CN102165059A - 哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与源自蜂房哈夫尼菌的肌醇六磷酸酶具有至少76%同一性并在其氨基酸序列中包含至少一个修饰的肌醇六磷酸酶。这些肌醇六磷酸酶变体具有修饰的,优选改进的,性质,例如,降低的蛋白酶敏感性,优选它们在热性能方面展现出改进的性质,如加热稳定性(温度稳定性,热稳定性),蒸汽稳定性,制粒稳定性和/或温度概貌;和/或蛋白酶稳定性,特别是胃蛋白酶稳定性,pH概貌,比活性,底物特异性,在动物饲料中的性能(如肌醇六磷酸盐改进的释放和/或降解),对糖化第一感性,和/或糖基化模式。本发明还水解编码这些肌醇六磷酸酶的DNA,它们的产生方法,以及它们的用途,例如在动物饲料和动物饲料添加剂中。
Description
对序列表的涉及
本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及与源自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的肌醇六磷酸酶(其氨基酸序列在所附序列表中作为SEQ ID NO:2显示)具有至少76%同一性并且如与这种肌醇六磷酸酶相比包含至少一个修饰(即,为其变体)的肌醇六磷酸酶。本发明还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA,包含所述多核苷酸的核酸构建体,载体和宿主细胞以及它们的产生方法,以及它们的用途,例如在动物饲料和动物饲料添加剂中。
发明背景
背景技术
肌醇六磷酸酶是公知的酶,将它们加入动物(包括人)的食物的优点也是公知的。已经从多种来源分离了肌醇六磷酸酶,包括多种真菌和细菌菌株。
本发明的一个目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的可供选择的多肽(肌醇六磷酸酶)和编码所述多肽的多核苷酸。本发明的肌醇六磷酸酶变体如与亲本肌醇六磷酸酶相比展现出修饰的或改变的优选改进的性质。这些性质的非限定性实例是:稳定性(如酸稳定性,加热稳定性(heat-stability),蒸汽稳定性,制粒稳定性(pelleting stablity)和/或蛋白酶稳定性,特别是胃蛋白酶稳定性),温度概貌(temperature profile),pH概貌(pH profile),比活性,底物特异性,在动物饲料中的性能(如肌醇六磷酸盐改进的释放和/或降解),对糖化的易感性和/或糖基化模式。
已知组氨酸酸性磷酸盐(HAP)型的肌醇六磷酸酶的多种三维结构。(例如Lim等,Nature struct.biol.7,108-113(2000))。这些肌醇六磷酸酶在结构上相关,但是在氨基酸序列上有很大差异。
PCT/EP2008/053561公开了蜂房哈夫尼菌DSM 19197的野生型HAP肌醇六磷酸酶的氨基酸序列(即,此处的SEQ ID NO:2),在PCT/EP2008/053561中为SEQ ID NO:10。蜂房哈夫尼菌DSM 19197的野生型HAP肌醇六磷酸酶的三维结构还公开在PCT/EP2008/053561中。所述结构与已知结构充分对应。
本发明的一个目的是提供如下肌醇六磷酸酶,该肌醇六磷酸酶如与其所源自的亲本或参照肌醇六磷酸酶相比具有修饰的,优选改进的性质。
序列表概述
在序列表中,SEQ ID NO:1和2提供了蜂房哈夫尼菌DSMZ 19197肌醇六磷酸酶的DNA和氨基酸序列。
实施例概述
在本说明书中提供以下实施例:
实施例1:变体的制备和活性的测定
实施例2:比活性
实施例3:温度稳定性
实施例4:热稳定性
实施例5:温度概貌
实施例6:pH概貌
实施例7:蒸汽稳定性
实施例8:糖化残余活性(glycation residual activity)
实施例9:制粒稳定性测试
实施例10:在用于雏鸡的体外模型中于动物饲料中的性能
实施例11:在猪的体内试验中的性能
发明内容
本发明涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-413具有至少76%同一性并且包含在选自下述的至少一个位置中的至少一个修饰的肌醇六磷酸酶:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413,其中所述位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶的位置,条件是所述肌醇六磷酸酶不是具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶。
本发明还涉及如下肌醇六磷酸酶,该肌醇六磷酸酶与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-413具有至少76%同一性并且包含在选自下述的至少一个位置中的至少一个修饰:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413;和在选自下述的至少一个位置中的至少一个另外的修饰:1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,139,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413,条件是所述肌醇六磷酸酶不是具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶。
本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-413具有至少76%同一性并且包含选自下述修饰的在至少一个位置的至少一个修饰的肌醇六磷酸酶:8L,C,9K,P,S,10V,12S,R,16V,18K,25A,26R,Q,27A,28A,29P,R,K,A,30P,L,31I,32Q,I,L,33C,N,35C,36C,37D,R,K,38A,41T,45P,48H,W,N,49L,54C,G,55E,59R,K,63C,66C,68L,69E,L,70E,74S,75A,76R,V,77K,G,W,78G,R,K,Q,S,79L,81E,82S,83G,92Y,93P,E,N,95P,A,96N,V,97R,100W,101C,103A,109D,111R,K,S,112S,115L,M,R,K,116S,T,N,117A,Q,118A,N,E,P,T,119D,K,E,120G,L,I,M,121A,S,T,G,K,122A,S,T,K,123P,M,V,A,T,128N,R,130L,131R,132T,V,134V,136Q,137L,138N,V,139C,R,140P,143C,V,144R,148R,150C,151D,160G,162N,R,163P,168V,172C,173N,175N,S 176C,Q,177C,178C,E 179C,L,W,181L,185R,K,186S,T,187E,190N,193R,195L,198E,199C,201C,202A,K,203Y,206G,T,A,207N,L,208A,209S,211T,R,215S,217S,G,219M,L,221T,G,224C,227Q,228C,Q,230E,234L,R,C,V,235P,236C,239R,243P,244P,245E,246N,247D,248T,249S,T,251S,D,E,R,256D,A,258Y,259C,260L,261F,Q,A,268R,270R,284P,285D,286T,287P,288P,293R,K,N,298S,299R,301M,308A,310L,312A,313L,314G,316P,A,318E,319L,320N,325C,K,326C,331C,S,T,335E,343C,344K,346S,T,347R,348D,E,S,R 354L,355S,T,356F,358C,360P,Q,362M,363C,R,K,V,365K,366T,368C,369S,370C,374C,P,376E,378K,380,382S,T,383N,394N,395E,396D,E,401N,403N,和411S。
本发明的肌醇六磷酸酶变体如与亲本肌醇六磷酸酶相比展现出修改的或改变的优选改进的性质。这些性质的非限定性实例是:稳定性(如酸稳定性,加热稳定性,蒸汽稳定性,和/或蛋白酶稳定性,特别是胃蛋白酶稳定性),温度概貌,pH概貌,比活性,底物特异性,在动物饲料中的性能(如肌醇六磷酸盐的改进的释放和/或降解),对糖化的易感性和/或糖基化模式。
本发明还涉及编码这些肌醇六磷酸酶的DNA,它们的产生方法,以及它们的用途,例如在动物饲料和动物饲料添加剂中。
发明详述
在第一个方面,本发明涉及与SEQ ID NO:2具有至少76%同一性并且在选自下述的至少一个位置中包含至少一个修饰的肌醇六磷酸酶:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413。同一性百分比是如“肌醇六磷酸酶多肽,同一性百分比”部分中所述确定的。
位置号是指SEQ ID NO:2的位置编号,如“位置编号”部分中所述。在其它肌醇六磷酸酶中对应于这些SEQ ID NO:2位置号的位置是如“鉴定对应位置号”部分中所述确定的。
本发明的肌醇六磷酸酶是SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的变体,即它与SEQ ID NO:2不同,因为它与SEQ ID NO:2相比包含至少一个修饰。
在一个优选的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶包含下述修饰中的至少一个:8L,C,9K,P,S,10V,12S,R,16V,18K,25A,26R,Q,27A,28A,29P,R,K,A,30P,L,31I,32Q,I,L,33C,N,35C,36C,37D,R,K,38A,41T,45P,48H,W,N,49L,54C,G,55E,59R,K,63C,66C,68L,69E,L,70E,74S,75A,76R,V,77K,G,W,78G,R,K,Q,S,79L,81E,82S,83G,92Y,93P,E,N,95P,A,96N,V,97R,100W,101C,103A,109D,111R,K,S,112S,115L,M,R,K,116S,T,N,117A,Q,118A,N,E,P,T,119D,K,E,120G,L,I,M,121A,S,T,G,K,122A,S,T,K,123P,M,V,A,T,128N,R,130L,131R,132T,V,134V,136Q,137L,138N,V,139C,R,140P,143C,V,144R,148R,150C,151D,160G,162N,R,163P,168V,172C,173N,175N,S 176C,Q,177C,178C,E 179C,L,W,181L,185R,K,186S,T,187E,190N,193R,195L,198E,199C,201C,202A,K,203Y,206G,T,A,207N,L,208A,209S,211T,R,215S,217S,G,219M,L,221T,G,224C,227Q,228C,Q,230E,234L,R,C,V,235P,236C,239R,243P,244P,245E,246N,247D,248T,249S,T,251SD,E,R,256D,A,258Y,259C,260L,261F,Q,A,268R,270R,284P,285D,286T,287P,288P,293R,K,N,298S,299R,301M,308A,310L,312A,313L,314G,316P,A,318E,319L,320N,325C,K,326C,331C,S,T,335E,343C,344K,346S,T,347R,348D,E,S,R 354L,355S,T,356F,358C,360P,Q,362M,363C,R,K,V,365K,366T,368C,369S,370C,374C,P,376E,378K,380,382S,T,383N,394N,395E,396D,E,401N,403N,和411S。
此处对于修饰使用的命名法在“修饰,如取代,缺失,插入”部分中详细描述。
优选地,展现出改进的热稳定性的本发明肌醇六磷酸酶包含下述修饰中的至少一个:8C,33C 35C,36C,54C,63C,66C,101C,139C,143C,201C,150C,172C,176C,177C,178C,179C,224C,228C,236C,259C,325C,326C,331C,343C,358C,363C,368C,370C,374C。具体地,其包含选自下述的修饰组:8C/343C,139C/201C,179C/33C,178C/33C,172C/35C,177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,368C/374C。本发明还包含如8C/343C与139C/201C,179C/33C,178C/33C,172C/35C,177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如139C/201与179C/33C,178C/33C,172C/35C,177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如179C/33C与178C/33C,172C/35C,177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如178C/33C与172C/35C,177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如172C/35C与177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如177C/36C与176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如176C/36C与143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如143C/201C与54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如54C/101C与63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如63C/368C与66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如66C/370C与224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如224C/236C与150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如150C/259C与331C/326C,358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如331C/326C与358C/325C,228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如358C/325C与228C/363C,或368C/374C的组合这样的组合。本发明还包含如228C/363C与368C/374C的组合这样的组合。
