CN102186965B - 酿造方法 - Google Patents

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Abstract

一种产生麦芽汁的方法，包括下述步骤：将谷物与水混合，添加脱支酶，其中所述脱支酶在64℃，pH5.0，10分钟的时间具有60％以上的酶活性，将所述混合物在58-68℃静置10-40分钟的时间，将所述混合物在72-80℃静置5-20分钟的时间，和将麦芽汁与固体组分分离。

Description

酿造方法
技术领域
本发明涉及用于生产麦芽汁(Brewer’s wort)和用于产生啤酒的包括缩短的糖化过程(mashing regime)的方法。
背景技术
酿造方法在本领域中公知，并且通常包括发麦芽(malting)、糖化(mashing)和发酵的步骤。糖化是将来自发芽谷粒和固体辅料的淀粉转化成可发酵和不可发酵的糖，从而产生具有所需组成的麦芽汁的方法。糖化方法在不同温度进行一段时间，以活化负责降解蛋白质和糖的内源酶。至今为止，糖化中带来的最重要的变化是将淀粉分子转化成可发酵糖。然而，带来该转化的酶具有不同的最适温度，且必需将醪(mash)加热至所述酶效用最佳的不同温度。
在给定温度所述酶需要一定时间间隔来适当反应，该时间通常称作例如酶静置(enzyme rest)(糖化静置)。这些酶静置耗费时间，且趋于在酿造方法中造成瓶颈，从而对于最大效率和成本效益的糖化方法而言，酶静置时间应尽可能地短。
然而，在糖化中淀粉降解的效力取决于例如酶静置的时间和温度，淀粉本身(类型，麦芽度等)和醪中淀粉降解酶的水平和活性。当淀粉达到糊化温度，即当淀粉对于淀粉酶而言是完全可接近的温度，通常约58-62℃时，淀粉水解进展非常迅速。在此温度，α-淀粉酶相对稳定，而β-淀粉酶和脱支酶如普鲁兰酶最为热不稳定并开始失活。因此，糖化方法一般采用受控的逐步温度增加，其中每一步相对于其它酶来说有利于一种酶作用，最终降解蛋白质、细胞壁和淀粉。因此，在酿造中，糖化是非常耗费时间的步骤。大多数糖化方法耗费至少90分钟，并包括在约45-52℃，约62℃和约72℃的静置。
温度和酶静置长度的组合影响麦芽汁中可发酵糖对不可发酵糖的比例并因此影响麦芽汁的可发酵性和发酵饮料的最终味道和芳香(aroma)。
WO2005121305描述了糖化方法，其中添加酶α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和异淀粉酶的组合以产生可发酵为低糖饮料的麦芽汁。
WO2007144393描述了用于产生其中普鲁兰酶添加至醪的麦芽汁。
Gregor等(Journal of Cereal Science,Vol.29,161-169页,1999)描述了糖化方法中淀粉转化酶α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶的相互作用。
Odibo和Obi1989,Mircen Journal,5(2)187-192公开了从高粱麦芽制备醪的方法，包括添加热稳定性微生物普鲁兰酶。总糖化时间为126分钟。
存在对改善的方法的需求，由此为了效率和成本利益，糖化时间尽可能地短。
发明内容
本发明人令人惊讶地发现通过添加热稳定性脱支酶，可缩短或消除在糖化过程中的酶静置，从而使得产生麦芽汁的方法明显更快。因此，本发明提供了一种用于产生麦芽汁的方法，包括下述步骤：
a)将谷物(grist)与水混合，
b)添加脱支酶，其中所述脱支酶在64℃，pH5.0，10分钟的时间具有60%以上的酶活性，
c)将所述混合物在58-68℃静置10-40分钟的时间，
d)将所述混合物在72-80℃静置5-20分钟的时间，和
e)将麦芽汁与固体组分分离。
本发明还涉及由本发明方法产生的麦芽汁或啤酒。本发明还涉及根据本发明的酶在任何本发明的方法中的用途。
除了缩短糖化过程之外，本发明的酶还可添加至用于产生具有高可发酵糖量的麦芽汁的方法中。
因此本发明还涉及产生麦芽汁的方法，包括下述步骤：
a)将谷物与水混合，其中所述谷物包含至少50%麦芽，
b)添加脱支酶，其中所述脱支酶在64℃，pH5.0，10分钟的时间具有60%以上的酶活性，并将所述混合物在58-68℃静置，
c)将温度增加至72-80℃，并将所述混合物在72-80℃静置，和
d)将麦芽汁与固体组分分离，
其中麦芽汁中可发酵糖的量多于可溶性碳水化合物的75%。
本发明还涉及从50-100%麦芽和0-50%含淀粉的辅料(adjunct)制备的麦芽汁，其中可发酵糖的量高于可溶性碳水化合物的75%，或由本发明的方法产生的麦芽汁，其中麦芽汁中可发酵糖的量为可溶性碳水化合物的至少75%。
定义
在整个该公开中，使用了本领域普通技术人员一般理解的多个术语。一些术语更加宽泛地描述于“发明详述”中。下面给出一些频繁使用的术语的简短定义。
在本上下文中，“酶静置”或简称为“静置”或“放置”是一段时间或时间间隔，其中将谷物和水和任选的辅料的混合物保持在一定温度，以供酶(内源酶和任选的外源酶)作用于淀粉。
如本文中使用的术语“谷物”理解为含有糖的材料，其为啤酒生产的基础，例如，大麦麦芽和辅料。
