CN104718289A - 用于生产啤酒麦芽汁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向一种醪液中添加一种特定的葡糖淀粉酶。此外，本发明涉及一种葡糖淀粉酶和一种α淀粉酶相组合用于生产啤酒麦芽汁的用途。
Description
对序列表的引用
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发明领域
本发明总体上涉及用于生产啤酒麦芽汁(brewers wort)的方法。具体地，本发明涉及用于通过添加一种葡糖淀粉酶来生产啤酒麦芽汁的方法。
发明背素
在现代淀粉糖化(mashing)工艺中，当淀粉糖化麦芽中的酶量低时或为了允许使用所有辅料麦芽粉，常常将酶作为补充剂添加。也可以在具有高酶含量的经良好改性的麦芽的淀粉糖化中使用酶，以增加提取物回收率并且增加可发酵糖的量。
US 3379534描述了通过使用一种淀粉葡糖苷酶来制备一种低糊精啤酒。US 4536477描述了一种热稳定的葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶尤其可用于制备包含来自淀粉的糖浆的葡萄糖。
WO 2009/075682描述了使用一种普鲁兰酶来生产一种啤酒麦芽汁，其中淀粉糖化是使用较少量的酶蛋白实现的。
马修斯(Matthews)等人，2001，酿造研究所杂志(Journal of Instituteof brewing)107(3)第185-194页披露了通过在高温下用一种葡糖淀粉酶来淀粉糖化以制备一种低碳水化合物啤酒，该葡糖淀粉酶源自于黑曲霉。
WO 2007113292描述了一种淀粉糖化工艺，其中进行了玉米和水稻辅料的调浆(mashing-in)以获得一种基于麦芽糖的麦芽汁，该麦芽汁衰减程度不高。
尽管，传统地，已从仅大麦麦芽、啤酒花和水中酿造了啤酒，但麦芽是一种昂贵的原材料，因为它需要优质的谷物、萌发用水、以及焙焦/焙烧用能源。传统地，该麦芽粉中也包括约30％-60％的未发麦芽的谷物(也称作辅料，如玉米、水稻、高粱和小麦)、精制淀粉或随时可发酵的碳水化合物(如糖或糖浆)。
在高衰减啤酒中使用辅料，部分是因为它们是随时可用的，并且与可从大麦麦芽获得的相比会以更低的成本提供碳水化合物，并且部分是因为它们对于高衰减啤酒的风味和本体特征是重要的。也可以实现其他优点，例如增强的物理稳定性、优秀的抗寒品质、以及更好的光泽。然而，当使用具有更高糊化温度的辅料(例如玉米或水稻)时，通常在混合到糖化之前的麦芽醪液中之前，将它们在单独的“谷类蒸煮器”中蒸煮并糊化。
因此，虽然使用辅料降低了原材料价格的成本，但在谷类蒸煮器上需要额外的投资并且需要针对用于加热该辅料的能源的额外成本。这些额外的费用需求在增加辅料比率上阻碍了酿造者，并且在其酿造工艺中也使用了不同的辅料选择。近来，在能源和原材料价格上存在一个显著变化，这是由于对谷物的增长的需求、全球水短缺、变化的天气模式等引起的。这迫使酿酒行业聚焦在生产效率以及原材料节约上。
对酿酒中的降低成本和/或提高生产效率的改进工艺存在需要。
发明概述
诸位发明人已出人意料地发现，通过使用一种葡糖淀粉酶，淀粉糖化可使用未糊化的淀粉辅料实现。
相应地，在一个方面，本发明涉及生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括
a.提供一种麦芽粉，该麦芽粉包括具有未糊化淀粉的淀粉来源，该未糊化淀粉的糊化温度高于68℃；
b.向一种包括该麦芽粉的醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在80℃具有至少10％残余活性，并且
c.获得一种麦芽汁。
相应地，在另一个方面，本发明涉及生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括
a.提供一种麦芽粉，该麦芽粉包括具有未糊化淀粉的淀粉来源，该未糊化淀粉的糊化温度高于68℃；
b.向一种包括该麦芽粉的醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在滤清(lautering)过程中仍具有活性并且在80℃具有至少10％残余活性，并且
c.获得一种麦芽汁。
相应地，在另一个方面，本发明涉及生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括
a.提供一种麦芽粉，该麦芽粉包括具有未糊化淀粉的淀粉来源，该未糊化淀粉的糊化温度在至少67℃；
b.向一种包括该麦芽粉的醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在80℃具有至少10％残余活性，并且
c.获得一种麦芽汁。
在一个实施例中，淀粉糖化是在低于该未糊化的淀粉的糊化温度的温度下进行，并且煮浆(mashing off)是在高于该糊化温度的温度下进行。
在一个方面，该麦芽粉进一步包括麦芽。
在一个实施例中，该麦芽粉包括至少25％W/W的未糊化淀粉。
在不同实施例中，该未糊化淀粉选自玉米、水稻或高粱，或其混合物。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1是至少50％一致的。
在一个优选方面，该葡糖淀粉酶是以少于5AGU/g麦芽粉给予。
在一个实施例中，该方法进一步包括添加一种α淀粉酶。
在一个优选方面，该α-淀粉酶在75℃具有至少10％残余活性。
在另一个优选方面，该α-淀粉酶与SEQ ID NO:5是至少50％一致的。
在不同实施例中，所得到的麦芽汁具有多于70％葡萄糖或少于20％糊精(DP4+)或两者。
在一个方面，该淀粉糖化特征曲线在高于70℃的温度包括一段间歇。
在一个实施例中，总淀粉糖化时间少于181min。
在一个方面，该醪液的pH是从4.6至约6.4。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有高于65℃的最适温度。
在不同实施例中，该方法进一步包括添加一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：普鲁兰酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶以及β葡聚糖酶；以及其组合。
在一个方面，该麦芽汁被进一步发酵以获得一种酒精饮料。
在一个实施例中，该酒精饮料是啤酒。
在一个方面，该葡糖淀粉酶在煮浆时是具有活性的。
在一个方面，该葡糖淀粉酶是在淀粉糖化开始时添加的。
在另一个方面，该葡糖淀粉酶是在淀粉糖化过程中添加的。
在一个方面，该葡糖淀粉酶是在滤清过程中添加的。
在另一个方面，该葡糖淀粉酶添加是在65℃和90℃之间的温度进行的。
在一个方面，该葡糖淀粉酶获得自青霉属。
在另一个方面，该葡糖淀粉酶获得自草酸青霉菌。
发明详细说明
酿造过程是本领域中熟知的，并且通常涉及麦芽制造(malting)、淀粉糖化(mashing)和发酵的步骤。淀粉糖化是将来自磨碎的大麦麦芽和固体辅料的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的糖类，以产生所希望的组合物的麦芽汁的过程。
传统的淀粉糖化包括将磨碎的大麦麦芽及辅料与水在设定的温度和体积混合以使在麦芽制造过程中开始的生物化学变化得以继续。淀粉糖化过程在恒温(等温淀粉糖化)或例如以顺序方式逐渐增加至不同温度下进行一段时间以激活负责降解蛋白质和碳水化合物的内源性酶。到目前为止，在淀粉糖化中发生的最重要的变化是麦芽/大麦/辅料中的可溶性物质释放进入液体馏分以及淀粉分子转化为可发酵糖。
在传统的淀粉糖化过程中，负责淀粉转化的主要酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶和右旋糖酐酶。α-淀粉酶通过将淀粉分子分裂成许多能被β-淀粉酶攻击的更短的链而非常迅速地降解不可溶的淀粉和可溶的淀粉。产生的二糖为麦芽糖。除了在淀粉糖化过程中形成的麦芽糖之外，还产生短的支链葡萄糖寡聚物。这些短的支链葡萄糖寡聚物是非可发酵糖并且增加味道以及成品啤酒的卡路里量。
淀粉糖化之后，当所有的淀粉已经被分解，就必须将液体提取物(麦芽汁)与残余的固体(酒糟)分离，例如通过过滤。麦芽汁分离(滤清)是重要的，因为固体含有大量蛋白、变性不足的淀粉、脂肪材料、硅酸盐及多酚(鞣酸)。滤清之前，可以将醪液温度升高至约75℃-78℃(称为煮浆)。以此方式获得的麦芽汁也可以被称为“第一麦芽汁”。
收集第一麦芽汁后留在酒糟中的提取物通过在滤清饼(lauter cake)的顶部添加热水也可以被洗出。这一过程被叫做喷洒(sparging)。热水流过酒糟并溶解剩余的提取物。稀释的麦芽汁被叫做第二麦芽汁，并且其提取物从第一麦芽汁的原始比重下降至1％-2％。
用于制备麦芽汁的适合程序的非限制性实例例如由布里格斯(Briggs)等人，“麦芽制造与酿造科学，第I卷，麦芽与甜麦芽汁(Malting and brewing science,Volume I Malt and sweet wort)”，查普曼和霍尔(Chapman and Hall)，纽约，美国，ISBN 0412165805(1981)及霍夫(Hough)等人，“麦芽制造与酿造科学，第II卷，加过啤酒花的麦芽汁与啤酒(Malting and brewing science,Volume II Hopped wort andbeer)”，查普曼和霍尔，纽约，美国，ISBN 0412165902(1981)描述。添加啤酒花后，煮沸麦芽汁。由此，许多物质(包括若干蛋白质)变性并且将发生多酚的沉淀。冷却并除去沉淀物后，可以为成品麦芽汁充气并用啤酒酵母(brewer's yeast)发酵，以产生啤酒。
