CN114867860A

CN114867860A - 用于生产发酵产物的方法

Info

Publication number: CN114867860A
Application number: CN202080086740.5A
Authority: CN
Inventors: 宋子良; 仓方悠马; B·F·欧曼
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2019-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-08-05
Also published as: AR120775A1; WO2021126966A1; BR112022011634A2; EP4077694A1; MX2022006438A; US20230023446A1; CA3158832A1

Abstract

本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中在液化期间存在和/或添加热稳定性木聚糖酶，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性。

Description

用于生产发酵产物的方法

技术领域

本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物(尤其是乙醇)的方法，其中在存在木聚糖酶的情况下液化含淀粉材料，该木聚糖酶在液化含淀粉材料时对存在的金属离子的抑制具有抗性。

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。

背景技术

从含淀粉材料生产发酵产物(如乙醇)是本领域中熟知的。目前在工业上使用两种不同种类的方法。最常使用的方法通常被称作“传统方法”，包括在高温下典型地使用细菌α-淀粉酶液化经糊化的淀粉，随后在葡糖淀粉酶和发酵生物体的存在下进行同时糖化和发酵。另一种众所周知的方法通常被称作“生淀粉水解”-方法(RSH方法)，包括典型地在至少一种葡糖淀粉酶的存在下在低于初始糊化温度进行颗粒淀粉的同时糖化和发酵。

尽管在过去几十年中发酵产物生产过程发生了显著改善，但是显著量的残余淀粉材料未被转化为所希望的发酵产物，如乙醇。

因此，仍然存在对于提供用于从含淀粉材料生产发酵产物(如乙醇)的方法的希望和需求，这些方法可以提供更高的发酵产物得率，或与传统方法相比的其他优点。

发明内容

本发明涉及使用发酵生物体从含淀粉材料生产发酵产物(尤其是如乙醇)的方法，其中在存在木聚糖酶的情况下液化含淀粉材料，该木聚糖酶在液化含淀粉材料时对存在的金属离子的抑制具有抗性。本发明还涉及用于本发明的方法中的组合物。与非抗金属离子抑制木聚糖酶相比，本发明的抗金属离子抑制木聚糖酶在水解玉米纤维和释放更多的纤维结合淀粉方面表现出改善的活性。与非抗金属离子抑制木聚糖酶相比，本发明的抗金属离子抑制木聚糖酶在完成液化后还产生更大量的短链寡糖，如DP1至DP6寡糖。

在第一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物(优选如乙醇)的方法，该方法包括以下步骤：

i)在高于初始糊化温度的温度(优选在80℃至90℃之间)，使用以下液化含淀粉材料：

-α-淀粉酶，如细菌α-淀粉酶；

-木聚糖酶，其在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，并且还具有大于80℃的熔点(DSC)；

-任选地，具有大于70℃熔点(DSC)的内切葡聚糖酶；

ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，木聚糖酶(尤其是来自热袍菌属的木聚糖酶)优选具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。

合适的热稳定性木聚糖酶的实例，特别是来自热袍菌属的木聚糖酶的实例包括本文SEQ ID NO:2中所示的木聚糖酶，例如源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的菌株；本文SEQ ID NO:3中所示的木聚糖酶，例如源自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)的菌株；本文SEQ ID NO:4中所示的木聚糖酶，例如源自嗜萘热袍菌(Thermotoga naphthophila)的菌株；或分别与本文SEQ ID NO:2、3和4的任何多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性的多肽。

在另一个方面，本发明涉及组合物，该组合物包含：-α-淀粉酶；-抗金属离子抑制木聚糖酶，其具有大于80℃、优选大于85℃、尤其是大于90℃、特别是大于95℃的熔点(DSC)；-任选地，内切葡聚糖酶；-任选地，蛋白酶；-任选地，产碳水化合物源的酶。

其他酶(如普鲁兰酶和植酸酶)也可以包含在本发明的组合物中。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶；-抗金属离子抑制木聚糖酶，其具有大于80℃、优选大于85℃、尤其是大于90℃、特别是大于95℃的熔点(DSC)；-蛋白酶，其具有大于80℃、优选大于85℃、尤其是大于90℃、特别是大于95℃的熔点(DSC)。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，其具有大于80℃、优选大于85℃、尤其是大于90℃、特别是大于95℃的熔点(DSC)；以及-热稳定性蛋白酶，其具有大于80℃、优选地大于85℃、尤其是大于90℃、特别是大于95℃的熔点(DSC)。

附图说明

图1是显示本发明的示例性抗金属离子抑制木聚糖酶，例如Tm木聚糖酶(SEQ IDNO:2)的最适温度的图。

图2是显示本发明的示例性抗金属离子抑制木聚糖酶，例如Tm木聚糖酶(SEQ IDNO:2)的温度稳定性的图。

具体实施方式

发明人已经发现，某些热稳定性木聚糖酶，如SEQ ID NO:1的嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)木聚糖酶被金属离子显著抑制，与之相反的是，某些热稳定性木聚糖酶(如来自热袍菌属的木聚糖酶，比如SEQ ID NO:2的海栖热袍菌木聚糖酶)表现出对金属离子抑制的抗性。令人惊讶的是，发明人出乎意料地发现，尽管通常在液化的玉米醪中发现的平均浓度的铁(Fe)离子、锌(Zn)离子和铜(Cu)离子存在的情况下，SEQ ID NO:1的嗜热网球菌木聚糖酶的相对活性减少了40％至80％，但来自热袍菌属的木聚糖酶，比如SEQ ID NO:2的海栖热袍菌木聚糖酶，在液化的玉米醪中存在平均浓度的铜离子的情况下保留了其相对活性的86％，在液化的玉米醪中存在平均浓度的铁离子的情况下保留了其相对活性的73％，并且在液化的玉米醪中存在平均浓度的锌离子的情况下保留了其相对活性的98％，这表明对金属离子抑制的显著抗性(参见实例6)。

发明人还出乎意料地发现，与非抗金属离子抑制木聚糖酶，如SEQ ID NO:1的嗜热网球菌木聚糖酶相比，本文所述的抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶，如来自热袍菌属的木聚糖酶，比如SEQ ID NO:2的海栖热袍菌木聚糖酶，在水解玉米纤维和释放更多的纤维结合淀粉方面表现出了改善的活性。

此外，发明人令人惊讶地发现，与非抗金属离子抑制木聚糖酶相比，本文所述的抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶，如来自热袍菌属的木聚糖酶，比如SEQ ID NO:2的海栖热袍菌木聚糖酶在液化完成后产生更大量的短链寡糖，如DP1至DP6寡糖。

观察到来自热袍菌属的本发明的木聚糖酶含有包含氨基酸酪氨酸(Y)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)和天冬氨酸(D)的基序，其中谷氨酸残基是催化残基。本发明涵盖在本发明的组合物或方法中使用含有YITEMD(SEQ ID NO:30)的基序的任何热袍菌属木聚糖酶(比如来自GH10家族)。

在第一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物(优选如乙醇)的方法，该方法包括以下步骤：i)在存在热稳定性木聚糖酶的情况下，在大于初始糊化温度的温度下液化含淀粉材料，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性；ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及iii)使用发酵生物体进行发酵。在一个实施例中，液化步骤i)在存在α-淀粉酶，即热稳定性α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶和/或热稳定性蛋白酶的情况下进行。

在第一方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在步骤i)中使用在液化含淀粉材料时对金属离子抑制具有抗性的热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料减少了在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量。

在第一方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶时在液化步骤i)结束时短链寡糖的量相比，在步骤i)中使用在液化含淀粉材料时对金属离子抑制具有抗性的热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料增加了在液化步骤i)结束时短链寡糖的量。

在第二方面，本发明涉及用于在从含淀粉材料生产发酵产物的方法中减少在液化结束时存在的残余淀粉的量的方法，该方法包括：i)用热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料以生产液化物，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，其中与使用在液化含淀粉材料时对因存在金属离子的抑制不具有抗性的木聚糖酶生产的液化物相比，该液化物具有减少的残余淀粉的量。在第二方面的一个实施例中，使该液化物进行步骤ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及iii)使用发酵生物体进行发酵。

如本文所用，“热稳定性”意指具有特定酶活性的多肽(即，酶，例如木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶)在酶执行其功能所需的特定时间段内在相关温度范围内保留其显著量的活性(例如，比活性、相对活性等)。例如，本文披露的用于液化步骤i)的酶在约75℃至100℃、优选约80℃至95℃、更优选约82℃至92℃或约85℃、约88℃或约90℃的温度范围内表现出热稳定性。术语“热稳定性”还涵盖具有在相关温度范围内的最适温度的酶，尽管本披露涵盖具有更高或更低的最适温度的酶，但是只要该酶在相关时间段内在相关温度范围内保留其显著量的活性(例如，液化中使用的酶将在从75℃至100℃温度范围内、在10分钟至2小时的任何时间保留其活性)。本发明的热稳定性酶(例如，抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶、热稳定性蛋白酶、热稳定性α-淀粉酶、热稳定性内切葡聚糖酶、热稳定性葡糖淀粉酶、热稳定性普鲁兰酶、植酸酶等)当在至少75℃、80℃、82℃、84℃、85℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、95℃、96℃、98℃或多达100℃的温度下用于液化多达10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.2小时、1.4小时、1.5小时、1.6小时、1.8小时或多达2小时时保留它们活性的至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。本发明的热稳定性酶(例如，抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶、热稳定性蛋白酶、热稳定性α-淀粉酶、热稳定性内切葡聚糖酶、热稳定性葡糖淀粉酶、热稳定性普鲁兰酶、植酸酶等)优选具有约75℃至约110℃，例如大于约80℃、约82℃、约84℃、约85℃、约86℃、约88℃、约90℃、约92℃、约94℃、约95℃、约96℃、约98℃、约100℃、约105℃或多达约110℃的熔点(DSC)。DSC熔点可以通过本领域技术人员可获得的技术来确定，例如通过以下针对木聚糖酶所述的差示扫描量热法测定。此外，活性测定可用于确定酶在不同温度下的活性以确定本发明的特定热稳定性酶的最适温度，以及确定热稳定性酶在特定温度范围内或在一段时间内保留多少活性。活性测定的实例描述于以下实例中。

本领域技术人员会理解，液化物中残余淀粉减少的程度可以变化，比如，取决于木聚糖酶的浓度，以及对本领域技术人员而言显而易见的其它因素。比如，与不存在热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下的液化物中残余淀粉的量相比，残余淀粉可以减少了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。当使用抗金属离子抑制木聚糖酶液化含淀粉材料时，实例7中所述的测定可用于确定存在于液化物中的残余淀粉的量，并与对照(例如，使用非抗金属离子抑制木聚糖酶，如SEQ ID NO:1的木聚糖酶)比较以确定使用本发明的抗金属离子抑制木聚糖酶减少残余淀粉的程度。

在第三方面，本发明涉及用于在从含淀粉材料生产发酵产物的方法中增加在液化结束时存在的短链寡糖的量的方法，该方法包括：i)用热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料以生产液化物，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，其中与使用在液化含淀粉材料时对因存在金属离子的抑制不具有抗性的木聚糖酶生产的液化物相比，该液化物具有增加的短链寡糖的量。在第三方面的一个实施例中，使该液化物进行步骤ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及iii)使用发酵生物体进行发酵。

如本文所用，短语“短链寡糖”是指DP1至DP6的寡糖，包括比如葡萄糖(DP1)、麦芽糖(DP2)、麦芽三糖(DP3)、麦芽四糖(DP4)、麦芽五糖(DP5)和麦芽六糖(DP6)。本领域技术人员会理解，在液化物中短链寡糖增加的程度可以变化，比如，取决于木聚糖酶的浓度，以及对本领域技术人员而言显而易见的其它因素。比如，与不存在热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下的液化物中残余淀粉的量相比，短链寡糖的总量可以增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。当使用抗金属离子抑制木聚糖酶液化含淀粉材料时，实例8中描述的测定可用于确定液化物中存在的短链寡糖的量，并与对照(例如，使用非抗金属离子抑制木聚糖酶，如SEQ ID NO:1的木聚糖酶)比较以确定使用本发明的抗金属离子抑制木聚糖酶增加短链寡糖的程度。

在一个实施例中，与不存在本发明的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下的液化物中DP1的量相比，该液化物中存在的DP1的量增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。在一个实施例中，与不存在本发明的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下的液化物中DP2的量相比，该液化物中存在的DP2的量增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。在一个实施例中，与不存在本发明的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下液化物中DP3的量相比，该液化物中存在的DP3的量增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。在一个实施例中，与不存在本发明的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下液化物中DP4的量相比，该液化物中存在的DP4的量增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。在一个实施例中，与不存在本发明的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下液化物中DP5的量相比，该液化物中存在的DP5的量增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。在一个实施例中，与不存在本发明的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶的情况下液化物中DP6的量相比，该液化物中存在的DP6的量增加了至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％。

步骤ii)和iii)可以依序或同时进行。在一个优选的实施例中，步骤ii)和iii)同时进行。木聚糖酶，其优选具有大于80℃的熔点(DSC)；可以在液化步骤i)之前和/或期间添加α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，以及任选的具有大于70℃的熔点(DSC)的热稳定性内切葡聚糖酶。任选地，也可以存在和/或添加的蛋白酶、产碳水化合物源的酶，优选地，葡糖淀粉酶、普鲁兰酶、和/或植酸酶。在一个优选的实施例中，以下定义的本发明的组合物可适用于本发明方法中的液化。酶可以单独添加或作为一种或多种混合组合物添加，该混合组合物包含α-淀粉酶，优选具有大于80℃的熔点(DSC)的木聚糖酶、以及任选的内切葡聚糖酶、和任选的蛋白酶、产碳水化合物源的酶、普鲁兰酶和/或植酸酶。

α-淀粉酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。

在一个实施例中，α-淀粉酶是本文SEQ ID NO:5中所示的α-淀粉酶的变体，如源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearomthermphilus)的菌株的变体，具有选自下组的突变：-I181*+G182*；-I181*+G182*+N193F；优选地-I181*+G182*+E129V+K177L+R179E；-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；和-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179S+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ IDNO:5用于编号)。

当嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶产生时通常天然地截短为约491个氨基酸长(与WO99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5进行比较)，如从约480至495个氨基酸长。

在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽胞杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，以在0.01-10KNU-A/g DS之间的浓度在液化中按剂量添加(dosed)，例如，在0.02和5KNU-A/g DS之间，如0.03和3KNU-A，优选地0.04和2KNU-A/g DS，如尤其是0.01和2KNU-A/g DS。