将术语“麦芽”理解为任何发芽的谷类谷粒(malted cereal grain)，特别是大麦。
将术语“麦芽汁”理解为糖化过程中提取谷物后的未发酵的液体流出物(liquor run-off)。
将术语“啤酒”理解为发酵的麦芽汁。
术语“同一性”是两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends in Genetics16:276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：
(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上)确定。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：
(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
发明详述
在酿造方法中，糖化条件，如温度、pH和酶量以及这些酶作用于淀粉(例如酶静置)的时间对发酵结果具有巨大影响。在啤酒酿造中，产生的啤酒的类型高度依赖于酶静置的长度和温度。
糖化
本发明人现已令人惊讶地发现通过使用热稳定性脱支酶可缩短或消除糖化中的酶静置。因此本发明的第一个方面涉及制备麦芽汁的方法，包括下述步骤：
一种产生麦芽汁的方法，包括下述步骤：
a)将谷物(grist)与水混合，
b)添加脱支酶，其中所述脱支酶在64℃，pH5.0，10分钟的时间具有60%以上的酶活性，
c)将所述混合物在58-68℃静置10-40分钟的时间，
d)将所述混合物在72-80℃静置5-20分钟的时间，和
e)将麦芽汁与固体组分分离。
在一个实施方案中，温度在20分钟内从步骤c)增加至步骤d)。
在另一个实施方案中，步骤b)-d)在30-70分钟之内完成。
温度曲线(temperature profile)
本发明人发现添加热稳定性脱支酶减少了糖化中酶静置的长度，和/或消除了所需的酶静置的量，由此可观地减少了总体糖化时间。
在本发明中，根据本发明第一个方面的方法的步骤c)的温度优选实施为58-68℃，如59-67℃，如60-66℃，如61-65℃，如62-64℃，如63-64℃，优选温度为63-65℃如64℃。
所述混合物(其为与水混合的谷物)，在选自上述温度间隔的温度静置10-40分钟，如11-39分钟，如12-38分钟，如13-37分钟，如14-36分钟，如15-35分钟，如16-34分钟，如17-33分钟，如18-32分钟，如19-31分钟，如20-30分钟，如21-29分钟，如22-28分钟，如23-27分钟，如24-26分钟，如25-26分钟的时间。在一个优选实施方案中，所述混合物静置15-35分钟，在一个更优选的实施方案中，所述混合物静置20-30分钟，在一个甚至更优选的实施方案中，所述混合物静置25-30分钟，在一个最优选的实施方案中，所述混合物静置15-30分钟。
在根据本发明第一个方面的方法中，步骤c)至步骤d)的温度优选以1℃/分钟增加。因此在一个实施方案中，所述温度在20分钟之内，如在19分钟之内，如在比18分钟之内，如在17分钟之内，如在16分钟之内，如在15如在14分钟之内，如在13分钟之内，如在12分钟之内，如在11分钟之内，如在10分钟之内，如在9分钟之内，如在8分钟之内，如在7分钟之内，如在6分钟之内，如在5分钟之内，如在4分钟之内从步骤c)增加至步骤d)。
在步骤d)中，所述混合物在72-80℃，如73-79℃，如74-78℃，如75-78℃，如76-78℃，优选如77-78℃的温度静置5-20分钟的时间，如6-19分钟的时间，如7-18分钟的时间，如8-17分钟的时间，如9-16分钟的时间，如10-15分钟的时间，如11-14分钟的时间，如12-13分钟的时间，如10-20分钟，优选在该温度静置10-15分钟的时间。
可将所述糖化方法分为三部分：预糖化(mashing in)，其中将磨制的谷物填充于容器并与水混合；糖化，其中内源和外源供应的酶降解淀粉；和后糖化(mashing out)，其中提升温度并将混合物转移至滤桶(lauter tun)。
因此在本发明的一个目标中，根据本发明的第一个方面的方法的糖化，即步骤b)-d)在30-70分钟之内，如31-69分钟之内，如32-67分钟之内，如33-66分钟之内，如34-65分钟之内，如35-64分钟之内，如36-63分钟之内，如37-62分钟之内，如38-61分钟之内，如39-60分钟之内，如40-59分钟之内，如41-58分钟之内，如42-57分钟之内，如43-56分钟之内，如44-55分钟之内，如45-54分钟之内，如46-53分钟之内，如47-52分钟之内，如48-51分钟之内，如49-50分钟之内完成。在一个特别优选的实施方案中，糖化在70分钟之内，更优选60分钟之内，更优选50分钟之内，甚至更优选40分钟之内或更优选30分钟之内完成。
因此在该上下文中，糖化时间包括所有的酶静置和所有加热步骤，如本发明产生麦芽汁的方法的所有步骤b)-d)在上述限定的该期间之内完成。