典型地持续5-10天的主发酵后，除去大部分酵母并且获得生啤(green beer)。将生啤在低温下，典型地在0-5℃下储存1至12周。在此期间，剩余的酵母将与多酚一起沉淀。为了除去剩余的过量多酚，进行过滤以获得发酵啤酒。可以在装瓶之前将发酵啤酒碳化。二氧化碳不仅有助于感观的“丰满(fullness)”或“大量(body)”并且作为一种增味剂，它还充当具有发泡潜力的增强剂并且在延长产品的货架期中发挥重要作用。关于常规的酿造方法的另外的信息可以在“酿造与麦芽制造技术(Technology Brewing and Malting)”(酿造的研究与教学研究所(Research and Teaching Institute of Brewing)的沃尔夫冈·坤泽(Wolfgang Kunze)，柏林(VLB)，第二次修订版1999,ISBN3-921690-39-0)中找到。
在一个方面，本发明提供了用以产生低碳水化合物含量(低碳水化合物(low carb))啤酒的方法。一种典型的麦芽汁由淀粉衍生的碳水化合物的混合物组成，根据它们是否可被啤酒酵母转化为乙醇，这些碳水化合物被归类为可发酵的或非可发酵的。在传统的淀粉糖化中，该可发酵的碳水化合物是通过麦芽α-和β-淀粉酶水解谷物淀粉而形成的。淀粉是一种葡萄糖聚合物，其中该葡萄糖残基由α-1,4键或α-1,6键连接。在该淀粉糖化周期中，首先将淀粉溶解，并且然后将淀粉分子的一部分水解为非可发酵糊精并且水解为低分子量糖(如葡萄糖，麦芽糖和麦芽三糖)，啤酒酵母可将这些低分子量糖发酵为乙醇。该糊精部分由比麦芽三塘具有更高聚合度(DP)的所有糖组成，迄今为止贡献了多数的不可发酵淀粉降解产物(除了该糊精部分之外，还有异麦芽糖、潘糖和异潘糖是不可发酵的)。该麦芽汁的组成可依赖于起始材料、淀粉糖化周期以及其他变量而变化。一种典型的(非高衰减的)麦芽汁的碳水化合物成分是由65％-80％可发酵的糖以及20％-35％非可发酵极限糊精组成。在发酵过程中，该可发酵部分被转化为乙醇，到3％w/w至6％w/w的最终浓度。这些糊精未被转化为乙醇并且保留在最终的啤酒中，添加到饮料的碳水化合物含量上。在“低碳水化合物”或超衰减啤酒的生产中，对获得更高比例的醇和更低量的残余糊精进行了尝试。葡糖淀粉酶常被用在酿造中以减少糊精的含量。然而，因为葡糖淀粉酶在水解α-1,4键方面更加有效，并且在水解α-1,6键方面具有困难，它们一般是以非常高的浓度来使用。
在一个方面，本发明提供了一种适于生产麦芽汁的方法，该麦芽汁是低糊精的并且从而是低非可发酵糖。在另一个方面，本发明涉及一种用于生产富含葡萄糖的麦芽汁的方法。在另一个方面，本发明涉及一种用于生产耗尽麦芽糖的麦芽汁的方法。该方法应用了特别选择的葡糖淀粉酶活性。
诸位发明人已出人意料地发现，使用在与一般用于酿造中的葡糖淀粉酶相比的更加高的温度下具有活性的葡糖淀粉酶可提供许多优点。例如通过应用在滤清时有活性的葡糖淀粉酶，诸位发明人发现，他们不仅可从传统的糖化步骤获益而且也在滤清工艺的间歇过程中获益。这因此减少了用以达到相同RDF(真正发酵度)的葡糖淀粉酶的量。可替代地，使用本发明的方法，甚至可以获得更高的RDF值和/或可以减少在60℃-66℃下的糖化时间。诸位发明人还发现，具有在更高温度下有活性的葡糖淀粉酶使能够进行辅料的调浆，其中该淀粉具有高糊化温度，如玉米、水稻和高粱。当该淀粉被糊化时，由于该葡糖淀粉酶具有活性，确保了此类辅料的高水平的淀粉水解。
诸位发明人还发现，通过添加一种α淀粉酶(例如一种在75℃下具有至少10％残余活性的α淀粉酶)并且在淀粉糖化过程中使用一个保持步骤(其中这些辅料的淀粉被糊化并且其中该葡糖淀粉酶具有活性)将获得进一步的效率。该保持步骤可以是恰在滤清(称作煮浆)之前或可以放在更早，该温度可以比滤清温度(典型地是75℃-80℃)更低、相等或甚至更高。
定义
贯穿本披露，使用了本领域的普通技术人员通常理解的不同术语。然而，若干术语是以特别的含义使用，并且意为如通过以下所定义的。
如在此使用，“一个/种(a)”可以意指一个(种)或多个(种)，取决于其使用的上下文。
如在此使用的，将术语“麦芽粉”理解为含有作为啤酒生产的基础的材料的淀粉或糖，例如但不限于大麦芽和辅料。通常，麦芽粉不含有任何添加水。
将术语“麦芽”理解为任何发麦芽的谷物，特别是大麦。
将术语“辅料”理解为麦芽粉的非麦芽部分。辅料可以是任何富含淀粉的植物材料，例如但不限于未发麦芽的谷物、大麦、玉米、水稻、高粱、小麦并且还包括容易发酵的糖和/或糖浆。一些辅料的淀粉具有相对较低的糊化温度，这使得它们能够与麦芽一起淀粉糖化，而其他辅料(例如水稻、玉米和高粱)具有较高的糊化温度，此类辅料在将其添加至醪液中之前典型地分开地煮熟并用α-淀粉酶液化。用于本发明的优选辅料包括如下辅料，与大麦或麦芽相比，其中的淀粉具有更高的起始、峰值、以及结束糊化温度(To，Tp，Tc)，更优选与麦芽淀粉相比高超过5℃。可以在淀粉糖化之前将辅料糊化或可将它们照原样添加至麦芽粉中。
在一个方面，在淀粉糖化之前，辅料未被糊化。
将术语“醪液”理解为含有淀粉的浆液，浆液包括浸泡在水中以制造麦芽汁的压碎的大麦芽、压碎的未发麦芽的谷物、其他含淀粉材料或其组合。“淀粉糖化”是将醪液中的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的糖的过程。
将术语“麦芽汁”理解为在淀粉糖化过程中提取麦芽粉后流出的未发酵液体。
将术语“酒糟”理解为当提取了麦芽粉并且分离了麦芽汁时剩下的脱水固体。
在此将术语“啤酒”理解为发酵的麦芽汁，即一种从大麦麦芽、任选地辅料及啤酒花酿造的酒精饮料。如在此使用的，术语“啤酒”意在至少涵盖制备自以下各项的啤酒：制备自未发麦芽的谷物的醪液，连同所有制备自发麦芽的谷物的醪液，以及所有制备自发麦芽的与未发麦芽的谷物的混合物的醪液。术语“啤酒”还覆盖制备自辅料的啤酒，以及具有所有可能酒精度的啤酒。
当加热淀粉粒的水溶液时，颗粒膨胀以形成糊。这一过程被叫做“糊化”。糊化发生的温度被叫做“糊化温度”。由于辅料中的淀粉的复杂性质并且还有淀粉糖化过程中的条件，糊化实际在特定温度范围内发生。将术语“淀粉糊化”理解为当在水的存在下加热时，淀粉所经历的不可逆转的有序-无序转变。差示扫描量热法(DSC)是一种可以用来研究描述了淀粉糊化的起始和峰值温度(To和Tp)的淀粉糊化的渐进过程的技术。除非另外指明，该糊化温度是指由MEBAK方法(MEBAK原材料(MEBAK RAW MATERIALS)，2006，第2章Rohfrucht，2.7Verkleisterungstemperatur，德国，第106-109页)所定义的淀粉糊化温度。
将术语“起始糊化温度(To)”理解为糊化开始时所处的温度。将术语“峰值糊化温度(Tp)”理解为吸热峰处的温度。将术语“结束糊化温度(Tc)”理解为糊化终止时所处的温度。
例如，对于玉米淀粉而言，起始糊化温度是大约62℃(峰值：67℃，结束：72℃)，并且对于水稻淀粉而言，起始糊化温度是大约68℃(峰值：74.5℃，结束：78℃)(淀粉(Starch)，第2版艾琳迈瓦尔德斯奈德的淀粉的工业显微术(Industrial microscopy of starch by EileenMaywald Snyder))。对于高粱，起始糊化温度是大约60℃(峰值：68℃，结束：76℃)。对于大麦，是大约56℃(峰值：大约64℃，结束：大约69℃)。初始糊化温度可以根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。
序列一致性：两个氨基酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European MolecularBiology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends in Genetics)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
麦芽汁生产
相应地，在一个方面，本发明涉及生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括
a.提供一种麦芽粉，该麦芽粉包括具有未糊化淀粉的淀粉来源，该未糊化淀粉的糊化温度高于68℃；
b.向一种包括该麦芽粉的醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在80℃具有至少10％残余活性，并且
c.获得一种麦芽汁。
在另一个方面，本发明涉及生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括
a.提供一种麦芽粉，该麦芽粉包括具有未糊化淀粉的淀粉来源，该未糊化淀粉的糊化温度在至少67℃；
b.向一种包括该麦芽粉的醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在80℃具有至少10％残余活性，并且
c.获得一种麦芽汁。
