a resistência a higromicina, ou a seleção pode ser obtida por co-transformação, por exemplo como descrito em WO 91/17243.

Apesar da expressão intracelular poder ser vantajosa em alguns aspectos, por exemplo quando usando algumas bactérias como células hospedeiras, é geralmente preferido que a expressão seja extracelular. Em geral, as α-amilases de Bacillus mencionadas aqui compreendem uma pré- região permitindo a secreção da protease expressa no meio de cultura. Se desejável, esta pré-região pode ser substituída por uma pré-região diferente ou sequência de sinal, convenientemente obtida por substituição das sequências de DNA codificando as pré-regiões respectivas.

Os procedimentos usados para ligar a construção de DNA da invenção codificando uma variante de α-amilase, o promotor, terminador e outros elementos, respectivamente, e para inserir os mesmos em vetores apropriados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos dos versados na arte (c f. por exemplo Sambrook et al, (1989)). A célula da invenção, ou compreendendo uma construção de DNA ou um vetor de expressão da invenção como definido acima, é com vantagem usado com uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de α-amilase da invenção. A célula pode ser transformada com a construção de DNA da invenção codificando a variante, convenientemente por integração da construção de DNA (em um ou mais cópias), no cromossomo hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada como sendo uma vantagem que a sequência de DNA é mais provável como sendo estavelmente mantida na célula. A integração de construções de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo com os processos convencionais, por exemplo por recombinação homóloga ou heteróloga. Altemativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão, como descrito acima em conjunto com os tipos diferentes de células hospedeiras. A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior como um mamífero ou inseto, mas é preferivelmente uma célula microbiana, por exemplo uma célula bacteriana ou fungica (incluindo levedura).

Exemplos de bactérias apropriadas são bactérias gram-positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, ou Streptomyces lividam ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas como E. coli. A transformação de bactéria pode, por exemplo ser efetuada por transformação de protoplastos ou por uso de células competentes em um modo conhecido por si. O organismo de levedura pode ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae. O fungo filamentoso pode com vantagem pertencer a uma espécie de aspergillus, por exemplo Aspergillus oryzae ou aspergillus niger. As células fungicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos e transformação de protoplastos seguida por regeneração da parece da célula em um modo conhecido por si. Um procedimento apropriado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito em EP 238 023.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para produzir uma variante de α-amilase da invenção, cujo processo compreende cultivar uma célula hospedeira como descrito acima sob condições que levam à produção da variante e recuperação da variante das células e/ou meio de cultura. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional apropriado para cultivar a célula hospedeira em questão e obter expressão da variante de α-amilase da invenção. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo como descrito nos catálogos do American Type Culture Collection). A variante de α-amilase secretada das células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separação das células do meio por centrifugação ou filtragem, e precipitação de componentes proteináceos do meio por meio de um sal, como sulfato de amônio seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos como cromatografia de troca de íons, cromatografia por afinidade, ou outros.

Aplicações industriais As variantes de α-amilase da invenção possuem valiosas propriedades permitindo várias aplicações industriais. Em particular, as variantes de enzima da invenção são aplicáveis como um componente na lavagem, lavagem de louça e composições detergentes para limpeza de superfícies duras. Numerosas variantes são particularmente utilizáveis na produção de adoçantes e etanol de amido e/ou para remoção de cola de têxteis.

As condições para processos de conversão de amido convencionais, incluindo liquefação de amido e/ou processos de sacarificação, são descritos em por exemplo US 3 912 590 e nas publicações de patente EP nos. 252.730 e 63.909.

Produção de adoçantes a partir de amido: Um processo "tradicional" para conversão de amido em xaropes de ffutose normalmente consiste de três processos enzimáticos consecutivos, ou seja, um processo de liquefação seguido por um processo de sacarificação e um processo de isomerização. Durante o processo de liquefação, amido é degradado em dextrinas por uma α-amilase (por exemplo Termamyl ™) a valores de pH entre 5,5 e 6,2 e em temperaturas de 95-160°C por um período de aproximadamente 2 h. A fim de assegurar uma estabilidade de enzima ótima sob estas condições, 1 mM de cálcio é adicionado (40 ppm de íons cálcio livres).

Após o processo de liquefação, as dextrinas são convertidas em dextrose por adição de uma glucoamilase (por exemplo AMG™) e uma enzima de des-ramificação, como uma isoamilase ou pululanase (por exemplo Promozyme ™). Antes desta etapa, o pH é reduzido a um valor abaixo de 4,5, mantendo a temperatura elevada (acima de 95 °C) e liquefazendo a atividade de α-amilase é desnaturada. A temperatura é abaixada a 60°C, e glucoamilase e enzima de des-ramificação são adicionados. O processo de sacarificação prossegue durante 24-72 h.

Após o processo de sacarificação , o pH é aumentado a um valor na faixa de 6-8, preferivelmente pH 7,5, e o cálcio é removido por troca de íons. O xarope de dextrose é então convertido em xarope de elevado teor em fratose, por exemplo usando uma glucoseisomerase imobilizada (como Sweetzyme ™).

Pelo menos 3 melhoras enzimáticas deste processo podem ser visadas. Todas as três melhoras podem ser vistas como benefícios individuais, mas qualquer combinação (por exemplo 1+2, 1+3, 2+3, ou 1+2+3) pode empregada.

Melhora 1: Redução da dependência de cálcio da liquefação de a- amilase A adição de cálcio livre é requerida para assegurar uma estabilidade adequadamente elevada de α-amilase, mas cálcio livre fortemente inibe a atividade de glucoseisomerase e precisa ser removida, por meio de uma operação unitária cara, em uma extensão que reduz o nível de cálcio livre a abaixo de 3-5 ppm. As economias de custo podem ser obtidas se esta operação puder ser evitada e o processo de liquefação pode ser realizado sem a adição de íons cálcio livres.

Para obter isto, uma α-amilase semelhante a Termamyl menos dependente de cálcio que é estável e altamente ativa em baixas concentrações de cálcio livre (< 40 ppm) é requerida. Esta α-amilase semelhante a Termamyl deve ter um pH ótimo a um pH na faixa de 4,5-6,5, preferivelmente na faixa de 4,5-5,5.

Melhora 2 : Redução de formação de produtos de Maillard indesejados A extensão de formação de produtos de Maillard indesejados durante o processo de liquefação é dependente do pH. O baixo pH favorece a formação reduzida de produtos .deMaillard. Deve ser assim desejável ser capaz de abaixar o pH do processo de em tomo de pH 6,0 a um valor em tomo de pH 4,5; infelizmente, todos as comumente conhecidas α-amilases semelhantes a Termamyl termoestáveis não são muito estáveis em baixo pH (isto é, pH < 6,0) e sua atividade específica é geralmente baixa. A obtenção de objetivo acima mencionado requer uma a- amilase semelhante a Termamyl que é estável em baixo pH na faixa de 4,5-5,5 e em concentrações de cálcio livre na faixa de 0-40 ppm, e que mantém uma alta atividade específica.

Melhora 3 Foi registrado previamente (patente US 5 234 823) que quando sacarificando glucoamilase de A. niger e pululanase de B. acidopullulyticus , a presença de atividade de α-amilase residual do processo de liquefação pode levar a menores rendimentos de dextrose, se a α-amilase não for inativada antes do estágio de sacarificação. Esta inativação pode tipicamente ser realizada por ajuste do pH a abaixo de 4,3 a 95°C, antes de abaixar a temperatura a 60°C para sacarificação. A razão deste efeito negativo em rendimento de dextrose não é completamente entendida, mas é considerado que a liquefaçâo de a-amilase (por exemplo Termamyl™ 120 L de B. licheniformis ) gera "dextrinas de limite" (que são pobres substratos para pululanase de B. acidopullulyticus) por hidrólise de ligações 1,4-a-glucosídicas próxima e em ambos os lados dos pontos de ramificação em amilopectina. A hidrólise destas dextrinas de limite por glucoamilase leva a um acúmulo da panose de trissacarídeos, que é somente lentamente hidrolisada por glucoamilase. O desenvolvimento de uma α-amilase termoestável que não sofre desta desvantagem pode ser uma melhora de processo significante, como nenhuma etapa de inativação separada seria requerida.