在某个方面，根据本发明第一个方面的方法在30-70分钟之内完成。换言之，所有步骤a)-e)在30-70分钟之内，如40-60分钟，如60分钟之内，如50分钟之内和如45分钟之内完成。
因此根据本发明的一个具体方面，无需45-52℃的静置。
在该上下文中，在糖化方法中消耗的时间与总糖化时间和完成本发明方法的所有糖化步骤例如步骤b)-d)所需的时间相同。糖化曲线(mashing profile)、糖化、糖化过程、糖化时间和糖化方法可互换使用。
热稳定的
在该上下文中，热稳定的酶是在64℃和pH水平5在10分钟之后具有60%以上酶活性的酶。
在一个实施方案中，在64℃，pH5.0，在10分钟的时间所述酶活性为60%以上，如61%以上，如62%以上，如63%以上，如64%以上，如65%以上，如66%以上，如67%以上，如68%以上，如69%以上，如70%以上，如71%以上，如72%以上，如73%以上，如74%以上，如75%以上，如76%以上，如77%以上，如78%以上，如79%以上，如80%以上，如81%以上，如82%以上，如83%以上，如84%以上，如85%以上，如86%以上，如87%以上，如88%以上，如89%以上，如90%以上，如91%以上，如92%以上，如93%以上，如94%以上，如95%以上，如96%以上，如97%以上，如98%以上，如99%以上和甚至100%。
在本发明一个具体实施方案中，所述酶在64℃和pH水平5.6-6.2在醪中10分钟之后，具有最少80%的活性，如85%以上，如90%以上如95%以上，或甚至100%的活性。应注意在糖化过程中醪的pH的范围是5.6-6.2。更具体而言，其范围为5.6至5.8。
在另一个实施方案中，所述酶在大麦麦芽的糊化温度10分钟之后具有至少80%的活性，如85%以上，如90%以上如95%以上或甚至100%的活性。
谷物
根据本发明，所述谷物可包含任何可从任何植物和植物部分包括块茎、根、茎、叶和种子获得的淀粉。优选所述谷物包含谷粒(grain)如来自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、买罗高粱(milo)、黍(millet)和高粱的谷粒，且更优选地，麦芽汁的谷物的至少50%，如至少60%，如至少70%，如至少80%，如至少90%或甚至100%(w/w)来源于谷粒。
根据本发明第一个方面的谷物包含含淀粉的发芽谷粒和/或辅料。所述谷物可优选包含0%至100%，优选20%至100%，优选30%至100%，更优选40%至100%，甚至更优选50%至100%，还更优选60%至100%，如70%至100%，如80%至100%或甚至最优选90%至100%的发芽谷粒。在一个具体实施方案中，所述谷物包含至少50%发芽谷粒，例如发芽大麦，和大约50%辅料，例如未发芽谷粒如未发芽大麦，在另一个实施方案中，所述谷物包含至少60%发芽谷粒，还在另一个实施方案中，所述谷物包含至少70%发芽谷粒，在一个具体实施方案中，所述谷物包含至少80%发芽谷粒，或甚至更优选地所述谷物包含至少90%发芽谷粒或甚至更优选地所述谷物包含至少95%发芽谷粒，且在某些优选实施方案中所述谷物包含100%发芽谷粒。100%发芽在该上下文中是指“全部发芽”。因此全麦芽醪是包含100%发芽谷粒的醪。根据本发明使用的谷粒可为任何谷粒，且优选为选自如下发芽谷粒：发芽的大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻，且最优选发芽的大麦。在本发明的一个实施方案中，使用预糊化的淀粉，如来自大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻的预糊化淀粉。
用于本发明方法中的谷粒可由修饰手段修饰，至所述谷粒中的淀粉分子由简单链糖分子而非支化链糖分子组成的程度，完全修饰的谷粒仅含有简单链淀粉分子。未经完全修饰的谷粒需要在多步骤中糖化以供脱支酶作用于分支。因此在本发明的一个方面，所述谷物包含良好修饰的发芽谷粒。
麦芽
发麦芽是谷类谷粒(cereal grain)萌发的过程，其通常通过将所述谷粒浸于水中来起始。该过程可通过用热空气的干燥加热来停止。因此术语“麦芽”理解为任何发芽的谷类谷粒，根据本发明使用的发芽的谷粒可为任何发芽的谷粒，且优选为选自发芽的大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻的发芽谷粒，且最优选发芽的大麦。
麦芽的良好品质会给酿造者提供高水平的提取物，并产生容易通过酵母发酵的麦芽汁。
因此在本发明的一个实施方案中，起始材料为全麦芽醪，在该上下文中是100%发芽的谷粒。
辅料
将辅料理解为谷物并非发芽谷粒的部分。所述辅料可包含任何富淀粉植物材料，例如未发芽的谷粒，如大麦、稻、玉米、小麦、黑麦、高粱和容易发酵的糖和/或糖浆。用于第一个方面的方法中的辅料可从块茎、根、茎、叶、豆类、谷类和/或全谷粒获取。辅料可包含含粗淀粉和/或精制淀粉和/或糖的材料，其来源于植物像小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、买罗高粱、黍、高粱、马铃薯、甘薯(sweet potato)、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、西米(sago)、香蕉、糖甜菜和/或甘蔗。优选地，辅料包含未发芽的谷粒，例如选自下组的未发芽谷粒：大麦、小麦、黑麦、高粱、黍、玉米和稻，且最优选未发芽的大麦。