在一个方面，该未糊化淀粉具有67℃，如高于67℃，例如高于68℃，例如高于69℃，例如高于70℃，例如高于71℃，例如高于72℃，例如高于73℃，例如高于74℃，例如高于75℃，例如高于76℃，例如高于77℃，如例如高于78℃的峰值糊化温度(Tp)。
在一个实施例中，淀粉糖化是在低于该未糊化的淀粉的糊化温度的温度下进行，并且其中之后的淀粉糖化包括在高于该糊化温度的温度下的一个保持步骤，这个保持步骤可以在滤清(煮浆)之前进行并且可具有恒定的或改变的温度。
在本发明的一个方面，该糊化温度是峰值糊化温度。
在另一个方面，本发明涉及一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向一种醪液中添加如下的一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在滤清过程中仍具有活性并且在80℃下具有至少10％残余活性，如通过该酶在pH 6.0释放葡萄糖的能力(通过如在实例1中所述的使用麦芽糊精作为底物而形成葡萄糖测量的)来确定的。
在一个方面，在pH 6.0并且通过使用麦芽糊精作为底物形成葡萄糖来测量残余活性。
在一个方面，本发明涉及一种用于生产啤酒麦芽汁的方法。具体地，本发明涉及一种用于生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向一种醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1中所示的序列是至少50％一致的。
根据一个方面，该醪液可通过研磨(grounding)一种包括麦芽和/或辅料的麦芽粉来获得。优选地，可以将水添加至麦芽粉、预热，以便在醪液形成的时刻醪液便达到所希望的醪液温度。如果形成的醪液的温度低于所希望的淀粉糖化温度，优选供给额外的热量以达到所希望的工艺温度。优选地，所希望的淀粉糖化温度在醪液形成后15分钟内，或更优选地，在10分钟内，例如在9、8、7、6、5、4、3、2分钟内，或甚至更优选地在1分钟内达到，或最优选地在醪液形成时达到所希望的淀粉糖化温度。淀粉糖化过程的温度特征曲线可以是一个来自常规的淀粉糖化过程特征曲线，其中设置温度以达到由麦芽酶最佳降解麦芽粉干物质。
淀粉糖化过程通常应用温度的受控分步增加，其中每个步骤都偏好一个酶促作用超过另一个，最终降解蛋白质、细胞壁及淀粉。淀粉糖化温度特征曲线在本领域通常是已知的。在本发明中，淀粉糖化工艺中的糖化(淀粉降解)步骤优选在60℃和66℃之间，更优选在61℃和66℃之间，甚至更优选在62℃和66℃之间，并且最优选在63℃和66℃之间进行。在本发明的具体实施例中，该糖化温度是64℃。
在一个方面，该淀粉糖化特征曲线在或高于70℃的温度时包括一段间歇(或延长时间)。在若干实施例中，该淀粉糖化特征曲线在高于70℃，如高于71℃，如高于72℃，如高于73℃，如高于74℃，如高于75℃，如高于76℃，如高于77℃，如高于78℃，如高于79℃，如高于80℃，如高于81℃，如高于82℃，如高于83℃，如高于84℃，如高于85℃，如例如高于86℃的温度包括一段间歇。可将一段间歇理解为如下的任何延长时间，其中的温度保持为高于此温度，即使温度在此时间间隔中未保持恒定。该延长的时间可以是5分钟(min)至2小时之间，例如从5min至1.5小时，例如从10min至1小时，例如10min至50min，例如从15min至40min。淀粉糖化可以具有一个或多于一个此类间歇期。
在一个方面，在或高于70℃淀粉糖化时间持续至少60分钟，例如持续至少65分钟，例如持续至少70分钟，例如持续至少75分钟，例如持续至少80分钟，例如持续至少85分钟，例如持续至少90分钟，例如持续至少95分钟，例如持续至少100分钟，例如持续至少105分钟，例如持续至少110分钟，例如持续至少115分钟，例如持续至少120分钟。
在一个方面，在低于70℃淀粉糖化时间持续少于60分钟，例如持续少于55分钟，例如持续少于50分钟，例如持续少于45分钟，例如持续少于40分钟，例如持续少于35分钟。
在一个方面，本发明涉及一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向一种醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在至少65℃的温度的淀粉糖化条件下是有活性的。在另一个方面，该葡糖淀粉酶在至少68℃，例如70℃，例如72℃，例如75℃，例如76℃，例如77℃，例如78℃，例如79℃，例如80℃的淀粉糖化条件下是有活性的。在一个方面，本发明涉及一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在滤清和/或醪液过滤过程中是有活性的。
在一个方面，本发明的淀粉糖化工艺包括但不限于一个煮浆步骤。在一个方面，该煮浆步骤包括但不限于将该醪液在至少65℃的温度孵育至少20分钟。在一个方面，该煮浆步骤包括将该醪液在至少65℃，例如至少66℃、至少67℃、至少68℃、至少69℃、至少70℃、至少71℃、至少72℃、至少73℃、至少74℃或至少75℃、至少76℃、至少77℃、至少78℃、至少79℃、至少80℃、至少81℃、至少82℃、至少83℃、至少84℃或至少85℃的温度孵育至少20分钟，例如至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少65分钟、至少70分钟、至少75分钟、至少80分钟、至少85分钟、至少90分钟、至少95分钟、至少100分钟、至少105分钟、至少110分钟、至少115分钟、至少120分钟、至少125分钟、至少130分钟、至少135分钟、至少140分钟、至少145分钟，如至少150分钟。在一个具体实施例中，在75℃煮浆120分钟。
在一个方面，该醪液的pH在约4.6至约6.4的范围中。在另一个方面，该pH是在约4.6至6.2的范围中，如在pH约4.8至约6.0的范围中，优选在pH约5.0至约6.0之间的范围中，更优选在pH约5.0至约5.8之间的范围中，甚至更优选在pH约5.2至约5.6之间的范围中。在一个方面，该麦芽粉进一步包括麦芽。
该麦芽优选源自于选自以下列表的谷物中的一种或多种，该列表由玉米、大麦、小麦、黑麦、高粱、粟和水稻组成。优选地，麦芽是大麦芽。该麦芽粉优选包括从0.5％至99％，优选从1％至95％，更优选从5％至90％，例如从10％至80％，例如从20％至70％，例如从30％至70％，例如从30％至60％，甚至更优选从35％至55％麦芽。
除了发麦芽的谷物之外，该麦芽粉可以优选包括辅料，例如未发麦芽的玉米，或其他未发麦芽的谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟和/或高粱(sorghum)，或未加工和/或精制淀粉和/或含有源自于植物的材料的糖，这些植物是像小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟、高粱、马铃薯、甘薯、木薯、木薯淀粉、西米、香蕉、甜菜和/或甘蔗。对于本发明，辅料可获得自块茎、根、茎、叶、豆荚、谷类和/或完整谷物。优选的是获得自玉米和/或水稻的辅料，更优选地该辅料是水稻淀粉、玉米淀粉和/或玉米渣。该醪液优选包括从1％至80％、优选从10％至70％、更优选从20％至65％的辅料淀粉。辅料还可以包括容易发酵的碳水化合物，例如糖或糖浆，并且可以将它们在本发明的淀粉糖化过程之前、之中或之后添加至麦芽醪液中但是优选在淀粉糖化过程之后添加。形成醪液之前，麦芽和/或辅料优选被磨碎并且最优选是干磨或湿磨。在一个方面，该辅料具有高糊化温度。在另一个方面，在淀粉糖化之前，该辅料未被糊化。
在一个方面中，该醪液由至少20％的辅料组成，这些辅料具有至少67℃的淀粉糊化温度，优选起始糊化温度。在另一个方面，该醪液是由至少25％，例如至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％，如至少65％的辅料组成，这些辅料具有至少67℃，如例如至少68℃至少67℃，如至少68℃，例如至少69℃，例如至少70℃，例如至少71℃，例如高于72℃，例如至少73℃，例如至少74℃，例如至少75℃，例如高于76℃，例如高于77℃，如例如高于78℃的淀粉糊化温度，优选起始糊化温度。
在一个方面，与全麦芽粉相比，该醪液包括至少10％的未发麦芽的谷物。在另一个方面中，该醪液包括至少15％，例如至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％，例如至少60％的未发麦芽的谷物。
在本发明的一个方面，该辅料包括玉米。在本发明的另一个方面，该醪液包括至少20％的玉米辅料。在一个方面，该醪液包括至少25％，例如至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％，如至少60％的玉米辅料。
在一个方面，当添加到该醪液中时，该玉米辅料是未糊化的。在本发明的一个方面，该辅料包括水稻。在本发明的另一个方面，该醪液包括至少20％的水稻辅料。在一个方面，该醪液包括至少25％，例如至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％，如至少60％的水稻辅料。在一个方面，当添加到该醪液中时，该水稻辅料是未糊化的。