在用于改进热稳定性的其它实施方案中,所述肌醇六磷酸酶包含选自下述的修饰:29P,30P,93P,95P,140P,163P,235P,243P,244P,284P,287P,288P,316P,和360P。
所述肌醇六磷酸酶也可包含选自下述的修饰:8L,9K,12S,16V,27A,30L,32Q,37D,38A,41T,48W,49L,54G,55E,75A,77K,78G,93E,103A,109D,128N,130L,132T,134V,136Q,137L,173N,176Q,195L,198E,206T,207N,209S,211T,215S,219M,221T,227Q,228Q,248T,258Y,260L,261Q,310L,313L,314G,316A,318E,319L,320N,335E,354L,356F,360Q,362M,251S,363R,365K,366T,369S,374P,376E,378K,和411S。
所述肌醇六磷酸酶也可包含选自下述的修饰:9R,29R,K,37R,K,59R,K,69E,70E,78R,K,81E,93E,111R,K,115R,K,119D,185R,K,230E,239R,245E,251D,E,293R,K,348D,E,363R,K,395E,和396D,E。
所述肌醇六磷酸酶也可包含选自下述的修饰:12R,25A,26R,28A,29A,30L,45P,48W,76R,97R,117A,118A,119D,120L,121A,122A,131R,139R,148R,176R,179L,187E,202A,206A,207L,219L,234R,251R,261A,268R,270R,299R,347R,256A,308A,和312A。
进一步地,当所述肌醇六磷酸酶包含选自下述的修饰时,其效力可以改进:31I,120I,I134V,N202K,D203Y和V208A。
在改进肌醇六磷酸酶的效力的具体实施方案中,位置180和189之间的氨基酸残基已经由长度为4,5,6,7或8个氨基酸残基的小肽替代,特别是五肽QADKP,GEDKP,NGISA,IAGKS,KEKHQ,KEKQQ,KEKKV,或KTDKL,和/或其也包括在位置115和124之间的氨基酸残基已经由长度为5,6,7,8,9,10或11个氨基酸残基的小肽替代,特别是七肽TQADTSSP。
在另外的优选实施方案中,所述肌醇六磷酸酶包含以下修饰组合:54C/55E/101C,33C/178E/179C和33C/175S/176Q/178E/179C。
本发明的肌醇六磷酸酶可为任何野生型或变体肌醇六磷酸酶的变体。
具体对于SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶包括以下具体修饰:
M31I,120I,I134V,N202K,D203Y,V208A,Y179W,A221G,R32I,R32L,D77G,D77W,T95A,D111S,K234C,K234V,K251S,H363V,H363R,D293R,Q93E,P348S,Q69L,Q245E,N78Q,K76V,G325K,G325G,A217G,A132T,和以下组合变体:
A132V/Q162R,A132V/Q181L,A132V/E211R,A132V/D83G,
A132V/A217G,A132V/A217S,E100W/H363R D138V/Y48H,A132V/A217G,A132V/Q162R/Q181L/A217G,P348R/H363R,Q9S/D92Y,
Q9P/L10V/D92Y/H115M,Q9P/L10V/D92Y/H115/L,D92Y/H115M,
D92Y/H115M/L,D92Y/H115M,E100W/A217G/H363R,A217G/K251S,
E100W/A217G/K251S,E100W/K251S,E100W/I555V/A217G,
Q9S/E100W/R160G/A217G/H363R,D92Y/E100W/A217G/H363R,
E100W/H115M/A217G/H363R,E100W/A217G/P348R/H363R,Q9S/A89A/D92Y/H115M/A217G/H363R,N78Q/E100W/A217G/H363R,
K76V/N78Q/E100W/A217G/H363R,D83G/E100W/A217G/H363R,
E100W/Y179W/A217G/H363R,E100W/A217G/K234V/K251E/I286T/H363R,
E100W/A217G/K234V/P348R/H363R,Q9S/R18K/A89A/D92Y/H115M/A217G/K234V/H363R,Q9S/D92Y/H115M/A217G/K234V/H363R,
Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115M/K234V/P348R/H363R,
Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/Q181L/A217G/K234V/P348R,Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/A217G/H363R,E54C/N78S/D92Y/A101C/H143C/L199C/A217G/H363R,
E54C/A101C/M168V/A217G/H363R,
P82S/D92Y/E100W/H143C/I201C/A217G/H363R,
P82S/D92Y/E100W/H143C/I201C/A217G/H363R,
Q9S/N78Q/D92Y/L112S/H115M/A217G/K234V/P348R/H363R,D92Y/A217G/K234V/H363R,Y64S/D92Y/E100W/Y179W/A217G/H363R,
D92Y/A217G/H363R,Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/H143C/Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R,Q9S/N78Q/
A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R,Q9S/N78Q/
A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/Q162R/Q181L/L199C/A217G/K234V/L301M/P348R,
Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/Y179W/Q181L/A217G/K234V/P348R,D92Y/E100W/A217G/H363R/+D33C/Y179C,
D92Y/E100W/A217G/H363R/+116-123(HQQNTQQA->TQADTSSP)=
D92Y/E100W/H116T/Q118A/N119D/Q121S/Q122S/A123P/A217G/H363R,
Q9S/E54C/D92Y/A101C/H143C/Q193R/I201C/A217G/N298S/H363R+116-123(HQQNTQQA->TQADTSSP)=
Q9S/E54C/D92Y/A101C/H116T/Q118A/N119D/Q121S/Q122S/A123P/H143C/Q193R/I201C/A217G/N298S/H363R,
Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/Y179W/A217G/K234V/P348R/H363R,
Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/Q162R/Y179W/A217G/K234V/S261F/P348R/H363R,
Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/G151D/Q162R/Y179W/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R,E54C/D92Y/A101C/M168V/A217G/H363R,
Q9S/N78Q/A132V/K139C/Q162R/Y179W/I201C/A217G/K234L/P348R/H363R,D92Y/E100W/H143C/A144R/I201C/A217G/N247D/H363R,
D92Y/E100W/H116S/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R,
D92Y/E100W/H128R/K139C/H143V/I201C/A217G/N247D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/N206G/A217G/N247D/H363R,D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/Q256D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/N247D/N344K/H363R,
D92Y/E100W/K139C/A144S/K176E/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R/E54C/H55E/A101C,D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R,
Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/S284C/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/T287W/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289M/H363R,
Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R,
N78Q/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/P348R/H363R,
D92Y/E100W/K139C/Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,D92Y/E100W/A113G/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R,
D92Y/E100W/T120G或
A*/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R/L395L或V,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/S284M/H363R,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R/A366S,
D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R,
D92Y/E100W/H128R/K139C/I201C/A217G/K234V/N247E/Q256D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/Q141S/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/A144S/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R,
P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,
D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,
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本发明还涉及用于产生与SEQ ID NO:2具有至少76%同一性的参照或亲本肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸酶变体的方法,其中所述变体在下述位置的一个或多个中展现出至少一个取代,插入或缺失:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413,其中所述位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶的位置,条件是所述变体不是具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶,所述方法包括:
a)以使编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA或基因编码所述取代,插入和/或缺失的方式突变所述DNA或基因,
b)将所述DNA或基因可操作地连接至一个或多个指导所述肌醇六磷酸酶在合适的表达宿主中产生的调控序列以创建DNA构建体或重组表达载体,
c)将所述构建体或载体转移至合适的宿主,
d)培养所述宿主以产生变体肌醇六磷酸酶,和
e)回收所述肌醇六磷酸酶。
具体而言,所述方法提供具有在热性能包括加热稳定性,温度稳定性,热稳定性,蒸汽稳定性,制粒稳定性和/或温度概貌方面的改进的性质,和/或改进的效力,包括改进的pH概貌,改进的比活性,改变的糖基化模式,改进的在动物饲料中的性能,和/或其并入了潜在的蛋白酶切割位点和/或糖基化位点的变化。
制备变体的策略
蜂房哈夫尼菌DSM 19197肌醇六磷酸酶(SEQ ID NO:2的氨基酸1-413)的结构公开在PCT/EP2008/053561中。
对该结构进行分子动力学(MD)模拟和静电计算。还鉴定了推定的二硫键和脯氨酸的位置,以及与各种理想的酶性质有关的具有潜在重要性的其它位置。最终,鉴定了推定的糖基化位点(NXT或NXS序列段(stretch))。
对所有这些提议均在模型化结构和模拟结果的框架内针对热稳定性质(特别强调在高温状态下)进行了评估。
相应的肌醇六磷酸酶变体通过本领域已知的方法制备并如实验部分中所述测试。
肌醇六磷酸酶多肽,同一性百分比
在本文中,肌醇六磷酸酶是具有肌醇六磷酸酶活性的多肽,即催化肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸盐(myo-inositol hexakisphosphate))水解成(1)肌醇和/或(2)它的一-,二-,三-,四-和/或五-磷酸盐和(3)无机磷酸盐的酶。
在本上下文中,术语肌醇六磷酸酶底物包括,但不限于,肌醇六磷酸和任何肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸的盐),以及上文(2)中所列的磷酸盐。
互联网上的ENZYME网站(http://www.expasy.ch/enzyme/)是与酶的命名法有关的信息库。其主要基于Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUB-MB)的推荐,并且其描述了各个类型的已提供了EC(酶学委员会)编号的经表征的酶(Bairoch A.The ENZYME database,2000,Nucleic Acids Res 28:304-305)。也参见NC-IUBMB,(1992)的手册Enzyme Nomenclature。
根据ENZYME网站,已知三种不同类型的肌醇六磷酸酶:所谓的3-肌醇六磷酸酶(别名1-肌醇六磷酸酶;肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶,EC 3.1.3.8),所谓的4-肌醇六磷酸酶(别名6-肌醇六磷酸酶,基于1L-编号体系而非1D-编号的命名,EC 3.1.3.26),和所谓的5-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.72)。就本发明而言,所有三种类型均包括在肌醇六磷酸酶的定义内。
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族,其包括大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶(基因appA),以及真菌肌醇六磷酸酶如泡盛曲霉(Aspergillus awamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC:3.1.3.8)(基因phyA和phyB)。组氨酸酸性磷酸酶共同具有两个具有序列相似性的区域,每个区域围绕着一个保守的组氨酸残基中心。这两个组氨酸似乎参与了所述酶的催化机制。第一个组氨酸位于N-末端部分并形成磷-组氨酸中间体,而第二个位于C-末端部分并且可能发挥质子供体的作用。
在一个更具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性位点基序,即R-H-G-X-R-X-P,其中X代表任何氨基酸(参见SEQ ID NOs:2的氨基酸18-24)。在一个优选的实施方案中,保守的活性位点基序为R-H-G-V-R-A-P,即氨基酸18-24(参考SEQ ID NO:2)是RHGVRAP。
就本发明而言,肌醇六磷酸酶活性以FYT单位来确定,一个FYT是在下列条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸的酶量:pH 5.5;温度37℃;底物:浓度为0.0050mol/l的肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)。适当的肌醇六磷酸酶测定法是在WO 00/20569的实施例1中描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混物中的肌醇六磷酸酶活性。还可以利用实施例1(“磷酸酶活性的测定”或“肌醇六磷酸酶活性的测定”)中的测定法来确定肌醇六磷酸酶的活性。
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶是分离的。本文所用的术语“分离的”是指如由SDS-PAGE确定的,至少20%纯的,优选至少40%纯的,更优选至少60%纯的,甚至更优选至少80%纯的,最优选至少90%纯的,和甚至最优选至少95%纯的多肽。具体而言,优选多肽为“基本上(essentially)纯的形式”,即,所述多肽制备物基本上不含(essentially free of)与其天然结合(natively associated)的其它多肽物质。例如,这可以通过用熟知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽来实现。
两个氨基酸序列之间的相关性通过参数“同一性”来描述。就本发明而言,两个氨基酸序列的比对通过利用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来确定。Needle程序执行在Needleman S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中描述的全局比对算法(global alignment algorithm)。所用的取代矩阵是BLOSUM62,缺口产生罚分(gapopening penalty)是10,并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。
本发明的氨基酸序列(“发明序列”)和权利要求中涉及的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)之间的同一性程度按照两个序列的比对中精确匹配的数目除以“发明序列”的长度或SEQ ID NO:2的长度中最短的一个来计算。结果以百分比同一性表示。
当“发明序列”和SEQ ID NO:2在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配(在下文的比对实例中用“|”代表这种情况)。序列的长度是序列中的氨基酸残基数(例如SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的长度是413)。
更详细的解释参考WO 2007/112739的第7页第24行至第8页第5行。
在本发明的肌醇六磷酸酶的具体实施方案中,与SEQ ID NO:2的同一性程度为至少76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或至少99%。在还更具体的实施方案中,所述同一性程度为至少98.0%,98.2%,98.4%,98.6%,98.8%,99.0%,99.1%,99.2%,99.3%,99.4%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,或至少99.9%。在可选的实施方案中,所述同一性程度为至少70%,71%,72%,或至少73%。
在还更具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶如与SEQ ID NO:2相比具有不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9个,或不多于10个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于11,12,13,14,15,16,17,18,19个,或不多于20个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于21,22,23,24,25,26,27,28,29个,或不多于30个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于31,32,33,34,35,36,37,38,39个,或不多于40个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于41,42,43,44,45,46,47,48,49个,或不多于50个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于51,52,53,54,55,56,57,58,59个,或不多于60个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于61,62,63,64,65,66,67,68,69个,或不多于70个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于71,72,73,74,75,76,77,78,79个,或不多于80个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于81,82,83,84,85,86,87,88,89个,或不多于90个修饰;如与SEQ ID NO:2相比不多于91,92,93,94,95,96,97,98,99个,或不多于100个修饰;如与SEQ ID NO:2相不多于101,102,103,104,105,106,107,108,109个,或不多于110个修饰。
位置编号
本文所用的定义氨基酸位置的命名法是基于源自蜂房哈夫尼菌DSM19197的肌醇六磷酸酶氨基酸序列,其成熟序列在序列表中作为SEQ IDNO:2给出(SEQ ID NO:2的氨基酸1-413)。因此,在本文上下中,用于编号位置的基础是SEQ ID NO:2,以S1起始并以P413结束。
当用于本文时术语“成熟”部分(或序列)是指由含有编码该多肽的多核苷酸作为其遗传部件(genetic equipment)部分的细胞分泌的多肽的部分。换句话说,成熟多肽部分是指在已经切掉信号肽部分,以及前肽部分(如果存在任何前肽部分的话)以后所剩余的多肽部分。信号肽部分可以通过本领域已知的程序预测(例如SignalP)。SEQ ID NO:2是预期的成熟部分。通常,酶的成熟部分的第一个氨基酸可以通过对纯化酶进行N-末端测序来确定。信号肽部分和成熟部分之间的任何差异则必然是由于前肽的存在。
修饰,如取代,缺失,插入
肌醇六磷酸酶变体相对于模板(即亲本或参照肌醇六磷酸酶,或比较性氨基酸序列如SEQ ID NO:2)可以包含各种类型的修饰:一个氨基酸可以用另一氨基酸取代;可以缺失氨基酸;可以在两个残基之间插入氨基酸;以及任意数目的这些修饰的任意组合。在本文中术语“插入”意欲还包括N-和/或C-末端的延伸。
本文对单一修饰所用的一般命名法如下:XDcY,其中“X”和“Y”独立地代表单字母氨基酸代码,或“*”(氨基酸的缺失),“D”代表数字,而“c”代表字母顺序计数(a,b,c等等),其只存在于插入的情况中。参考下表1,其描述了该命名法应用于各种类型的修饰的完全假定的实例。
表1命名法实例
如上面所解释的,位置数(″D″)从SEQ ID NO:2的第一个氨基酸残基起算。
在同一序列中的几个修饰用″/″(斜线)隔开,例如标识″1*/2*/3*″表示在位置号1,2和3的氨基酸全部缺失,而标识″104A/105F″表示位置号104的氨基酸由A取代,并且位置号105的氨基酸由F取代。
可选的修饰用″,″(逗号)隔开,例如,标识″119R,K″表示位置119的氨基酸用R或K取代。
本文在各种其它不胜枚举的可能性中所用的逗号(,)表示它们通常在语法上的作用,即通常是和/或。例如,所列的“53V,Q,121D,和/或167Q”中第一个逗号表示二中选一(V或Q),而后面的两个逗号应理解为和/或的选择:53V或53Q,和/或121D,和/或167Q。
在本文中,“至少一个/至少一种”(例如修饰)表示一个或多个/一种或多种,例如1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个修饰;或12,14,15,16,18,20,22,24,25,28或30个修饰;等等,直至最大修饰数目125,130,140,150,160,170,180,190或200个。然而,本发明的肌醇六磷酸酶变体还必需与SEQ ID NO:2至少76%相同,这个百分比如上所述确定。
对用什么取代或延伸没有进行任何指定的取代或延伸是指插入任何天然的,或非天然的氨基酸,除了占据模板中该位置的氨基酸以外。
鉴定相应的位置号
如上面所解释,使用蜂房哈夫尼菌DSM 19197(SEQ ID NO:2)的成熟肌醇六磷酸酶作为位置编号的标准,且因此也是命名法的标准。
对于别的肌醇六磷酸酶,特别是本发明的肌醇六磷酸酶变体,对应于SEQ ID NO:2中位置D的位置通过如在名为“肌醇六磷酸酶多肽,同一性百分比”部分中所指明的比对两个序列来找到。从比对中,本发明序列中与SEQ ID NO:2的位置D相对应的位置可以清晰地和明白地鉴定出来(在比对中互在对方顶部的那两个位置)。