Se α-amilase estável em baixo pH, semelhante a Termamyl, for desenvolvida, uma alteração da especificidade pode ser uma vantagem necessária em combinação com aumentada estabilidade em baixo pH. A metodologia e princípios da presente invenção toma possível projetar e produzir variantes de acordo com a invenção tendo propriedades requeridas como descrito acima. Nesta conexão, mutações particularmente interessantes são mutações em uma α-amilase semelhante a Termamyl (por exemplo o próprio Termamyl™ (α-amilase de B. licheniformis ), SEQ. ID. NO.: 2), ou uma α-amilase semelhante a Termamyl tendo uma sequência de aminoácido N-terminal (isto é a sequência parcial até a posição de aminoácido correspondendo a posição 35 em Termamyl ™, que é idêntica a α-amilase de B. amyloliquefaciens (SEQ. ID. NO.: 4), isto é, uma a-amilase semelhante a Termamyl tendo a seguinte sequência N-terminal com relação a sequência de aminoácido de Termamyl™. A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I, em que um asterístico (*) indica deleção de resíduo de aminoácido em questão] em posições correspondendo a qualquer uma das seguintes posições em Termamyl™: H133 Η156 Α181 Α209 G310 Η450 V128 Ν104 V54 S187 Η293 Α294 (onde cada resíduo de aminoácido posterior pode ser substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido, isto é, qualquer outro resíduo escolhido dentre A, R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y e V), assim como as seguintes deleções triplas: K370*+G371*+D372* D372*+S373*+Q374* As substituições particularmente preferidas nas posições acima identificadas são as seguintes: H133I

H156Y

A181T

A209V

G310D

H450Y

V128E

N104D

V54W, Y, F, I, L

S187D Η293Υ A294V.

Qualquer combinação de uma ou mais (isto é, uma, duas, três, quatro, ... etc) das mutações acima indicadas podem ser efetuadas de modo apropriado em uma α-amilase semelhante a Termamyl no contexto em questão, e variantes particularmente interessantes da invenção no contexto de obter uma das melhoras acima mencionadas com relação ao comportamento de liquefação de amido de α-amilase incluem variantes compreendendo combinações de mutações múltiplas correspondendo às seguintes combinações de mutações em próprio Termamyl™ (SEQ. ID. NO.: 2): H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54W+S 187D+H293Y+A294V+K370*+G371*+D372*;

H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54W+S 187D+H293Y+A294V+D3 72*+S373 *+Q3 74*; Η13 3I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54Y+S1 87D+H293Y+A294V+K370*+G371*+D372*; H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54Y+S1 87D+H293Y+A294V+D372*+S373*+Q374; H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54F+S1 87D+H293Y+A294V+K370*+G371*+D372*; H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54F+S1 87D+H293Y+A294V+D372*+S373*+Q374; H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54I+S18 7D+H293Y+A294V+K370*+G371*+D372*; Η133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54I+S18 7D+H293Y+A294V+D372*+S373*+Q374; H133I+H156Y+A181T+A209V+G31OD+H450Y+V128E+N104D+V54L+S1 87D+H293Y+A294V+K370*+G371 *+D372*; H133I+H156Y+A181T+A209V+G310D+H450Y+V128E+N104D+V54L+S1 87D+H293Y+A294V+D372*+S373*+Q374;

Outras variantes interessantes da invenção neste contexto incluem as variantes compreendendo mutações únicas ou múltiplas correspondendo às seguintes mutações únicas ou múltiplas em próprio Termamyl™: mutações (substituições de aminoácido) nas posições NI 72 (por exemplo, N172R, K), SI87 (por exemplo, S187D), NI88 (por exemplo, N188P), N190 (por exemplo, N190L, F), H205 (por exemplo, H205C), D207 (por exemplo, D207Y), A210 (por exemplo, A210S), Q264 (por exemplo, Q264S) ou N265 (por exemplo, N265Y); as seguintes mutações múltiplas; H156Y+A181T+A209V;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S

Al *+N2*+L3V+Ml 5T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H1 5 6Y+A181T+A209V;

Al *+N2*+L3V+Ml 5T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H1 56Y+A181T+N190F+A209V; ou Al *+N2*+L3V+Ml 5T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H1 5 6Y+A181 T+Nl 90F+A209V+Q264S assim como combinações de quaisquer dois ou mais das últimas mutações únicas ou múltiplas.

Como já indicado, numerosos variantes de acordo com a invenção são particularmente bem apropriadas para uso em conversão de amido, por exemplo em liquefação de amido. Nesta conexão, um outro aspecto da presente invenção se refere a composições compreendendo uma mistura de: (i) a α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência mostrada na SEQ. ID. NO.: 2, com uma ou mais variantes (α-amilases mutantes) de acordo com a invenção derivadas de (como a α-amilase semelhante a Termamyl originária)a-amilase de B. stearothermophilus tendo a sequência mostrada na SEQ. ID. NO.: 6, ou (ii) a α-amilase de B. stearothermophilus tendo a sequência mostrada na SEQ. ID. NO.: 6, com uma ou mais variantes (a-amilases mutantes) de acordo com a invenção derivada de uma ou mais a-amilases semelhantes a Termamyl originárias (por exemplo de α-amilase de B. licheniformis tendo a sequência mostrada na SEQ. ID. NO.: 2, ou de uma de outras α-amilases semelhantes a Termamyl originárias especificamente referidas aqui); ou (iii) uma ou mais variantes (α-amilases mutantes) de acordo com a invenção derivadas de (como a α-amilase semelhante a Termamyl originária) a α-amilase de B. stearothermophilus tendo a sequência mostrada na SEQ. ID. NO.: 6, com uma ou mais variantes (α-amilases mutantes) de acordo com a invenção derivadas de uma ou mais α-amilases semelhantes a Termamyl originárias (por exemplo de α-amilase B. licheniformis tendo a sequência mostrada na SEQ. ID. NO.: 2, ou de uma ou outras a-amilases semelhantes a Termamyl originárias especificamente referidas aqui).

As mutações preferidas em uma variante de α-amilase de B. stearothermophilus a serem incorporadas em tal mistura incluem substituições em N193 e/ou em E210, e/ou as deleções à feição de pares R179*+G180* ou I181*+G182* (usando a numeração de sequência de aminoácidos para a a- amilase particular).

As composições de um dos últimos tipos, contendo a-amilase de B. stearothermophilus ou variante do mesmo, de acordo com a invenção, parecem ter grande potencial para uso em liquefação de amido. A relação (expressa, por exemplo em termos de mg de proteína amilolítica ativa por litro de meio líquido) entre os componentes α-amilolíticos individuais de uma dada mistura irão depender da natureza exata e propriedades de cada componente.

Composições detergentes Como mencionado acima, variantes da invenção podem ser incorporados de modo apropriado em composições detergentes. Faz-se referência, por exemplo a WO 96/23874 e WO 97/07202 para outros detalhes com relação a ingredientes relevantes de composições detergentes (como detergentes para lavagem de roupas ou louça), processos apropriados de formulação de variantes em tais composições detergentes, e para exemplos de tipos relevantes de composições detergentes.

As composições detergentes compreendendo uma variante da invenção podem adicionalmente compreende uma ou mais de outras enzimas, como uma lipase, cutinase, protease, celulase, peroxidase, ou lacase, e/ou outra a-amilase.

Variantes de α-amilase da invenção podem ser incorporadas em detergentes em concentrações convencionalmente empregadas. É atualmente contemplado que uma variante da invenção pode ser incorporada em uma quantidade correspondente a 0,00001-1 mg (calculado como proteína de enzima ativa, pura) de α-amilase por litro de licor de lavagem/lavagem de louça usando níveis de dosagem convencionais do detergente. A presente invenção é ainda descrita com referência ao desenho anexo, em que A figura 1 mostra a sequência de DNA, junto com códon de parada TAA, codificando a cepa de Bacillus NCIB 12512 α-amilase descrita em WO 95/26397, junto com a sequência de aminoácidos de a-amilase codificada (cf. figura 2). A figura 2 é um alinhamento de sequências de aminoácido de quatro α-amilases semelhantes a Termamyl originárias no contexto da invenção. Os números da esquerda extrema designam as respectivas sequências de aminoácidos, como a seguir: 1: a sequência de aminoácido de a-amilase 12512 da cepa Bacillus NCIB descrito em WO 95/26397; 2: a sequência de aminoácido de a-amilase 12513 da cepa Bacillus NCIB descrito em WO 95/26397; 3: a sequência de aminoácido de α-amilase B. stearothermophilus como mostra na SEQID No. 6 aqui; 4: a sequência de aminoácido de α-amilase Bacillus sp. #707 descrito por Tsukamoto et al. in Biochem. Biophvs. Res, Commun. 151 (1988), pp. 25-31.

Os números na direita extrema da figura dão o número total de ciclo de aminoácidos para cada uma das sequências em questão. Nota-se que para a sequência numerada 3 (correspondendo à sequência em SEQ. ID. NO.: 6), o alinhamento resulta em "intervalos" nas posições correspondentes a aminoácido 1 e no. 175, respectivamente, nas sequências numeradas 1,2 e 4. A figura 3 ilustra a estratégia de PCR empregada no exemplo 2 (vide infira).