在不同实施例中，该未糊化淀粉选自玉米、水稻或高粱，或其混合物。
在一个方面，该葡糖淀粉酶是外源性提供的和/或存在于该醪液中。在一个方面，该葡糖淀粉酶是在淀粉糖化开始时引入的。在另一个方面，该葡糖淀粉酶是在淀粉糖化过程中引入的。在另一个方面，该葡糖淀粉酶是在滤清时引入的。
在一个优选实施例中，一种或多种α淀粉酶被进一步添加该醪液中。不受理论约束，相信添加淀粉酶会确保高的酿造产率。
在一个优选方面，该α-淀粉酶在高于75℃具有至少10％残余活性，如在高于76℃(如，例如高于77℃，如高于78℃，如高于79℃，如高于80℃，如高于82℃)具有至少10％残余活性。
在另一个优选实施例中，该淀粉酶可从芽孢杆菌属或曲霉属获得。
在一个优选实施例中，该α-淀粉酶与SEQ ID NO:5是至少50％一致的。
在另一个优选实施例中，将一种或多种另外的酶添加至醪液中，所述一种或多种酶包括但不限于异淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、漆酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、植酸酶、植酸钙镁以及酯酶。
在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括但不限于一种普鲁兰酶。
在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括但不限于一种蛋白酶。
在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括但不限于一种纤维素酶。
在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括但不限于一种木聚糖酶。
在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括但不限于一种脂肪酶。
在该方法的一个方面，所添加的另外的酶包括但不限于一种葡聚糖酶，优选但不限于β葡聚糖酶。
在一个方面，实践本发明的方法导致麦芽汁中葡萄糖的水平增加。在一个方面，当与不存在这样一种葡糖淀粉酶的情况下产生的麦芽汁相比时，葡萄糖的增加是至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％。
在一个方面，实践本发明的方法导致具有至少70％葡萄糖(当与该麦芽汁的总碳水化合物含量相比时)的麦芽汁。在另一个方面，该麦芽汁具有至少71％的葡萄糖，例如至少72％、至少73％、如至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％，例如至少81％葡萄糖，例如至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.5％，例如至少94％的葡萄糖(当与该麦芽汁的总碳水化合物含量相比时)。
在一个方面，实践本发明的方法导致具有少于20％糊精(DP4+)(当与该麦芽汁的总碳水化合物含量相比时)的麦芽汁。在一个方面，该麦芽汁具有少于19％的DP4+，如例如少于18％、少于17％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％，如少于2.5％的糊精(DP4+)。
在一个方面，该醪液和/或该麦芽汁不包括添加的葡萄糖糖浆。
在另一个方面，实践本发明的方法导致在68℃至90℃之间的温度形成额外的葡萄糖。在一个方面，当与不存在这样一种葡糖淀粉酶的情况下产生的麦芽汁相比时，在68℃至90℃之间的温度形成的额外的葡萄糖是至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％。
在一个方面，实践本发明的方法导致该麦芽汁中麦芽糖浓度降低。在一个方面，当与不存在这样一种葡糖淀粉酶的情况下产生的麦芽汁相比时，麦芽糖的浓度被降低至少0.5％，例如至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％。
在一个方面，实践本发明的方法导致该麦芽汁中葡萄糖浓度增加并且麦芽糖浓度降低。在一个方面，当与不存在这样一种葡糖淀粉酶的情况下产生的麦芽汁相比时，葡萄糖的浓度被增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％，并且麦芽糖的浓度被降低至少0.5％，例如至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％。
在一个方面，本发明的方法导致淀粉糖化时间缩短。在一个方面，当与不存在这样一种葡糖淀粉酶的情况下进行的此方法相比时，该方法导致淀粉糖化时间减少至少5分钟，例如至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟，更优选减少至少30分钟。
在一个方面，本发明的方法导致低于181分钟的淀粉糖化时间。在另一个方面，该淀粉糖化时间是低于160分钟，例如低于140分钟，例如低于120分钟，如低于110分钟，例如低于100分钟，如例如低于90分钟、低于80分钟、低于70分钟、低于60分钟、低于50分钟，例如低于40分钟。
在一个方面，本发明的方法导致更短的糖化时间，即，当温度在60℃和66℃之间时淀粉糖化过程的时间。在一个方面，该时间少于60分钟。在另一个方面，该时间少于58分钟，例如少于56分钟、少于54分钟、少于52分钟、少于50分钟、少于48分钟、少于46分钟、少于44分钟、少于42分钟、少于40分钟、少于38分钟、少于36分钟、少于34分钟、少于32分钟、少于30分钟、少于28分钟、少于26分钟、少于24分钟、少于22分钟，如少于20分钟。
在另一个方面，本发明的方法导致更低的酶剂量，特别是葡糖淀粉酶剂量(AGU/g麦芽粉)。在一个方面，当与采用现有技术中发现的一种葡糖淀粉酶进行的方法相比时，该葡糖淀粉酶剂量被减少至少10％，例如至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％，如至少75％。
在淀粉糖化过程中，从麦芽粉中提取的淀粉逐渐地水解为可发酵的糖和更小的糊精。优选地，该醪液在提取麦芽汁之前对于碘测试是淀粉阴性的。
从醪液中获得麦芽汁典型地包括从酒糟，即不可溶谷物和形成麦芽粉的部分的壳料中精滤(straining)麦芽汁。可以使热水穿过酒糟以清洗或喷洒任何剩余的来自麦芽粉的提取物。任选地，在本发明的方法中应用热稳定的纤维素酶导致β-葡聚糖水平的有效减少，有助于麦芽汁精滤，从而确保减少的周期时间和高提取物回收。优选地，提取物回收是至少80％，优选至少81％，更优选至少82％，甚至更优选至少83％，例如至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％，并且最优选至少91％。
在从该麦芽粉的酒糟分离麦芽汁之后，可以将麦芽汁照原样使用，或它可以被脱水以提供浓缩和/或干燥的麦芽汁。可以将浓缩的和/或干燥的麦芽汁用作酿造提取物、用作麦芽提取物调味品、用于非酒精麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷类食品、用于糖果等。在一个优选实施例中，将麦芽汁发酵以产生酒精饮料，优选啤酒，例如爱尔啤酒(ale)、烈性爱尔啤酒、苦啤酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、出口啤酒、麦芽酒(malt liquor)、大麦酒、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。麦芽汁的发酵可以包括以含有新鲜酵母，即先前未曾用于本发明的酵母或其可为回收酵母的酵母浆投入麦芽汁。应用的酵母可以为适于碑酒酿造的任何酵母，尤其是选自酵母属的酵母，例如酿酒酵母和葡萄汁酵母，包括这些有机体的天然或人工产生的变体。用于生产啤酒的麦芽汁的发酵方法是本领域的普通技术人员熟知的。
本发明的工艺可包括向发酵的麦芽汁中添加硅水凝胶，以增加啤酒的胶体稳定性。该工艺可以进一步包括向发酵的麦芽汁中添加硅藻土并过滤以使得啤酒鲜亮。在一个方面，本发明提供产生自麦芽汁的啤酒，如通过发酵麦芽汁以生产啤酒而产生的啤酒。该啤酒可以是任何类型的啤酒，例如爱尔啤酒(ale)、烈性爱尔啤酒、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、出口啤酒、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。
在一个方面，本发明涉及一种葡糖淀粉酶在麦芽汁生产工艺中的用途，该葡糖淀粉酶具有与在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少50％一致的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及通过使用本发明的方法产生的麦芽汁。在另一个方面，本发明涉及一种啤酒以及用于使用通过本发明的方法制备的麦芽汁来生产该啤酒的方法。
酶：
本发明中应用的酶应根据它们在本发明的工艺的加工温度下保留足够的活性的能力，以及它们在醪液的中等酸度pH条件下保留足够的活性的能力进行选择，并应以有效量添加。这些酶可源自任何来源，优选源自植物或藻类，并且更优选源自微生物，如源自细菌或真菌。
葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)
葡糖淀粉酶可获得自微生物或植物。为了本发明的目标，结合给定来源，如在此使用，术语“获得自”应指由该来源或由其中已经插入来自该来源的核苷酸序列的菌株产生的核苷酸序列编码的多肽。在一个优选方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
本发明的葡糖淀粉酶可以是真菌来源的。例如，该葡糖淀粉酶可获得自酵母，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或子囊菌酵母属(Yarrowia)。优选地，该葡糖淀粉酶可获得自丝状真菌，如具有葡糖淀粉酶活性的枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、金担子菌属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球酵母属(Cryptococcus)、壳色单隔孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、绒黑粉类酵母(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、巨座壳属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、蓝状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个优选方面，该葡糖淀粉酶获得自解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌、热带金孢子菌、粪状金孢子菌、狭边金孢子菌、毡金孢子菌、节状金孢子菌、带纹金孢子菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、灰腐质酶、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、托姆青霉、草酸青霉菌、无色梭孢壳、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳、澳洲梭孢壳、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、秘鲁梭孢壳、瘤孢梭孢壳、毛梭抱壳、耐热梭孢壳、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
使用本领域中已知的技术通过蛋白质工程，可获得自生物体的葡糖淀粉酶也可被转化为本发明的一种葡糖淀粉酶。[例如，莱曼(Lehmann)和怀斯(Wyss)，2001，生物技术新见(Curr OpinBiotechnol.)，12(4):371-5。]
在一个更优选方面，该葡糖淀粉酶获得自草酸青霉菌。在一个最优选方面，该葡糖淀粉酶是具有葡糖淀粉酶活性的一种草酸青霉菌多肽，例如包括SEQ ID NO:1的多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)。
此外，可以使用本领域中已知的技术，例如使用编码一种多肽的多核苷酸作为探针，从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定并获得此类多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选这样一种微生物的基因组或cDNA文库来获得多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码一种多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员熟知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨拉布鲁克(Sambrook)等人(1989)，分子克隆实验指南(Molecular cloning:A laboratorymanual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor lab.)，冷泉港，纽约)。
在一个方面，该葡糖淀粉酶具有如下的氨基酸序列，其与SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列是至少50％，例如至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％一致的。
在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶具有如下氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1的氨基酸序列在不多于100个氨基酸，优选不多于80个氨基酸，更优选不多于50个氨基酸，更优选不多于30个氨基酸，甚至更优选不多于20个氨基酸，并且最优选不多于10个氨基酸上不同。
在一个方面，本发明涉及一种葡糖淀粉酶在麦芽汁生产工艺中的用途，该葡糖淀粉酶具有如下氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列是至少50％一致的，例如至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％,至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％一致的。
在一个方面，该葡糖淀粉酶具有至少65℃的最适温度。在另一个方面，该最适温度是至少66℃，例如至少67℃，如至少68℃，至少69℃，至少70℃，至少71℃，至少72℃，至少73℃，至少74℃，至少75℃，至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，如至少80℃，这是通过在32C-85C在pH 5.0至6.0下孵育1小时的过程中该酶释放葡萄糖的能力确定的。在一个方面，该孵育pH是6.0。在另一个方面，该pH是5.8。在一个方面，该pH是5.6。在另一个方面，该pH是5.4。在一个方面，该pH是5.2。在另一个方面，该pH是5.0。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有65℃-75℃左右的最适温度，这是通过如在实例编号：1中所述的，在32℃-85℃在pH 6.0下孵育1小时的过程中该酶释放葡萄糖的能力确定的。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶在80℃具有至少10％，如至少11％，例如12％，例如13％，例如14％，例如15％，例如16％，例如17％，例如18％，例如19％，例如20％，如至少21％，例如22％，例如23％，例如24％，例如25％，例如26％，例如27％，例如28％，例如29％，例如30％，例如31％，例如32％的残余活性，如通过该酶在pH 6.0释放葡萄糖的能力(通过如在实例编号：1中所述的使用麦芽糊精作为底物而形成葡萄糖测量的)来确定的。
在一个方面，该葡糖淀粉酶是以约0.0005至约200mg酶蛋白/克全麦芽粉，优选约0.001至约100、更优选约0.01至约50、甚至更优选约0.05至约2.0mg的酶蛋白(EP)/克该麦芽粉的总重量的浓度添加的。
在一个方面，所添加的葡糖淀粉酶的浓度少于0.4mg酶蛋白(EP)/克全麦芽粉。在另一个方面，葡糖淀粉酶的浓度少于0.35，如少于0.3，如少于0.25，如少于0.2，如少于0.15mg酶蛋白(EP)/克全麦芽粉。
在一个方面，该葡糖淀粉酶是以少于5AGU/g麦芽粉给予的。在一些实施例中，该葡糖淀粉酶是以少于4.5AGU/g麦芽粉，如例如，少于4.0AGU/g麦芽粉，例如少于3.5AGU/g麦芽粉，例如少于3AGU/g麦芽粉，例如少于2.5AGU/g麦芽粉，例如少于2AGU/g麦芽粉，例如少于1.5AGU/g麦芽粉，如少于1AGU/g麦芽粉给予的。
普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)
普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)催化普鲁兰、支链淀粉和糖原中，以及支链淀粉和糖原的α-和β-极限糊精中的(1->6)-α-D-糖苷键的水解。这些酶原来是EC 3.2.1.69。可替代地，它们被称为α-糊精内切-1,6-α-葡糖苷酶或支链淀粉6-葡聚糖水解酶或脱支酶或极限糊精酶或普鲁兰6-葡聚糖水解酶。
根据本发明的普鲁兰酶优选是来自火球菌属(Pyrococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)(例如嗜酸性普鲁兰芽抱杆菌(Bacillusacidopullulyticus))的普鲁兰酶，例如描述于凯利(Kelly)等人，1994，欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Letters)115:97-106的普鲁兰酶；或从诺维信公司(Novozymes A/S)可得的普鲁兰酶，如Promozyme 400L。普鲁兰酶还可以来自长野芽孢杆菌(Bacillusnaganoencis)或脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)，例如衍生自脱支芽孢杆菌(美国专利5,736,375)。普鲁兰酶还可以是一种来自例如芽孢杆菌菌株的工程化普鲁兰酶。