以下包括了一些额外的完全假设性的实例,这些实例源自上文表1,表1在第三列(栏)中包括多个两个序列的比对:
参照表1的第一行的第三格:上面的序列为模板,下面的是变体。位置号80是指模板中的氨基酸残基G。氨基酸A占据了变体中的相应位置。因此,该取代表示为G80A。
现在参照表1的第二行的第三格:上面的序列还是模板而下面是变体。位置号80仍指模板中的氨基酸残基G。变体有两个插入,即TY,其在模板的G80后V81前。而T和Y当然会有它们自己在变体氨基酸序列中“实际”的位置号,就目前的情况而言我们始终参照模板位置号,并因此将T和Y称为分别在位置号80a和80b。
最后,参照表1的最后一行第三格:位置号275是指模板的最后一个氨基酸。C-末端的延伸ST分别称为在位置号275a和275b,同样,尽管它们当然也具有它们自己“实际”的在变体氨基酸序列中的位置号。
修饰的性质,参照或亲本肌醇六磷酸酶
在具体实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶具有改变的或修饰的,优选是改进的性质。术语“改变的”、“修饰的”和“改进的”意指与另一肌醇六磷酸酶比较。这些其它的参照、亲本或比较性肌醇六磷酸酶的实例是:SEQID NO:2,和/或其它与SEQ ID NO:2具有多于76%,优选多于80,85,90,95,或98%的序列同一性的肌醇六磷酸酶。
得到修饰,优选改进的性质的非限定性实例如下:热稳定性,蒸汽稳定性,制粒稳定性,pH概貌,比活性,在动物饲料中的性能,蛋白酶敏感性,和/或糖基化模式。本发明的肌醇六磷酸酶也可具有改变的,优选改进的温度概貌,和/或其可以并入潜在蛋白酶切割位点的改变以降低蛋白酶敏感性。尤其是热性能,包括加热稳定性,温度稳定性,热稳定性,蒸汽稳定性,和/或制粒稳定性被认为是重要的特征或性质。
热性能
温度稳定性
温度稳定性可以如实施例3中所述通过测定在70℃-80℃的温度温育30分钟之后的残余活性来测定。
热稳定性
热稳定性可以如实施例4中所述测定,即使用DSC测量法以测定纯化的肌醇六磷酸酶蛋白的变性温度Td。Td指示蛋白质的热稳定性:Td越高,热稳定性越高。因此,在一个优选的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶具有高于参照肌醇六磷酸酶的Td的Td,其中Td是对纯化的肌醇六磷酸酶样品测定的(优选通过SDS-PAGE测定具有至少90%或95%的纯度)。
加热稳定性
加热稳定性可以如实施例5所述通过测定变体肌醇六磷酸酶的温度/活性曲线(profile)来测定。
蒸汽稳定性
蒸汽稳定性可以如实施例7中所述通过测定在85℃或90℃短时间蒸汽处理之后肌醇六磷酸酶分子的残余活性来测定。
制粒稳定性
制粒稳定性可以如实施例9中所述通过使用与饲料预混的酶颗粒来测定。将这种预混物与饲料混合。从混合器中将饲料用蒸汽调节至95℃。调节之后,将饲料压成团粒(pellet)并测定残余活性。
在一个优选的实施方案中,热性质如加热稳定性,温度稳定性,热稳定性,蒸汽稳定性,和/或制粒稳定性,如由本发明的肌醇六磷酸酶的残余活性,Td或其它参数所提供的,高于SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的相应值,如残余活性或Td,更优选是其至少101%,或使其至少102%,103%,104%,105%,106%,107%,108%,109%,或至少110%。甚至更优选地,本发明的肌醇六磷酸酶的所述参数的值,如残余活性或Td,是SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的值的至少120%,130%,140%,150%,160%,170%,180%,或至少190%。
在还更具体的实施方案中,本发明的热稳定性肌醇六磷酸酶具有至少50℃的熔化温度Tm(或变性温度Td),如实施例中所述使用示差扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry;DSC)所测定的(即在20mM乙酸钠中,pH4.0)。在还更具体的实施方案中,Tm为至少51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,62.5,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或至少100℃。DSC测量也可以如实施例中所述的进行。
使用PCT/EP2008/053561中公开的结构来鉴定选择用于修饰的位置。出于相同的目的,还将所述结构与其它已知的HAP肌醇六磷酸酶结构相比。
使用分子动力学模拟分析高温下的移动性(mobility),鉴定了以下位置用于进行修饰以提供改进的热性质:4,5,6,7,8,9,26,27,28,29,30,32,33,37,38,39,40,41,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,91,108,109,110,111,117,118,119,120,121,122,131,132,133,134,138,139,140,144,145,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,163,175,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,193,194,196,198,200,201,202,203,204,205,206,207,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,319,320,322,324,343,344,345,346,347,364,365,366,367,369,370,371,372,373,375,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,396,397,400,403,404,408,409,412,和413。
具体地提出在这些位置中的一些上的修饰选自下述:8L,C,M,Y,9K,P,S,26R,Q,H,27A,28A,29P,R,K,A,30P,L,32Q,I,L,33C,N,37D,R,K,38A,41T,Q,69E,L,70E,72A,74S,75A,76R,V,N,77K,G,W,Q,78G,R,K,Q,S,T,79L,81E,82S,83G,109D,G,111R,K,S,117A,Q,118A,N,E,P,T,119D,K,E,120G,L,I,M,121A,S,T,G,K,122A,S,T,K,131R,Q,132T,V,134V,138N,V,139C,R,140P,144R,148R,150C,151D,152A,G,T,I,160G,163P,K,175N,S 178C,E 179C,L,W,181L,185R,K,186S,T,187E,190N,193R,198E,201C,G,V,202A,K,203Y,206G,T,A,207N,L,Q,R,234L,R,C,V,E,235P,236C,239R,K,242S,243P,244P,285D,286T,287P,288P,289W,293R,K,N,294L,319L,320N,343C,344K,346S,T,347R,365K,366T,369S,D,370C,382S,T,383N,396D,E,K 403N,和411S。
基于与其它已知肌醇六磷酸酶的比较,鉴定出以下位置能够提供改进的热性质,如热稳定性:12,16,48,49,54,55,77,93,100,103,128,130,136,137,173,176,195,209,211,215,219,221,227,228,248,251,258,260,261,310,313,314,316,318,335,354,356,360,362,363,374,376,378,和411。
根据所述比较,具体指出取代应该选自下述:12S,16V,48W,49L,54G,55E,77K,93E,100W,103A,128N,130L,136Q,137L,173N,176Q,195L,209S,211T,215S,219M,221T,227Q,228Q,248T,251S,258Y,260L,261Q,310L,313L,314G,316A,318E,335E,354L,356F,360Q,362M,363R,374P,376E,378K,和411S。
关于产生自SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的变体,所述修饰应该选自下述:K12S,L16V,Y48W,I49L,E54G,H55E,D77K,Q93E,L103A,H128N,V130L,S136Q,M137L,D173N,K176Q,M195L,A209S,E211T,G215S,T219M,A221T,E227Q,H228Q,S248T,K251S,D258Y,M260L,S261Q,I310L,I313L,S314G,M316A,G318E,A335E,M354L,Y356F,A360Q,L362M,H363R,A374P,S376E,R378K,和/或Q411S。
在一个具体的实施方案中,凭借在分子中建立了二硫键桥,认为与SEQID NO:2的氨基酸残基2-413具有至少76%同一性的肌醇六磷酸酶的下述变体具有改进的热稳定性:8C/343C,139C/201C,179C/33C,178C/33C,172C/35C,177C/36C,176C/36C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,331C/326C,358C/325C,228C/363C,和368C/374C。
类似地,还认为通过用脯氨酸残基取代所选位置上的现有残基而具有改进的热稳定性。认为下述肌醇六磷酸酶变体是这样的:29P,30P,93P,95P,140P,163P,235P,243P,244P,284P,287P,288P,316P,和360P。具体对于SEQ ID NO:2中的修饰,以下修饰应会改进热稳定性:Q29P,T30P,Q93P,K95P,S140P,A163P,V235P,E243P,Q244P,S284P,T287P,S288P,M316P,和A360P。
同样,对荷电残基的优化能够改进热性质,如热稳定性。所述优化涉及肌醇六磷酸酶分子表面上的电荷-电荷相互作用。
以下列出三组取代以供修饰与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-413具有至少76%同一性的亲本或参照肌醇六磷酸酶,并指明了残基。电荷可以倒转的残基,变成负电的残基,和变成正电的残基是:
电荷倒转
D111R,K,K251D,E和D293R,K。
变成负电
Q69E,Q70E,T81E,Q93E,N119D,Q230E,Q245E,P348D,E,L395E,和S396D,E。
变成正电
Q9R,Q29R,K,H37R,K,L59R,K,N78R,K,H115R,K,I185R,K,N239R和H363R,K。
温度概貌/温度稳定性
本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比是否具有修饰的温度概貌可以如实施例5中所述来测定。因此,在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有修饰的温度概貌,其中所述温度概貌按照在20-90℃的温度范围内(以10℃为间隔)于pH 5.5作为温度的函数的对肌醇六磷酸钠的肌醇六磷酸酶活性来测定的。优选的缓冲液是0.25M乙酸钠缓冲液pH 5.5。在各温度的活性优选表示为相对最优温度的值标准化的相对活性(以%表示)。最优温度是在测试的温度内(即以5-10℃为间隔的温度)活性最高的温度。
pH概貌
本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比是否具有改变的pH概貌可以如实施例中所述来测定。因此,在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有改变的pH概貌,其中所述pH概貌是按照在37℃在2.0-7.5的pH范围(以0.5个pH单位为间隔)中作为pH的函数的对肌醇六磷酸钠的肌醇六磷酸酶活性来测定的。优选的缓冲液是50mM甘氨酸,50mM乙酸和50mM Bis-Tris。在各个pH的活性优选表示为相对于在最优pH的值标准化的相对活性(以%表示)。
改变的pH概貌的实例是其中pH曲线(相对活性作为pH的函数)朝更高或更低的pH迁移的情况。优选的取代提供如与SEQ ID NO:2的参照肌醇六磷酸酶相比朝更高的pH迁移0.5个pH单位。然而,出于特定的目的,可能优选提供如与SEQ ID NO:2的参照肌醇六磷酸酶相比朝更低的pH迁移0.5个pH单位。
改变的pH概貌的另一实例是最优pH向上或向下变化的情况。
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶如与参照肌醇六磷酸酶相比具有改变的pH概貌。更具体而言,pH概貌在3.5-5.5的范围内得到修饰。还更具体而言,在pH 4.0,4.5,5.0,和/或5.5的活性是在最优pH下活性的至少50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,或至少95%的水平。
比活性
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶相对于参照肌醇六磷酸酶具有改进的比活性。更具体而言,本发明的肌醇六磷酸酶的比活性相对于通过相同方法测定的参照肌醇六磷酸酶的比活性至少为105%。在还更具体的实施方案中,相对比活性至少为110,115,120,125,130,140,145,150,160,170,180,190,200,220,240,260,280,300,350或甚至400%,仍是相对于通过相同方法测定的参照肌醇六磷酸酶的比活性。