RDF
在本发明的一个实施方案中，将本发明的热稳定的脱支酶添加于用于产生麦芽汁的方法，其中起始材料为具有至少50%麦芽的谷物，且产生的麦芽汁中的可发酵糖为至少75%可发酵糖。
因此本发明的另一个方面涉及一种方法，包含下述步骤：
a)将谷物与水混合，其中所述谷物包含至少50%麦芽，
b)添加脱支酶，其中所述脱支酶在64℃，pH5.0，10分钟的时间具有60%以上的酶活性，并将所述混合物在58-68℃静置，
c)将温度增加至72-80℃，并将所述混合物在72-80℃静置，和
d)将麦芽汁与固体组分分离，
其中麦芽汁中可发酵糖的量为多于可溶性碳水化合物的75%。
可发酵糖和不可发酵糖
在糖化循环过程中，首先将淀粉溶解，然后将一部分淀粉分子水解为不可发酵的糊精和酿造酵母可发酵为乙醇的低分子量糖如葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。不可发酵的或极限糊精级分是比麦芽三糖具有更高聚合度(DP)的糖，其为DP4或更高。在糖化方法过程中，糊精通过β-淀粉酶水解为可发酵糖，所述β-淀粉酶从糊精的非还原端顺序去除麦芽糖单元。然而，(1→6)-α支化点耐受淀粉酶的攻击，而这些支化点需由脱支酶(极限糊精)如普鲁兰酶、极限糊精酶和异淀粉酶水解。
DP是聚合度，本文中用于多糖水解物中聚合物中葡萄糖单元的平均数。因此DP1-3糖根据本发明是可为葡萄糖(DP1)、麦芽糖(DP2)或麦芽三糖(DP3)的可发酵糖，而例如糊精(DP4)是不可发酵(或非可发酵)糖。
RDF(发酵实际程度)计算为RDF%=100*(OE%P-ER%)/OE%P，而OE意指以%P表示的起始提取物，而ER意指由密度计(Analytica EBC参照)测量的实际提取物%P。
根据本发明，麦芽汁中可发酵糖的量为多于75%的可溶性碳水化合物，如至少76%，如至少77%，如至少78%，如至少79%，如至少80%，如至少81%，如至少82%，如至少83%，如至少84%，如至少85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少91%，如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%，如至少100%。
一些酿造厂将酿造糖浆(brewery syrup)，例如高麦芽糖酿造糖浆添加至煮麦芽汁锅(wort kettle)中，其可增加可发酵糖的量。然而，尽管根据本发明可添加酿造糖浆，对于增加可发酵糖的量或RDF这并非必需的。
在糖化方法过程中，淀粉转化为包含可发酵和不可发酵糖的麦芽汁。根据本发明，可显著地缩短糖化方法，并使得酿造厂能够使用非常简单的糖化曲线而不降低麦芽汁中的可发酵性。举例而言，不再需要在45-52℃的糖化步骤来产生其中可发酵糖量多于可溶性碳水化合物的75%的麦芽汁。
本发明人还发现本发明的热稳定的脱支酶可用于产生麦芽汁的方法，其中麦芽汁中可发酵糖的量多于75%的可溶性碳水化合物，其中所述方法包括下述步骤：
a)将谷物与水混合，其中所述谷物包含至少50%的麦芽，
b)添加热稳定的脱支酶，
c)将所述混合物在58-68℃静置10-40分钟的时间，
d)将温度增加至72-80℃，
e)将所述混合物在72-80℃静置5-20分钟的时间，和
f)将麦芽汁与固体组分分离。
其中麦芽汁中可发酵糖的量多于可溶性碳水化合物的75%。
重要的是，本发明的方法涉及通过减少或消除酶静置所需的时间来缩短糖化过程，并且产生包含高可发酵糖量的麦芽汁。
因此，根据本发明，缩短糖化时间并未减少麦芽汁的可发酵性，也就是说，麦芽汁中可发酵糖的量与不可发酵糖的量相比是高的。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述方法产生具有相对于葡萄糖的高量麦芽糖的麦芽汁。这是有利的，因为其阻止了对酵母的渗透压，并调节酯产生，并因此调节最终啤酒的味道和芳香概貌。
因此本发明的另一个实施方案涉及方法，其中麦芽汁中麦芽糖:葡萄糖的比例高于2:1，如高于2.5:1，如高于3:1，优选高于3.2:1，优选高于3.3:1，优选高于3.4:1，优选高于3.5:1，在一个特别优选的实施方案中，麦芽汁中麦芽糖:葡萄糖的比例高于3.3:1。
在另一个实施方案中，本发明涉及从50-100%麦芽和0-50%含淀粉辅料制备的麦芽汁，其中可发酵糖的量高于可溶性碳水化合物的75%，优选高于80%，且其中麦芽糖:葡萄糖比例高于2.5:1，优选高于3.3:1。
又一个实施方案涉及由本发明方法产生的麦芽汁，其中麦芽汁中的可发酵糖为可溶性碳水化合物的至少75%。
脱支酶