MATERIAIS E PROCESSOS

Construção de pSNKI 01 Este vetor shuttle de E. coli/ Bacillus pode ser usado para introduzir mutações sem expressão de oc-amilase em E. coli e então ser modificado em tal modo que a α-amilase é ativa em Bacillus. O vetor foi construído como a seguir: o gene α-amilase no vetor pX (pDN1528 com as seguintes alterações dentro de amyL: BAN (1-33), H156Y, A181T, N190F, A209V, Q264S, o plasmídeo pDN1528 é além disso descrito no exemplo 1) foi inativado por interrupção no sítio PstI na região de codificação 5' de gene a- amilase por um fragmento de 1,2 kb contendo um fragmento de origem de E. coli. Este fragmento foi amplificado de pUC19 (no. de acesso GenBank X02514) usando o iniciador dianteiro: 5'- gacctgcagtcaggcaacta -3' e o iniciador reverso: 5'- tagagtcgacctgcaggcat -3'. O amplicon PCR e o plasmídeo pX contendo o gene de α-amilase foram digeridos com PstI a 37°C durante 2 h. O fragmento de vetor pX e o amplicon de origem de E. coli foram ligados em temperatura ambiente, durante 1 h e transformado em E. coli por eletro- transformação. O vetor resultante é designado pSnKIOl.

Fermentação e purificação de variantes de a-amilase A cepa de B. subtilis abrigando o plasmídeo de expressão relevante é riscada em placa de agar LB com 15 pg/ml cloranfenicol de -80°C carga, e cultivados durante a noite a 37°C . As colônias são transferidas a meio BPX 100 ml suplementado com 15 pg/ml cloranfenicol em um frasco de agitação 500 ml. A composição de meio BPX: amido de batata 100 g/1 farinha de cevada 50 g/1 BAN5000SKB 0,1 g/1 caseinato de sódio 10 g/1 meai de feijão de soja 20 g/1 Na2HP04,12 H20 9 g/1 Pluronic™ 0,1 g/1 A cultura é agitada a 37°C a 270 rpm durante 5 dias.

As células e resíduos de células são removidas após caldo de fermentação por centrifugação a 450 rpm em 20-25 min. Depois, o sobrenadante é filtrado para obter uma solução completamente límpida. O filtrado é concentrado e lavado de um filtro UF (membrana de corte 1000) e o tampão é mudado para acetato de 20 mM pH 5,5. O filtrado de UF é aplicado em S-Sepharose e eluição é realizada por eluição em etapas com 0,2M NaCl no mesmo tampão. O eluado é dialisado contra lOmM tris, pH 9,0 e aplicado em um F.F. Q-Sepharose e eluído com um gradiente linear, de 0-0,3 M NaCl sobre 6 volumes de coluna. As frações que contém a atividade (medida em teste Phadebas) são reunidas, pH foi ajustado a pH 7,5 e restante cor foi removida por um tratamento com 0,5% peso/vol. carvão ativo em 5 min.

Teste para atividade de a-amilase A atividade de α-amilase é determinada por um processo empregando comprimidos de Phadebas® como substrato. Os comprimidos de Phadebas (teste de amilase Phadebas® suprido pela Pharmacia Diagnostic) contém um polímero de amido colorido de azul insolúvel, reticulado, que foi misturado com albumina de soro bovino e uma substância tampão e formado em comprimidos.

Para cada medida única, um comprimido foi colocado em suspensão em um tubo contendo 5 ml 50 mM tampão Britton-Robinson (50 mM ácido acético, 50 mM ácido fosfórico, 50 mM ácido bórico, 0,1 mM

CaCl2, pH ajustado ao valor de interesse com NaOH). O teste é realizado em banho de água a uma temperatura de interesse. A α-amilase a ser testada é diluída em x ml de 50 mM tampão Britton- Robinson. 1 ml desta solução de a- amilase é adicionado a 5 ml 50 mM tampão Britton Robinson. O amido é hidrolisado por α-amilase dando fragmentos de cor azul solúveis. A absorbância da solução azul resultante, medida espectrofotometricamente em 620 nm, é uma função da atividade de a-amilase. É importante que a absorbância de 620 nm medida após 10 ou 15 minutos de incubação (tempo de teste) está na faixa de 0,2 a 2,0 unidades absorbância a 620 nm. Nesta faixa de absorbância, se tem uma linearidade entre atividade e absorbância (lei de Lambert-Beer). A diluição da enzima deve ser assim ajustada para se adequar a este critério. Sob um conjunto especificado de condições, (temperatura, pH, tempo de reação, condições de tampão), 1 mg de uma dada α-amilase irá hidrolisar uma certa quantidade de substrato e uma cor azul será produzida. A intensidade de cor é medida a 620 nm. A absorbância medida é diretamente proporcional à atividade específica (atividade /mg de proteína α-amilase pura) da α-amilase em questão sob o dado conjunto de condições.

Processo geral para mutagênese aleatória por uso de programa DOPE A mutagênese aleatória pode ser realizada pelas seguintes etapas: 1. selecionar regiões de interesse para modificação na enzima originária 2. Decidir em sítios de mutação e sítios não mudados na região selecionada, 3. decidir em que tipo de mutações deve ser realizada, por exemplo com-relação à desejada estabilidade e/ou desempenho da variante a ser construída 4. selecionar mutações estruturalmente razoáveis. 5. ajustar os resíduos selecionados por etapa 3 com relação a etapa 4. 6. analisar pelo uso de um algoritmo dope apropriado a distribuição de nucleotídeos 7. se necessário, ajustar os resíduos desejados para o realismo do código genético (por exemplo levando em conta limitações resultantes de código genético (por exemplo a fim de evitar introdução dos códons de parada) (o versado na arte terá conhecimento de que algumas combinações de códons não podem ser usadas na prática e precisarão ser adaptadas) 8. fazer iniciadores 9. realizar a mutagênese aleatória por uso dos iniciadores 10. selecionar variantes de α-amilase resultantes por triagem para as desejadas propriedades melhoradas.

Os algoritmos de dope apropriados para uso na etapa 6 são bem conhecidos dos versados na arte. Um algoritmo é descrito por Tomandl, D. et al., Journal of Computer-Aided Molecular Design, 11 (1997), pp. 29-38). O programa dope O programa "DOPE" é um algoritmo de computador utilizável para otimizar a composição de nucleotídeos de um tripleto de códon em tal modo que ele codifica uma distribuição de aminoácidos que se parece mais com a distribuição de aminoácidos desejada. A fim de avaliar quais das distribuições possíveis é a mais similar à distribuição de aminoácidos desejada, uma função de escores é necessária. No programa "Dope", a seguinte função foi verificada como sendo apropriada: onde os x, 's são as quantidades obtidas de aminoácidos e grupos de aminoácidos como calculados pelo programa, y,· 's são as quantidades desejadas de aminoácidos e grupos de aminoácidos como definido pelo usuário do programa (isto é especificar quais dos 20 aminoácidos ou códons de parada são desejados a serem introduzidos, por exemplo com uma certa porcentagem (por exemplo 90% Ala, 3% Ile, 7% Vai) e w, 's recebem fatores ponderais como definido pelo usuário do programa (por exemplo dependendo da importância de ter um resíduo de aminoácido específico inserido na posição em questão). N é 21 mais o número de grupos de aminoácidos como definido pelo usuário do programa, para fins desta função, 0o é definido como sendo 1.

Um algoritmo de Monte-Carlo (um exemplo sendo o descrito por Valleau, J. P. & Whittington, S. G. (1977) A guide to Mont Cario for statistical mechanics: 1 Highways. In "Stastistical Mechanics, Part A" Equilibrium Techniques ed. B. J. Beme, New York: Plenum) é usado para encontrar o valor máximo desta função. Em cada iteração, as seguintes etapas são realizadas: 1. uma nova composição de nucleotídeos aleatória é escolhida para cada base, onde a diferença absoluta entre a corrente a nova composição é menor do que ou igual a d para cada um dos quatro nucleotídeos G,A,T,C em todas as três posições do códon (ver abaixo para definição de d). 2. os escores da nova composição e da composição corrente são comparados pelo uso da função s como descrito acima. Se um novo escore for maior ou igual ao escore da composição corrente, a nova composição é mantida e a composição corrente é mudada para uma nova. SE o novo escore for menor, a probabilidade de manter a nova composição é exp (1000(novo escore - escore _ corrente)).

Um ciclo normalmente consiste de 1000 iterações como descrito acima em que d é decrescente linearmente de 1 a 0. Cem ou mais ciclos são realizados em um processo de otimização. A composição de nucleotídeos resultante no maior escore é finalmente apresentada. EXEMPLO 1 Construção de variantes de Termamyl™ de acordo com a invenção Termamyl (α-amilase de B. licheniformis SEQ. ID. NO.: 2) é expressa em B. subíilis de um plasmídeo denotado pDN1528. Este plasmídeo contém o ene completo codificando Termamyl, amyl, cuja expressão é dirigida por seu próprio promotor. Além disso, o plasmídeo contém a origem de replicação, ori, de plasmídeo pUBl 10, e o gene cat de plasmídeo pC194, conferindo resistência para cloranfenicol. pDN1528 é mostrado na figura 9 de WO 96/23874.