在一个实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，以在0.0001至1mg EP(酶蛋白)/g DS，例如，0.0005至0.5mg EP/gDS，如0.001至0.1mg EP/g DS的浓度在液化中按剂量添加。

在一个方面，来自热袍菌属的含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)的GH10木聚糖酶用于本发明的方法或组合物中。合适的热稳定性木聚糖酶的实例，特别是来自热袍菌属的木聚糖酶，包括本文SEQ ID NO:2中所示的木聚糖酶，例如源自海栖热袍菌的菌株；本文SEQID NO:3中所示的木聚糖酶，例如源自那不勒斯栖热袍菌的菌株；本文SEQ ID NO:4中所示的木聚糖酶，例如源自嗜萘热袍菌的菌株；或分别与本文SEQ ID NO:2、3和4的任何多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性的多肽。

在一个实施例中，热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶是来自热袍菌属的GH10家族木聚糖酶，其含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)并且进一步与SEQ ID NO:2的任何多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性。

在一个实施例中，热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶是来自热袍菌属的GH10家族木聚糖酶，其含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)并且进一步与SEQ ID NO:3的任何多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性。

在一个实施例中，热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶是来自热袍菌属的GH10家族木聚糖酶，其含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)并且进一步与SEQ ID NO:4的任何多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性。

具有大于70℃的熔点(DSC)的适合的任选的内切葡聚糖酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的热稳定性内切葡聚糖酶”-部分中。

在一个优选的实施例中，内切葡聚糖酶是本文的SEQ ID NO:7中所示的内切葡聚糖酶，如源自雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)的菌株(WO 2013/019780)的内切葡聚糖酶、或与本文的SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，内切葡聚糖酶是本文的SEQ ID NO:7中所示的内切葡聚糖酶，如源自雷塞氏篮状菌的菌株(WO2013/019780–通过引用特此并入)的内切葡聚糖酶、或与本文SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的具有大于70℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。

任选的蛋白酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在的和/或添加的蛋白酶”-部分中。

适合的任选的产碳水化合物源的酶、优选地热稳定性产碳水化合物源的酶、特别是葡糖淀粉酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中。

适合的任选的普鲁兰酶可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的普鲁兰酶”-部分中。在一个优选的实施例中，普鲁兰酶源自芽孢杆菌属物种。

任选的植酸酶的实例可以发现于下文的“在液化期间存在和/或添加的植酸酶”-部分中。在一个优选的实施例中，植酸酶源自布丘氏菌属(Buttiauxella)的菌株。

在糖化和/或发酵或同时糖化和发酵(SSF)期间存在的和/或添加的适合的纤维素酶或纤维素分解酶组合物可以发现于下文的“在糖化和/或发酵或SSF期间存在和/或添加的纤维素酶或纤维素分解酶组合物”-部分中。在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自里氏木霉(Trichoderma reesei)。

在一个优选的实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:18)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16)。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含披露为WO 2011/041397中SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:19的埃默森青霉GH61A多肽、以及披露为WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有以下取代的一种、优选地以下取代的全部：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文的SEQ ID NO:16用于编号)。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含披露为WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有以下取代的一种、优选地以下取代的全部：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文的SEQ ID NO:16用于编号)。

根据本发明的方法，在液化期间的pH可以是在4.0至6.5之间，如4.5至6.2、如大于4.8至6.0、如在5.0至5.8之间。

根据本发明，温度可以大于初始糊化温度。术语“初始糊化温度”指典型地通过加热，淀粉开始溶解的最低温度。针对不同淀粉，该温度可以变化。初始糊化温度可以从50℃至70℃。

在一个实施例中，在液化步骤i)期间的温度是在从70℃至100℃的范围，如在70℃至95℃之间、如在75℃至90℃之间、优选地在80℃至90℃之间、如约85℃。

在一个实施例中，本发明的方法在步骤i)之前进一步包括以下步骤：

a)优选地通过干磨来减小含淀粉材料的粒度；

b)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。

该含淀粉起始材料(如全谷物)可以例如，经过碾磨减少粒度，以便展开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常存在两种类型的方法：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿磨常常应用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨两者都是淀粉加工领域中熟知的。根据本发明，优选干磨。可以将粒度甚至进一步减少，例如通过土耳其式研磨(Turkishgrinding)。在一个实施例中，将粒度减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％、优选地至少70％、更优选地至少80％、尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。在一个实施例中，至少75％的含淀粉材料适合通过具有小于0.5mm筛网的筛子，更优选地至少79％或80％的含淀粉材料适合通过具有小于0.425mm筛网的筛子。在一个实施例中，至少50％的含淀粉材料适合通过具有0.25mm至0.425mm筛网的筛子，更优选地至少59％或60％的含淀粉材料适合通过具有0.25mm至0.425mm筛网的筛子。

水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55w/w-％干固体(DS)，优选25-45w/w-％干固体(DS)，更优选30-40w/w-％干固体(DS)。

该浆料可以加热至大于初始糊化温度，优选地在70℃-95℃之间，如在80℃-90℃之间，pH在5.0-7.0之间，优选地在5.0和6.0之间，持续30分钟至5小时，如约2小时。

在一个实施例中，在从70℃至95℃的温度在从4至6的pH，将液化步骤i)进行0.5至5小时。

在一个优选的实施例中，在从80℃至90℃的温度在从4至6的pH，将液化步骤i)进行0.5至3小时。

可以将α-淀粉酶、抗金属离子抑制木聚糖酶和任选的热稳定性内切葡聚糖酶、任选的蛋白酶、任选的产碳水化合物源的酶、特别是葡糖淀粉酶、任选的普鲁兰酶、和/或任选的植酸酶初始添加至水性浆料以开始液化(稀释)。在一个实施例中，这些酶中仅有一部分被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分在液化步骤i)期间添加。

在一个实施例中，该水性浆料在步骤i)中进行液化之前可以喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。该喷射蒸煮可在95℃至160℃之间、如在110℃至145℃、优选120℃至140℃、如125℃至135℃、优选约130℃的温度进行约1至15分钟，优选进行约3至10分钟，尤其是大约5分钟左右。

糖化与发酵

根据本发明的方法，一种或多种产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，可以是在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间存在和/或添加的。该产碳水化合物源的酶优选地可以是葡糖淀粉酶，但还可以是选自由以下组成的组的酶：β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶和α-葡糖苷酶。在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)期间添加的产碳水化合物源的酶典型地与任选地不同于在液化步骤i)期间添加的任选的产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶。在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶一起添加的。

产碳水化合物源的酶(包括葡糖淀粉酶)的实例可以发现于下文的“在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶”部分中。

当依序进行糖化和发酵时，糖化步骤ii)可以在本领域中熟知的条件下进行。比如，糖化步骤ii)可以持续多达从约24至约72小时。

在一个实施例中，进行预糖化步骤。在一个实施例中，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)之前进行的预糖化期间添加产碳水化合物源的酶。也可以在同时糖化和发酵(SSF)之前进行的预糖化期间添加产碳水化合物源的酶。

在一个实施例中，在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)之前进行的预糖化期间添加产碳水化合物源的酶、优选地葡糖淀粉酶、和/或纤维素酶或纤维素分解酶组合物。也可以在同时糖化和发酵(SSF)之前进行的预糖化期间添加产碳水化合物源的酶、优选地葡糖淀粉酶、和纤维素酶或纤维素分解酶组合物。预糖化在30℃至65℃之间(典型地约60℃)的温度典型地进行40至90分钟。在同时糖化和发酵(SSF)中，预糖化之后可以是发酵期间的糖化。糖化典型地在从20℃至75℃、优选地从40℃至70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH、如在约pH 4.5进行。

同时糖化和发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤ii)和发酵步骤iii)。糖化可能不存在保持阶段，这意味着，发酵生物体(如酵母)和一种或多种酶(根据本发明的优选的实施例中，葡糖淀粉酶、和纤维素酶或纤维素分解酶组合物)可以一起添加。然而，还涵盖了分开添加发酵生物体以及一种或多种酶。根据本发明，发酵或SSF可典型地在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃、优选大约32℃左右的温度进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。在一个实施例中，pH是在3.5至5之间，特别是在3.8和4.3之间。

发酵培养基

“发酵培养基”(Fermentation media或fermentation medium)是指其中进行发酵的环境。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物体代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物体的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源，如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。

发酵生物体

术语“发酵生物体”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物体，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物体能够使糖(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所希望的发酵产物(如乙醇)。发酵生物体的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。

在发酵(如SSF)期间，有活力的发酵生物体的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物体(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物体(如酵母)计数在从10⁵至10¹²，优选从10⁷至10¹⁰的范围内，尤其是约5x 10⁷个。

可商购的酵母的实例包括例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentisis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。

含淀粉材料

根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适用于本发明的方法中的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆类或甜薯或其混合物或者由其衍生的淀粉，或谷类。还涵盖糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。

在一个优选的实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物体进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明涵盖的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的方法是用于生产醇，如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。

回收

发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。

在液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明，在液化中使α-淀粉酶与优选具有大于80℃、如在80℃和95℃之间的熔点(DSC)的抗金属离子抑制木聚糖酶、以及任选的内切葡聚糖酶、任选的蛋白酶、任选的产碳水化合物源的酶、特别是葡糖淀粉酶、任选的普鲁兰酶、和/或任选的植酸酶一起存在和/或添加。

在液化步骤i)期间添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，如尤其是芽孢杆菌α-淀粉酶，如在液化期间使用的温度下稳定的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。

细菌α-淀粉酶

术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在一个实施例中，芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种TS-23、或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属物种。

细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:5的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、和WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、以及WO 2009/061380中披露为SEQ ID NO:1的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶(将所有序列通过引用特此并入)。

在一个实施例中，细菌α-淀粉酶可以是分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5以及WO 2009/061380中的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在一个实施例中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQID NO:5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在一个优选的实施例中，α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体可以是在重组产生期间天然地截短的。例如，成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在C-末端截短的，所以它是约491个氨基酸长(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1比较)，如从480至495个氨基酸长。

该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这种变体的实例可见于以下任一项中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、WO 02/10355以及WO 2009/061380(所有文件通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038、和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下情况的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181、和/或G182的任何一处的一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失——参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5所阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌(BSG)α-淀粉酶，其与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5所阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比在对应于位置R179、G180、I181、和G182具有一个或两个氨基酸缺失，优选地其对应于R179和G180具有双缺失，或优选地位置181和182的缺失(被表示为I181*+G182*)，并且任选地，进一步包含N193F取代(被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或本文的SEQ ID NO:5中的S239的位置处具有取代。

在一个实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E、或Q变体，优选S242Q、或A变体(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)。

在一个实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)。

其他涵盖的变体是在WO 2009/061380中披露的芽孢杆菌属(Bacillus)物种TS-23变体，尤其是WO 2009/061380的权利要求1中定义的变体(通过引用特此并入)。

细菌杂合α-淀粉酶

细菌α-淀粉酶也可以是杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的α-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基。在一个优选的实施例中，杂合体具有下列取代中的一种或多种，尤其是全部：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V、以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。

在一个实施例中，细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人,2002,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]277(29):.267501-26507，被称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ IDNO:2所示的α-淀粉酶相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。

热稳定性α-淀粉酶

根据本发明，热稳定性α-淀粉酶可以与热稳定性木聚糖酶组合用于液化步骤i)中，该热稳定性木聚糖酶对因其中的金属离子的抑制具有抗性，优选具有大于80℃的熔点(DSC)。热稳定性α-淀粉酶可以与任选的产碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶和/或任选的普鲁兰酶一起添加。任选地，可以包括具有大于70℃、如大于75℃、特别是大于80℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。热稳定性α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶)优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌或芽孢杆菌属物种TS-23。在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mMCaCl₂下具有至少10的T1/2(min)。

术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属菌种。

细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过引用特此并入)。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在一个优选的实施例中，α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生期间天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比较)。

该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文件通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723(通过引用特此并入)中披露，包括具有以下缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体，这些变体在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:5所阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(其通过引用特此并入)中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5所阐述的的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或本文的SEQ ID NO:5中的S239的位置处具有取代。

在一个实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)。

在一个实施例中，细菌α-淀粉酶可为截短的芽孢杆菌属α-淀粉酶。尤其地，截短是这样的，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:5中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长。

最重要的是，用于在液化中使用的合适α-淀粉酶必须具有足够的热稳定性，因此可以使用在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下T1/2(min)至少为10、如至少15、如至少20、如至少25、如至少30、如至少40、如至少50、如至少60、如10-70之间、如在15-70之间、如在20-70之间、如在25-70之间、如在30-70之间、如在40-70之间、如在50-70之间、如在60-70之间的任何α-淀粉酶。

根据本发明，α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶，如热稳定性细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在一个实施例中，根据本发明使用的α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少10的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少15的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少20的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少25的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少30的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少40的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少50的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少60的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在10-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在15-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在20-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在25-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在30-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在40-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在50-70之间的T1/2(min)。

在一个实施例中，该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有在60-70之间的T1/2(min)。

在本发明的一个实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如WO99/019467中作为SEQ ID NO:3(本文的SEQ IDNO:5)披露的嗜热脂肪芽孢杆菌，其在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，具有以下突变列表中的突变。

在一个优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶选自以下嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组(使用SEQ ID NO:5进行编号)：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+S173N+E188P+H208Y+S242Y+K279I；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+E188P+K279W；

-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+W115D+D117Q+T133P；并且

其中该变体与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。

应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可以是这样的，使得WO99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:5中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长。

在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶变体可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:5所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％同一性程度的酶。

在液化期间存在和/或添加的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶

根据本发明，优选具有大于80℃的熔点(DSC)的抗金属离子抑制木聚糖酶与例如α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶(以上描述的))组合存在和/或添加至液化步骤i)中。短语“抗金属离子抑制木聚糖酶”和“对金属离子的抑制具有抗性的木聚糖酶”在本文中可互换使用，是指与存在金属离子的情况下失去其显著量活性的木聚糖酶相比，在存在金属离子的情况下保留其显著量的相对活性的木聚糖酶。例如，与不存在金属离子的情况下的不抗金属离子抑制木聚糖酶的活性相比，存在金属离子的情况下，不抗金属离子抑制木聚糖酶将损失其相对活性的至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％或至少80％，与此相反的是，与不存在金属离子的情况下的抗金属离子抑制木聚糖酶的活性相比，存在金属离子的情况下，抗金属离子抑制木聚糖酶将保留其相对活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。为了确定木聚糖酶是否抗金属离子抑制，可以测定与不存在那些一种金属离子的情况下木聚糖酶的相对活性相比，存在一种或多种金属离子情况下木聚糖酶的相对活性。