在本发明的一个优选实施方案中，外源提供普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)酶活性并使其存在于醪中。可在形成醪之前、过程中或之后将普鲁兰酶添加于醪成分，例如水和/或谷物。可将另一种酶添加至醪，所述酶选自下组：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)和/或葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、异淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、非汀(phytin)和酯酶。
然而，本发明人令人惊讶地发现本发明的方法例如短糖化可仅用本发明的脱支酶实施。因此在本发明的一个方面仅将脱支酶添加至醪。
本发明的脱支酶包括异淀粉酶和普鲁兰酶。脱支酶，其攻击胶淀粉(amylopectin)，可分为两类：分别为异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)和普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解胶淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-葡糖苷分支键(branch linkage)，并可因异淀粉酶不能攻击支链淀粉(pullulan)，以及对α-极限糊精的有限作用来与普鲁兰酶相区分。
普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)
最优选所述普鲁兰酶来源于酸解支链淀粉芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)。待用于本发明方法和/或组合物中的优选普鲁兰酶是具有与SEQ ID NO:1中所示的序列至少50%，如至少55%，如至少60%，如至少65%，如至少66%，如至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少91%，如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%或甚至100%相同的氨基酸序列的普鲁兰酶；特别是当使用Needle程序使用矩阵：BLOSUM62；缺口起始罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.5；无缺口同一性矩阵时如此。
用于本发明的方法中的普鲁兰酶优选为来自例如火球菌属(Pyrococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)菌种，如酸解支链淀粉芽孢杆菌(例如，FEMSMicrobiol.Letters115:97-106中所描述的)或Bacillus deramificans，或长野芽孢杆菌(Bacillus naganoencis)的普鲁兰酶。所述普鲁兰酶也可是来自例如芽孢杆菌属菌株的工程改造的普鲁兰酶。
优选用于本发明的方法的其它普鲁兰酶包括：Bacillus deramificans(美国专利5,736,375号)，或普鲁兰酶可来源于PCT/DK91/00219中描述的沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)，或者普鲁兰酶可来源于PCT/DK92/00079中描述的闪烁杆菌属菌种Ven5(Fervidobacterium sp.Ven5)，或者普鲁兰酶可来源于PCT/DK95/00097中描述的速生热球菌(Thermococcus celer)，或者普鲁兰酶可来源于PCT/DK95/00211中描述的Pyrodictium abyssei，或者普鲁兰酶可来源于PCT/DK95/00095中描述的Fervidobacterium pennavorans，或者普鲁兰酶可来源于PCT/DK95/00098中描述的Desulforococcus mucosus。
所述普鲁兰酶是以0.1至3PUN/g DM，如0.2至2.9，如0.3至2.8，如0.3至2.7，如0.3至2.6，如0.3至2.5，如0.3至2.4，如0.3至2.3，如0.3至2.2，如0.3至2.1，如0.3至2.0，如0.3至1.9，如0.3至1.8，如0.3至1.7，如0.3至1.6的剂量添加，最优选普鲁兰酶是以如0.3至1.5，优选0.4至1.4，更优选0.5至1.3，更优选0.6至1.2，更优选0.7至1.1，更优选0.8至1.0，更优选0.9至1.0的剂量添加。在本发明的一个具体实施方案中，所述酶以0.3PUN/g DM，如0.4PUN/g DM，如0.5PUN/g DM添加。在本发明的一个特别优选的实施方案中，酶剂量不大于1PUN/g DM。
异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)