其他普鲁兰酶可源自于描述于PCT/DK91/00219的乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)，或该普鲁兰酶可以源自于描述于PCT/DK92/00079的闪烁杆菌属(Fervidobacterium sp.)Ven 5，或该普鲁兰酶可以源自于描述于PCT/DK95/00097的速生热球菌(Thermococcus celer)，或该普鲁兰酶可以源自于描述于PCT/DK95/00211的艾比斯热网菌(Pyrodictium abyssei)，或该普鲁兰酶可以源自于描述于PCT/DK95/00095的喷哪乌兰闪烁杆菌(Fervidobacterium pennavorans)，或该普鲁兰酶可以源自于描述于PCT/DK95/00098的Desulforococcus mucosus。
最优选地，该普鲁兰酶源自于普鲁兰多糖芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)。有待用于本发明的工艺和/或组合物中的一种优选的普鲁兰酶是一种具有如下氨基酸序列的普鲁兰酶，该氨基酸序列与WO2009/075682中披露的普鲁兰酶3的序列是至少50％，例如至少55％，例如至少60％，例如至少65％，例如至少66％，例如至少70％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少86％，例如至少87％，例如至少88％，例如至少89％，例如至少90％，例如至少91％，例如至少92％，例如至少93％，例如至少94％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％或甚至100％一致的。
该普鲁兰酶可以按本领域的普通技术人员熟知的有效量添加。在一方面，该普鲁兰酶是以0.1至3PUN/g DM的剂量添加，例如0.2至2.9、例如0.3至2.8、例如0.3至2.7、例如0.3至2.6、例如0.3至2.5、例如0.3至2.4、例如0.3至2.3、例如0.3至2.2、例如0.3至2.1、例如0.3至2.0、例如0.3至1.9、例如0.3至1.8、例如0.3至1.7、例如0.3至1.6，最优选地普鲁兰酶是以例如0.3至1.5，优选0.4至1.4，更优选0.5至1.3，更优选0.6至1.2，更优选0.7至1.1，更优选0.8至1.0，更优选0.9至1.0的剂量添加。在本发明的一个具体实施例中，该酶是以0.3PUN/g DM，例如0.4PUN/g DM，例如0.5PUN/g DM添加，在本发明的一个特别优选的实施例中，该酶剂量不大于1PUN/g DM。
一普鲁兰酶单位(PUN)是在标准条件(即，在40℃和pH 5.0下30分钟反应时间后；并且用0.2％普鲁兰(pullulan)作为底物)下，水解普鲁兰，从而以等于每分钟1微摩尔葡萄糖的还原力还原碳水化合物的酶量。通过在以下条件中检测增加的还原糖容量(斯莫吉-尼尔森(Somogyi-Nelson)反应)测量普鲁兰酶活性：底物：0.2％普鲁兰，pH 5.0，反应时间30分钟。将样品通过分光光度计在OD 520nm处进行分析。
在一个方面，本发明的方法包括一种葡糖淀粉酶和一种普鲁兰酶两者。
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)
有待在本发明的工艺和/或组合物中使用的一种具体的α-淀粉酶可为芽孢杆菌α-淀粉酶。熟知的芽孢杆菌α-淀粉酶包括源自于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株的α-淀粉酶。在本发明的一个方面，所考虑的芽孢杆菌α-淀粉酶是如在WO 99/19467第3页第18行至第6页第27行中定义的α-淀粉酶。优选地，该α-淀粉酶与WO 99/19467中披露为SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的氨基酸序列(具有突变：I181*+G182*+N193F)具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少94％，更优选至少95％，优选至少96％，优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％的一致性。还考虑了来自诺维信公司的淀粉酶SC。有待用于本发明的工艺中的另一种具体的α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶，例如源自于曲霉属内一个物种，并且优选来自黑曲霉的菌株的一种α-淀粉酶。尤其考虑的是以下真菌α-淀粉酶，这些α-淀粉酶展现出与在WO 2002/038787中示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列的高一致性，即，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或甚至至少90％的一致性。
在一个优选实施例中，该α-淀粉酶与SEQ ID No 5是至少50％一致的，例如与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列是至少51％，至少52％，至少53％，至少54％，至少55％，至少56％，至少57％，至少58％，至少59％，至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或甚至至少99％一致的。
待添加的α淀粉酶的量取决于各种参数，并且一般是本领域的普通技术人员已知的。在一个方面，该醪液中的α淀粉酶活性是0.1-1.0KNU/g，更优选0.2-0.4KNU/g，并且最优选0.25-0.35KNU/g干重谷类。一千Novoα-淀粉酶单位(KNU)等于1000NU。一个KNU被定义为在标准条件(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6)下，将5.26g可溶性干淀粉底物Merck Amylum糊精化的酶量。
异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)
在本发明的工艺和/或组合物中应用的另一种酶可以是一种替代的脱支酶，如一种异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-D-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶的不能攻击支链淀粉的特性以及通过对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。异淀粉酶可以按本领域的技术人员熟知的有效量添加。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌的和细菌的蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。这些蛋白酶有助于将该醪液中高分子量蛋白的全长降低至低分子量蛋白。该低分子量蛋白对于酵母营养是必要的，并且该高分子量蛋白确保泡沫稳定性。因此，本领域的技术人员熟知，蛋白酶应以平衡的量添加，同时允许针对该酵母的充足的游离氨基酸，并且留下足够的高分子量蛋白以稳定该泡沫。在一个方面，该蛋白酶活性是由蛋白水解酶系统提供的，该蛋白水解酶系统具有适合的FAN产生活性，包括内切-蛋白酶、外肽酶或其任何组合，优选一种金属-蛋白酶。优选地，该蛋白酶与WO 99/67370中所述的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％的一致性。在另一个方面，该蛋白酶是可从诺维信公司获得的蛋白酶可以按0.0001-1000AU/kg DS的量添加，优选1-100AU/kg DS并且最优选5-25AU/kg干重谷类。
可以通过使用变性血红蛋白作为底物来确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的安森-血红蛋白(Anson-Hemoglobin)方法中，变性血红蛋白被消化，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。通过使用酚试剂确定TCA可溶的产物的量，酚试剂可以与酪氨酸和色氨酸一起给出蓝色。一安森单位(AU)被定义为在标准条件(即25℃，pH 7.5和10min反应时间)下以初始速率消化血红蛋白，以使得每分钟释放的TCA可溶的产物的量与酚试剂给出与一毫当量的酪氨酸相同的颜色的酶量。
纤维素酶(E.C.3.2.1.4)
该纤维素酶可以是微生物来源的，如可源自于丝状真菌(例如，曲霉属、木霉属、腐质霉属、镰刀菌属)的菌株。纤维素酶的具体实例包括可获得自特异腐质霉并且由WO 91/17244中的图14的氨基酸序列进一步定义的内切葡聚糖酶(内切葡聚糖酶I)和描述于WO 91/17243中的43kD特异腐质霉内切葡聚糖酶。