抗金属离子抑制木聚糖酶还可以不仅在存在金属离子的情况下保留其相对活性的100％，而且在存在金属离子的情况下还可以表现出增加的相对活性。例如，与不存在金属离子的情况下木聚糖酶的相对活性相比，本发明的抗金属离子抑制木聚糖酶可以表现出增加了至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％或至少20％的相对活性。

木聚糖酶的热稳定性可以如“材料与方法”部分“通过差示扫描量热法确定木聚糖酶的T_d”中所述来确定。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶，尤其是来自热袍菌属的木聚糖酶具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶，尤其是来自热袍菌属的GH10家族木聚糖酶，含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时的短链寡糖的量相比，在步骤i)中使用来自热袍菌属的热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料增加在液化步骤i)结束时短链寡糖的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。在一个实施例中，含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)的来自嗜热袍菌属的热稳定性木聚糖酶用于在液化中使用以增加液化物中短链寡糖的量。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在步骤i)中使用来自热袍菌属的热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料减少了在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。在一个实施例中，含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)的来自热袍菌属的热稳定性木聚糖酶用于在液化中使用以减少在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量。

在一个优选的实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与本文SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如海栖热袍菌的菌株。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时短链寡糖的量相比，在步骤i)中使用与本文SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的热稳定性木聚糖酶(优选源自热袍菌属的菌株，如海栖热袍菌的菌株)液化含淀粉材料增加在液化步骤i)结束时短链寡糖的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在步骤i)中使用与本文SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的热稳定性木聚糖酶(优选源自热袍菌属的菌株，如海栖热袍菌的菌株)液化含淀粉材料减少在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在平均浓度的金属离子的情况下保留其相对活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在铜离子的情况下保留其相对活性的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在铁离子的情况下保留其相对活性的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在锌离子的情况下保留其相对活性的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且：(i)在液化含淀粉材料时在存在多达0.25mM铜离子的情况下，保留其相对活性的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％；(ii)在液化含淀粉材料时在存在多达0.125mM铁离子的情况下，保留其相对活性的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％；(iii)在液化含淀粉材料时在存在多达0.25mM的锌离子的情况下，保留其相对活性的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)的菌株。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时短链寡糖的量相比，在步骤i)中使用与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的热稳定性木聚糖酶(优选源自热袍菌属的菌株，如那不勒斯栖热袍菌的菌株)液化含淀粉材料增加在液化步骤i)结束时短链寡糖的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在步骤i)中使用与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的热稳定性木聚糖酶(优选源自热袍菌属的菌株，如那不勒斯栖热袍菌的菌株)液化含淀粉材料减少在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在平均浓度的金属离子的情况下保留其相对活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在铜离子的情况下保留其相对活性的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在铁离子的情况下保留其相对活性的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在锌离子的情况下保留其相对活性的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且：(i)在液化含淀粉材料时在存在多达0.25mM铜离子的情况下，保留其相对活性的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％；(ii)在液化含淀粉材料时在存在多达0.125mM铁离子的情况下，保留其相对活性的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％；(iii)在液化含淀粉材料时在存在多达0.25mM的锌离子的情况下，保留其相对活性的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与本文SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％，如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如嗜萘热袍菌的菌株。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时的短链寡糖的量相比，在步骤i)使用与本文SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的热稳定性木聚糖酶(优选源自热袍菌属的菌株，如嗜萘热袍菌的菌株)液化含淀粉材料增加在液化步骤i)结束时短链寡糖的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。

在第一、第二和第三方面的一个实施例中，与在液化步骤i)中使用非抗金属离子抑制的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的Dt木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在步骤i)中使用与本文SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的热稳定性木聚糖酶(优选源自热袍菌属的菌株，如嗜萘热袍菌的菌株)液化含淀粉材料减少在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量(例如，液化物中短链寡糖的量)。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在平均浓度的金属离子的情况下保留其相对活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在铜离子的情况下保留其相对活性的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在铁离子的情况下保留其相对活性的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且在液化含淀粉材料时在存在锌离子的情况下保留其相对活性的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在一个实施例中，抗金属离子抑制木聚糖酶与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，并且：(i)在液化含淀粉材料时在存在多达0.25mM铜离子的情况下，保留其相对活性的至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％；(ii)在液化含淀粉材料时在存在多达0.125mM铁离子的情况下，保留其相对活性的至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％；(iii)在液化含淀粉材料时在存在多达0.25mM的锌离子的情况下，保留其相对活性的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

在液化期间存在和/或添加的热稳定性内切葡聚糖酶

根据本发明，在液化步骤i)中可以与抗金属离子抑制木聚糖酶(优选具有大于80℃的熔点(DSC))组合存在和/或添加熔点(DSC)大于70℃(如在70℃和95℃之间)的任选的内切葡聚糖酶(“EG”)，和任选地热稳定性α-淀粉酶、内切葡聚糖酶、产碳水化合物源酶，特别是葡糖淀粉酶，任选地普鲁兰酶和/或任选地植酸酶。

内切葡聚糖酶的热稳定性可以如“材料与方法”部分所述来确定。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶具有大于72℃、如大于74℃、如大于76℃、如大于78℃、如大于80℃、如大于82℃、如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如在70℃和95℃之间、如在76℃和94℃之间、如在78℃和93℃之间、如在80℃和92℃之间、如在82℃和91℃之间、如在84℃和90℃之间的熔点(DSC)。

在一个优选的实施例中，在本发明的方法中使用的或包含在本发明的组合物中的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶(参见在万维网的CAZy数据库)。在一个实施例中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文的SEQ ID NO:7中所示的雷塞氏篮状菌内切葡聚糖酶；本文的SEQ ID NO:22中所示的胶囊青霉(Penicilliumcapsulatum)内切葡聚糖酶、以及本文的SEQ ID NO:23中所示的褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)内切葡聚糖酶。在一个实施例中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在一个实施例中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文的SEQ ID NO:25中所示的粪生粪壳菌(ordaria fimicola)或本文的SEQ ID NO:24中所示的土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。在一个实施例中，内切葡聚糖酶是源自篮状菌属的菌株，如雷塞氏篮状菌的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:22的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自青霉属的菌株，如胶囊青霉的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:23的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自长毛盘菌属(Trichophaea)的菌株，如褐孢长毛盘菌的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:24的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:25的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选源自粪壳菌属的菌株，如粪生粪壳菌的菌株。

在一个实施例中，在液化步骤i)中以1-10,000μg EP(酶蛋白)/g DS、如10-1,000μg EP/g DS的剂量添加内切葡聚糖酶。

在液化期间存在的和/或添加的蛋白酶

在本发明的一个实施例中，在液化中，可以将任选的蛋白酶(如热稳定性蛋白酶)与热稳定性金属离子抑制抗性木聚糖酶(优选具有大于80℃的熔点(DSC))、以及任选地热稳定性α-淀粉酶、内切葡聚糖酶、产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，任选地普鲁兰酶和/或任选地植酸酶可以一起存在和/或添加。

蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)、以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。

在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定性蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)的蛋白酶，优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。

为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；或基因工程化的或合成的蛋白酶。

可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。

在一个实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定所确定的，热稳定性蛋白酶具有JTP196变体或蛋白酶Pfu(本文的SEQ ID NO:11)的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。

对于在本发明的方法或组合物中使用的热稳定性蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。

在一个优选的实施例中，热稳定性蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本发明的方法或组合物中使用的热稳定性蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。

在一个实施例中，热稳定性蛋白酶是披露于以下的变体：在WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文作为SEQ ID NO:6所示的，该变体进一步具有选自以下列表的突变：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L。

在一个优选的实施例中，热稳定性蛋白酶是披露为以下的成熟金属蛋白酶的变体：在WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或在WO 2010/008841中披露的SEQID NO:1或本文的SEQ ID NO:6的成熟部分，该变体具有以下突变：D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在一个实施例中，蛋白酶变体与在WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或在WO 2010/008841中披露的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:6的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。

热稳定性蛋白酶还可源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，热稳定性蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株(pfu蛋白酶)。

在一个实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、和本文的SEQ ID NO:11所示的一种蛋白酶。

在一个实施例中，热稳定性蛋白酶是在本文的SEQ ID NO:11中披露的一种或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:11具有至少80％同一性、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。

强烈火球菌蛋白酶是根据本发明的热稳定性蛋白酶。如US-2018-0371505(该文献对于用于确定热稳定性的测定的描述，特别是如实例5中所述的通过引用特此并入)的实例5中所述确定的，发现商业产品强烈火球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性(参见实例5)。

在一个实施例中，如US-2018-0371505(该文献对于用于确定热稳定性的测定的描述，特别是如实例2中所述的通过引用特此并入)的实例2中所述确定的，热稳定性蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的超过20％的热稳定性值。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、如超过105％、如超过110％、如超过115％、如超过120％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在20％和50％之间、如在20％和40％之间、如20％和30％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在50％和115％之间、如在50％和70％之间、如在50％和60％之间、如在100％和120％之间、如在105％和115％之间的热稳定性。

在一个实施例中，如US-2018-0371505(该文献对于用于确定热稳定性的测定的描述，特别是如实例2中所述的通过引用特此并入)的实例2中所述确定的，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的超过10％的热稳定性值。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，超过10％，如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，在10％与50％之间、如在10％与30％之间、如在10％与25％之间的热稳定性。

在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的确定为在80℃的残余活性；以及/或者

在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的确定为在84℃的残余活性。

“相对活性”和“残余活性”的测定如US-2018-0371505(该文献对于用于确定热稳定性的测定的描述，尤其是如实例2中所述的通过引用特此并入)的实例2中所述进行。

在一个实施例中，蛋白酶源自嗜热裂孢菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:26中所示的解纤维素嗜热裂孢菌(Thermobifida cellulosytica)蛋白酶或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶源自嗜热裂孢菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:27中所示的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)蛋白酶(在WO 2018/118815A1中称为SEQ ID NO:8，其全部内容通过引用并入本文)或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶源自嗜热裂孢菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:28中所示的耐盐嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)蛋白酶(在WO 2018/118815 A1中称为SEQ ID NO:10，其全部内容通过引用并入本文)或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶源自高温球菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:29中所示的诺蒂利高温球菌(Thermococcus nautili)蛋白酶(在WO 2018/169780A1中称为SEQ ID NO:3，其全部内容通过引用并入本文)或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃可以具有大于90℃、如大于100℃的热稳定性，如使用使用下文材料与方法部分中披露的Zein-BCA测定所确定的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有大于60％，如大于90％、如大于100％、如大于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，如在70％-120％之间、如在80％-120％之间、如在90％-120％之间、如在100％-120％之间、如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。

在一个实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定所确定的，热稳定性蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。

在液化期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶

根据本发明，在液化中，任选的产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶可以与热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶(优选具有大于80℃的熔点(DSC))以及任选的α-淀粉酶、具有大于70℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶、热稳定性蛋白酶、以及任选的普鲁兰酶和/或任选的植酸酶一起存在和/或添加。

术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵生物体用作能量源，比如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化成所希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。

在一个优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定性的。产碳水化合物源的酶、特别是热稳定性葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起或分开添加。在一个实施例中，如US-2018-0371505(该文献对于确定热稳定性的测定的描述，尤其是如实例4中所述的通过引用特此并入)的实例4(热稳定性)所述确定的，该产碳水化合物源的酶、优选热稳定性葡糖淀粉酶，在85℃具有至少20％、至少30％、优选至少35％的相对活性热稳定性。

在一个实施例中，产碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，在pH 5.0的pH最佳值时具有至少90％，优选至少95％、优选至少97％、例如100％的相对活性，如实例4(pH最佳值)中所述来确定。

在一个实施例中，产碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，在pH 5.0具有至少80％，至少85％、至少90％的pH稳定性，如实例4(pH稳定性)中所述来确定。

在具体且优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉的菌株，特别是在WO 2011/127802(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:12中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶。

在一个实施例中，热稳定性葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:14中所示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性。

在一个实施例中，产碳水化合物源的酶、特别是热稳定性葡糖淀粉酶是本文的SEQID NO:12中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶。

在一个优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是WO2011/127802中披露为SEQ IDNO:2的以及本文的SEQ ID NO:14所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，其具有K79V取代(称为“PE001”)(使用SEQ ID NO:12所示的成熟序列进行编号)。如在WO2013/036526(其通过引用特此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。

涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用特此并入)中。

在一个实施例中，这些变体对蛋白酶降解具有降低的敏感度。

在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改善的热稳定性。

更具体地，在一个实施例中，该葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:12进行编号)，并且进一步包括至少一种以下取代或取代的组合：

T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；

R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。

在一个优选的实施例中，草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有使用本文的SEQ ID NO:12进行编号的K79V取代(PE001变体)，并且进一步包含以下突变中的一种：P11F+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶变体(如草酸青霉葡糖淀粉酶变体)与本文的SEQ IDNO:12的成熟多肽具有至少60％，如至少70％，如至少75％的同一性，优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，以及甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的同一性。

产碳水化合物源的酶(特别是葡糖淀粉酶)能以0.1-100微克EP/g DS、如0.5-50微克EP/g DS、如1-25微克EP/g DS、如2-12微克EP/g DS的量添加。

在液化期间存在和/或添加的普鲁兰酶

任选地，在液化步骤i)期间普鲁兰酶可以与抗金属离子抑制的木聚糖酶(优选具有大于80℃的熔点(DSC))一起存在和/或添加。如上所述，在液化步骤i)期间还可以任选地存在和/或添加热稳定性α-淀粉酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶，优选地热稳定性葡糖淀粉酶。

普鲁兰酶可以在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化和发酵期间存在和/或添加。

普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰糖6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在水解例如支链淀粉和普鲁兰糖中的α-1,6-糖苷键的能力。

根据本发明涵盖的普鲁兰酶包括来自在美国专利号4,560,651(通过引用特此并入)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的普鲁兰酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的普鲁兰酶、WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶以及来自WO 01/151620(通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性支链淀粉芽孢杆菌的普鲁兰酶，以及还有描述于FEMS Mic.Let.[FEMS微生物学通讯](1994)115,97-106中的普鲁兰酶。