或者,术语高比活性是指至少200FYT/mg酶蛋白(EP)的比活性。在一个具体的实施方案中,所述比活性至少为300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300,2400,2500,2600,2700,2800,2900或3000FYT/mg EP。
比活性是对高度纯化的样品(SDS聚丙烯酰胺凝胶应显示只存在一个成分)测定的。酶蛋白浓度可以通过氨基酸分析测定,而肌醇六磷酸酶活性以FYT为单位,如实施例1中所述测定。比活性是所讨论的特定肌醇六磷酸酶变体的一个特征,并且将其作为以每毫克肌醇六磷酸酶变体酶蛋白的FYT单位测得的肌醇六磷酸酶活性来计算。更多细节参见实施例。
在一个具体的实施方案中,预期SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的下述变体具有修饰的比活性,其中,按照优选的顺序,用选自例如HQEKMGTMDPT,HQQDIKQVDSL,HQPEIGKMDPV,TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL,TQTDTSSPDPL,NQADLKKTDPL的环替代面向活性位点的残基115和127之间的环(HQQNTQQADPL)。
在动物饲料中的性能
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶与参照肌醇六磷酸酶相比具有改进的在动物饲料中的性能。在动物饲料中的性能可以通过实施例中指明的体外模型来测定。因此,在一个优选的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶具有改进的在动物饲料中的性能,其中所述性能是在体外模型中通过如下测定的:制备由30%大豆粉和70%玉米粉组成饲料样品,其中加入了CaCl2至5g钙每kg饲料的浓度;在40℃和pH 3.0将它们预温育30分钟,其后加入胃蛋白酶(3000U/g饲料)和肌醇六磷酸酶;将样品在40℃和pH 3.0温育60分钟,其后在pH 4.0温育30分钟;终止反应;通过加入HCl至0.5M的终浓度并在40℃温育2小时来提取肌醇六磷酸和肌醇磷酸盐,其后是一个冻-融循环和1小时的40℃温育;通过高效离子层析分离肌醇六磷酸和肌醇磷酸盐;测定残余肌醇六磷酸盐的磷的量(IP6-P);计算经肌醇六磷酸酶处理的和未经肌醇六磷酸酶处理的空白样品之间残余IP6-P的差异(此差异为降解的IP6-P);并相对于参照肌醇六磷酸酶所降解的IP6-P来表示本发明的肌醇六磷酸酶所降解的IP6-P。
当然,本发明的肌醇六磷酸酶和参照肌醇六磷酸酶以相同的量定量添加,优选基于肌醇六磷酸酶活性单位(FYT)。优选剂量是125FYT/kg饲料。另一优选剂量是250FYT/kg饲料。所述肌醇六磷酸酶可以以纯化的肌醇六磷酸酶的形式,或以发酵上清液的形式定量添加。纯化的肌醇六磷酸酶优选具有至少95%的纯度,如通过SDS-PAGE所测定的。
在一个优选的实施方案中,纯化的本发明肌醇六磷酸酶的降解IP6-P值相对于参照肌醇六磷酸酶的降解IP6-P值是至少101%,或至少102%,103%,104%,105%,110%,115%,或至少120%。在还更优选的实施方案中,纯化的本发明的肌醇六磷酸酶的降解IP6-P值相对于参照肌醇六磷酸酶的降解IP6-P值是至少125%,130%,140%,150%,160%,170%,180%,190%,或至少200%。优选地,本发明的肌醇六磷酸酶的降解IP6-P值相对于SEQ IDNO:2肌醇六磷酸酶的降解IP6-P值是至少105%,110%,113%,115%,120%,125%,或至少130%。
本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能也可以作为占参照肌醇六磷酸酶所释放的磷的百分比来计算。
在一个还更具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶的相对性能也可以作为本发明的肌醇六磷酸酶释放的磷相对于参照肌醇六磷酸酶释放的磷的量的百分比来计算。
在还更具体的实施方案中,本发明肌醇六磷酸酶的相对性能是至少105%,优选至少110,120,130,140,150,160,170,180,190,或至少200%。
糖化的减少
非酶糖化是一种自发的翻译后过程,其中还原糖共价结合至蛋白质中主要位于赖氨酸(K)残基处的游离氨基。为了降低糖化导致的肌醇六磷酸酶活性的减少,通过取代特定氨基酸残基(如Lys)来改进活性。
因此,提出在SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶中进行下述修饰中的一个或多个:K12R,Q,K26R,Q,K45P,K76R,Q,K97R,Q,K131R,Q,K139R,Q,K148R,Q,K176R,Q,K187E,K207L,K234R,Q,K251R,Q,K268R,Q,K299R,Q,K347R,Q,S261A,T308A,T25A,T28A,T30L,T219L,T120L,N202A,N206A,N270R,Q,N312A,N119D,Q256A,Q29A,Q121A,Q122A,Q117A,Q118A,Y48W,和Y179L。就这种效力上的改进而言,具体优选的修饰是修饰K26Q和K26R。
降低的蛋白酶敏感性
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶具有降低的蛋白酶敏感性。更具体而言,其具有降低的针对胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白酶的敏感性,意味着降低的会被这些蛋白酶切割的趋势。
在此方面要修饰的位置在下表2中指出。
表2用于修饰蛋白酶敏感性的位置
胃蛋白酶 | 胃蛋白酶 | 胰蛋白酶 |
F8 | W42 | R22 |
L46 | Y48 | K26 |
L73 | L74 | K45 |
L112 | F174 | K76 |
L126 | W237 | K131 |
L157 | L323 | R160 |
L188 | L379 | K176 |
W321 | K187 | |
L368 | K234 | |
L370 | ||
L395 |
为了降低针对胃蛋白酶的敏感性,应将氨基酸残基修饰成不同于F,L,W或Y的氨基酸。在胰蛋白酶的情况下,应修饰成不同于R或K的氨基酸残基。
糖基化模式
糖基化是一种只有在真核生物如真菌和转基因植物中表达蛋白质时才观察到的现象,在原核生物如细菌中则没有。存在多种类型的糖基化,但在本文中,最相关的是N-糖基化,即天冬酰胺相关的糖基化,其中糖附接于蛋白质,起始于N-乙酰葡糖胺分子附接于天冬酰胺。已经发现N-糖基化仅对序列中其为下述三肽的一部分的天冬酰胺发生:N-X-T或N-X-S,其中X指任何氨基酸。
已经发现通过改变潜在的糖基化位点可以改进在真菌中表达的肌醇六磷酸酶的热稳定性。
因此本发明还涉及具有修饰的糖基化模式,优选修饰的N-糖基化位点的肌醇六磷酸酶变体。当在真菌中表达时,预期所述修饰的糖基化对肌醇六磷酸酶变体赋予改进的热稳定性。
肌醇六磷酸酶的实例是细菌肌醇六磷酸酶,例如革兰氏阴性肌醇六磷酸酶,如大肠杆菌,柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶及其变体,包括本发明的肌醇六磷酸酶。真菌表达宿主的实例是毕赤杆菌属(Pichia),酵母属(Saccharomyces),和曲霉属(Aspergillus)菌种。
在具体的实施方案中,预期下述本发明的肌醇六磷酸酶的修饰的糖基化模式:
糖基化位点的去除。
残基号 | 残基类型 | 变为 |
285 | Asn | Asp |
新的糖基化位点:NXX
残基号 | 残基类型 | 变为 |
121 | Gln | Ser,Thr |
186 | Gly | Ser,Thr |
249 | Leu | Ser,Thr |
331 | Pro | Ser,Thr |
346 | Gly | Ser,Thr |
355 | Val | Ser,Thr |
382 | Pro | Ser,Thr |
创造XXT型的新糖基化位点
残基号 | 残基类型 | 变为 |
33 | Asp | Asn |
48 | Tyr | Asn |
93 | Gln | Asn |
96 | Arg | Asn |
118 | Gln | Asn |
320 | Thr | Asn |
创造XXS型的新糖基化位点
残基号 | 残基类型 | 变为 |
138 | Asp | Asn |
162 | Gln | Asn |
175 | Pro | Asn |
190 | Asp | Asn |
246 | Trp | Asn |
293 | Asp | Asn |
383 | Gly | Asn |
394 | Pro | Asn |
401 | Leu | Asn |
403 | Ser | Asn |
蒸汽稳定性
热稳定性是一个重要参数,但是与之相关的蒸汽稳定性也很重要。在这方面参考下文的实施例8。
低变应原性变体
在一个具体的实施方案中,本发明的肌醇六磷酸酶(也)是低变应原性变体,将其设计为当曝露于动物包括人时引起的免疫应答降低。术语免疫应答应理解为由曝露于所述肌醇六磷酸酶变体的动物的免疫系统产生的任何反应。免疫应答的一种类型是变态反应,其导致曝露的动物中IgE水平升高。低免疫原性变体可以使用本领域已知技术制备。例如,所述肌醇六磷酸酶变体可以与聚合物部分缀合,所述聚合物部分屏蔽所述肌醇六磷酸酶参与免疫应答的部分或表位。与聚合物的缀合可涉及在体外将聚合物化学偶联至所述肌醇六磷酸酶变体,例如如WO 96/17929,WO 98/30682,WO 98/35026,和/或WO 99/00489中所述。除此之外或可供选择地,缀合可以涉及在体内将聚合物偶联至肌醇六磷酸酶变体。这种缀合可以通过对编码所述肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列进行遗传工程改造,在所述肌醇六磷酸酶变体中插入编码另外的糖基化位点的共有序列和在能够糖基化所述肌醇六磷酸酶变体的宿主中表达所述肌醇六磷酸酶变体来实现,参见例如WO 00/26354。另一提供低变应原性变体的方法是对编码肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列进行遗传工程改造从而引起所述肌醇六磷酸酶变体的自身寡聚化,致使该肌醇六磷酸酶变体单体可以屏蔽其它肌醇六磷酸酶变体单体的表位并由此降低所述寡聚物的抗原性。这种产物和它们的制备记载在例如WO 96/16177中。免疫应答中涉及的表位可以通过多种方法来鉴定,如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示方法,或EP 561907中描述的随机方法。一旦鉴定了表位,可以通过已知的基因操作技术如定点诱变(参见例如WO 00/26230,WO 00/26354和/或WO 00/22103)改变其氨基酸序列以产生所述肌醇六磷酸酶变体经修饰的免疫性质,和/或可以足够靠近表位地进行聚合物的缀合以使聚合物屏蔽所述表位。
核酸序列和构建体
本发明还涉及包含编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的核酸序列。
术语“分离的核酸序列”指基本上不含其它核酸序列的核酸序列,例如,如通过琼脂糖电泳测定为至少约20%纯的,优选至少约40%纯的,更优选至少约60%纯的,甚至更优选至少约80%纯的,并且最优选至少约90%纯的。例如,分离的核酸序列能够通过遗传工程改造中使用的标准克隆方法来获得,以将所述核酸序列自其天然位置重新定位至不同的部位,所述核酸序列会在该部位进行复制。克隆方法可以涉及切除和分离包含编码所述多肽的核酸序列的期望的核酸片段,将所述片段插入载体分子,和将所述重组载体并入宿主细胞,在所述细胞中会复制所述核酸序列的多个拷贝或克隆。所述核酸序列可以是基因组的,cDNA,RNA,半合成,合成来源的,或其任意组合。
本发明的核酸序列可以通过将至少一个突变引入模板肌醇六磷酸酶编码序列或其亚序列来制备,其中所述突变体核酸序列编码变体肌醇六磷酸酶。将突变引入核酸序列以用一个核苷酸交换另一核苷酸可以通过本领域已知的任何方法来实现,例如通过定点诱变,通过随机诱变,或通过掺杂,掺入或局部随机诱变(doped,spiked,or localized random mutagenesis)。
适当地,将随机诱变或者作为局部或区域特异性随机诱变在翻译成所显示的氨基酸序列的基因中的至少三个部分中进行,或者在整个基因内进行。当通过使用寡核苷酸进行所述诱变时,可以在寡核苷酸合成期间在要改变的位置处向所述寡核苷酸掺杂或掺入三个非亲本核苷酸。可以进行掺杂或掺入从而避开不理想氨基酸的密码子。可以将掺杂或掺入的寡核苷酸通过任何技术并入编码肌醇六磷酸酶的DNA,在认为合适的情况下使用例如PCR,LCR或任何DNA聚合酶和连接酶。
优选地,掺杂使用“恒定随机掺杂”进行,其中在各个位置上野生型和突变的百分比是预先限定的。另外,可以使掺杂致力于优选引入某些核苷酸,并由此优选引入一种或多种具体的氨基酸残基。例如,可以进行掺杂从而允许在各个位置引入90%野生型和10%突变。在选择掺杂配置时的其它考虑会基于遗传以及蛋白质结构的约束。
可以有利地使随机诱变局部化至所讨论的亲本肌醇六磷酸酶的一部分。例如,当已经鉴定出酶的某些区域对于酶的给定性质特别关键时,这可能是有利的。
用于提供本发明变体的可选方法包括例如WO 95/22625中或WO96/00343中所述的基因改组,和如EP 897985中所述的共有序列衍生方法(consensus derivation process)。
核酸构建体
核酸构建体包含与一个或多个调控序列可操作连接的本发明的核酸序列,所述调控序列指导所述编码序列在合适宿主细胞中在与所述调控序列相容的条件下表达。表达应理解为包括任何涉及多肽产生的步骤,包括但不限于转录,转录后修饰,翻译,翻译后修饰,和分泌。