本发明方法和/或组合物中应用的另一种酶可为另一种脱支酶，如异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。异淀粉酶可为微生物的。异淀粉酶水解胶淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-葡糖苷分支键，并可因异淀粉酶不能攻击支链淀粉(pullulan)，以及对α-极限糊精的有限作用来与普鲁兰酶相区分。异淀粉酶可以以本领域技术人员公知的有效量添加。异淀粉酶可以单独添加或与普鲁兰酶一起添加。
任选的酶
α-淀粉酶(EC3.2.1.1)
α-淀粉酶酶还可为外源、微生物的，并添加于本发明的方法和/或组合物。α-淀粉酶可为芽孢杆菌属α-淀粉酶。公知的芽孢杆菌属α-淀粉酶包括源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株的α-淀粉酶。在本发明的上下文中，涵盖的芽孢杆菌属α-淀粉酶是WO99/19467第3页第18行至第6页第27行中所定义的α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶具有氨基酸序列，其与WO99/19467中SEQ ID NO:4具有至少90%，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者特别是至少99%同一性。最优选的产麦芽糖α-淀粉酶是WO99/43794中公开的SEQ ID NO:9或包括其变体。涵盖的变体和杂合体在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中描述。特别涵盖的是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其具有WO99/19467中SEQID NO:3所公开的氨基酸序列及突变：I181*+G182*+N193F。芽孢杆菌属α-淀粉酶可以以1.0-1000NU/kg DS，优选2.0-500NU/kg DS，优选10-200NU/kg DS的量加入。本发明的方法使用的另一种特定的α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶。例如，源自曲霉属(Aspergillus)菌种的α-淀粉酶，并且优选来自黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株。特别涵盖的是与WO2002/038787中SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列显示高同一性，即至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%或者甚至至少90%同一性的真菌α-淀粉酶。真菌α-淀粉酶可以以1-1000AFAU/kg DS，优选2-500AFAU/kg DS，优选20-100AFAU/kg DS的量加入。
葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)
可用于本发明方法中的葡糖淀粉酶可来源于微生物或植物。优选的是真菌来源的葡糖淀粉酶如曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)。还优选其变体，如WO92/00381和WO00/04136中公开的；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)或其变体或片段。优选的葡糖淀粉酶包括来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶，如与WO00/04136中所述的氨基酸序列具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%同源性的葡糖淀粉酶和SEQ ID NO:13。还优选来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，如与WO00/04136SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或甚至90%同源性的葡糖淀粉酶。其它优选的葡糖淀粉酶包括包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利Re.32,153号)、杜邦踝节菌(Talaromycesduponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利4,587,215号)的葡糖淀粉酶，梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。商业上可获得的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER、SAN EXTRA L和AMGTME(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。葡糖淀粉酶活性可以以0.1至100000AGU/kg DS的量，优选以1至10000AGU/kg DS的量，更优选以10至1000AGU/kg DS的量，如100至500AGU/kg DS的量使用。葡糖淀粉酶可以以0.001mg至100000mgEP/kg DS的量，优选以0.01mg至10000mg EP/kg DS的量，更优选以0.1mg至1000mg EP/kg DS的量，最优选以1mg至100mg EP/kg DS的量添加。