根据本发明涵盖的另外的普鲁兰酶包括来自沃斯氏热球菌(Pyrococcuswoesei)、具体地来自在WO 92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM号3773的普鲁兰酶。

在一个实施例中，普鲁兰酶是家族GH57普鲁兰酶。在一个实施例中，普鲁兰酶包括如在WO 2011/087836中披露的(其通过引用特此并入)中的X47结构域。更具体地，普鲁兰酶可以源自高温球菌属(Thermococcus)的菌株，包括海滨高温球菌(Thermococcuslitoralis)和热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)，如在WO2011/087836所示的就在X47结构域之后的X4位点截短的热水高温球菌普鲁兰酶。普鲁兰酶还可以是海滨高温球菌和热水高温球菌普鲁兰酶杂合体或具有在WO 2011/087836(其通过引用特此并入)中披露的截短位点X4的热水高温球菌/海滨高温球菌杂合酶。

在另一个实施例中，该普鲁兰酶是包含披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的普鲁兰酶。

根据本发明，普鲁兰酶可以按有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”部分中。

适合的可商购普鲁兰酶产品包括PROMOZYME 400L、PROMOZYME^TMD2(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)、OPTIMAX L-300(杰能科公司(Genencor Int.)，美国)、以及AMANO8(安能满公司(Amano)，日本)。

在液化期间存在和/或添加的植酸酶

任选地，在液化中，植酸酶可以与抗金属离子抑制木聚糖酶(优选具有大于80℃的熔点(DSC)的抗金属离子抑制木聚糖酶)组合存在和/或添加。如上所述，在液化步骤i)期间还可以任选地存在和/或添加热稳定性α-淀粉酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶，优选地热稳定性葡糖淀粉酶。

根据本发明使用的植酸酶可以是能够从植酸(肌醇六磷酸盐)或其任何盐(植酸盐)中释放无机磷酸盐的任何酶。植酸酶可以根据其在初始水解步骤中的特异性进行分类，据此首先水解磷酸酯基团。本发明中使用的植酸酶可以具有任何特异性，例如可以是3-植酸酶(EC3.1.3.8)、或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)、或5-植酸酶(无EC号)。在一个实施例中，植酸酶具有大于50℃的最适温度，例如在从50℃至90℃的范围内。

植酸酶可以源自植物或微生物，如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。

植物植酸酶可以来自麦麸、玉蜀黍、大豆或百合花粉。适合的植物植酸酶描述在Thomlinson等人，Biochemistry[生物化学]，1(1962)，166-171；Barrientos等人,Plant.Physiol.[植物生理学杂志],106(1994),1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139中。

细菌植酸酶可以来自芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、假单胞菌属、布丘氏菌属、或埃希氏菌属(Escherichia)，特别是枯草芽孢杆菌、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、布伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)、乡间布丘菌(Buttiauxella agrestis)、诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)、和大肠杆菌。适合的细菌植酸酶描述在Paver和Jagannathan,1982,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]151:1102-1108；Cosgrove,1970,Australian Journal of Biological Sciences[澳大利亚生物科学杂志]23:1207-1220；Greiner等人,Arch.Biochem.Biophys.[农业生物化学生物生理学],303,107-113,1993；WO 1997/33976；WO 1997/48812、WO 1998/06856、WO 1998/028408、WO 2004/085638、WO2006/037327、WO 2006/038062、WO 2006/063588、WO 2008/092901、WO 2008/116878、和WO 2010/034835中。

酵母植酸酶可以源自酵母属或许旺酵母属(Schwanniomyces)，特别地源自物种酿酒酵母或许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)。前面的酶已经描述为适合的酵母植酸酶描述于Nayini等人,1984,Lebensmittel Wissenschaft und Technologie[食品科学与技术]17:24-26；Wodzinski等人,Adv.Appl.Microbiol.[应用微生物学进展],42,263-303；AU-A-24840/95。

来自丝状真菌的植酸酶可以源自子囊菌(Ascomycota、ascomycetes)真菌门或担子菌门(Basidiomycota)，例如曲霉属、嗜热真菌属(Thermomyces)(也称为腐质霉属)、毁丝霉属(Myceliophthora)、红曲霉属(Manascus)、青霉属、隔孢伏革属(Peniophora)、田头菇属(Agrocybe)、桩菇属(Paxillus)、或栓菌属(Trametes)，特别地物种土曲霉(Aspergillusterreus)、黑曲霉、黑曲霉泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、烟曲霉、米曲霉、疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(也称为疏棉状腐质霉(H.lanuginosa))、嗜热毁丝霉、隔孢伏革菌(Peniophora lycii)、平田头菇(Agrocybe pediades)、安卡红曲霉(Manascus anka)、卷边网褶菌(Paxillus involtus)、或绒毛栓菌(Trametes pubescens)。适合的真菌植酸酶描述在Yamada等人,1986,Agric.Biol.Chem.[农业和生物化学]322:1275-1282；Piddington等人，1993，Gene[基因]133:55-62；EP 684,313；EP 0 420358；EP 0 684 313；WO 1998/28408；WO 1998/28409；JP7-67635；WO 1998/44125；WO 1997/38096；WO 1998/13480中。

在一个优选的实施例中，植酸酶源自布丘氏菌属，如布伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)、乡间布丘菌(Buttiauxella agrestis)、或诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)，如在WO 2008/092901(通过引用特此并入)中分别披露为SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、和SEQ ID NO:6的那些。

在一个优选的实施例中，植酸酶源自柠檬酸杆菌属，如布氏柠檬酸杆菌，如在WO2006/037328(通过引用特此并入)中披露的。

通过本领域已知的方法可获得修饰的植酸酶或植酸酶变体，特别是通过以下中披露的方法：EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330、WO 2003/066847、WO 2007/112739、WO 2009/129489、和WO 2010/034835。

含有产物的可商购的植酸酶包括BIO-FEED PHYTASE^TM、PHYTASE NOVO^TMCT或L(均来自诺维信公司(Novozymes))、LIQMAX(杜邦公司(DuPont))、或RONOZYME^TMNP、

HiPhos、

P5000(CT)、NATUPHOS^TMNG 5000(来自DSM)。

在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶

根据本发明，在糖化和/或发酵期间存在和/或添加产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶。

在一个优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌的菌株，

葡糖淀粉酶

根据本发明，在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的葡糖淀粉酶可以源自任何适合的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自由以下组成的组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如在WO92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自诺维信公司(Novozymes)，丹麦)；在WO 84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或它们的变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.[生物化学杂志]301,275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Engng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵期间使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。

涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括均在WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌(Trametescingulata)，纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)；和大白桩蘑(Leucopaxillusgiganteus)；和WO 2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和表4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此并入)。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，特别地源自如WO 2011/066576中所描述的密孔菌属的菌株(SEQ ID NO 2、4、或6)；或源自褐褶菌属(Gloephyllum)的菌株，特别地源自如WO 2011/068803中所描述的褐褶菌属的菌株(SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、或16)；或源自黑层孔属(Nigrofomes)的菌株，特别地源自如WO2012/064351中所披露的黑层孔属物种的菌株(SEQ ID NO:2)(所有参考文献通过引用特此并入)。还涵盖了以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶的任一种的高同一性，即，与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％的同一性。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。

包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TMSUPER、SAN^TMEXTRA L、SPIRIZYME^TMPLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TMB4U、SPIRIZYME^TMULTRA、SPIRIZYME^TMEXCEL、SPIRIZYME^TMACHIEVE、和AMG^TME(来自诺维信公司(Novozymes A/S))；OPTIDEX^TM300、GC480、GC417(来自杰能科国际(Genencor Int.))；AMIGASE^TM和AMIGASE^TMPLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYME^TMG900、G-ZYME^TM、和G990 ZR(来自美国丹尼斯克公司(Danisco US))。

产麦芽糖淀粉酶

在糖化和/或发酵期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能水解直链淀粉和支链淀粉为α-构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司(Novozymes A/S)。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355、和6,162,628中，这些专利通过引用特此并入。在一个优选的实施例中，可以以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加产麦芽糖淀粉酶。

在糖化和/或发酵或SSF期间存在的和/或添加的纤维素酶或纤维素分解酶组合物

在本发明的优选的实施例中在步骤ii)的糖化中和/或在步骤iii)的发酵或SSF中存在和/或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物。

纤维素酶或纤维素分解酶组合物可以包含一种或多种纤维素分解酶。纤维素酶或纤维素分解酶组合物可以是任何来源。在一个优选的实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物包含真菌来源的纤维素分解酶。在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自木霉属的菌株，如里氏木霉；或腐质霉属的菌株，如特异腐质霉；或金孢子菌属的菌株，如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)；或青霉属的菌株，如斜卧青霉(Penicillium decumbens)。在一个优选的实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉的菌株。纤维素酶可以是β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶或其组合。该纤维素分解酶组合物可以包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、和内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物包括一种或多种选自由以下组成的组的多肽：-β-葡糖苷酶；-纤维二糖水解酶I；-纤维二糖水解酶II；或其混合物。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物包括一种或多种选自由以下组成的组的多肽：-β-葡糖苷酶；纤维二糖水解酶；和-内切葡聚糖酶；或其混合物。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物包括一种或多种选自由以下组成的组的多肽：-β-葡糖苷酶；-纤维二糖水解酶I；和-内切葡聚糖酶；或其混合物。

在一个优选的实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物进一步包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。如在WO 2011/041397(通过引用并入)中所述限定和确定纤维素分解增强活性。

术语“具有纤维素分解增强活性的GH61多肽”是指通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解的GH61多肽。出于本发明的目的，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加可以确定纤维素分解增强活性：在PCS(预处理的玉米秸秆)中的1-50mg的总蛋白/g纤维素，其中总蛋白由以下组成：50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白，以及与对照水解(具有相等的总蛋白加载，但不具有增强的纤维素分解活性，在PCS中的1-50mg的纤维素分解蛋白/g纤维素)进行比较在50℃持续1-7天具有增强的纤维素分解活性的0.5-50％w/w的GH61多肽蛋白。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组地产生的)或总蛋白重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重组地产生的)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下的CELLUCLAST^TM1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦尔德

丹麦)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

纤维素分解酶组合物可以包含β-葡糖苷酶，优选地源自曲霉属的菌株如米曲霉的β-葡糖苷酶，例如WO 2002/095014中披露的β-葡糖苷酶或WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(参见SEQ ID NO:74或76)，或如烟曲霉的β-葡糖苷酶，例如在WO2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16中披露的β-葡糖苷酶；或WO 2012/044915中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或源自青霉属的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，例如是烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:16)、或其变体，该变体包括一个或多个选自由以下组成的组的取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E以及F512Y；如其具有以下取代的变体：

-F100D+S283G+N456E+F512Y；-L89M+G91L+I186V+I140V；

-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y(使用本文的SEQ ID NO:16用于编号)。

亲本β-葡糖苷酶与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽可以具有至少60％同一性，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同一性。

在β-葡糖苷酶是β-葡糖苷酶变体的情况下，它可以与本文的SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少60％同一性，例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、但是小于100％同一性。

在纤维素分解酶组合物可以包含GH61多肽的情况下，它可以是源自嗜热子囊菌属(如橙色嗜热子囊菌的菌株)的多肽，如WO2005/074656中作为SEQ ID NO:6或本文的SEQ IDNO:18所述的多肽；或源自梭孢壳属，如土生梭孢壳霉的菌株，如WO 2005/074647中作为SEQID NO:7和SEQ ID NO:8所描述的多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所描述的该多肽；或源自青霉属的菌株，如埃默森青霉的菌株，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:19披露的多肽。

在一个优选的实施例中，GH61多肽(如源自青霉属的菌株(优选是埃默森青霉的菌株)的多肽)选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽的GH61多肽；

(ii)包含以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。

在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文的SEQ IDNO:20中披露的Cel7a CBH I，或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在一个优选的实施例中，如源自曲霉属的菌株，优选是烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶I选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:20的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；

(ii)包含以下氨基酸序列的纤维二糖水解酶I，该氨基酸序列与本文的SEQ IDNO:20的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II；如披露为本文的SEQ ID NO:21的纤维二糖水解酶II，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉；或源自梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个优选的实施例中，如源自曲霉属的菌株，优选是烟曲霉的菌株的纤维二糖水解酶II选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:21的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；

(ii)包含以下氨基酸序列的纤维二糖水解酶II，该氨基酸序列与本文的SEQ IDNO:21的成熟多肽具有至少60％、如至少70％，例如少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性。

在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包括源自青霉属的菌株例如埃默森青霉菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如披露为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:19的GH61多肽，以及β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含源自青霉属的菌株(如埃默森青霉菌株)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(例如披露为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:19的GH61多肽)、β-葡糖苷酶以及CBHI。

在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI以及CBHII。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含源自青霉属的菌株(如埃默森青霉的菌株)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(例如披露为WO 2011/041397中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:19的GH61多肽)、β-葡糖苷酶、CBHI、以及CBHII。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:18)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:18)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16)。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含披露为WO 2011/041397中SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:19的埃默森青霉GH61A多肽、以及披露为WO2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16的烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体，该变体具有以下取代的一种、优选地以下取代的全部：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分：(i)烟曲霉纤维素二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维素二糖水解酶II；和(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和(iii)里氏木霉内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:16)包括选自一种或多种由以下组成的组的取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E、和F512Y；例如其具有以下取代的变体：-F100D+S283G+N456E+F512Y；-L89M+G91L+I186V+I140V；或-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。

在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物进一步包含本文的SEQ ID NO:19中所示的青霉属物种GH61多肽；或包含以下氨基酸序列的GH61多肽，该氨基酸序列与本文的SEQID NO:19的成熟多肽具有至少60％、如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、如100％同一性。

在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物进一步包含本文的SEQ ID NO:17中所示的里氏木霉多肽；或包含以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少60％、如至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、如100％同一性。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含以下组分：(i)本文的SEQ ID NO:20中所示的烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)本文的SEQ ID NO:21中所示的烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)SEQ ID NO:16中所示的具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶的变体：F100D+S283G+N456E+F512Y；和(iv)本文的SEQ ID NO:19中所示的青霉属物种GH61多肽。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物包含以下组分：(i)本文的SEQ ID NO:20中所示的烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)SEQ ID NO:16中所示的具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶的变体：F100D+S283G+N456E+F512Y；和(iii)本文的SEQ ID NO:17中所示的里氏木霉内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自里氏木霉并且进一步包含：(i)本文的SEQ ID NO:20中所示的烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)SEQ ID NO:16中所示的具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶的变体：F100D+S283G+N456E+F512Y；和(iii)本文的SEQ ID NO:17中所示的里氏木霉内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，纤维素分解酶组合物(即，在步骤ii)的糖化和/或步骤iii)的发酵或SSF期间)以0.0001-3mg EP/g DS、优选0.0005-2mg EP/g DS、优选0.001-1mg/g DS、更优选从0.005-0.5mg EP/g DS、甚至更优选0.01-0.1mg EP/g DS按剂量添加。