本文使用的术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子,所述核酸分子分离自天然存在的基因,或者修饰所述核酸分子以使其以本来不会存在于自然界中(would not otherwise exist in nature)的方式含有核酸的片段。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的调控序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”(expression cassette)同义。
术语“调控序列”在本文定义为包括对于编码本发明的多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。对于编码多肽的核苷酸序列而言每个调控序列可以是天然的或外源的。这样的调控序列包括,但不限于,前导序列,多腺苷酸化序列,前肽序列,启动子,信号肽序列和转录终止子。最少的情况,调控序列包括启动子,和转录的和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置,从而使调控序列指导多肽编码序列的表达。
当用于本文时术语“编码序列”(CDS)表示直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开读框确定,通常以ATG起始密码子或其它的起始密码子如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA,cDNA或重组核苷酸序列。
表达载体
术语“表达”包括多肽产生中涉及的任何步骤,但不限于,转录,转录后修饰,翻译,翻译后修饰以及分泌。
术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子,其包含编码本发明的多肽的多核苷酸,并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的核酸序列可以使用表达载体表达,所述表达载体通常包括调控序列,其编码启动子,操纵子,核糖体结合位点,翻译起始信号,和任选地阻抑基因或各种活化基因。
携带编码本发明的肌醇六磷酸酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何载体,其可以方便地进行重组DNA方法,而载体的选择经常取决于其将引入的宿主细胞。载体可以是这样一种载体,当将其引入宿主细胞时,该载体整合进宿主细胞基因组并与整合了它的染色体一起复制。
肌醇六磷酸酶变体还可以与有动物饲料价值的至少一种其它的酶一起共表达,所述其它的酶例如肌醇六磷酸酶,磷酸酶,木聚糖酶,半乳聚糖酶,α-半乳糖苷酶,蛋白酶,磷脂酶,淀粉酶,和/或β-葡聚糖酶。酶可以从不同载体共表达,从一个载体共表达,或使用两种技术的组合。当使用不同载体时,载体可以有不同的选择标记,以及不同的复制起点。当仅使用一个载体时,各基因可以从一个或多个启动子表达。如果在一个启动子的调节下克隆(二或多顺反子的),基因克隆的顺序可能影响蛋白质的表达水平。还可以将肌醇六磷酸酶变体作为融合蛋白来表达,即已经将编码肌醇六磷酸酶变体的基因符合读框地(in frame)融合到编码另一蛋白质的基因中。该蛋白质可以是另一种酶或来自另一种酶的功能结构域。
宿主细胞
术语“宿主细胞”,如本文所用的,包括对于使用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体的转化,转染,转导等易感的任何细胞类型。
本发明还涉及有利地用于多肽的重组产生的重组宿主细胞,其包含本发明的多核苷酸。将包含本发明的多核苷酸的载体导入到宿主细胞,从而使该载体作为染色体整合体或作为如较早所述的自复制染色体外载体保持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何子代,其由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不完全相同。宿主细胞的选择很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物,例如原核细胞,或非单细胞微生物,例如真核细胞。
有用的单细胞微生物是细菌细胞,例如革兰氏阳性细菌,包括,但不限于,芽孢杆菌属(Bacillus)细胞,例如,嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus),解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),短芽孢杆菌(Bacillus brevis),环状芽孢杆菌(Bacillus circulans),克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii),凝结芽孢杆菌(Bacillus soagulans),灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus),迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus),地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus),枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis);或链霉菌属(Streptomyces)细胞,例如,浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus);或革兰氏阴性细菌,例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp)。在一个优选的方面,细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一优选的方面,芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillus)。
向细菌宿主细胞导入载体可以通过如下方法来实现:例如原生质体转化(参见,例如,Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics 168:111-115),使用感受态细胞(参见,例如,Young和Spizizin,1961,Journal of Bacteriology81:823-829,或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of MolecularBiology 56:209-221),电穿孔(参见,例如,Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751),或接合(conjugation)(参见,Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169:5771-5278)。
宿主细胞还可以是真核生物,例如哺乳动物,昆虫,植物或真菌细胞。
在一个优选的方面,宿主细胞是真菌细胞。这里用到的“真菌”包括以下门:子囊菌门(Ascomycota),担子菌门(Basidiomycota),壶菌门(Chytridiomycota),和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如在Hawksworth等,1995,同上,171页中所引用),和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,同上)。
在更优选的方面,真菌的宿主细胞是酵母细胞。“酵母”如本文所用包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales)),产担子酵母(basidiosporogenous yeast),和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomyetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变,就本发明而言,酵母应该如在酵母生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述定义。
在甚至更优选的方面中,酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida),汉逊酵母属(Hansenula),克鲁维酵母属(Kluyveromyces),毕赤酵母属(Pichia),酵母属(Saccharomyces),裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。
在最优选的方面中,酵母宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica),卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),糖化酵母(Saccharomyces diastaticus),道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii),克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri),诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一最优选的方面中,酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一最优选方面中,酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一更优选的方面,真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门中的所有丝状形式(如Hawksworth等,1995,同上所定义)。丝状真菌的特征通常在于由壳多糖,纤维素,葡聚糖,壳聚糖,甘露聚糖,以及其它复杂多糖所组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行并且碳分解代谢是专性需氧的。相反地,酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽来进行的并且碳分解代谢可以是发酵的。
在甚至更优选的方面中,丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium),曲霉属,短梗霉属(Aureobasidium),烟管菌属(Bjerkandera),拟蜡菌属(Ceriporiopsis),鬼伞属(Coprinus),革盖菌属(Coriolus),隐球菌属(Cryptococcus),网孢菌属(Filobasidium),镰孢属(Fusarium),腐质霉属(Humicola),梨孢属(Magnaporthe),毛霉属(Mucor),毁丝霉属(Myceliophthora),新考玛脂霉属(Neocallimastix),脉孢菌属(Neurospora),拟青霉属(Paecilomyces),青霉属(Penicillium),平革菌属(Phanerochaete),射脉菌属(Phlebia),瘤胃壶菌属(Piromyces),侧耳属(Pleurotus),裂褶菌属(Schizophyllum),踝节菌属(Talaromyces),嗜热子囊菌属(Thermoascus),梭孢壳属(Thielavia),弯颈霉属(Tolypocladium),栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
在最优选的方面中,丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉,烟曲霉(Aspergillus fumigatus),臭曲霉(Aspergillus foetidus),日本曲霉(Aspergillus japonicus),构巢曲霉(Aspergillus nidulans),黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选的方面中,丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides),禾谷镰孢(Fusarium cerealis),库威镰孢(Fusarium crookwellense),大刀镰孢(Fusarium culmorum),禾本科镰孢(Fusarium graminearum),禾赤镰孢(Fusarium graminum),异孢镰孢(Fusarium heterosporum),合欢木镰孢(Fusarium negundi),尖镰孢(Fusarium oxysporum),多枝镰孢(Fusarium reticulatum),粉红镰孢(Fusarium roseum),接骨木镰孢(Fusarium sambucinum),肤色镰孢(Fusarium sarcochroum),拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides),硫色镰孢(Fusarium sulphureum),圆镰孢(Fusarium torulosum),拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta),干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina),干拟蜡菌,Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens,Ceriporiopsis pannocinta,Ceriporiopsis rivulosa,Ceriporiopsis subrufa或虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora),灰盖鬼伞(Coprinus cinereus),毛革盖菌(Coriolus hirsutus),特异腐质霉(Humicola insolens),疏棉状腐质霉(Humicola lanuginose),米黑毛霉(Mucor miehei),嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila),粗糙脉孢菌(Neurospora crassa),产紫青霉(Penicillium purpurogenum),黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),辐射射脉菌(Phlebia radiata),刺芹侧耳(Pleurotus eryngii),土生梭孢霉(Thielavia terrestris),长绒毛栓菌(Trametes villosa),杂色栓菌(Trametes versicolor),哈茨木霉(Trichoderma harzianum),康宁木霉(Trichodermakoningii),长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株的细胞。