有待用于本发明的工艺中的一种具体纤维素酶可以是内切葡聚糖酶，例如内切-1,4-β-葡聚糖酶。尤其考虑的是示于WO 2003/062409的SEQ.ID.NO:2及同源序列中的β-葡聚糖酶。可使用的可商购纤维素酶制品包括和(可购自诺维信公司)，LAMINEXTM和CP(可购自杰能科公司(Genencor Int.))，以及7069 W(可购自德国)。
β-葡聚糖酶可以按照1.0-10000BGXU/kg DS，优选从10-5000BGXU/kg DS，优选从50-1000BGXU/kg DS，并且最优选从100-500BGXU/kg DS的量添加。一个β葡聚糖酶单位(BGXU)对应于在标准条件(在pH 4.40下，在30℃下孵育10分钟)下，每分钟产生1微摩尔还原糖所需要的酶量。
木聚糖酶：
木聚糖酶是本领域中己知的。在一个方面，木聚糖酶活性由一种来自糖基水解酶家族10的木聚糖酶提供。在一方面，该木聚糖酶与WO 94/21785中所述的木聚糖酶具有至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，并且最优选至少99％或甚至100％的一致性。在另一个方面，该木聚糖酶是来自于诺维信公司的优选地，该醪液中的木聚糖酶活性是0.02-0.1FXU(S)/g，更优选0.04-0.08FXU(S)/g干重谷类。
能以FXU单位表示木聚糖分解活性，用雷马素(remazol)-木聚糖(用雷马素艳蓝R，Fluka(Remazol Brilliant Blue R,Fluka)染色的4-O-甲基-D-葡醛(glucurono)-D-木聚糖)作为底物在pH 6.0下来确定。用雷马素-木聚糖底物孵育木聚糖酶样品。通过乙醇沉淀不降解的染色底物的背景。上清液中的剩余蓝色(如在585nm处用分光光度计确定)与木聚糖酶活性成正比，并且然后相对于酶标准在标准反应条件，即底物浓度0.45％w/v，酶浓度0.04–0.14FXU(S)/mL，在50.0℃、pH 6.0下，及30分钟反应时间下确定木聚糖酶单位。FXU(S)中的木聚糖酶活性是相对于以下测量的：诺维信FXU(S)酶标准(可获得自诺维信)，包括单组分木聚糖酶制品，来自棘孢曲霉的
脂肪酶：
脂肪酶是本领域中己知的。在一个实施例中，该脂肪酶活性是由一种对甘油三酯和/或半乳糖脂和/或磷脂具有活性的脂肪酶提供的。优选地，脂肪酶活性是由一种来自镰刀菌属(包括尖孢镰刀菌和异孢镰刀菌)、曲霉属(包括塔宾曲霉(A.tubigensis))、根霉属(包括米曲霉)或嗜热霉属(包括疏棉状嗜热丝孢菌)的脂肪酶、或这些脂肪酶的变体提供的。一个实例是Lipopan X(Lipopan Xtra)，一种具有取代G91A+D96W+E99K+P256V+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的变体，描述于WO 2004099400A2中。在另一个方面，该脂肪酶是一种来自于尖孢镰刀菌的脂肪酶/磷脂酶，描述于EP 869167中，可购自诺维信公司，如在本发明的一个特别优选实施例中，该脂肪酶是或这种脂肪酶对过滤速度和雾度减少具有显著地良好作用，并且可购自丹麦诺维信公司。该脂肪酶还可以是Lipozyme的一种变体，可购自丹麦诺维信公司。脂肪酶将来自大麦的脂质(例如甘油三酯)降解为偏甘油酯和游离脂肪酸。这导致较低的浊度和大大改进的醪液过滤及滤清特性。优选地，醪液中的脂肪酶活性是0-50LU/g，例如0-40LU/g，例如0-30LU/g，例如0-20LU/g干重谷类。一个脂肪酶单位(LU)是在30.0℃；pH 7.0下；用阿拉伯树胶作为乳化剂并且用三丁酸甘油脂作为底物，每分钟释放1微摩尔的可滴定丁酸的酶量。
可以将这些酶作为酶组合物而添加。它们可以由一种酶或多于一种酶或多于一种酶组合物组成。除了这一种或多种酶之外，酶组合物还可以含有至少一种其他物质，例如但不限于还缓冲液、表面活性剂等。酶组合物可以出于任何本领域公认的形式，例如固体、液体、乳液、凝胶或糊。此类形式是本领域的普通技术人员已知的。在本发明的一个方面，可以添加多于一种酶组合物，每种组合物都含有不同酶。在本发明的另一个方面，可以添加一种酶组合物，该组合物含有所有必需酶。在本发明的又另一个方面，可以添加一种酶组合物(含有一些酶)以及至少一种另一组合物(含有一些或所有剩余的酶)。可以同时或按顺序一个接一个地或甚至作为两种酶的组合与一种酶分开地一个接一个地添加这些酶。
在以下实例中进一步阐明本发明，该实例不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
材料与方法：
葡糖淀粉酶活性：
可以按单位AGU来测量葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的)每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。
| 葡糖淀粉酶孵育： | |
| 底物： | 麦芽糖100mM |
| 缓冲液： | 乙酸盐0.1M |
| pH： | 4.30±0.05 |
| 孵育温度： | 37℃±1 |
| 反应时间： | 6分钟 |
| 酶工作范围： | 0.5AGU/mL至4.0AGU/mL |
通过3个反应步骤描述分析原理：
步骤1是一个酶反应：
葡糖淀粉酶，EC 3.2.1.3(外-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。
步骤2和步骤3引起一个终点反应。
在由己糖激酶催化的一个反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab 30分析仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。
用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。
酶：
SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4的葡糖淀粉酶以及SEQ ID No:5的α淀粉酶是使用标准重组技术(例如如在WO 2011/127802中找到的)制造的。
Attenuzyme-一种葡糖淀粉酶、一种α淀粉酶以及一种普鲁兰酶的一个组合，是可购自丹麦诺维信公司的一种可商购酶组合物。
实例
实例1：葡糖淀粉酶的最适温度
不同序列的葡糖淀粉酶的最适温度是通过在32℃至85℃在pH6.0下孵育的过程中该酶释放葡萄糖的能力确定的。使用了4种不同的葡糖淀粉酶SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4。将10μL的酶溶液(0.5mg葡糖淀粉酶/mL于具有0.02％Triton X-100的10mM NaOAc缓冲液pH 6.0中)与190μL底物溶液(10.5％麦芽糊精DE11于50mM NaOAc中)混合。将该混合物在32℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃或85℃孵育1小时。在孵育后，将10μL的这种样品与190μL Milli-Q水(20倍稀释)混合，这针对所有样品，除了32℃孵育的样品仅稀释5倍。该样品中的葡萄糖浓度(mg/mL)是通过酶促麦芽糖-GOD测定(和光自动试剂盒葡萄糖(Wako AutokitGlucose)，439-90901)确定的。
将10μL的稀释样品转移到96孔板，添加200μL停止试剂，并在505nm测量吸光度。应用葡萄糖标准曲线将吸光度转换为mg/mL葡萄糖。结果列表于以下表1中：
表1：在pH 6.0通过使用麦芽糊精作为底物形成葡萄糖(mg/mL)而测量的葡糖淀粉酶的最适温度
从该表看出，Seq ID No 1的葡糖淀粉酶表明了比所测量的其他葡糖淀粉酶(60℃-65℃)更高的最适温度(70℃)。
实例2：葡糖淀粉酶与α淀粉酶组合在麦芽汁生产中的影响。
以实验室规模用50％良好改性的麦芽和50％麦芽粉玉米麦芽粉组合物进行试验。
参照(子试验1)代表了使用现有技术(其中该辅料被蒸煮)进行的典型试验。
对于该参照试验，即子试验1，将该玉米麦芽粉以0.2mm的粒径研磨并液化，例如通过以下方法；将磨碎的玉米麦芽粉分散在水中(33％玉米麦芽粉，在65℃，此时在添加0.05KNU/g麦芽粉的SEQ ID No 5的α淀粉酶后。添加自来水，然后将该悬浮液以2℃/min加热至95℃。在95℃，在将其冷却至64℃之前，将其保持30min)。将对应于25g玉米麦芽粉的液化的玉米麦芽粉与25g磨碎的麦芽(也研磨至2mm的粒径)混合，并添加水以给出250ml的总体积，添加60ppm CaCl2并将该pH调节至5.4。在淀粉糖化开始时添加该酶(参见下表2)，淀粉糖化是以如下的温度特征曲线进行的，其由以下组成：64℃保持120min，随后增加(1℃/min)至75℃，保持20min，并且然后冷却至20℃(3.9℃/min)之后将体积调节至300克，之后将其过滤。将所得到的麦芽汁通过HPLC(糖谱)以及Anton Paar(柏拉图测量(Platomeasurement))进行分析。结果在表3中给出。