本发明优选方法的实例

在一个优选的实施例中，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在从70℃至100℃范围内的温度，使用以下液化含淀粉材料：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；

-具有大于70℃的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.5至6.2之间范围内的pH在大于初始糊化温度的温度，使用以下液化含淀粉材料：

-α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下具有至少10的T1/2(min)；

-具有大于70℃的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在70℃至100℃之间的温，液化含淀粉材料：

-细菌α-淀粉酶，优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5，85℃，0.12mM CaCl₂下具有至少10的T1/2(min)；

-木聚糖酶，其在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，并且还具有大于80℃的熔点(DSC)；-具有在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

-任选地，蛋白酶，优选源自强烈火球菌或橙色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在大于初始糊化温度的温度下，使用以下液化含淀粉材料：

-α-淀粉酶，SEQ ID NO:5中所示的该α-淀粉酶在位置R179+G180或I181+G182具有双缺失、以及任选的取代N193F；以及任选地以下取代集合中的另一种：

-E129V+K177L+R179E；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)；

-木聚糖酶，其在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，具有大于80℃的熔点(DSC)；

如与本文中的SEQ ID NO:2、3和4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的木聚糖酶；

-具有在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；如与本文的SEQ IDNO:7、22、23、24或25中所示的任何多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％的内切葡聚糖酶；

-任选地，蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，源自强烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌；

-任选地，本文的SEQ ID NO:12中的草酸青霉葡糖淀粉酶，优选地具有选自下组的取代：

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；(使用SEQ ID NO:12用于编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在70℃至100℃之间的温度下，使用以下液化含淀粉材料：

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，该α-淀粉酶在位置I181+G182具有双缺失、以及任选的取代N193F；以及任选地以下取代集合中的另一种：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+S173N+E188P+H208Y+S242Y+K279I；

-V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N；

-V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+S242Y+K279I；

-V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+E188P+K279W；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+W115D+D117Q+T133P；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或

-具有在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；优选地与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少90％同一性；

-任选的蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，源自强烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌；以及

-K79V；或

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文的SEQ ID NO:12用于编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179S+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)；

如与本文中的SEQ ID NO:2、3和4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、更优选至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性的木聚糖酶；

-K79V；或

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用本文的SEQ ID NO:12用于编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在70℃至100℃之间的温度，使用以下液化含淀粉材料：

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+E188P+K279W；

-E129V+K177L+R179E；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)；

-蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，源自强烈火球菌；

-本文的SEQ ID NO:12中的草酸青霉葡糖淀粉酶，优选地具有选自下组的取代：

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用本文的SEQ ID NO:12用于编号)；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在80℃至95℃之间的温度下，使用以下液化含淀粉材料：

-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性木聚糖酶；以及

-热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:11的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；

-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:3的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

i)在从大于4.0至6.5之间范围内的pH在80℃至95℃之间的温度，使用以下液化含淀粉材料：

热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:11的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

-热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵。

在一个优选的实施例中，在发酵或同时糖化和发酵期间存在和/或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物。

在一个优选的实施例中，在发酵或同时糖化和发酵(SSF)期间存在和/或添加源自里氏木霉的纤维素酶或纤维素分解酶组合物。

在一个优选的实施例中，在发酵或同时糖化和发酵期间存在和/或添加纤维素酶或纤维素分解酶组合物和葡糖淀粉酶。

在一个实施例中，纤维素酶或纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉、卢克诺文思金孢子菌或斜卧青霉。

本发明的组合物

本发明的组合物包含α-淀粉酶，如热稳定性α-淀粉酶，和木聚糖酶，该木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，具有大于80℃的熔点(DSC)；具有大于70℃的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；任选的蛋白酶(如热稳定性蛋白酶)。该组合物还进一步包含产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶、任选地普鲁兰酶以及任选地植酸酶。

因此，在这个方面，本发明涉及包含以下项的组合物：

-α-淀粉酶；

-木聚糖酶，其在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，并且进一步具有大于80℃的熔点(DSC)；

-具有大于70℃的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

-任选地，蛋白酶；

-任选地，产碳水化合物源的酶。

α-淀粉酶：该α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，如源自芽孢杆菌属(如嗜热脂肪芽孢杆菌)的α-淀粉酶，优选本文SEQ IDNO:5中所示的α-淀粉酶。

该α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶。该热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl₂下可以具有至少10的T1/2(min)，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如在10至70之间，如在15至70之间，如在20至70之间，如在25至70之间，如在30至70之间，如在40至70之间，如在50至70之间，如在60至70之间。

在一个实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，特别是具有选自下组的突变的截短至491个氨基酸长(如从480个至495个氨基酸长)：

-I181*+G182*；

-I181*+G182*+N193F；

优选地

-I181*+G182*+E129V+K177L+R179E；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+E188P+K279W；

-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)。

应理解，这些α-淀粉酶仅是具体实例。在上文的“在液化期间存在和/或添加的α-淀粉酶”-部分中披露的任何α-淀粉酶可以用作在本发明的组合物中的α-淀粉酶组分。

内切葡聚糖酶：根据本发明，任选的内切葡聚糖酶组分可以包含在该组合物中。其可以是使用在以下“材料与方法”部分中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的具有大于70℃、如大于75℃、特别是大于80℃、如在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的任何内切葡聚糖酶。

在一个优选的实施例中，包含在本发明的组合物中的在本发明的方法中使用的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶(参见在“www.cazy.org”网站的CAZy数据库)。在一个实施例中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文的SEQ IDNO:7中所示的雷塞氏篮状菌内切葡聚糖酶；本文的SEQ ID NO:22中所示的胶囊青霉内切葡聚糖酶、以及本文的SEQ ID NO:23中所示的褐孢长毛盘菌内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在一个实施例中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文的SEQ ID NO:25中所示的粪生粪壳菌或本文的SEQ IDNO:24中所示的土生梭孢壳霉内切葡聚糖酶。

应当理解是，这些内切葡聚糖酶仅仅是具体实例。在上文的“在液化期间存在和/或添加的热稳定性内切葡聚糖酶”-部分中披露的任何内切葡聚糖酶可以用于本发明的组合物中的任选的内切葡聚糖酶部分。

在一个尤其优选的实施例中，内切葡聚糖酶(EG)与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少90％同一性，源自雷塞氏篮状菌的菌株，具有大于80℃的熔点(DSC)。

蛋白酶：本发明的组合物可以任选地包含蛋白酶，如热稳定性蛋白酶。对该蛋白酶组分的起源没有限制，只要其满足在此定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。在一个实施例中，该蛋白酶是金属蛋白酶。在一个实施例中，该蛋白酶源自本文的SEQ ID NO:6中所示的橙色嗜热子囊菌。

在一个优选的实施例中，蛋白酶是上面提到的嗜热子囊菌蛋白酶的变体，其具有如US-2018-0371505 0371505(该文献对于用于确定热稳定性的测定的描述，特别是如实例2中所述的通过引用特此并入)的实例2中所述确定的，确定为在80℃/70℃的相对活性的超过20％的热稳定性值。

在一个特定优选的实施例中，该蛋白酶是源自橙色嗜热子囊菌的金属蛋白酶的变体，披露为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或WO 2010/008841中SEQ IDNO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:6，具有选自下组的突变：

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L；以及

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在另一个实施例中，该蛋白酶是细菌蛋白酶。在另一个实施例中，该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一个优选的实施例中，丝氨酸蛋白酶源自强烈火球菌的菌株，如US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:11中所示的丝氨酸蛋白酶，或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的丝氨酸蛋白酶。在一个实施例中，丝氨酸蛋白酶源自嗜热裂孢菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:26中所示的丝氨酸蛋白酶，或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的丝氨酸蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶源自嗜热裂孢菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:27中所示的褐色嗜热裂孢菌蛋白酶(在WO 2018/118815 A1中称为SEQ ID NO:8，其全部内容通过引用并入本文)或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶源自嗜热裂孢菌属的菌株，如本文SEQ IDNO:28中所示的耐盐嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)蛋白酶(在WO 2018/118815A1中称为SEQ ID NO:10，其全部内容通过引用并入本文)或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。在一个实施例中，蛋白酶源自高温球菌属的菌株，如本文SEQ ID NO:29中所示的诺蒂利高温球菌(Thermococcusnautili)蛋白酶(在WO2018/169780A1中称为SEQ ID NO:3，其全部内容通过引用并入本文)或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

应理解，这些蛋白酶仅是实例。在上文的“在液化期间存在和/或添加的蛋白酶”-部分中披露的任何蛋白酶可以用作在本发明的组合物中的蛋白酶组分。

产碳水化合物源的酶：本发明的组合物可以任选地进一步包含产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶(如热稳定性葡糖淀粉酶)，其在85℃、pH 5.3具有至少30％(优选地至少35％)的热稳定性。

所述产碳水化合物源的酶可以是热稳定性葡糖淀粉酶，该热稳定性葡糖淀粉酶在85℃具有至少20％、至少30％、优选至少35％的相对活性热稳定性，如实例4(热稳定性)中描述的进行测定。

在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，在pH5.0的pH最佳值时具有至少90％、优选至少95％、优选至少97％、如100％的相对活性，如实例4(pH最佳值)中描述的进行测定。

在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，在pH5.0具有至少80％，至少85％、至少90％的pH稳定性，如实例4(pH稳定性)中描述的进行测定。

在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，尤其是在WO 2011/127802(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:12中所示的草酸青霉的菌株或其变体。

在一个实施例中，该葡糖淀粉酶或其变体与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:12中所示的成熟多肽可以具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。

在一个具体并优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是披露为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2以及本文的SEQ ID NO:12中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:12中所示的成熟序列用于编号)。如在WO2013/036526(其通过引用特此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。

适合的热稳定性草酸青霉葡糖淀粉酶变体的实例在上文列出。

在一个实施例中，产碳水化合物源的酶，如葡糖淀粉酶、如草酸青霉葡糖淀粉酶具有普鲁兰酶副活性。

应理解，这些产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶仅是实例。在上文的“在液化期间存在和/或添加的产碳水化合物源的酶”-部分中披露的任何产碳水化合物源的酶可以用作在本发明的组合物中的组分。

在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是在本文SEQ ID NO:12中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶或者与进一步包含K79V取代的其具有至少90％同一性的序列。

普鲁兰酶：本发明的组合物可以任选地进一步包含普鲁兰酶。该普鲁兰酶可以是任何来源的。

在一个实施例中，该普鲁兰酶是细菌来源的。在一个实施例中，该普鲁兰酶源自芽孢杆菌属物种的菌株。

在一个实施例中，普鲁兰酶是家族GH57普鲁兰酶。在一个优选的实施例中，该普鲁兰酶包括如披露于WO 2011/087836中的(其通过引用特此并入)中的X47结构域。

具体地，该普鲁兰酶可以来源于来自高温球菌属的菌株，包括海滨高温球菌和热水高温球菌，或其杂合体。

普鲁兰酶可以是在本文SEQ ID NO:9中所示的在位点X4截短的热水高温球菌普鲁兰酶，或者如WO 2011/087836中披露的具有截短位点X4的热水高温球菌/海滨高温球菌杂合酶(本文的SEQ ID NO:10)。

另一个实施例中，该普鲁兰酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司(Novozymes))中的X46结构域的普鲁兰酶。

应理解，这些普鲁兰酶仅是具体实例。在上文的“在液化期间存在/或添加的普鲁兰酶”-部分中披露的任何普鲁兰酶可以用于本发明的组合物中的任选的普鲁兰酶部分。

植酸酶：本发明的组合物可以任选地进一步包含植酸酶。该植酸酶可以是任何来源的。

在一个实施例中，该植酸酶是细菌来源的。在一个实施例中，该植酸酶源自布丘氏菌属，如布伽瓦尼布丘氏菌的菌株，如披露为WO2008/092901中的SEQ ID NO:2(氨基酸1-33预期是信号肽)的布伽瓦尼布丘氏菌；或乡间布丘菌，如显示为WO 2008/092901中SEQ IDNO:4(氨基酸-9至-1预期为信号肽的部分)的乡间布丘菌；或诺亚克布丘氏菌，如显示为WO2008/092901中SEQ ID NO:6的诺亚克布丘氏菌。

在另一个实施例中，该植酸酶是源自柠檬酸杆菌属的菌株，如布氏柠檬酸杆菌的菌株，如披露为WO 2006/037328(通过引用特此并入)中的SEQ ID NO:2或4的菌株。

应当理解的是，这些植酸酶仅仅是具体实例。在上文的“在液化期间存在和/或添加的植酸酶”-部分中披露的任何植酸酶可以用于本发明的组合物中的任选的植酸酶部分。

在一个优选的实施例中，植酸酶源自布丘氏菌属的菌株。

本发明的组合物的优选的实施例的实例

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；

-具有大于70℃(如在70℃和95℃之间)的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

-任选地，蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，源自强烈火球菌或橙色嗜热子囊菌；以及

-任选地，葡糖淀粉酶，如源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。

在另一个实施例中，本发明的组合物包含

-具有在70℃和95℃之间的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

-任选的蛋白酶，优选地源自强烈火球菌或橙色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及

-任选地，葡糖淀粉酶，例如源自草酸青霉。

在另一个实施例中，本发明的组合物包含

-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有在位置I181+G182的双缺失、以及任选的取代N193F；以及任选地以下取代集合中的另一种：

-I181*+G182*+E129V+K177L+R179E；；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+E188P+K279W；

-I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及

-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:5进行编号)；

-具有大于70℃的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶；

-任选地，蛋白酶，优选地源自强烈火球菌和/或橙色嗜热子囊菌，具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值；以及

-任选地SEQ ID NO:12的草酸青霉葡糖淀粉酶，具有选自下组的取代：

-K79V；

-K79V+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

-K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

-K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

-K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(使用SEQ ID NO:12用于编号)。

在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO:5)或其变体是成熟α-淀粉酶或与本文的SEQ ID NO:5具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟α-淀粉酶。