真菌细胞可以通过涉及原生质体形成,原生质体转化以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式来转化。转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 81:1470-1474中有描述。转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可使用Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,卷194,182-187页,Academic Press,Inc.,New York;Ito等,1983,Journal of Bacteriology 153:163;和Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920中所述的方法转化酵母。
制备方法
本发明还涉及用于制备本发明的肌醇六磷酸酶的方法,其包括(a)在有益于肌醇六磷酸酶产生的条件下培养宿主细胞;以及(b)回收肌醇六磷酸酶。
在本发明的产生方法中,应用本领域所熟知的方法在适合多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如,可以通过摇瓶培养,以及在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续的,分批,补料分批(fed-batch),或固态发酵),在合适的培养基中并在允许所述多肽表达和/或分离的条件下进行。使用本领域已知的方法,在合适的营养培养基中进行培养,所述培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基可从供应商处获得,或可以按照公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中,则可以从培养基直接回收多肽。如果多肽没有分泌,则可以从细胞裂解物中回收。
得到的多肽可以用本领域已知方法回收。例如,可以通过常规的方法包括,但不限于,离心,过滤,提取,喷雾干燥,蒸发或沉淀,从营养培养基中回收多肽。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法来纯化,包括但不限于,层析(例如,离子交换,亲合,疏水,层析聚焦,和大小排阻),电泳方法(例如,制备型等电聚焦),差示溶解度(例如,硫酸铵沉淀),SDS-PAGE或提取(参见,例如,Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,编,VCHPublishers,New York,1989)。
转基因植物
本发明还涉及转基因植物,植物部分或植物细胞,其已经使用编码具有本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列转化,从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可以从植物或植物部分中回收。可供选择地,包含重组多肽的植物或植物部分可以如这样使用,用以改进食物或饲料的质量,例如,改进营养价值,适口性和流变性质,或破坏抗营养(antinutritive)因子。
在一个具体的实施方案中,多肽靶向种子中的胚乳储藏泡(endosperm storage vacuole)。这可以通过将其合成为具有合适信号肽的前体来获得,参见Horvath等,于PNAS,2000年2月15日,97卷,4号,1914-1919页中。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或它们经工程改造的变体。单子叶植物的实例为草,例如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass),禾本科(Poa)),牧草(forage grass)例如羊茅属(Festuca),黑麦草属(Lolium),温带草,例如剪股颖属(Agrostis),以及谷类,例如,小麦,燕麦,黑麦,大麦,稻,高粱,黑小麦(triticale)(小麦(小麦属(Triticum))和黑麦(黑麦属(Secale))的稳定杂合体),以及玉蜀黍(maize)(玉米(corn))。双子叶植物的实例为烟草,豆类,例如向日葵(向日葵属(Helianthus)),棉花(棉属(Gossypium)),羽扇豆,马铃薯,糖甜菜(sugar beet),豌豆,菜豆(bean)以及大豆,和十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae)),例如花椰菜,油菜籽(rape seed),以及紧密关联的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。低肌醇六磷酸盐植物如例如美国专利号5,689,054和美国专利号6,111,168所述的为经工程改造的植物的实例。
植物部分的实例为茎,愈伤组织,叶,根,果实,种子和块茎,以及包含这些部分的独立组织,例如表皮,叶肉,薄壁组织,维管组织,分生组织。特定的植物细胞区室,例如叶绿体,质外体(apoplast),线粒体,液泡,过氧化物酶体,以及细胞质也被认为是植物部分。此外,任何植物细胞,不管组织来源如何,均认为是植物部分。同样,植物部分,如为促进本发明的应用而分离的特定组织和细胞也被认为是植物部分,例如胚,胚乳,糊粉和种皮(seed coats)。
在本发明范围内还包含这些植物,植物部分和植物细胞的子代。
可以按照本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简言之,如下构建转基因植物或植物细胞,通过将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体并入植物宿主基因组,并使得到的经修饰的植物或植物细胞增殖成为转基因植物或植物细胞。
方便地,表达构建体是核酸构建体,其包含编码本发明的多肽的核酸序列,所述核酸序列与在所选植物或植物部分中表达该核酸序列所需的合适的调节序列可操作地连接。此外,表达构建体可以包含选择标记用于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞以及对于将构建体导入所述植物所必需的DNA序列(后者依赖于所用的DNA导入方法)。
调控序列,例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择,基于例如期望何时,何处以及如何表达多肽来确定。例如,编码本发明的多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型,或可以是发育,阶段或组织特异性的,并且基因产物可以靶向特定细胞区室,组织或植物部分如种子或叶。调节序列是,例如,由Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所描述的。
对于组成型表达,可以使用下列启动子:35S-CaMV启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294),玉米泛素1(Christensen AH,Sharrock RA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genes:structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation),或稻肌动蛋白1启动子(Plant Mo.Biol.18,675-689.;Zhang W,McElroy D.和Wu R 1991,Analysis of rice Act15’region activity in transgenic rice plants.Plant Cell 3,1155-1165)。器官特异性的启动子可以是,例如,贮存库组织(storage sink tissue)例如种子,马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards& Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303),或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878),种子特异性的启动子例如来自稻的谷蛋白,醇溶谷蛋白,球蛋白或白蛋白的启动子(Wu等,1998,Plant and Cell Physiology 39:885-889),来自豆球蛋白B4和来自蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of Plant Physiology 152:708-711),来自种子油体蛋白(seed oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant and Cell Physiology 39:935-941),来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮存蛋白napA启动子,或本领域已知的其它任何种子特异性的启动子,例如,如WO 91/14772中所述。此外,启动子可以是叶特异启动子例如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,Plant Physiology 102:991-1000),小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Molecular Biology 26:85-93),或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and General Genetics 248:668-674),或损伤诱导型启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Molecular Biology22:573-588)。同样,启动子可以通过非生物(abiotic)处理例如温度,干旱或盐度上的修改来诱导,或可以通过外源施用的激活启动子的物质来诱导,所述物质例如乙醇,雌激素,植物激素如乙烯,脱落酸,赤霉酸和/或重金属。
启动子增强元件还可以用于在植物中获得多肽更高的表达。例如,启动子增强元件可以是内含子,其置于启动子和编码本发明的多肽的核苷酸序列之间。例如,上述Xu等,1993,见上文公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。
更进一步,可以相对于所讨论的植物种类优化密码子选择以改进表达(参见上面提到的Horvath等)。
选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可以从本领域那些可获得的选取。
按照本领域已知的常规技术将核酸构建体并入进植物基因组,这些技术包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化,病毒介导的转化,显微注射,粒子轰击,生物弹射转化以及电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535;Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。
目前,根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是用于生成转基因双子叶植物的优选方法(参见综述Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Molecular Biology 19:15-38),并且它还可以用于转化单子叶植物,尽管对于这些植物更通常使用其它转化方法。目前,生成转基因单子叶植物的优选方法,除了土壤杆菌方法外,是对胚愈伤组织或发育中的胚的粒子轰击(用转化用DNA涂覆的微观的(microscopic)金或钨颗粒)(Christou,1992,Plant Journal 2:275-281;Shimamoto,1994,Current Opinion Biotechnology 5:158-162;Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。可供选择的单子叶植物转化方法基于原生质体转化,如Omirulleh等,1993,Plant Molecular Biology21:415-428所述。
转化之后,按照本领域所熟知的方法选择其中并入了表达构建体的转化体并再生成为完整植株。通常将转化方法设计为在再生过程中或者在接下来的世代中可以选择性地去除选择基因,其通过使用例如用两个分离的T-DNA构建体的共转化或者通过特定重组酶对选择基因进行位点特异性切除。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法,其包括(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞,所述转基因植物或植物细胞包含编码本发明具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列;和(b)回收所述多肽。