蛋白酶
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，通过在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。
蛋白酶负责在醪中将全长的高分子量蛋白降解成低分子量蛋白。低分子量蛋白对于酵母的营养是必需的，而高分子量蛋白保证泡沫稳定性。因此技术人员熟知蛋白酶应该以平衡量加入，同时为酵母提供缓慢(amble)游离氨基酸并且保留足够的高分子量蛋白以使泡沫稳定化。可以以0.1-1000AU/kg DS，优选1-100AU/kg DS并且最优选5-25AU/kg DS的量加入蛋白酶。
纤维素酶(E.C.3.2.1.4)
纤维素酶可以是微生物来源的，如源自丝状真菌(例如，曲霉属、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium))的菌株。纤维素酶的具体实例包括从特异腐质霉(H.insolens)可获得的内切葡聚糖酶(内切葡聚糖酶I)，其还由WO91/17244中图14的氨基酸序列定义，和WO91/17243中所述的43kD特异腐质霉内切葡聚糖酶。
本发明的方法中使用的特定纤维素酶可以是内切葡聚糖酶，如内切-1,4-β-葡聚糖酶。特别涵盖的是WO2003/062409中SEQ ID NO:2中所示的β-葡聚糖酶和同源序列。可以使用的商业上可获得的纤维素酶制备物包括和(可从Novozymes A/S获得)，LAMINEXTM和CP(可从Genencor Int.获得)和7069W(可从Germany获得)。可以以1.0-10000BGU/kg DS，优选10-5000BGU/kg DS，优选50-1000BGU/kg DS和最优选100-500BGU/kg DS的量加入β-葡聚糖酶。
麦芽汁的分离
从醪获得麦芽汁通常包括将麦芽汁与固体组分如酒糟分离，即构成谷物部分的不溶性谷粒和壳材料。可将热水流经所述酒糟以润洗或喷洒任何来自谷物的残余提取物。
在从任何前述第一方面的实施方案的谷物的酒糟分离麦芽汁之后，可按原样(as it is)使用麦芽汁将其脱水以提供浓缩和/或干燥的麦芽汁。浓缩和/或干燥的麦芽汁可用作酿造提取物、用作麦芽提取物调味料、用于非酒精麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷类、用于糖果店等。
啤酒的产生
在一个优选实施方案中，发酵麦芽汁以产生酒精饮料，优选为啤酒例如爱儿啤酒(ale)、烈性爱儿啤酒(strong ale)、苦味酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、Export啤酒、麦芽酒(malt liquor)、大麦酒、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。麦芽汁的发酵可包括向麦芽汁中投入(pitch with)酵母浆料，该浆料包含新鲜酵母(即先前未用于本发明的酵母)或者所述酵母可以是回收的酵母。应用的酵母可以是适于啤酒酿造的任何酵母，特别是选自酵母属菌种(Saccharomyces spp.)的酵母，如酿酒酵母(S.cerevisiae)和葡萄汁酵母(S.uvarum)，其包括这些生物体的天然或人工产生的变体。用于产生啤酒的麦芽汁的发酵方法为本领域的技术人员所熟知的。
本发明的方法可包括向发酵麦芽汁中加入二氧化硅水凝胶(silicahydrogel)，以增加啤酒的胶质稳定性(colloidal stability)。这些方法还可以包括向发酵的麦芽汁中加入硅藻土(kieselguhr)并过滤以使啤酒鲜亮(bright)。
根据本发明的一个方面，提供由第二或第三方面的麦芽汁产生的啤酒，如通过将麦芽汁发酵以产生啤酒而产生的啤酒。啤酒可以是任何类型的啤酒，例如，爱儿啤酒、烈性爱儿啤酒、烈性黑啤酒、钵尔透黑啤酒、陈贮啤酒、苦味酒、Export啤酒、麦芽酒、低麦芽啤酒、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。
实施例
普鲁兰酶活性(PUN)：
一个普鲁兰酶单位(PUN)定义为在pH5柠檬酸盐缓冲液中，在50℃能从支链淀粉底物每分钟形成1微摩尔葡萄糖的酶量。
普鲁兰酶样品和底物(红色支链淀粉)一起温育。内切普鲁兰酶水解支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，释放底物降解产物。使用乙醇将未降解的底物沉淀。在510nm用分光光度法测定释放颜色的量，其与样品中的内切-普鲁兰酶活性成比例。将样品的颜色形成与由普鲁兰酶活性已知的样品产生的颜色形成相比较。
普鲁兰酶是支链淀粉6-葡聚糖-水解酶，酶分类号为E.C.3.2.1.41。