在一个实施例中，木聚糖酶(如来自热袍菌属的木聚糖酶)具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。

合适的热稳定性木聚糖酶的实例，特别是来自热袍菌属的木聚糖酶，包括本文SEQID NO:2中所示的木聚糖酶，例如源自海栖热袍菌的菌株；本文SEQ ID NO:3中所示的木聚糖酶，例如源自那不勒斯栖热袍菌的菌株；本文SEQ ID NO:5中所示的木聚糖酶，例如源自嗜萘热袍菌的菌株；或分别与本文SEQ ID NO:2、3和4的任何多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性的多肽。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:11的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:11的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:3的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:11的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:11的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQID NO:29的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:3的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQID NO:29的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含-α-淀粉酶，优选热稳定性细菌α-淀粉酶，更优选与SEQ ID NO:5的氨基酸1至491的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α-淀粉酶，其具有突变-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I；-热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶，更优选与SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的热稳定性抗金属离子抑制木聚糖酶；以及热稳定性蛋白酶，其与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQID NO:29的成熟多肽的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个实施例中，任选的内切葡聚糖酶具有大于74℃、如大于76℃、如大于78℃、如大于80℃、如大于82℃、如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如在70℃和95℃之间、如在76℃和94℃之间、如在78℃和93℃之间、如在80℃和92℃之间、如在82℃和91℃之间、如在84℃和90℃之间的熔点(DSC)。

在一个实施例中，任选的内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:7、22、23、24或25的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少80％同一性。

在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少90％同一性，该内切葡聚糖酶具有大于70℃的熔点(DSC)。

在一个实施例中，强烈火球菌蛋白酶(本文的SEQ ID NO:11)和/或橙色嗜热子囊菌蛋白酶(本文的SEQ ID NO:6)或其变体是成熟蛋白酶、或分别与本文的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:11具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟蛋白酶。

在一个实施例中，草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:12)或其变体是成熟葡糖淀粉酶、或与本文的SEQ ID NO:12具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟葡糖淀粉酶。

本发明的另外方面

在本发明的另一方面，其涉及本发明的组合物用于液化含淀粉材料的用途。

在本发明的另一方面，其涉及生产液化的淀粉的方法，该方法包括用本发明的组合物液化含淀粉材料。

在本发明的另一方面，其涉及对金属离子抑制具有抗性的木聚糖酶用于液化含淀粉材料的用途。

在本发明的另一方面，其涉及生产液化的淀粉的方法，该方法包括用对金属离子抑制具有抗性的木聚糖酶液化含淀粉材料。

在本发明的另一方面，其涉及本发明的组合物用于减少液化物中的残余淀粉的用途。

在本发明的另一方面，其涉及对金属离子抑制具有抗性的木聚糖酶用于减少液化物中的残余淀粉的用途。

在本发明的另一方面，其涉及本发明的组合物用于增加液化物中的短链寡糖的用途。

在本发明的另一方面，其涉及对金属离子抑制具有抗性的木聚糖酶用于增加液化物中的短链寡糖的用途。

在以下段落中进一步总结了本发明：

1.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

i)在存在热稳定性木聚糖酶的情况下，在大于初始糊化温度的温度下液化含淀粉材料，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性；

ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵以生产该发酵产物。

2.如段落1所述的方法，其中与在不存在木聚糖酶的情况下在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，或与在液化含淀粉材料中使用对金属离子的抑制不具有抗性或具有较小抗性的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量减少。

3.如段落1所述的方法，其中与在液化含淀粉材料中使用对金属离子的抑制不具有抗性或具有较小抗性的热稳定性木聚糖酶(诸如例如SEQ ID NO:1的木聚糖酶)时在液化步骤i)结束时短链寡糖的量相比，在液化步骤i)结束时存在的短链寡糖的量增加。

4.一种用于减少在液化物中存在的残余淀粉的量的方法，该方法包括：

i)用热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料以生产液化物，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，其中与不用该热稳定性木聚糖酶生产的液化物相比或与在液化含淀粉材料中使用对金属离子的抑制不具有抗性或具有较小抗性的热稳定性木聚糖酶时生产的液化物相比，该液化物具有减少量的残余淀粉；

任选地，ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及任选地，iii)使用发酵生物体进行发酵以生产该发酵产物。

5.一种用于增加在液化物中存在的短链寡糖的量的方法，该方法包括：

i)用热稳定性木聚糖酶液化含淀粉材料以生产液化物，该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时对金属离子的抑制具有抗性，其中与不用该热稳定性木聚糖酶生产的液化物相比或与在液化含淀粉材料中使用对金属离子的抑制不具有抗性或具有较小抗性的热稳定性木聚糖酶时生产的液化物相比，该液化物具有增加量的短链寡糖；

6.如段落4或5所述的方法，该方法进一步包括ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及任选地，iii)使用发酵生物体进行发酵以生产该发酵产物。

7.如段落1至6中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶源自热袍菌属的菌株。

8.如段落1至7中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶与本文SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如海栖热袍菌的菌株。

9.如段落1至8中任一项所述的方法，其中该热稳定木聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％的同一性、至少77％的同一性、至少78％的同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如那不勒斯栖热袍菌的菌株。

10.如段落1至9中任一项所述的方法，其中该热稳定木聚糖酶与本文SEQ ID NO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如嗜萘热袍菌的菌株。

11.如段落1至10中任一项所述的方法，其中该热稳定木聚糖酶具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。

12.如段落1至11中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是玉米，并且在液化含淀粉材料时金属离子是铜离子、铁离子和锌离子。

13.如段落1至12中任一项所述的方法，其中在液化含淀粉材料时对金属离子抑制的抗性是在液化含淀粉材料时在存在平均浓度的该金属离子的情况下保留该木聚糖酶的相对活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

14.如段落1至13中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时在存在铜离子的情况下保留其相对活性的至少80％。

15.如段落1至14中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时在存在铁离子的情况下保留其相对活性的至少70％。

16.如段落1至15中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时在存在锌离子的情况下保留其相对活性的至少95％。

17.如段落1至16中任一项所述的方法，其中在液化含淀粉材料时存在的金属离子的平均浓度范围为0.012mM至0.15mM。

18.如段落1至17中任一项所述的方法，其中该玉米中存在的铜离子的平均浓度为0.012mM。

19.如段落1至18中任一项所述的方法，其中该玉米中存在的铁离子的平均浓度为0.15mM。

20.如段落1至19中任一项所述的方法，其中该玉米中存在的锌离子的平均浓度为0.12mM。

21.如段落1至20中任一项所述的方法，其中热稳定性α-淀粉酶和/或热稳定性蛋白酶存在于液化步骤i)中。

22.如段落1至21中任一项所述的方法，其中该热稳定性α-淀粉酶与本文SEQ IDNO:5的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性，至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自芽孢杆菌属的菌株，如嗜热脂肪芽孢杆菌。

23.如段落1至22中任一项所述的方法，其中该热稳定性蛋白酶选自由以下组成的组：

(i)源自火球菌属的菌株的蛋白酶，如SEQ ID NO:11中所示的强烈火球菌蛋白酶或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

(ii)源自嗜热裂孢菌属的菌株的蛋白酶，如本文SEQ ID NO:26中所示的解纤维素嗜热裂孢菌蛋白酶或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶，或本文SEQ ID NO:27中所示的褐色嗜热裂孢菌蛋白酶或与SEQ IDNO:27的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶，或SEQ ID NO:28中所示的耐盐嗜热裂孢菌蛋白酶或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性，更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶；以及

(iii)源自高温球菌属的菌株的蛋白酶，如本文SEQ ID NO:29中所示的诺蒂利高温球菌蛋白酶，或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶。

24.如段落1至23中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)期间的pH在4.0-6.5之间，如4.5-6.2，如大于4.8-6.0，如5.0-5.8之间。

25.如段落1至24中任一项所述的方法，其中在液化期间的温度是在70℃至100℃的范围内，如在70℃至95℃之间、如在75℃至90℃之间、优选在80℃至90℃之间、如约85℃。

26.如段落1至25中任一项所述的方法，其中糖化和发酵顺序进行或同时进行。

27.如段落1至27中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。

28.如段落1至28中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。

29.如段落1至28中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。

30.如段落1至29中任一项所述的方法，其中该发酵生物体是酵母，优选酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母的菌株。

31.如段落1至30中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶是含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)的GH10家族木聚糖酶。

本文所描述和要求保护的发明并不局限于本文披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的几方面的例示性说明。任何等同的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。本文引用了多个参考，其披露内容通过引用以其全部内部并入本文。进一步通过以下实例来描述本发明，这些实例不应理解为限制本发明的范围。

材料与方法

材料：

α-淀粉酶369(AA369)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V截短至491个氨基酸(本文的SEQ IDNO:5)。

α-淀粉酶2330(AA2330)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：-I181*+G182*+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N+A184Q+E188P+T191N+N193F+S242Y+K279I截短至491个氨基酸(本文的SEQ ID NO:5)

内切葡聚糖酶TL(EG TL)：来自雷塞氏篮状菌(在WO2013/019780中披露为SEQ IDNO:2以及本文的SEQ ID NO:7)的内切葡聚糖酶GH5。(P23YSQ)。

蛋白酶Pfu：购买自宝酒造生物公司(Takara Bio)(日本)的、源自强烈火球菌的蛋白酶，为Pfu蛋白酶S(活性10.5mg/mL)并且还示于本文的SEQ ID NO:11中。

葡糖淀粉酶Po：草酸青霉葡糖淀粉酶的成熟部分披露为WO2011/127802中的SEQID NO:2并且示于本文的SEQ ID NO:12中。

葡糖淀粉酶PE001：使用SEQ ID NO:12中所示的成熟序列对具有K79V取代的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体进行编号。

葡糖淀粉酶Po 498(GA498)：具有以下突变的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体：K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:12进行编号)。

葡糖淀粉酶SA(GSA)：包含以下的共混物：WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:34或本文中披露为SEQ ID NO:15的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、WO 06/69289中披露为SEQ IDNO:2或本文中披露为SEQ ID NO:13的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及本文的SEQ ID NO:14中披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)α-淀粉酶，该微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代：G128D+D143N(AGU:AGU:FAU-F中的活性比为约20:5:1)。

葡糖淀粉酶BL(GBL)：包含以下的共混物：WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2或本文中披露为SEQ ID NO:13的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及本文的SEQ ID NO:14中披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，该微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代：G128D+D143N(AGU:AGU:FAU-F中的活性比为约20:5:1)。

蛋白酶X：源自橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的、披露为本文的SEQ ID NO:6中的氨基酸1-177以及WO 2003/048353的SEQ ID NO:2中的氨基酸1至177的金属蛋白酶。

酵母：ETHANOL RED^TM，购自美国红星/乐斯福公司(Red Star/Lesaffre,USA)。

方法

通过差示扫描量热法确定木聚糖酶的Td。

使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)通过差示扫描热量测定(DSC)测定酶的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，加热在缓冲液(50mM乙酸盐，pH 5.0)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对比T)中，将热变性温度Td(℃)当作变性峰(主要的吸热峰)的顶端。

将样品溶液和参比溶液(大约0.2ml)从10℃的储存条件下装载到量热仪中(参比溶液：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃热预平衡20分钟，随后从20℃至120℃进行DSC扫描。以大约+/-1℃的精确度确定变性温度。

同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，可以通过程序“比对”确定两个氨基酸序列之间的同一性程度以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，该程序是尼德尔曼-翁施比对(Needleman-Wunschalignment)(即总体对比)。使用该程序进行多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BLOSUM50进行多肽比对，以及使用缺省同一性矩阵进行核苷酸比对。对多肽而言，缺口第一个残基的罚分为-12，对核苷酸而言该罚分为-16。对多肽而言，缺口另外残基的罚分为-2，对核苷酸而言该罚分为-4。

“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis[用于生物序列分析的改进的工具]”,PNAS 85:2444-2448，和W.R.Pearson(1990)“Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA[使用FASTP和FASTA进行的快速且灵敏的序列比较]”Methods in Enzymology[酶学方法]183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)进行，对缺口大小没有限制(参见“Smith-Watermanalgorithm[史密斯-沃特曼算法]”,T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]147:195-197)。

玉米素-BCA测定：

在不同温度通过变体蛋白酶可以进行玉米素-BCA测定以检测释放自玉米素的可溶性蛋白的定量。

方案：

1)混合10微升的10微克/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米素溶液于微滴定板(MTP)中。

2)在不同温度孵育60min。

3)添加10微升的100％三氯乙酸(TCA)溶液。

4)在3500rpm离心MTP持续5min。

5)取15微升至新的包含100微升的BCA测定溶液的MTP中(皮尔斯公司(Pierce)目录号；23225，BCA蛋白测定试剂盒)。

6)在60℃孵育30min。

7)测量A562。

该测定的结果可用于确定与参照蛋白酶相比具有改善的热稳定性的蛋白酶。

普鲁兰酶活性(NPUN)的确定

相对于诺维信普鲁兰酶标准品测量NPUN中的内切-普鲁兰酶活性。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme))，pH 5，40℃，20分钟)下每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。

将1mL稀释的样品或标准品在40℃孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将这些管在40℃孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm下测量上清液的OD并使用标准曲线计算活性。

AZCL-酪蛋白测定

边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH 9的Borax/NaH₂PO₄缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在艾本德热混器(Eppendorf Thermomixer)中在45℃和600rpm下孵育持续30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸持续20分钟)作为空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃以3000rpm离心持续5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRad Microplate Reader)测量在595nm处的吸光度。

蛋白酶测定

AZCL-酪蛋白测定

pNA测定

将50微升含蛋白酶样品添加到微量滴定板并且通过添加100微升1mM pNA底物(5mg溶解于100微升DMSO中并进一步用pH 9.0的Borax/NaH₂PO₄缓冲液稀释至10mL)开始该测定。监测OD₄₀₅在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

能以葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。

诺维信葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。

可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性地反应，形成NADH，使用光度计在340nm下测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。

<u>AMG孵育：</u>
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸盐0.1M
		pH：	4.30±0.05
孵育温度：	37℃±1℃
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

<u>显色反应：</u>
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
孵育温度：	37℃±1℃
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

更详细描述这种分析方法的文件(EB-SM-0131.02/01)可从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件结合在此。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品确定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下将淀粉酶活性确定为淀粉浓度的降低。