Um vetor de mutagênese específico contendo uma parte principal de região de codificação de SEQ. ID. NO.: 1 foi preparado. Os aspectos importantes deste vetor, denotado pJeENl, incluem uma origem de replicação derivada de plasmídeos pUC, o gene cat conferindo resistência para cloranfenicol, e uma versão contendo deslocamento de quadro de gene bla, cujo tipo selvagem normalmente confere resistência para ampicilina (fenótipo ampR). Esta versão mudada resulta em um fenótipo amps . O plasmídeo pJeENl é mostrado na figura 10 de WO 96/23874, e a origem de E.coli de replicação, ori, bla, cat, a versão truncada 5' de gene amilase Termamyl e sítios de restrição selecionados são indicados no plasmídeo.

As mutações são introduzidas em amyL pelo processo descrito por Deng e Nickoloff (1992, Anal, fíiochetn. 200. pp. 81-88) exceto os plasmídeos com o "iniciador de seleção" (iniciador #6616; ver abaixo) incorporado são selecionados com base em fenótipo ampR de células E. coli transformadas abrigando um plasmídeo com um gene bla re-formado em pares, em vez de empregar a seleção por digestão de enzima de restrição descrita em Deng e Nickoloff. Os produtos químicos e enzimas usados para mutagênese foram obtidos de kit de mutagênese ChameleonÔ de Stratagene (catálogo número 200509).

Após a verificação da sequência de DNA em plasmídeos variante, o gene truncado, contendo a alteração desejada, é subclonado em pDN1528 como um fragmento PstI-EcoRI e transformado ema cepa exaurida em protease- e amilase de Bacillus subtilis SHA273 (descrito em WO 92/11357 e WO 95/10603) a fim de expressar a enzima variante. A variante Termamyl V54W foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' a 3', esquerda à direita): PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG A variante de Termamyl A52W + V54W foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' a 3', esquerda à direita): PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG

Iniciador #6616 (escrito 5' a 3', esquerda à direita; P denota um fosfato 5'): P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C A variante Termamyl Y54E foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG A variante Termamyl V54M foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG A variante Termamyl V54I foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG

As variantes Termamyl Y290E e Y290K foram construídas por usarem o seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C Y representa uma mistura igual de C e T. A presença de um códon codificando ou glutamato ou lisina na posição 290 foram verificadas por sequenciação de DNA. A variante Termamyl N190F foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C A variante Termamyl N188P+N190F foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC A variante Termamyl H140K+H142D foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT

TAG A variante Termamyl H156Y foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG A variante Termamyl A181T foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC A variante Termamyl A209V foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC A variante Termamyl Q264S foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC A variante Termamyl S187D foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC A variante Termamyl DELTA (K370-G371-D372) (isto é, deletada de resíduos de aminoácido nos. 370, 371 e 372) foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC A variante Termamyl DELTA (D372-S373-Q374) foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito 5' -3', esquerda à direita): PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C

As variantes Termamyl A181T e A209V foram combinadas para A181T+A209V por digestão do A181T contendo plasmídeo semelhante a pDN1528 (isto é pDN1528 contendo em amyL a mutação resultante da alteração A181T) e o plasmídeo semelhante a pDN1528 contendo A209V (isto é, pDN1528 contendo em amyL a mutação resultante da alteração A209V) com a enzima de restrição Clal que corta os plasmídeos pDN1528 duas vezes resultando em um fragmento de 1116 bp e o vetor-parte (isto é, contém a origem de replicação do plasmídeo) de 3850 bp. O fragmento contendo a mutação A209V e parte do vetor contendo a mutação A1821T foram purificados pelo kit de extração gel QIAquick (adquirido de QIAGEN) após a separação em gel agarose. O fragmento e o vetor foram ligados e transformados em uma cepa exaurida em protease e amilase de Bacillus subtilis referida acima. O plasmídeo de amy+ (zonas de clareamento em placas agar contendo amido) e transformantes resistentes a cloranfenicol foram analisadas pela presença de ambas as mutações no plasmídeo.

Em um modo similar como descrito acima, H156Y e A209V foram combinados utilizando endonucleases de restrição Acc65I e EcoRI, dando H156Y+A209V. H156Y +A209V e A181T+A209V foram combinadas em H156Y+A181T+A209V pelo uso de endonucleases de restrição Acc65I e HindIII.

Os resíduos 35 N-terminal de parte madura de variante de Termamyl H156Y+ A181T+A209V foram substituídos pelos resíduos 33 N- terminal de α-amilase B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO 4) (que no presente contexto é terminado com BAN) por uma abordagem SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351) como a seguir: Iniciador 19364 (sequência 5' -3’): CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC

GTAAATGGC ACG CTG

Iniciador 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA

ATG TTC CG

Iniciador 19363: CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC

Iniciador 1C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC

Um PCR padrão, reação de cadeia de polimerase, foi realizado usando a polimerase termoestável Pwo de Boehringer Mannheim de acordo as instruções do fabricante e o ciclo de temperatura : 5 minutos a 94°C, 25 ciclos de (94°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72°C durante 1 minuto), 72°C durante 10 minutos.

Um fragmento de aproximadamente 130 bp foi amplificado em um primeiro PCR denotado PCR1 com os iniciadores 19364 e 19362 em um fragmento de DNA contendo o gene codificando a α-amilase B. amyloliquefaciens.

Um fragmento de aproximadamente 400 bp foi amplificado em outro PCR denotado PCR2 com os iniciadores 19363 e 1C em gabarito pDN1528. PCR1 e PCR2 foram purificados de um gel agarose e usados como gabaritos em PCR3 com os iniciadores 19364 e 1C que resultou em um fragmento de aproximadamente 520 bp. Esse fragmento assim contém uma parte de DNA codificando o N-terminus de BAN fundido a uma parte de DNA codificando Termamyl de trigésimo quinto aminoácido. 0 fragmento 520 bp foi subclonado em um plasmídeo de pDN1528-like (contendo o gene codificando a variante Termamyl H156Y+A181T+A209V) por digestão com a endonuclease de restrição PstI e SacII, ligação e transformação da cepa B. subtilis como previamente descrito. A sequência de DNA entre os sítios de restrição PstI e SacII foi verificada por sequenciação de DNA em plasmídeos extraídos de amy+ e transformantes resistentes a cloranfenicol. A construção final contendo o N-término correto de BAN e H156Y+ A181T+A209V foi denotado BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V. N190F foi combinado com BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V dando BAN (1-35) + H156Y+ A181T+N190F+A209V

transportando mutagênese como descrito acima exceto a sequência de amyL em pJeENl foi substituído pela sequência de DNA codificando a variante Termamyl BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V Q264S foi combinado com BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V dando BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V+Q264S

transportando mutagênese como descrito acima exceto a sequência de amyL em pJeEN foi substituída pela sequência de DNA codificando a variante Termamyl BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V BAN (1-35) + H156Y+ A181T+A209V+Q264S e BAN (1-35) + H156Y+ A181T+N190F+A209V foram combinados em BAN (1-35) + H156Y+ A181T+N190F+A209V+Q264S utilizando a endonuclease de restrição BsaFH (sítio BsaHI foi introduzido próximo da mutação A209V) e PstI. EXEMPLO 2 Construção, por mutagênese dopada aleatória localizada, de variantes de a- amilases semelhantes a Termamyl tendo uma estabilidade melhorada em baixo pH e uma dependência reduzida em íons cálcio para estabilidade comparada com a enzima originária As α-amilases são de grande importância para o processo de liquefação de amido industrial. A variante de α-amilase de B. licheniformis termoestável consistindo de aminoácidos 1-33 de amilase B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO 4) fundida em aminoácidos 36-483 de amilase B. licheniformis (SEQ ID NO 2) e ainda compreendendo as mutações seguintes: Y156, T181, F190, V209 e S264 (a construção dessa variante é descrita no exemplo 1) tem uma estabilidade muito satisfatória em baixo pH e baixas concentrações de cálcio. Em uma tentativa para ainda melhorar a estabilidade em baixo pH e baixa concentração de cálcio de referida mutagênese aleatória de variante de α-amilase em regiões pré-selecionadas foram realizadas As regiões são: Região: Resíduo: I: Phel53-Thrl63 II: Glnl78-Asnl92 III: His205-Arg214 IV: Ala232-Asp237 e VIII: Glyl31-Lysl36 IX: Aspl64-Tyrl75 X: Tyr 262-Thr278 Região Total % Média % Número de resíduos mudada I: 35 88 8 dentre 11 II: 20 86 11 dentre 15 III: 27 88 10 dentre 10 IV: 34 91 11 dentre 12 VIII: 39 86 6 dentre 6 IX: 46 93 12 dentre 12 X: 27 90 12 dentre 13 VIII + IX: 18 VIII + IX 4 + 11: II + III + 2 IV: IV+ 1: 12 Os números sob % total dão o número total de aminoácidos de tipo selvagem (wt) desejados em uma dada região após dopagem. O número é obtido por multiplicação de número de posições mudadas (por exemplo 8 com relação a região I) por seu wt respectivo. Com relação a região I, a % total desejada é 80*80*90*90*90*90*95*90/100 = 35%. A % média é o nível médio de dopar para o número total de posições na região em questão (por exemplo 11 posições com relação a região I). Para região I, a % média é calculada como a seguir: 80+80+90+90+90+90+95+90 = 705 dividido por 11=88% O software DOPE (ver Materiais e Processos) foi usado para determinar os códons salpicados para cada mudança sugerida nas sete regiões minimizando a quantidade de códons de parada. A distribuição exata de nucleotídeos foi calculada nas três posições do códon para dar a população sugerida de mudanças de aminoácidos. As regiões dopadas foram dopadas especificamente nas posições indicadas para ter uma alta mudança de obter os desejados resíduos, mas ainda permite outras possibilidades.