对于子试验2-7，使用相同比率的麦芽和玉米麦芽粉(未糊化的和未液化的)，但将该玉米麦芽粉直接调浆(浸出法淀粉糖化)，通过70℃间歇和缩短的66℃间歇，修饰淀粉糖化温度特征曲线以利用该葡糖淀粉酶的热稳定性。此外，包括在78℃的120min间歇，以模仿工业滤清下的条件。
对于子试验2-7，在66℃将25g麦芽和25g玉米麦芽粉与200g水混合，之后添加60ppm CaCl2，并且将该pH调节至5.4。在淀粉糖化开始时添加这些酶(根据表2)，淀粉糖化是以如下的淀粉糖化温度特征曲线进行的，其由以下组成：66℃保持90min，增加(1℃/min)至70℃，保持50min，随后增加至78℃(1℃/min)，保持120min，并且然后冷却至20℃(3.9℃/min)，之后将体积调节至300克，之后将其过滤。将所得到的麦芽汁通过HPLC(糖谱)以及Anton Parr(柏拉图测量)进行分析。表3中给出结果。
表2：酶添加表
表3 过滤后获得的麦芽汁的糖谱(总数的％)。
术语“DP1”(聚合度1)表示葡萄糖或果糖，“DP2”表示麦芽糖(和异麦芽糖)，并且DP3表示麦芽三塘(以及潘糖和异潘糖)。术语“DP4+”或“DP4/4+”表示糊精，或聚合度为4或更高的不可发酵的麦芽寡糖。
从表3可以看到，Seq ID No 1的葡糖淀粉酶表现出众，并且能够从50％玉米辅料的浸出法淀粉糖化提供一种麦芽汁，其具有一个糖谱，该糖谱与用Attenuzyme Flex和液化玉米辅料获得的传统(参照实验)麦芽汁的糖谱是可比的。
Attenuzyme Flex甚至当以升高的剂量(6AGU/g麦芽粉)使用时也不能达到相同的低水平的DP4+。子试验4-7的柏拉图水平与子试验2的柏拉图水平是可比的。
实例3：葡糖淀粉酶与α-淀粉酶的组合在麦芽汁生产中(其中在不同调浆温度下进行浸出法淀粉糖化，随后为更高温度糖化并且模仿滤清)的影响。
以实验室规模用40％良好改性的麦芽和60％玉米麦芽粉组合物进行浸出法淀粉糖化试验。对于葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的酶剂量给予是如表4中所述。
表4：酶添加表
将麦芽和玉米麦芽粉以0.2mm的粒径研磨，并且添加相同比率的麦芽和玉米麦芽粉(未糊化的和未液化的)，其中玉米麦芽粉和麦芽一起被直接调浆(浸出法淀粉糖化)。对于每个子试验，将20g的麦芽和30g的玉米麦芽粉(总计50g)与200g的水以及60ppm的CaCl2混合。将开始调浆温度针对每个子试验分别调节为55℃、65℃、75℃或78℃的温度，如在表4中所示。利用该葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的热稳定性，采用在78℃的更高糖化温度，并且进一步包括在78℃的80min间歇，以模仿工业滤清下的条件。
添加这些酶(根据表4)，在开始各个调浆温度(55℃-78℃)保持60min，随后78℃保持60min并且继续在78℃，保持80min，以模仿工业滤清，并且最终冷却至20℃(3.9℃/min)。在孵育终止后，将每个样品的重量调节至300克，并且用滤纸使其经受过滤以从不可溶的化合物分离麦芽汁。将所得到的麦芽汁通过HPLC(糖谱)以及AntonParr(柏拉图测量)进行分析。结果示于表5中。
表5：过滤后麦芽汁的糖谱(总数的％)，如通过HPLC分析的
术语“DP1”(聚合度1)表示葡萄糖或果糖，“DP2”表示麦芽糖(和异麦芽糖)，并且DP3表示麦芽三塘(以及潘糖和异潘糖)。术语“DP4+”或“DP4/4+”表示糊精，或聚合度为4或更高的不可发酵的麦芽寡糖。
如在表5中所示，使用Seq ID 1的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶Seq ID 5的组合对60％玉米辅料加上40％麦芽进行的浸出法淀粉糖化产生显著高的DP1产率和低DP2、DP3以及DP4+浓度，尤其在高调浆温度时(≥75℃，子试验3和4)。更低的调浆温度(≤65℃，子试验1和2)显示可比的糖谱和明显更高的柏拉图水平。这些结果表明了葡糖淀粉酶Seq ID 1与α-淀粉酶Seq ID 5的组合对于浸出法淀粉糖化的出众表现，伴随具有卓越的糖谱以及可比得上或高于使用Attenuzyme Flex(表3，参照实验)进行淀粉糖化和糖化来蒸煮玉米辅料的传统方法的柏拉图水平。
实例4：葡糖淀粉酶与α-淀粉酶的组合在麦芽汁生产中(其中在65℃淀粉糖化以不同的时间进行浸出法淀粉糖化，随后为更高温度的糖化并且模仿滤清)的影响。
以实验室规模用40％良好改性的麦芽和60％麦芽粉玉米麦芽粉组合物进行浸出法淀粉糖化试验。对于葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的酶剂量给予是如表6中所述。
表6：酶添加表
对于子试验6，将麦芽和玉米麦芽粉以0.2mm的粒径研磨，并且添加相同比率的麦芽和玉米麦芽粉(未糊化的和未液化的)，其中玉米麦芽粉和麦芽一起被直接调浆(浸出法淀粉糖化)。对于每个子试验，将20g的麦芽和30g的玉米麦芽粉(总计50g)与200g的水混合，并且添加60ppm的CaCl2。将调浆温度调节至65℃。如在表6中所示，子试验1-6添加了相同的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶剂量，并且对每个子试验，将淀粉糖化在65℃分别进行10至60min。利用该葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的热稳定性，采用在75℃的更高糖化温度持续90min，并且进一步包括在78℃的80min间歇，以模仿工业滤清下的条件。
在开始调浆时添加这些酶(根据表6)，并在65℃保持10、20、30、40、50或60min，增加(1℃/min)至75℃，保持90min并且继续在78℃，保持80min，以模仿工业滤清，并且然后冷却至20℃(3.9℃/min)。在孵育终止后，将每个样品的重量调节至300克，并且用滤纸使其经受过滤以从不可溶的化合物分离麦芽汁。将所得到的麦芽汁通过HPLC(糖谱)以及Anton Parr(柏拉图测量)进行分析。结果在表7中给出。
表7：过滤后麦芽汁的糖谱(总数的％)，如通过HPLC分析的
如在表7中所示，在65℃调浆10至60min显示相似的糖(DP1-DP4+)浓度和柏拉图产率。该柏拉图和DP1产率是相当高并且相对低的DP4+。这些结果表明，使用葡糖淀粉酶Seq ID 1与α-淀粉酶Seq ID 5的组合进行的浸出法淀粉糖化可将65℃调浆时间从60min缩短至30min或更少。
Claims (17)
1.一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括
a)提供一种麦芽粉，该麦芽粉包括具有未糊化淀粉的淀粉来源，该未糊化淀粉的糊化温度高于68℃；
b)向一种包括该麦芽粉的醪液中添加一种葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶在80℃具有至少10％残余活性，并且
c)获得一种麦芽汁。
2.根据权利要求1所述的方法，其中淀粉糖化是在低于该未糊化的淀粉的糊化温度的温度下进行，并且煮浆是在高于该糊化温度的温度下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该麦芽粉包括麦芽。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该麦芽粉包括至少25％W/W的该未糊化淀粉。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该未糊化淀粉选自玉米、水稻或高粱，或其混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1是至少50％一致的。
7.根椐权利要求1所述的方法，其中该葡糖淀粉酶是以少于5AGU/g麦芽粉给予。
8.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括添加一种α-淀粉酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中该α-淀粉酶在75℃具有至少10％残余活性。
10.根据权利要求8所述的方法，其中该α-淀粉酶与SEQ ID NO:5是至少50％一致的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中该麦芽汁具有多于70％的葡萄糖。
12.根据权利要求1所述的方法，其中该麦芽汁具有少于20％的糊精(DP4+)。
13.根据权利要求2所述的方法，其中该淀粉糖化特征曲线在高于70℃的温度时包括一段间歇。
14.根据权利要求2所述的方法，其中总淀粉糖化时间是少于181min。
15.根据权利要求1所述的方法，其中该葡糖淀粉酶具有高于65℃的最适温度。
16.根据权利要求1所述的方法，进一步包括添加一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：普鲁兰酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶以及β葡聚糖酶。
17.根据权利要求1所述的方法，其中该麦芽汁被发酵为一种啤酒。
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