λ＝590nm

蓝色/紫色t＝23sec。脱色

标准条件/反应条件：

更详细描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。

α-淀粉酶活性(KNU)

可以使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪。最初形成黑蓝色，但淀粉分解期间蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。

一千诺维信α淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，在37℃+/-0.05℃；0.0003MCa²⁺；和pH 5.6)下，将5260mg可溶的淀粉干物质Merck Amylum糊精化的酶量。

更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0009.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。

FAU(F)的测定

相对于已知强度的酶标准品测量FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(Fungal Alpha-Amylase Units(Fungamyl))。

更详细描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。

普鲁兰酶活性(NPUN)的确定

相对于诺维信普鲁兰酶标准品测量NPUN中的内切-普鲁兰酶活性。一个普鲁兰酶单位(NPUN)定义为在标准条件(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司)，pH 5，40℃，20分钟)下每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。

将1mL稀释的样品或标准品在40℃孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm下测量上清液的OD并使用标准曲线计算活性。

本发明将在以下实例中进行更详细的描述，这些实例被提供用以说明本发明而决不意图限制本发明要求的范围。本文引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引用具体结合。

实例

实例1-α-淀粉酶变体的稳定性

通过将参比α-淀粉酶(具有突变I181*+G182*+N193F的、截短至491个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(以本文的SEQ ID NO:1进行编号))及其α-淀粉酶变体在pH 4.5和5.5下以及在温度75℃和85℃用0.12mM CaCl₂进行孵育，随后使用

底物(

超级淀粉酶测定试剂盒(Ultra Amylase assay kit)，E33651，分子探针公司(Molecular Probes))进行残余活性测定来确定该参比α-淀粉酶及变体的稳定性。

使纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mMCaCl₂，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/毫升)的工作浓度。将二十微升酶样品转移至48孔PCR MTP并且将180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐、150mM MES、0.01％TritonX100、0.12mM CaCl₂，pH 4.5或5.5)添加至每个孔并且混合。测定使用两种浓度的酶来重复两次执行。在75℃或85℃孵育之前，取出20微升并且储存在冰上作为对照样品。在PCR仪(在75℃和85℃)中进行孵育。孵育之后，将样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％Triton X100、0.12mM CaCl₂，pH 5.5)中稀释至15ng/mL并且将25微升稀释酶转移至黑色384-MTP。使用EnzChek底物通过将25微升底物溶液(100微克/毫升)添加至每个孔来测定残余活性。使用485-P nm的激发滤光器以及555nm的发射滤光器(荧光读取器是Polarstar，BMG公司)每分钟测量荧光持续15分钟。对于每个设置，将残留活性相对于对照样品标准化。

假定对数式衰减，那么使用以下方程来计算半衰期时间(T1/2(min))：T1/2(min)＝T(min)*LN(0.5)/LN(％RA/100)，其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。

使用此测定设置，针对参考α-淀粉酶及其变体确定半衰期时间，如表1中所示。

表1

ND未检测到

这些结果证明α-淀粉酶变体比参考α-淀粉酶具有显著更高的半衰期和稳定性。

实例2-蛋白酶变体的制备以及热稳定性测试

菌株与质粒

大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒拯救。pJTP000是在TPI启动子的控制之下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，构建自描述于WO 01/92502中的pJC039，在其中已经插入了橙色嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO 03048353)。

酿酒酵母YNG318感受态细胞：MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his 4-539用于蛋白酶变体表达。这被描述于J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272(15),第9720-9727页,1997中。

培养基与底物

10X基础溶液：不包含氨基酸的酵母氮基(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH60g/l。

SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，终浓度为2％＝2g/100ml)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径大小为0.20微米的过滤器将溶液灭菌。将琼脂(2％)和H₂O(大约761ml)一起热压处理，并且向琼脂溶液中添加分开灭菌的SC-葡萄糖溶液。

YPD：细菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。

YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO4。

PEG/LiAc溶液：40％PEG4000 50ml，5M乙酸锂1ml。

96孔玉米素微滴度板：

每个孔包含200微升的0.05％-0.1％的玉米素(西格玛公司(Sigma))，0.25mMZnSO₄以及1％的琼脂于20mM乙酸钠缓冲液中，pH 4.5。

DNA操纵

除非另有说明，否则DNA操作和转化是使用Sambrook等人(1989)Molecularcloning:A laboratory manual[分子克隆：实验室手册],冷泉港实验室,冷泉港,纽约州；Ausubel,F.M.等人(编辑)“Current protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]”,John Wiley and Sons[约翰威利父子出版公司],1995；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(编辑)所述的分子生物学标准方法进行的。

酵母转化

使用乙酸锂法进行酵母转化。混合0.5微升载体(由限制性内切核酸酶消化)以及1微升的PCR片段。将DNA混合物、100微升的YNG318感受态细胞、以及10微升的酵母标记载体DNA(YEAST MAKER carrier DNA)(克罗泰克公司(Clontech))添加到12ml聚丙烯管(Falcon2059)中。添加0.6ml PEG/LiAc溶液并轻轻混合。在30℃下并且200rpm孵育30min，并且随后在42℃下孵育30min(热休克)。转移到微量离心管并离心5秒钟。去除上清液并在3ml YPD中溶解。在30℃以200rpm孵育该细胞悬浮液45min。将悬浮液倾倒在SC-葡萄糖板上并在30℃孵育3天以使菌落生长。通过Zymoprep酵母质粒小量制备试剂盒(ZYMO研究公司(ZYMOresearch))提取酵母总DNA。

DNA测序

通过电穿孔(伯乐基因脉冲发生器(BIO-RAD Gene Pulser))进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法(分子克隆公司(Molecular Cloning)，冷泉港)或使用

质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎(DNA Engine)进行PCR。使用ABI PRISMTM 310基因分析器来测定所有的DNA序列。

蛋白酶表达载体的构建

使用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:5)扩增嗜热子囊菌属M35蛋白酶基因。将所得PCR片段连同pJC039载体引入酿酒酵母YNG318(描述于WO 2001/92502中)，用限制性内切酶消化以去除特异腐质霉角质酶基因。

回收在SC-葡萄糖板上的酵母克隆中的质粒以确认内部序列并称作pJTP001。

酵母文库和定点变体的构建

通过SOE PCR法(重叠延伸剪接(Splicing by Overlap Extension)，参见“PCR:Apractical approach[PCR：一种实用方法]”,第207-209页,Oxford University press[牛津大学出版社],编辑McPherson,Quirke,Taylor)、随后进行酵母体内重组来构建酵母文库和定点变体。

用于扩增和测序的通用引物

使用引物AM34(SEQ ID NO:5)和AM35(SEQ ID NO:6)，通过SOE法与简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一起制备包含任何突变的片段的DNA片段或仅仅扩增整个蛋白酶基因(AM34+AM35)。

通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将所得纯化的片段与载体消化物混合。将混合溶液引入酿酒酵母中，以通过体内重组来构建文库或定点变体。

相对活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进包含YPD+Zn培养基的96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将培养物上清液施加到96孔玉米素微滴定板并在至少2个温度(例如60℃和65℃、70℃和75℃、70℃和80℃)下孵育超过4小时或过夜。玉米素在板中的浊度被测量为A630并且相对活性(较高/较低温度)被确定为热稳定性改善的一个指标。选择比亲本变体具有更高相对活性的克隆并确定这些序列。

残余活性测定

将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种进96孔微滴度板的孔中并在28℃下培养3天。将该培养物上清液在特定温度(80℃或84℃，以4℃作为参考)下于20mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中孵育10min之后，使用偶氮-酪蛋白(麦格酶公司)在65℃下测定蛋白酶活性，从而确定残余活性。选择比亲本变体具有更高残余活性的克隆并确定这些序列。

偶氮-酪蛋白测定

将20微升样品与150微升底物溶液(4ml的在乙醇中的12.5％偶氮-酪蛋白，在96ml的20mM乙酸钠(pH 4.5)中，包含0.01％triton-100和0.25mM ZnSO₄)混合并孵育4小时或更久。

添加20微升/孔的100％三氯乙酸(TCA)溶液之后，将该板离心并且吸取100微升的上清液以测量A440。

蛋白酶变体在米曲霉中的表达

使用包含蛋白酶变体基因的构建体来构建用于曲霉属的表达载体。曲霉属表达载体由表达盒组成，该表达盒是基于与构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)、和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上还存在曲霉属选择性标记amdS，其来自能够在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的构巢曲霉。如描述于Lassen等人(2001),Applied and Environmental Micorbiology[应用与环境微生物学],67,4701-4707中，将蛋白酶变体的表达质粒转化进曲霉属中。针对每个构建体，分离、纯化并在摇瓶中培养10-20个菌株。

所表达的变体的纯化

1.调节0.22μm经过滤的发酵样品的pH至4.0。

2.将样品置于冰浴中，伴随磁力搅拌。以小量的等分试样添加(NH4)2SO4(对应于大约2.0-2.2M(NH4)2SO4，当添加该化合物时未考虑体积增加)。

3.(NH4)2SO4的最终添加之后，将该样品于冰浴中伴随轻柔的磁力搅拌孵育min。45min。

4.离心：日立(Hitachi)himac CR20G高速冷冻离心机，配备有R20A2转头，5℃，20,000rpm，30min。

5.将形成的沉淀物溶解于200ml 50mM乙酸钠(pH 4.0)中。

6.通过真空吸引器，使用0.22μm PES PLUS膜(易威奇公司(IWAKI))过滤该样品。

7.在冷室中，使用超滤法(来自赛多利斯公司(Vivascience)的Vivacell 250，配备有5kDa MWCO PES膜)将样品脱盐/缓冲液置换到50mM乙酸钠(pH 4.0)中。使用50mM乙酸钠(pH 4.0)将渗余样品稀释至200ml。样品的导电性优选地小于5mS/cm。

8.将样品加载到用50mM乙酸钠(pH 4.0)平衡的阳离子交换柱上。使用3倍柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.0)将未结合样品从该柱洗出，并且使用线性梯度(0-100％洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.0))，以10倍柱体积对样品进行洗脱。

9.通过内切-蛋白酶测定(参见下文)测定所收集的级分，随后对所选择的级分进行标准SDS-PAGE(还原条件)。基于内切-蛋白酶测定和SDS-PAGE，合并多个级分。

内切-蛋白酶测定

1.通过磁力搅拌溶解Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠(pH5.0)(底物：来自麦格酶公司的目录号PRAK 11/08的内切-蛋白酶Protazyme AK片)。

2.边搅拌边将250微升的底物溶液转移到1.5ml的埃彭道夫管。

3.向每个管中添加25微升的样品(空白对照是样品缓冲液)。

4.将这些管在50℃在热混器中振荡(1000rpm)孵育15分钟。

5.向每个管中添加250微升的1M NaOH，随后进行涡旋。

6.以16,100×G并且在25℃离心3min。

7.将200微升的上清液转移到MTP，并且记录590nm处的吸光度。

结果

实例3

使用纯化的酶，所选择变体的温度特征曲线

纯化所选择的显示良好热稳定性的变体并且将经纯化的酶用于如下所述的玉米素-BCA测定中。将该酶在如所指出的升高的温度孵育60min之后，在60℃确定残余蛋白酶活性。

玉米素-BCA测定：

在不同温度通过变体蛋白酶进行玉米素-BCA测定以检测释放自玉米素的可溶性蛋白的定量。

方案：

8)混合10ul的10ug/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米素溶液于微滴定板(MTP)中。

9)在不同温度孵育60min。

10)添加10ul的100％三氯乙酸(TCA)溶液。

11)以3500rpm离心MTP持续5min。

12)取15ul至一个新的包含100ul BCA测定溶液的MTP(皮尔斯公司(Pierce)目录号：23225，BCA蛋白测定试剂盒)中。

13)在60℃孵育30min。

14)测量A562。

结果示于表6中。与野生型蛋白酶相比较，所有的经测试的变体均显示改善的热稳定性。

表6.玉米素-BCA测定

实例4

蛋白酶Pfu的热稳定性

使用如与实例2中相同的方法来检测购买自宝酒造生物公司(Takara Bio Inc)(日本)的强烈火球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性。发现热稳定性(相对活性)在pH 4.5是110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。

实例5：确定液化的玉米醪中的金属离子浓度

通过离子耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)进行金属离子分析。从美国中西部的工业乙醇工厂收集各种液化的玉米醪。将该液化物用硝酸(3％，v/v)降解，并使用ICP-OES定量各个元素如铝(Al)、硼(B)、钙(Ca)、铜(Cu)、铁/亚铁(Fe)、钾(K)、镁(Mg)、锰(Mn)、钠(Na)、镍(Ni)和锌(Zn)的浓度。使用来自SPEX CertiPrep(Fisher P/N CL-CAL-2)的可商购标准混合物计算各元素的浓度。

称取1g液化物样品放入125ml具有刻度的Nalgene瓶中，并用3％硝酸填充至100ml刻度，并且混匀。松开盖子，让其在室温下置于通风罩中过夜。降解过夜后，将10ml处理过的醪液通过0.45μm注射器过滤器过滤到15ml离心管中。将过滤的样品置于来自珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)型号Avio 500的ICP-OES自动进样器上。空白读数为3％硝酸，每个样品的分析取3个单独读数的平均值。

结果

通过ICP-OES测定的各种工业液化醪的金属离子浓度(mM)示出于表7。选择金属离子如Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Ni和Zn用于表征研究其对来自嗜热网球菌(SEQ ID NO:1)和海栖热袍菌(SEQ ID NO:2)的热稳定性木聚糖酶的活性的影响。

表7.