反应条件
温度 50℃±2℃
pH 5.0
底物浓度 0.67%红色支链淀粉
酶浓度 0.04-0.13PUN/mL
反应时间 30分钟
波长 510nm
试剂/底物
氯化钾溶液0.5M
支链淀粉底物2%。供应商为Megazyme,Australia
柠檬酸盐缓冲液0.05M pH5.0
包括25mM半胱氨酸的柠檬酸盐缓冲液0.05M pH5.0
乙醇99.8%
将904PUN/g的普鲁兰酶标准品制备物在柠檬酸盐缓冲液0.05M中稀释成0.05-0.20PUN/ml的标准品稀释液系列。
空白柠檬酸盐缓冲液0.05M
将酶样品在柠檬酸盐缓冲液0.05M中稀释至活性为0.06-0.20PUN/ml，并与标准品稀释液系列比较。
实施例1：
在该实施例中，在64℃15分钟和30分钟之后以及在78℃15分钟之后研究了缩短的糖化过程的糖分布。以1℃/分钟进行了从64℃至78℃的加热，因此在该情况下，在14分钟之内加热醪。在该情况下总糖化时间为在64℃静置30分钟+用14分钟加热至78℃+在78℃静置15分钟，总糖化时间为59分钟。
使用100%良好修饰的麦芽，而使用的酶是具有SEQ ID NO:1的普鲁兰酶。
用于该实施例的普鲁兰酶是具有SEQ ID NO:1的普鲁兰酶，其在t=0分钟(糖化开始)以下面指示的浓度添加。
糖化分布和样品收集
酶剂量：
杯 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PUN/g DM - - - 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.1 0.1 0.1
表2.麦芽汁样品的总糖含量
总糖(g/L) 酶(PUN/g DM)
130.10 空白
130.47 1PUN
131.18 0.5PUN
130.71 0.1PUN
在所有样品中可发酵糖的总量是相同的(78℃/45分钟)(表2)
表3显示非常短的糖化分布的糖分布可通过使用剂量为0.5和1PUN/gdm的普鲁兰酶来增强。获得了普鲁兰酶明显的剂量应答，其可用作工具来引起最终的减弱(which can be used as a tool to stir the final attenuation)。
在糖化过程终止之后收集的麦芽汁样品中的可发酵糖级分改进了8.6%(1PUN/g DM)和4.9%(0.5PUN/g DM)，表3最后一栏。
表3.在短糖化方法中可发酵糖和不可发酵糖
缩写：
DP：聚合度，DP1：葡萄糖，DP2：麦芽糖，DP3：麦芽三糖，DP4：不可发酵糖，如糊精。
PUN：普鲁兰酶单位
空白：未添加酶
所述值以可溶性碳水化合物的总DP的百分比DP表示。
表3显示非常短糖化方法的糖分布。将普鲁兰酶添加于谷物和水的混合物，其中所述混合物具有64℃的温度，将混合物静置30分钟，并在15和30分钟取样。以1℃/分钟将溶液加热至78℃，将混合物在78℃静置15分钟，并在15分钟之后取样。
表3显示当以1和0.5PUN添加普鲁兰酶时，在64℃15分钟之后、在64℃30分钟之后以及在78℃15分钟之后的可发酵糖的量为至少80%。因此其令人惊讶地显示了添加本发明的酶减少了糖化时间，并产生具有高可发酵糖(例如DP1-3)量的麦芽汁。

Claims (9)

1.一种产生麦芽汁的方法，包括下述步骤：
a)将谷物与水混合，
b)添加脱支酶，其中所述脱支酶在64℃，pH5.0，10分钟的时间具有60%以上的酶活性，
c)将所述混合物在58-68℃静置10-40分钟的时间，
d)将所述混合物在72-80℃静置5-20分钟的时间，和
e)将麦芽汁与固体组分分离；
其中，糖化在70分钟之内完成，所述脱支酶为普鲁兰酶，来源于芽孢杆菌属，而且所述普鲁兰酶具有与SEQ ID NO1至少99%或者100%相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的方法，其中温度在20分钟之内从步骤c)增加至步骤d)。
3.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述谷物包含至少50%麦芽。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中麦芽汁中可发酵糖的量多于可溶性碳水化合物的75%。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中步骤b)-d)在30-70分钟之内完成。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述麦芽是大麦麦芽。
7.根据权利要求1的方法，其中所述麦芽汁中可发酵糖的量高于可溶性碳水化合物的80%。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述麦芽汁中麦芽糖:葡萄糖的比例高于2:1。
9.一种产生啤酒的方法，包括产生根据前述任一项权利要求的麦芽汁，并发酵该麦芽汁。
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