Por exemplo, ο H156 original na sequência wt foi mudado em um Y, significando um novo códon, e então dopado 10% para outros resíduos. Isto é, a sequência de DNA tem um código para um Y em vez de um H. Na posição 156, o Tyr foi programado para ser 90% desejado e outros resíduos foram livremente permitidos. Para algumas posições, não foi possível criar a população sugerida de resíduos de aminoácidos porque o código genético limitou os resíduos estruturalmente e funcionalmente desejados. Os sete oligonucleotídeos dopados resultantes são mostrados na tabela 1-7, com o wt do nucleotídeo e as sequências de aminoácidos e a distribuição dos nucleotídeos para cada posição dopada. Todos os iniciadores de biblioteca foram sintetizados como filamentos sentido.

Tabela 1: Biblioteca DASI (Phel53-Thrl63) 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Iniciador: 5' CGC GGC AGC ACA TAC AGC GAT T1T 2A3 TGG 45T

TGG 67T 8AT TTT GAC GGA A9C GAT TGG GAC GAG TCC CGA AAG 3' Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 80% T, 20% A. 2: 96% A, 2% G, 2% C. 3: 98% A. 2% T. 4: 93% T, 4% G, 3% A. 5: 97% A, 3% G. 6: 98% T, 2% A. 7: 97% A, 3% C. 8: 90% C, 10% T. 9: 95% C, 5% A.

Tabela 2: Biblioteca DASII (Glnl78-Asnl92) 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 Gin Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Vai Ser Asn Glu Phe Gly Asn Iniciador: 5’ CTG AAC CGC ATC TAT AAG TTT 1A2 34T AAG 567 TGG

GAT 89G GAIO GTT A11T 1213T GAA T1415 161718 AAC TAT GAT TAT TTG ATG TAT 3' Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 93% C, 7% A. 2: 84% G, 16% T. 3: 95% G, 5% A. 4: 95% G, 5% C. 5: 94% A, 6% G. 6: 95% C, 5% A. 7: 62% T, 38% G. 8: 87% T, 13% A. 9: 91% G, 9% C. 10: 92% G, 8% T. 11: 90% G, 5% A, 5% C. 12: 88% A, 12% C. 13: 88% A, 12% C. 14: 93% T, 5% A, 2% C. 15: 97% T, 3% G. 16: 86% G, 14% A. 17: 89% G, 11% C. 18: 60% G, 40% T.

Tabela 3: Biblioteca DASIII (His205-Arg214) 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 His Pro Asp Vai Vai Ala Glu Ile Lys Arg Iniciador: 5' TAT GCC GAC ATC GAT TAT GAC 12T 3CT 456 7TT 8910 1112T 13A14 15T16 A17A 1819A TGG GGC ACT TGG TAT GCC AAT 3' Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 89% C, 11% T. 2: 89% A, 11% G. 3: 95% C, 2,5 %T, 2,5% A. 4: 96% G, 1% A, 3% T. 5: 96% A, 4% C. 6: 98% T, 2% A. 7: 95% G, 2,5% A, 2,5% C. 8: 93% G, 7% A. 9: 96% T, 4% A. 10: 84% A, 16% G. 11: 81% G, 7% A, 7% T, 5% C. 12: 98% C, 2% A. 13: 96% G, 4% C. 14: 94% G, 6% T. 15: 82% A, 18% T. 16: 50% A, 50% T. 17: 90% A, 10% G. 18: 70% A, 30% C.

19: 86% G, 14% A

Tabela 4: Biblioteca DASIV (Ala232-Asp243) 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 Ala Vai Lys His Ile Lys Phe SerPhe Leu Arg Asp Iniciador: 5' TTG GAC GGT TTC CGT CTT GAT 12T G3T AAA 456 7TT

A8G T9T 1011T T12T 13T14 1516G GA17 TGG GTT AAT CAT GTC

AGGGAA

Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 93% G, 3,5% A, 3,5% T. 2: 94% C, 4% T. 3: 94% T, 6% C. 4: 93% C, 2% T, 2% A, 3% G. 5: 98% A, 2% T. 6: 98% T, 2% A. 7: 95% A, 5% C. 8: 94% A, 6% G. 9: 90% T, 10% A. 10: 89% T, 11% A. 11: 89% C, 11% A.

12: 95% T, 5% A 13: 64% C, 33% T, 3% A. 14: 93% A, 7% T. 15: 90% A, 10% C.

16: 90% G, 5% A, 5% C

17: 90% T, 10% A

Tabela 5: Biblioteca DASVIII (Gly 131 -Lys 136) 131 132 133 134 136 136 Gly Glu His Leu Ile Lys Iniciador: 5' GCT GAC CGC AAC CGC GTA ATT TCA 123 GA4 56T 78A 9TA A10G GCC TGG ACA CAT TTT CAT TTT 3’ Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 91% G, 9% A. 2: 87% G, 13% C. 3: 90% T, 10% G. 4: 90% G, 10% T. 5: 85% C, 8% T, 7% A. 6: 89% A, 9% T, 2% C.

7: 88% T, 12% A

8: 88% T, 11% C, 1% G

9: 92% A, 8% T

10: 93% A, 7% G

Tabela 6: Biblioteca DASIX (Aspl64-Tyrl75) 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174175 Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg IleTyr Iniciador: 5' TGG TAC CAT TTT GAC GGA ACC GAT TGG 1A2 GAG

3CG CGA A4G 56A A7T A8G 9 1011 T12T AAG TTT CAA GGA AAG GCT TGG 3’ Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 94% G, 6% A. 2: 96% T, 4% G. 3: 92% T, 4% A, 4% G. 4: 95% A, 5% G. 5: 93% C, 7% A. 6: 92% T, 8% A. 7: 90% A, 5% G, 5% C. 8: 90% G, 10% A. 9: 92% A, 6% G, 2% T. 10: 92% T, 8% A. 11: 50% T, 50% C. 12: 96% A, 4% T.

Tabela 7: Biblioteca DASX (Try262-Asn278) 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 374 275 276 277 278 Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Iniciador: 5' GAA ATG TTT ACG GTA GCT GAA T1T TGG 234 56T 7A8 91011 1213T 1415T 16T17 GA18 A19T T20T 21T22 A23C A24G ACA 25AT TTT AAT CAT TCA GTG TTT GAC 3' Distribuição de nucleotídeos para cada posição dopada. 1: 95% A, 5% T. 2: 97% A, 3% G. 3: 95% G, 2,5% A, 2,5% C. 4: 94% T, 6,2% G. 5: 97% A, 3% T. 6: 94% A, 3% G, 3% C. 7: 95% G, 5% A. 8: 95% T, 5% A. 9: 52% T, 45% C, 3% A. 10: 96% T, 4% C. 11: 60% A, 40% G. 12: 90% G, 10% A. 13: 94% G, 6% C. 14: 81% G, 8% A, 8% T, 3% C. 15: 98% C, 2% T. 16: 90% C, 10% A. 17: 50% G, 50% T. 18: 90% A, 10% T. 19: 90% A, 5% G, 5% C. 20: 95% A, 5% T. 21: 91% T, 9% A. 22: 92% A, 8% G. 23: 94% A, 3% G, 3% C. 24: 93% G, 7% A. 25: 90% A, 10% G.

Mutagênese aleatória Os oligonucleotídeos salpicados aparentes das tabelas 1-7 (que por um termo comum são designados FDAS na figura 3) e iniciadores reversos RDAS para cada região e iniciadores de B. licheniformis específicos cobrindo os sítios SacII e Sall são usados para gerar fragmentos de biblioteca PCR pelo processo de extensão global (Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68) com uma sobreposição de 21 bp. A figura 3 mostra a estratégia PCR.