实例6-金属离子对来自嗜热网球菌和海栖热袍菌的热稳定性木聚糖酶的活性的影响

使用10g/L小麦阿糖基木聚糖(P-WAXYM，麦格酶公司)作为底物测定来自嗜热网球菌(SEQ ID NO:1)和海栖热袍菌(SEQ ID NO:2)的经纯化的热稳定性木聚糖酶的活性。通过称量出0.5g小麦阿糖基木聚糖到烧杯中然后添加大约40ml超纯水来制备底物溶液。剧烈搅拌并在微波炉中加热至80℃，并且重复搅拌/加热步骤直至基质完全溶解。在水浴中冷却烧杯，同时搅拌。将溶液冷却至室温后，转移至容量瓶中并用超纯水补足至50ml。

通过将250μl底物溶液，200μl 250mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)与含或不含最终浓度为0、0.0625、0.125、0.25和0.5mM的Ca、Cu、Fe、Mg、Mn和Zn的50μl金属离子溶液混合到1.5ml管中并涡旋来制备底物、缓冲液和金属离子混合物。使用PCR热循环仪进行酶活性测定。在PCR板中，向孔中分配80μl底物/缓冲液/金属离子混合物，并且通过添加20μl适当稀释的纯化木聚糖酶引发反应。放上盖，并在Veriti热循环仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))上在85℃下孵育30分钟。反应30分钟后，立即将板在冰中冷却3分钟。

使用对羟基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(其检测释放的还原糖的量)确定木聚糖酶产生的木寡糖的产物。向每个板孔中添加40μl PAHBAH溶液，并在55℃下孵育20分钟。20分钟后，将100μl相应的PAHBAH反应的上清液转移到96孔板中，并使用分光光度计在405nm处测量显色。酶活性定义为405nm处的吸光度强度。对照是在金属离子不存在的情况下的酶与底物/缓冲液反应。空白是没有添加酶的底物、缓冲液和相应浓度的金属离子。

结果

表8显示浓度低至0.0625mM的Cu、Fe和Zn使嗜热网球菌木聚糖酶(SEQ ID NO:1)的活性降低了20％-40％，而与之相比，海栖热袍菌木聚糖酶(SEQ ID NO:2)的活性不受影响(表9)。如表7中所示，在对应于液化玉米醪中检测到的量的0.125mM至0.25mM之间的较高浓度的Fe和Zn下，与海栖热袍菌木聚糖酶(SEQ ID NO:2)相比，嗜热网球菌木聚糖酶(SEQ IDNO:1)的活性显著减少了50％至60％(表8)，该海栖热袍菌木聚糖酶不受Cu或Zn的太大影响并且受Fe的影响较小(表9)。

出乎意料地，本文所述的结果表明，对玉米中存在的Cu、Fe或Zn抑制具有更大耐受性的热稳定性木聚糖酶如海栖热袍菌木聚糖酶(SEQ ID NO:2)将在液化中提供更稳健和一致的性能以实现产量效益。

表8：金属离子对嗜热网球菌木聚糖酶的影响

表9：金属离子对海栖热袍菌木聚糖酶的影响

实例7-确定用来自嗜热网球菌(Dt)和海栖热袍菌(Tm)的热稳定性木聚糖酶处理的液化玉米醪中的残余淀粉

使用Labomat BFA-24(北卡罗来纳州康科德市马西斯公司(Mathis,Concord,NC))在金属罐中进行液化。在罐中添加37.9g工业生产的磨碎的玉米至62.0g自来水中并充分混合。目标干固体(DS)为约33％DS。用40％v/v硫酸将pH调节至pH 5.0并使用水分天平(梅特勒-托利多公司(Mettler-Toledo))测量干固体。将由2.4μgα-淀粉酶AA2330加2.7μg Pfu蛋白酶组成的α-淀粉酶和蛋白酶混合物与或不与来自嗜热网球菌(SEQ ID NO:1)和海栖热袍菌(SEQ ID NO:2)的热稳定性木聚糖酶按剂量加入玉米浆中。每种处理一式三份地进行。作为对照，仅添加α-淀粉酶和蛋白酶而不添加木聚糖酶。木聚糖酶剂量为5μg/g干固体。液化在Labomat室中于91℃下进行2小时。一旦完成液化，将所有罐在冰浴中冷却至室温，然后进行探测以进行残余淀粉测定。将4-5g液化醪样品转移到预称重的15mL管中。为了确定残余淀粉，通过用超纯水洗涤除去醪液中的可溶性物质。通过添加大约6mL超纯水进行洗涤步骤，然后通过剧烈涡旋混合样品并以3500rpm离心5分钟。小心弃去上清液，如上所述用6mL超纯水将沉淀再洗涤2次。洗涤步骤后，用6mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)悬浮不溶性固体。通过添加50μL由α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(葡糖淀粉酶BL(GBL))的混合物组成的浓缩生淀粉水解酶来测定不溶性固体的残余淀粉。酶反应在50℃下进行过夜。孵育完成后，充分涡旋试管，并以3500rpm离心5分钟。收获上清液，然后用0.2μM过滤器进行注射器过滤。将滤液适当稀释到HPLC小瓶中。通过HPLC定量葡萄糖浓度并将计算值转化为淀粉的量。

结果

与对照或Dt木聚糖酶处理的液化物(SEQ ID NO:1)相比，用Tm木聚糖酶(SEQ IDNO:2)处理的液化后样品显示出较低的残余淀粉(表10)。较低的残余淀粉表明，与Dt木聚糖酶相比，Tm木聚糖酶从磨碎的玉米中释放更多的淀粉，这表明Tm木聚糖酶更有活性地水解玉米纤维并释放更多的纤维结合淀粉。

表10：用或不用热稳定木聚糖酶处理的液化样品的平均残余淀粉

处理	木聚糖酶剂量(ug/gDS)	液化后残余淀粉(％淀粉/gDS)
			对照	0	9.2％
Dt木聚糖酶	5	8.6％
			Tm木聚糖酶	5	7.6％

实例8-确定用来自嗜热网球菌(Dt)和海栖热袍菌(Tm)的热稳定性木聚糖酶处理的液化玉米醪中的寡糖浓度

使用Labomat BFA-24(北卡罗来纳州康科德市马西斯公司(Mathis,Concord,NC))在金属罐中进行液化。在罐中添加38.4g工业生产的磨碎的玉米至61.4g自来水中并充分混合。目标干固体(DS)为约33％DS。用40％v/v硫酸将pH调节至pH 5.0并使用水分天平(梅特勒-托利多公司)测量干固体。将由1.5μgα-淀粉酶AA2330加3.0μg Pfu蛋白酶组成的α-淀粉酶和蛋白酶混合物与或不与来自嗜热网球菌(SEQ ID NO:1)和海栖热袍菌(SEQ ID NO:2)的热稳定性木聚糖酶按剂量加入玉米浆中。每种处理一式三份地进行。作为对照，仅添加α-淀粉酶和蛋白酶而不添加木聚糖酶。木聚糖酶剂量为2.5、5和10μg/g干固体。液化在Labomat室中于91℃下进行2小时。一旦完成液化，将所有罐在冰浴中冷却至室温，然后进行高效液相色谱(HPLC)分析。为了制备用于HPLC分析的样品，将大约5g液化醪转移到15mL离心管中并以3500rpm离心10分钟。离心后，收获上清液，然后用0.2μM过滤器通过注射器过滤到HPLC小瓶中。HPLC配备有Aminex HPX-42A柱(伯乐公司(Bio-rad))，以超纯水作为流动相以0.5ml/min的流速并将温度设定在85℃运行，并且配备有折射率检测。葡萄糖的寡糖标准，DP1；麦芽糖，DP2；麦芽三糖，DP3；麦芽四糖，DP4；麦芽五糖(DP5)和麦芽六糖(DP6)是商购的，并用作定量由液化后的酶反应产生的短链寡糖的参考。

结果

与对照或Dt木聚糖酶(SEQ ID NO:1)处理的液化物相比，用Tm木聚糖酶(SEQ IDNO:2)处理的液化物样品显示更高浓度的DP2、DP3、DP4、DP5和DP6(表11)。寡糖(DP1至DP6)的总量随Tm木聚糖酶的酶量增加而成比例地增加。与Dt木聚糖酶相比，Tm木聚糖酶在液化后活性更高从而产生更大量的短链低聚糖，由于Tm木聚糖酶释放更多的纤维结合淀粉的作用，这使得α-淀粉酶协同水解更多能够实现高发酵产率的淀粉。

表11.用或不用热稳定性木聚糖酶处理的液化样品的寡糖(DP1至DP6)的平均浓度

实例9-确定来自海栖热袍菌(Tm)的抗金属离子的热稳定性木聚糖酶的最适温度和温度稳定性

该实例说明了如何确定酶(例如本披露的抗金属离子抑制木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶等)的最适温度和DSC熔点以确定该酶是否是热稳定的(例如，适合用于在液化步骤i)中使用)。使用10g/L小麦阿糖基木聚糖(P-WAXYM，麦格酶公司)作为底物测定来自海栖热袍菌(SEQ ID NO:2)的抗金属离子的热稳定性木聚糖酶的最适温度和稳定性。通过称量出0.5g小麦阿糖基木聚糖到烧杯中然后添加大约40mL超纯水来制备底物溶液。将该溶液剧烈搅拌并在微波中在80℃下加热直至底物完全溶解。通过将烧杯置于水浴中同时搅拌来冷却溶液。在溶液冷却至室温后，将溶液转移到容量瓶中并用超纯水补足至50mL。通过将250μl底物溶液、200μl 250mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)混合到1.5ml试管中并涡旋来制备底物和缓冲液混合物。

使用分别预设为80℃、83℃、86℃、89℃、92℃和95℃的PCR热循环仪进行最适温度测定。在PCR板中，将80μl底物/缓冲液分配到孔中以混合，并通过添加20μl适当稀释的纯化Tm木聚糖酶引发反应。放上盖，并在Veriti热循环仪(赛默飞世尔科技公司)上在相应温度下孵育30分钟。反应30分钟后，立即将板在冰中冷却3分钟，然后进行如下所述的PAHBAH测定。

使用分别预设为4℃、86℃、89℃、92℃、95℃和98℃的PCR热循环仪进行温度稳定性测定。在PCR板中，分配20μl适当稀释的纯化Tm木聚糖酶，然后加盖并预孵育30分钟。孵育30分钟后，通过向孔中添加80μl底物/缓冲液混合物、放上盖、并在Veriti热循环仪(赛默飞世尔科技公司)上并孵育30分钟来测定木聚糖酶活性。反应30分钟后，立即将板在冰中冷却3分钟，然后进行如下所述的PAHBAH测定。此外，使用差示扫描量热法(DSC)确定Tm木聚糖酶(SEQ ID NO:2)的熔解温度(Td)。

使用对羟基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(其检测释放的还原糖的量)确定木聚糖酶产生的木寡糖的产物。向每个板孔中添加40μL PAHBAH溶液，并在55℃下孵育20分钟。20分钟后，将100μL相应的PAHBAH反应上清液转移到96孔板中，并使用分光光度计在405nm处测量显色。酶活性定义为405nm处的吸光度强度。对照是在金属离子不存在的情况下的酶与底物/缓冲液反应。空白是不添加酶的底物和缓冲液。

结果

Tm木聚糖酶(SEQ ID NO:2)的最适温度示于图1的图中。参考呈现最高活性为100％的温度来计算木聚糖酶相对活性。Tm木聚糖酶在95℃显示最高活性。

Tm木聚糖酶的温度稳定性示于图2的图中。参考在4℃预孵育的木聚糖酶活性为100％来计算木聚糖酶残余活性。Tm木聚糖酶是非常热稳定的并且在多达98℃的温度下几乎没有活性损失。

按差示扫描量热法(DSC)测量的Tm木聚糖酶的熔解温度(Td)具有110℃的Td值。

Claims

ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及

iii)使用发酵生物体进行发酵以生产该发酵产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中与不存在该木聚糖酶的情况下在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量相比，在液化步骤i)结束时存在的残余淀粉的量减少。

3.如权利要求1所述的方法，其中与不存在该木聚糖酶的情况下在液化步骤i)结束时的短链寡糖的量相比，在液化步骤i)结束时存在的短链寡糖的量增加。

任选地，ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及

任选地，iii)使用发酵生物体进行发酵以生产该发酵产物。

6.如权利要求4或5所述的方法，该方法进一步包括ii)使用产碳水化合物源的酶进行糖化；以及任选地，iii)使用发酵生物体进行发酵以生产该发酵产物。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶源自热袍菌属的菌株。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶与本文SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如海栖热袍菌的菌株。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶与本文SEQ ID NO:3的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如那不勒斯栖热袍菌的菌株。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶与本文SEQ IDNO:4的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自热袍菌属的菌株，如嗜萘热袍菌的菌株。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是玉米，以及在液化含淀粉材料时金属离子是铜离子、铁离子和锌离子。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在液化含淀粉材料时对金属离子抑制的抗性是在液化含淀粉材料时在存在平均浓度的该金属离子的情况下保留该木聚糖酶的相对活性的至少60％、至少65％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时在存在铜离子的情况下保留其相对活性的至少80％。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时在存在铁离子的情况下保留其相对活性的至少70％。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶在液化含淀粉材料时在存在锌离子的情况下保留其相对活性的至少95％。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在液化含淀粉材料时存在的金属离子的平均浓度为0.012mM至0.15mM。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该玉米中存在的铜离子的平均浓度为0.012mM。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该玉米中存在的铁离子的平均浓度为0.15mM。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中该玉米中存在的锌离子的平均浓度为0.12mM。

21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中热稳定性α-淀粉酶和/或热稳定性蛋白酶存在于液化步骤i)中。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该热稳定性α-淀粉酶与本文SEQ IDNO:5的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、如100％同一性，优选源自芽孢杆菌属的菌株，如嗜热脂肪芽孢杆菌。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该热稳定性蛋白酶选自由以下组成的组：

(i)源自火球菌属的菌株的蛋白酶，如SEQ ID NO:11中所示的强烈火球菌蛋白酶或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶；

(ii)源自嗜热裂孢菌属的菌株的蛋白酶，如本文SEQ ID NO:26中所示的解纤维素嗜热裂孢菌蛋白酶或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶，或本文SEQ ID NO:27中所示的褐色嗜热裂孢菌蛋白酶或与SEQ IDNO:27的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性，至少79％同一性、优选至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的蛋白酶，或SEQ ID NO:28中所示的耐盐嗜热裂孢菌蛋白酶或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、至少76％同一性、至少77％同一性、至少78％同一性、至少79％同一性、优选至少80％、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、更优选至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性或至少95％同一性、如至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％的同一性、至少99％同一性的蛋白酶；以及

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)期间的pH在4.0-6.5之间，如4.5-6.2，如大于4.8-6.0，如5.0-5.8之间。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在液化期间的温度是在70℃至100℃的范围内，如在70℃至95℃之间、如在75℃至90℃之间、优选地在80℃至90℃之间、如约85℃。

26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中糖化和发酵顺序进行或同时进行。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。

29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。

30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中该发酵生物体是酵母，优选酵母属的菌株，特别是酿酒酵母的菌株。

31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中该热稳定性木聚糖酶是含有基序YITEMD(SEQ ID NO:30)的GH10家族木聚糖酶。