Os fragmentos PCR são clonados em vetor shuttle de E. coli/Bacillus pSNKIOl (ver materiais e processos) permitindo a mutagênese de E. coli e expressão imediata em Bacillus subtilis evitando o acúmulo letal de amilases em E. coli. Após estabelecer os fragmentos de PCR clonados em E. coli, um fragmento pUC19 modificado é digerido do plasmídeo e o promotor e o gene Termamyl mudado é fisicamente conectado e a expressão pode ocorrer em Bacillus.

Triagem.

As sete bibliotecas podem ser tríadas no baixo pH e os testes de filtro de cálcio baixo descritos abaixo.

Teste de filtro de pH baixo As bibliotecas de Bacillus são colocadas em placas em um sanduíche de acetato de celulose (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) - e filtros de nitrocelulose (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha) em placas agar TY com 10 pg/ml de cloranfenicol a 37°C durante pelo menos 21 horas. A camada de acetato de celulose está localizada em placa agar TY.

Cada sanduíche de filtro é especificamente marcado com uma agulha após colocar na placa, mas antes da incubação a fim de permitir localizar variantes positivas no filtro e o filtro de nitrocelulose com variantes ligados é transferido para um recipiente com tampão citrato, pH 4,5 e incubado a 80°C durante 15 min. Os filtros de acetato de celulose com as colônias são armazenados nas placas TY em temperatura ambiente até uso.

Após incubação, atividade residual é detectada em placas contendo 1% de agarose, 0,2% de amido em tampão citrato, pH 6,0. As placas de teste com filtros de nitrocelulose são marcadas do mesmo modo que o sanduíche de filtro e incubadas durante 2 h a 50°C. Após remoção dos filtros, as placas de teste são manchadas com 10% de solução Lugol. As variantes de degradação de amido são detectadas como pontos brancos em fundo azul escuro e então identificadas em placas de armazenagem. As variantes positivas são re- triadas duas vezes sob as mesmas condições na primeira tela.

Teste de filtro de baixo teor em cálcio 0 teste é realizado do mesmo modo que o teste de filtro de baixo pH com as seguintes modificações: o filtro com a proteína ligada é incubado a 95°C, pH 6,0 durante 1 h. com concentrações EDTA diferentes (0,001 mM-100 mM).

As variantes seguintes foram obtidas pelo processo acima (a- amilase B. amyloliquefaciens designadas BAN): * BAN/híbrido Termamyl *+ H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + E211Q • BAN/híbrido Termamyl *+ H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S + H205C + D207Y + A210S

As mutações indicadas em negrito foram introduzidas pelo processo de mutagênese aleatória. Os dados de estabilidade para estas variantes aparecem da tabela 11 no exemplo 3.

Em um modo análogo ao descrito acima, a mutagênese aleatória das sete regiões acima identificadas foi realizada na α-amilase de B. lichenifortnis originária (SEQ. ID. NO.: 2). O esquema de dopagem é determinado analogamente ao usado acima. EXEMPLO 3 Medida da estabilidade dependente de cálcio e pH

Normalmente, o processo de liquefação industrial corre usando o pH 6,0 - 6,2 como o pH de liquefação e uma adição de 40 ppm de cálcio isento a fim de melhorar a estabilidade a 95°C - 105°C. Algumas das substituições propostas aqui foram feitas a fim de melhorar a estabilidade a 1. pH mais baixo do que pH 6,2 e/ou 2. a níveis de cálcio isento mais baixos do que 40 ppm de cálcio isento.

Três processos diferentes foram usados para medir as melhoras na estabilidade obtida por substituições diferentes em Termamyl: 1. Um teste que mede a estabilidade em pH levemente reduzido, pH 5,5, na presença de 40 ppm de cálcio isento, (desse modo, a melhora da estabilidade ao pH baixo é medida). 10 pg das variantes foram incubados sob as seguintes condições: Uma solução de 0,1 M de acetato, o pH ajustado a pH 5,5, contendo 40 ppm de cálcio e 5% p/p de amido de milho comum (isento de cálcio). A incubação foi feita em um banho de água a 95°C durante 30 minutos. 2. Outro teste que mede a estabilidade na ausência de cálcio livre e onde o pH é mantido a pH 6,2. Este teste mede a diminuição na sensibilidade de cálcio: 10 pg da variantes foram incubados sob as seguintes condições: Uma solução de 0,1 M de acetato, o pH ajustado a pH 6,2, contendo 5% p/p de amido de milho comum (isento de cálcio). A incubação foi feita em um banho de água a 95°C durante 30 minutos. 3. Um terceiro teste em que as condições de testes nos. 1 e 2 foram combinadas. Este teste mede a estabilidade na ausência de cálcio e ao pH baixo (pH 5,5). 4. Um quarto teste similar ao no. 3 onde o pH foi ainda reduzido para pH 5,0.

Determinação de estabilidade Todas as tentativas de estabilidade 1, 2, 3 e 4 foram feitas usando o mesmo procedimento. O processo foi: A enzima foi incubada sob as condições relevantes (1-4). As amostras foram feitas a 0, 5, 10, 15 e 30 minutos e diluídas 25 vezes (mesma diluição para todas as amostras feitas) no tampão de teste (0,1 M 50 mM

Britton tampão pH 7,3) e a atividade foi medida usando o teste Phadebas (Pharmacia) sob condições padrão pH 7,3, 37°C. A atividade medida antes da incubação (0 minutos) foi usada como referência (100%). O declínio em porcentagem foi calculado como uma função do tempo de incubação. A tabela mostra a atividade residual após 30 minutos de incubação.

Determinação de atividade específica A atividade específica foi determinada usando o teste Phadebas (Pharmacia) como enzima de atividade/mg. A atividade foi determinada usando o teste de α-amilase descrito aqui na seção de Materiais e Processos.

Resultados Tabela 8: Processo de estabilidade no. 1 / Melhora de estabilidade em pH baixo Tabela 9: Processo de estabilidade no. 2 / Sensibilidade de cálcio diminuidade Tabela 10: Processo de estabilidade no. 3 / Melhora de estabilidade de pH baixo + sensibilidade de cálcio diminuída * BAN (B. amyloliquefaciens α-amilase (SEQ ID NO 4) / Termamyl (B. lichenijfromis α-amilase (SEQ ID NO 2) PCR híbrido.

Os primeiros 33 aminoácidos N-terminais são BAN e o resto 36-483 são Termamyl (a construção da variante é descrita no Exemplo 1). ** Medida após 5 min. de incubação. Comparado a Termamyl wt.

Que sob as mesmas condições mostra 36% de atividade residual.

Tabela 11: Processo de estabilidade no. 4. / Melhora de estabilidade de pH baixo (pH 5,0) + sensibilidade de cálcio diminuída * como indicado na relação para Tabela 10 As variantes na Tabela 11 acima foram construídas por meios da mutagênese aleatória localizada descrita no Exemplo 2. EXEMPLO 5 Estabilidade de α-amilase a uma temperatura de pH baixo e elevado Este exemplo resume os resultados de estabilidade das variantes caracterizadas por um teste fluorimétrico a 70°C sob as duas condições diferentes, (1) pH 4,5 e 1 mM CaCl2 e (2) pH 6,2 e 10 μΜ CaCl2.

Descrição de processo Todas as experiências de fluorescência foram realizadas em um espectrômetro luminescence Perkin-Elmer LS-50 usando um suporte de 4 cubas. A temperatura foi controlada por um banho de água circulante e medida diretamente na pequena cuba usando termômetro Noronix Digital (modelo NTD 100). Durante as medidas, mistura completa de reagentes na pequena cuba foi assegurada usando os operadores magnéticos operando a uma taxa de agitação elevada. As pequenas cubas foram tampadas com tampas de teflon para minimizar a evaporação. A fluorescência de proteína intrínseca (devido a cadeias laterais Trp) foi monitorada por excitação a 280 nm e emissão a 350 nm. As larguras de corte foram de 5 nm.

Durante as medidas cinéticas, 4 reações foram monitoradas em paralelo. Dados foram coletados no diálogo Wavelength Programme, permitindo a coleta de dados automática durante um período prolongado (por exemplo, mais de uma hora). A não duplicação foi realizada a 70°C. As condições de não duplicação foram (1) 50 mM NaOAc pH 4,5 e 1 mM CaCl2 (2) 50 mM NaOAc pH 6,2 e 10 μΜ CaCl2. A concentração de proteína foi 5 pg/ml e glicerol foi de 0,5% p/v (da solução de carga de proteína).

Nota: Ocorreu alguma variação a cada dia no valor absoluto do meio tempo de não duplicação devido a variações de temperatura leves (ocasionado por exemplo, quantidades diferentes de água no banho de água).

Entretanto, Termamyl foi sempre incluído como uma das quatro enzimas analisadas em cada experiência, com efeito tomando-a um padrão interno.

Taxas de não duplicação relativas para este padrão interno foram satisfatoriamente reproduzíveis (realizado em triplicata).

Análise de dados foi realizada usando o software de GraphPad Prism.

Em pH 4,5, dados de não duplicação poderiam ser providos muito satisfatoriamente para um decaimento exponencial único com derivação: F(t) - A*exp (-ln (2) * t/t,/2) + derivação *t + desvio (1) onde F é a fluorescência medida, A é a amplitude de não duplicação, t é o tempo e t1/2 é o meio tempo de não duplicação.

Em pH 6,2, a não duplicação foi mais complexa (envolvendo uma fase lag inicial), e dados não puderam ser adequados à eq. 1. Ao contrário, o tempo que leva para o sinal de fluorescência decair a 50% do sinal inicial foi usado como um t1/2 aparente. A partir destes meio-tempos, a mudança na energia livre de não duplicação com relação à de Termamyl pode ser calculada como a seguir: onde R é a constante de gás universal e T é a temperatura (o valor de R*T é 0,5919, dando um valor de DDG em kcal/mol).

Para converter dados a valores DDG, os efeitos desestabilizantes /estabilizantes de mutações diferentes podem ser comparados diretamente e examinados para aditividade (DDG!+2 = DDG, + DDG2) e sinergia (DDGI+2 > DDG, + DDG2) onde DDG1+2 é o efeito de energia de mutações de introdução 1 e 2.

Resultados A não duplicação de amilases em temperaturas de pH baixo e alto pode ser seguida pelo decaimento na fluorescência Trp. Em pH 4,5 e 1 mM CaCl2, todas as amilases não duplicaram bastante rapidamente.

Os dados de não duplicação a pH 4,5se ajusta melhor a uma equação exponencial dupla do que a uma equação exponencial única. No entanto, desde que a segunda fase é muito lenta, ela é aproximada por uma derivação linear (equação 1). A não duplicação a pH 6,2 e 10 uM CaCl2 a 70°C é muito menos rápida do que em pH 4,5 apesar de [Ca2 ] baixo. A não duplicação é bem mais completa em uma hora do que não é possível se ajustar aos dados para uma equação exponencial única. Ao contrário o tempo tomado para o sinal de fluorescência decair a 50% do sinal inicial é usado como um t1/2 aparente.

Resultados do testes de fluorescência são apresentados na Tabela 12.

Tabela 12 Resumo dos dados para não duplicação de variantes Termamyl pH 4,5 e pH 6,2 a 70°C. a A porcentagem indica o nível ao que o nível de fluorescência inicial tinha declinado no curso de 3 horas a 70°C. O declínio lento é indicativo de estabilidade alta. EXEMPLO 5 Variantes de α-amilase com atividade específica aumentada Este exemplo resume os resultados de variantes caracterizadas tendo aumentada atividade específica comparada para Termamyl wt. A presença destas substituições ou na combinação com cada outro ou como substituições únicas adicionadas para estabilizar substituições aumenta a atividade específica da variante resultante. A atividade específica foi determinada usando o teste de α-amilase (Phadebas) descrito em Materiais e Processos onde a atividade/mg enzima foi determinada. A atividade foi determinada usando a seguinte descrição onde o pH foi 7,3, a temperatura de 37°C e tempo de teste de 15 min. e o tampão como definido. EXEMPLO 6 ” ' Teste de variantes de especificidade (sacarificação) Foi registrado previamente (Patente U.S. No. 5.234.823) que, quando a sacarificação com glucoamilase e pululanase, a presença da atividade de α-amilase residual que surge do processo de liquefação, pode conduzir a rendimentos inferiores de glicose, se a α-amilase não está inativa antes do estágio de sacarificação. Esta inativação pode ser tipicamente realizada por ajuste do pH a abaixo de 4,3 a 95°C, antes de abaixar a temperatura a 60°C para sacarificação. Á reação para este efeito negativo no rendimento de glicose não está completamente entendido, mas é assumido que a α-amilase de liquefação (por exemplo, Termamyl 120 L de B. licheniformis) gera “dextrinas de limite” (que são substratos pobres para pulunanase), por hidrólise de ligações 1,4-alfa-glucosídicas próximas a e em ambos os lados dos pontos de ramificações em amilopectina. A hidrólise destas dextrinas de limite por glucoamilase leva a um acúmulo de trissacarídeo panose, que só é lentamente hidrolisada por glucoamilase. O desenvolvimento de uma α-amilase termoestável, que não sofra desta desvantagem será uma melhora significante, como nenhuma etapa de inativação separada pode ser requerida. Várias variantes de α-amilase B. licheniformis, com especificidade alterada, foram avaliadas por sacarificação de um substrato de Maltodextrina DE 10 com glucoamilase A. niger e pululanase de B. acidopullulyticus sob condições onde a variante amilase era ativa.

As reações de sacarificação foram monitoradas tomando amostras a intervalos de 24 horas e analisando os mesmos por HPLC. As condições de reação padrões foram: Concentração de substrato: 28,2% p/p Temperatura 60°C pH inicial (a 60°C) 4,7 Dosagem de enzima Glucoamilase 0,18 AG/g DS

Pululanase 0,06 PUN/g DS

a-amilase 60 NU/g DS

As seguintes enzima7s foram usadas: Glucoamilase: AMG (Novo Nordisk) 153 AG/g Pullulanase: Promozima (Novo Nordisk) 295 PUN/g a-amilase: Termamyl (Novo Nordisk) 13 5 KNU/g V54Y 313 KNU/g A52W 5.116NU/ml D53E 3.280 NU/ml D53W 599 NU/ml A52W+V54Y 134 NU/ml As mutações listadas na listagem de α-amilase acima são usadas para indicar variantes da α-amilase de B. licheniformis (SEQ ID NO 2) (Termamyl) que foi modificada por mutação (s) indicada (s).

Os substratos para sacarificação foram preparado por dissolução de 230 g DE 10 maltodextrina seca por pulverização, preparada de amido de milho comum, em 460 ml de água deionizada fervente e ajustando a substância seca em aproximadamente 30% p/p. O pH foi ajustado a 4,7 (medido a 60°C) e as alíquotas do substrato correspondentes para 15 g de peso seco, foram transferidas a frascos de 50 ml de vidro de tampa azul.

Os frascos foram então colocados em um banho de água agitada equilibrada a 60°C, e as enzimas adicionadas. O pH foi reajustado a 4,7 onde necessário. Amostras de 2 ml foram tomadas periodicamente, o pH ajustado a cerca de 3,0, e então aquecido em um banho de água fervente durante 15 minutos para inativar as enzimas. Após o resfriamento, as amostras foram tratadas com aproximadamente 0,1 g de resina de troca de íons de leito misto (BIO-Rad 501 X8 (D)) durante 30 minutos em um misturador rotativo para remover sais solúveis N. Após a filtração, a composição de carboidratos foi determinada por HPLC. Após 72 horas, os seguintes resultados foram obtidos: α-Amilase adicionada %DP, %DP2 %DP3 % DP4 Nenhuma (controle) 96,59 2,2 0,3 1,0 V54Y 96,5 2,2 0,4 0,9 A52W + V54Y 96,4 2,2 0,5 0,9 Termamyl 96,3 2,1 0,8 0,8 Comparado com o controle (sem α-amilase ativa presente durante a liquefação), a presença das variantes α-amilase ativas V54Y e A52W+V54Y não conduziu a níveis de panose elevados (DP3).

Se estas variantes de α-amilase são usadas para liquefação de amido, não será necessário inativar a enzima antes do começo de sacarificação. EXEMPLO 7 Avaliação de variantes de B. licheniformis sob condições de liquefação simuladas O processo padrão para liquefação de amido industrial compreende dois estágios, normalmente referidos como liquefação primária e secundária. No primeiro estágio, uma suspensão de amido de 30-40% p/p a pH 5,5-6,0, para qual foi adicionada uma α-amilase termoestável de B. licheniformis ou B. stearothermophillus, é aquecida a 105-110°C em um cozedor de jato onde o vapor vivo é injetado dentro da corrente de amido.

Após de um tempo de manutenção de 5-10 minutos sob pressão a esta temperatura, a amido liqüefeito é destilado instantaneamente e resfriado a cerca de 95°C e mantido nesta temperatura durante 60-120 minutos. A fim de avaliar as quantidades pequenas de enzima em uma escala de laboratório o seguinte processo de teste foi usado: Alíquotas de 10 g de uma suspensão de amido de milho comum (Cerestar GL 3406) em água deionizada (aproximadamente 30% p/p) são pesadas em frascos cônicos de 100 ml (Schott GL 125) que são providos com tampas de roscas de ajustes apertados. O pH, o nível de cálcio e a dosagem de enzima na suspensão podem ser variados. 4 frascos são usados par cada conjunto diferente de condições experimentais. Os frascos são colocados em um banho de óleo de agitação (Heto VS 01) mantida a 105°C. Após um período de 7 minutos, o óleo frio é despejado dentro do banho para abaixar a temperatura a 95°C. Para cada série experimental, os frascos são removidos após 20, 40, 60 e 90 minutos e imediatamente resfriados sob água corrente. Uma gota de IN HC1 é adicionada ao frasco para inativar a enzima. A reação é monitorada medindo o DE (reduzindo o teor de açúcar expresso como glicose) usando o processo Neocuproine.

Os detalhes deste processo podem ser encontrados em "Determination of reducing sugar with improved precision". Dygert, Li, Florida e Thomas, Anal Bichem, 13,368 (1965).

Os seguintes DEs foram registrados após 90 minutos. 7 REFERÊNCIAS CITADAS

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LISTAGEM DA SEQUÊNCIA

Nas seguintes SEQ. ID. NO.: 1, 3, 5, a sequência de codificação 5' e sequência 3' de genes de α-amilase relevantes são ilustradas. A sequência 5' é a primeira parte da sequência da sequência escrita com as letras minúsculas, a sequência de codificação é a parte intermediária da sequência, onde a sequência de sinal é escrita com letras minúsculas e a sequência codificando a α-amilase madura é escrita com letras maiúsculas, e a sequência 3' é a terceira parte separada escrita com letras minúsculas. SEQ ID No. 1 cggaagattggaagtacaaaaataagcaaaagattgtcaatcatgtcatgagccatgcgg- gagacggaaaaatcgtctta atgcacgatatttatgcaacgttcgcagatgctgctgaa- gagattattaaaaagctgaaagcaaaaggctatcaattggt aactgtatctcagcttga- agaagtgaagaagcagagaggctattgaataaatgagtagaagcgccatatcggcgcttttc ttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatacaacatc- atatgtttcacattgaaa ggggaggagaatc atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttctt- gctgc ctcattctgcagcagcggcgGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTT- GAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAA CATTGGAGGCGTTTGCAAAACGACTCGGCATAT- TTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAA GGGAACGAGC- CAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAG- GGACGGTTC GGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTC- ATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGAT GTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGA- TGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCG CGTAATTT- CAGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATA- CAGCGATTTTA AATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAA- GCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAG GCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAATGAA- AACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGA TGTCGCAG- CAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGGTTTCCGTCTT- GATGCTGTCA AACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGA- AAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCT GAATATTGGCAGAAT- GACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCC GCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAG- GAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTT CCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCG- ATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAA ACATGGTTTAAG- CCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGG- GATATGTA CGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAAT- TGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGT ATGCGTACGGAGCAC AGCATGATTATTTCGAC - CACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCA AATTCAGGTTTGC- CGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCA- AAACGCCGGTGA GACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCA- ATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACG GCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAA- GATAG aagagcagagaggacggatttcctgaaggaaatccgtttttttatttt SEQ ID No. 2 ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITAV

WIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTK

GELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEV

DPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHF

DGTDWDESRKLNRIYKFQGKAWDWEVSNENGNYDYLMYAD

IDYDHPDVMEIKRWGTWYANELQLDG FRL DAVKHIKFS F

LRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFN

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GLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIY SEQ ID No. 5 aaattcgatattgaaaacgattacaaataaaaattataatagacgtaaacgttcgagggt- ttgctccctttütactcttt ttatgcaatcgtttcccttaattttttggaagccaaacc- gtcgaatgtaacatttgattaagggggaagggcatt gtgct aacgtttcaccgcatcattcgaaaaggatggatgttcctgctcgcgtt- tttgctcactgtctcgctgttctgcccaacag gacagcccgccaaggctGCCGCACCGT- TTAACGGCACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACG TTATC-G- ACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTG- CCGCCCGCTTACAA AGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTA- TGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCC GCACAAAATACGGAACAAAAGCTC- AATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGAT GTC- GTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCG- TCCGACCGCAACCA AGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGA- TTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTA AGTGGCGCTGGTACCATTTTG- ACGGCGTTGATTGGGACGAAAGCCGAAAATTGAGCCGCATTTACAAATTCCGCGGCATC GGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACGGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTAT- GCCGACCTTGATATGGATCA TCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATG- GTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATG CCGTCAAGCATATTAAGT- TCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACC GTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAGAC- GGAACGATGTCTTTGTTTGA TGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGG- GGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTC TCATGAAAGATCAAC- CGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGG GTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGG- CAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGA CTATTATGGCATTCCACAATATAACAT- TCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATG CTTACG- GAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGGCA- CTGAAAAACCAGGA TCCGGACTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAA- TGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGT GTTCTATGACCTTACCGGCAACCGGAG- TGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCG GTT- CGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACCGTTTCTACCATCGCTCGGCCGATCACAA- CCCGACCGTGGACTGGT GAATTCGTCCGTTGGACCGAACCACGGTTGGTGGCATGGCCTTGA tgcctgcga SEQ ID No. 6 AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITA

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31 NTADQKYCGG TWQGIIDKLD YIQGMGFTAI

61 WITPVTAQLP QTTAYGDAYH GYWQQDIYSL

91 NENYGTADDL KALSSALHER GMYLMVDWA

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181 DVVKNEWYDW VGSLVSNYSI DGLRIDTVKH

211 VQKDFWPGYN KAAGVYCIGE VLDGDPAYTC

241 PYQNVMDGVL NYPIYYPLLN AFKSTSGSMD

271 DLYNMINTVK SDCPDSTLLG TFVENHDNPR

301 FASYTNDIAL AKNVAAFIIL NDGIPIIYAG

331 QEQHYAGGND PANREATWLS GYPTDSELYK

361 LIASANAIRN YAISKDTGFV TYKNWPIYKD

391 DITIAMRKGT DGSQIVTILS NKGASGDSYT

421 LSLSGAGYTA GQQLTEVIGC TTVTVGSDGN

451 VPVPMAGGLP RVLYPTEKLA GSKICSSS

Claims (17)

1. Variante de uma α-amilase semelhante a Termamyl originária, caracterizada pelo fato de que a variante tem atividade α-amilase e demonstra melhorada estabilidade de enzima em baixo pH ou sensibilidade de cálcio diminuída com relação à referida ot-amilase originária, a referida variante compreendendo múltiplas mutações correspondentes às seguintes mutações: í) SEQ ID NO:2 apresentando as mutações: H156Y + AI8IT + A209V; ii) SEQ ID NO:2 apresentando as mutações: H156Y+ A181T + N190F + A209V + Q264S; iii) aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO:4 fundidos com os aminoácidos 36-483 de SEQ ID NO:2 e que ainda apresenta as mutações: H156Y + A181T + A209V; iv) aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO:4 fundidos com os aminoácidos 36-483 de SEQ ID NO:2 e que ainda apresenta as mutações: Η156'Y + A i 81T + N190F + A209V; v) aminoácidos 1-33 de SEQ ID NÜ:4 fundidos com os aminoácidos 36-483 de SEQ ID NO:2 e que ainda apresenta as mutações: Η156'Y + A181T + N190F + A209V + Q264S.

2. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de DNA codificando uma variante de a-amilase conforme definida na reivindicação l *

3. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de transportar uma construção de DNA conforme definida na reivindicação 2,

4. Célula de bactéria ou fungo, caracterizada pelo fato de ser transformada com uma construção de DNA conforme definida na reivindicação 2 ou um vetor conforme definido na reivindicação 3.

5. Célula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser uma bactéria gram-positiva como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefadens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus ou Bacillus thuringiensis.

6. Uso de uma variante de α-amilase, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na lavagem e/ou lavagem de louça.

7. Uso de uma variante de α-amilase, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a remoção de cola de têxteis.

8. Uso de uma variante de α-amilase, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a liquefação de amido.

9. Aditivo detergente, caracterizado pelo fato de compreender uma variante de α-amilase conforme definida na reivindicação 1, opcionalmente na forma de um granulado não pulverulento, líquido estabilizado ou enzima protegida.

10. Aditivo detergente, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de conter 0,02-200 mg de proteína de enzima/g de aditivo.

11. Aditivo detergente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente outra enzima como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.

12. Composição detergente, caracterizada pelo fato de compreender uma variante de α-amilase conforme definida na reivindicação 1.

13. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente outra enzima como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.

14. Composição detergente para lavagem de louça automática ou manual, caracterizada pelo fato de compreender uma variante de a- amilase, conforme definida na reivindicação 1.

15. Composição detergente para lavagem de louça, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente outra enzima como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, outra enzima amilolítica e/ou uma celulase.

16. Composição para lavagem de roupas automática ou manual, caracterizada pelo fato de compreender uma variante de a-amilase como definida na reivindicação 1.

17. Composição para lavagem de roupas, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender outra enzima como uma protease, uma lipase, uma peroxidase, uma enzima amilolítica e/ou uma celulase.