转基因动物
本发明还涉及转基因的非人动物以及它们的产品或成分,其实例为体液例如乳和血,器官,肉和动物细胞。用于表达蛋白质的技术,例如在哺乳动物细胞中表达蛋白质的技术,是本领域已知的,参见例如手册Protein Expression:A Practical Approach(蛋白表达:实用方法),Higgins和Hames(编),Oxford University Press(牛津大学出版社)(1999),以及该系列涉及基因转录,RNA加工和翻译后加工的其它三个手册。通常来说,为了制备转基因动物,用编码具有本发明的肌醇六磷酸酶活性的多肽的核酸序列转化所选动物的所选细胞,从而表达并产生多肽。可以从动物回收多肽,例如从雌性动物的乳中,或可以将多肽表达为有益于动物本身,例如辅助动物消化。动物的实例在下面标题为动物饲料的部分中提到。
为了产生以从动物乳中回收多肽为目的的转基因动物,可以将编码多肽的基因插入到所讨论的动物的受精卵中,例如通过使用包含合适的乳蛋白启动子和编码所述多肽的基因的转基因表达载体。将转基因表达载体显微注射进受精卵,并优选永久整合入染色体。一旦卵开始生长和分裂,就将潜在的胚胎植入代孕母体(surrogate mother),并且鉴定出携带该转基因的动物。获得的动物随即可以通过常规饲养来繁殖。多肽可以从动物乳中纯化,参见例如Meade,H.M.等(1999):Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals,Gene expression systems:Using nature for the art of expression.J.M.Fernandez和J.P.Hoeffler(编),Academic Press。
在另一可选的方面,为了产生在其体细胞和/或生殖细胞的基因组中携带有包含异源转基因构建体的核酸序列的转基因非人动物,其中所述异源转基因构建体包含编码多肽的转基因,可以将该转基因与用于多肽的唾液腺特异性表达的第一调节序列可操作地连接,如WO 00/064247所公开的。
组合物和用途
在更进一步的方面中,本发明涉及包含本发明的多肽的组合物,以及使用这些组合物的方法。
多肽组合物可以按照本领域已知的方法来制备,并且可以以液体或干组合物的形式。例如,多肽组合物可以以颗粒或微颗粒形式存在。要包括在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法来稳定化。
本发明的肌醇六磷酸酶可以在任何工业环境中用于降解,例如,肌醇六磷酸盐,肌醇六磷酸和/或肌醇的一,二,三,四和/或五磷酸盐。公知这些化合物的磷酸部分螯合二价和三价的阳离子例如金属离子,包括但不限于(i.a.)营养必需离子钙,铁,锌和镁,以及痕量金属锰,铜和钼。此外,肌醇六磷酸还在某种程度上通过静电相互作用结合蛋白。
因此,本发明的多肽的优选用途是在动物饲料制备物中(包括人类食物)或用于这些制备物的添加剂中。
在一个具体的实施方案中,本发明的多肽可以用于改进动物饲料的营养价值。改进动物饲料(包括人的食物)的营养价值的非限定性实例是:改进饲料消化性;促进动物生长;改进饲料应用;改进蛋白质的生物利用度;提高可消化磷酸盐的水平;改进肌醇六磷酸盐的释放和/或降解;改进痕量矿物质的生物利用度;改进大量(macro)矿物质的生物利用度;消除或降低对添加补充性磷酸盐,痕量矿物质和/或大量矿物质的需要;和/或改进卵壳质量。饲料的营养价值因此增加,并且可以改进动物的生长速率和/或重量增加(weight gain)和/或饲料转化率(即摄入的饲料重量相对于重量增加)。
另外,本发明的多肽可以用于降低粪便中的肌醇六磷酸盐水平。
本发明的肌醇六磷酸酶变体也可用于产生发酵产物的方法,所述方法包括(a)在本发明的肌醇六磷酸酶存在下使用发酵微生物发酵含糖材料,和(b)从经发酵的含糖材料产生发酵产物或发酵副产物。
当用于此目的时,发酵产物优选是乙醇,啤酒,葡萄酒或干酒糟(DDG)。
动物,动物饲料以及动物饲料添加剂
术语动物包括所有动物,包括人。动物的实例是非反刍动物,和反刍动物。反刍动物包括,例如绵羊,山羊和牛(cattle),例如奶牛(cow)如肉牛(beef cattle)和奶牛(dairy cow)。在一个具体的实施方案中,动物是非反刍的动物。非反刍动物包括单胃的动物,例如猪(pig)或猪(swine)(包括但不限于,小猪(piglet),饲育猪(growing pig)和母猪(sow));家禽例如火鸡,鸭和鸡(包括但不限于雏鸡(broiler chick),蛋鸡(layers));鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon),鳟鱼(trout),罗非鱼(tilapia),鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp));和甲壳类(包括但不限于虾(shrimp)和对虾(prawn))。
术语饲料或饲料组合物是指适合于动物摄入或意欲由动物摄入的任何化合物,制备物,混合物或组合物。
在按照本发明的用途中,可以在饮食之前,之后或与饮食同时向动物喂食多肽。后者是优选的。
在一个具体的实施方案中,多肽,以其添加到饲料中的形式,或当其包括在饲料添加剂中时,是基本上(substantially)纯的。在具体的实施方案中它是明确确定的(well-defined)。术语“明确确定的”意味着肌醇六磷酸酶制备物至少是50%纯的,如由大小排阻层析所测定(参见WO 01/58275的实施例12)。在其它的具体实施方案中,如通过这种方法测定,肌醇六磷酸酶制备物是至少60,70,80,85,88,90,92,94,或至少95%纯的。
基本上纯的,和/或明确确定的多肽制备物是有利的。例如,正确地向饲料定量添加基本上不含干扰性或污染性的其它多肽的多肽容易得多。术语正确地定量添加具体是指获得恒定(consistent)和不变的(constant)结果的目的,以及基于期望的效果优化剂量的能力。
然而,对于在动物饲料中的使用,本发明的肌醇六磷酸酶多肽不需要那么纯;例如它可以包含其它多肽,在此情况下可以称其为肌醇六磷酸酶制备物。
肌醇六磷酸酶制备物可以(a)直接添加到饲料(或直接用于蛋白质的处理方法),或(b)可以用于一个或多个中间组分的产生,所述中间组分如随后添加到饲料中(或在处理过程中使用)的饲料添加剂或预混物(premix)。上述纯度的程度是指原始多肽制备物的纯度,无论按照是上面的(a)或(b)使用。
具有这种数量级的纯度的多肽制备物具体可以用重组产生方法来获得,而通过传统发酵方法产生所述多肽时,它们并不是很容易并且还具有高得多的批与批之间的差异(batch-to-batch variation)。
当然,这样的多肽制备物可以与其它多肽混合。
多肽可以以任何形式添加到饲料中,作为相对纯的多肽(be it as a relatively pure polypeptide),或与意欲添加到动物饲料中的其它组分混合,即以动物饲料添加剂的形式,例如所谓的动物饲料的预混物(pre-mixes)。
在进一步的方面中本发明涉及在动物饲料方面使用的组合物,例如动物饲料,和动物饲料添加剂,例如预混物。
除本发明的多肽之外,本发明的动物添加剂含有至少一种脂溶性维生素,和/或至少一种水溶性维生素,和/或至少一种痕量矿物质。饲料添加剂还可以包含至少一种大量矿物质(macro mineral)。
另外,可选的饲料添加剂成分是着色剂,例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素,虾青素和叶黄素;芳香化合物;稳定剂;抗微生物肽;多不饱和脂肪酸;活性氧生成物(reactive oxygen generating species);和/或选自下列之中的至少一种其它多肽:肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26);磷酸酶(EC 3.1.3.1;EC3.1.3.2;EC 3.1.3.39);木聚糖酶(EC 3.2.1.8);半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89);α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22);蛋白酶(EC 3.4.-.-);磷脂酶A1(EC 3.1.1.32);磷脂酶A2(EC 3.1.1.4);溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5);磷脂酶C(3.1.4.3);磷脂酶D(EC3.1.4.4);淀粉酶例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1);和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在具体的实施方案中这些其它的多肽是明确确定的(如上面对肌醇六磷酸酶制备物所定义的)。
本发明的肌醇六磷酸酶还可以与其它肌醇六磷酸酶组合,例如子囊菌类(ascomycete)肌醇六磷酸酶如曲霉属肌醇六磷酸酶,例如源自无花果曲霉(Aspergillus ficuum),黑曲霉或泡盛曲霉;或担子菌类(basidiomycete)肌醇六磷酸酶,例如源自Peniophora lycii,平田头菇(Agrocybe pediades),绒毛栓菌(Trametes pubescens)或卷边桩菇(Paxillus involutus);或它们具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物,片段或变体。
因而,在本发明的在动物饲料中的用途的优选实施方案中,以及在本发明的动物饲料添加剂和动物饲料的优选实施方案中,将本发明的肌醇六磷酸酶与这样的肌醇六磷酸酶组合。
抗微生物肽(AMP’s)的实例是CAP18,Leucocin A,Tritrpticin,Protegrin-1,Thanatin,防卫素(Defensin),乳铁蛋白(Lactoferrin),Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer,2000),Plectasins和他汀类药物(Statins),包括在WO 03/044049和WO 03/048148中所公开的化合物和多肽,以及保持抗微生物活性的上述各项的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP’s)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽,以及保持抗真菌活性的它们的变体和片段,如在WO 94/01459和WO02/090384中所公开的。
多不饱和脂肪酸的实例是C18,C20和C22多不饱和脂肪酸,如花生四烯酸,二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid),十二碳五烯酸和γ-亚油酸。
活性氧生成物的实例是化学品例如过硼酸盐,过硫酸盐或过碳酸盐;以及多肽例如氧化酶,加氧酶或合成酶。
通常脂溶性和水溶性维生素,以及痕量矿物质形成意欲向饲料添加的所谓的预混物的部分,而大量矿物质则通常单独添加到饲料中。这些组合物类型中的任一种当富含本发明的多肽时便成为本发明的动物饲料添加剂。
在一个具体的实施方案中,意欲将本发明的动物饲料添加剂以0.01至10.0%的水平包含于(或规定必须包含于)动物饮食或饲料中;更具体地以0.05至5.0%的水平;或0.2至1.0%的水平(%意指每100克饲料中添加剂的克数)。在预混物中尤其是这样。
下列是这些组分的实例的非排他性列表:
脂溶性维生素的实例是维生素A,维生素D3,维生素E和维生素K,例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12,生物素和胆碱,维生素B1,维生素B2,维生素B6,烟酸,叶酸和泛酸盐(panthothenate),例如D-泛酸钙(Ca-D-panthothenate)。
痕量矿物质的实例是锰,锌,铁,铜,碘,硒和钴。
大量矿物质的实例是钙,磷和钠。
对这些组分的营养要求(用家禽和小猪/猪为例)在WO 01/58275的表A中列出。营养要求意味着这些组分在饮食中应该以指定的浓度提供。
可选地,本发明的动物饲料添加剂包含至少一种在WO 01/58275的表A中指定的个体组分。至少一种意味着,任何一种,一种或多种,一种,或两种,或三种,或四种和以此类推多至全部的十三种,或多至全部的十五种个体组分。更具体地,这至少一种的个体组分以这样的量包括在本发明的添加剂中,该量提供在表A的第四列,或第五列,或第六列中说明的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)。
本发明还涉及动物饲料的组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食的特征可以如WO 01/58275表B第2-3列中所述。鱼的饮食的特征可以如该表B的第4列中所述。此外这样的鱼类饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275对应于US 09/779334,其通过提述并入。
本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量,并且此外还包含至少一种本文要求保护的多肽。
此外,或在可供选择的情况下(对于上述的粗蛋白含量),本发明的动物饲料组合物具有含量为10-30MJ/kg的可代谢能量;和/或0.1-200g/kg的钙含量;和/或0.1-200g/kg的可用磷(available phosphorus)含量;和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量;和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量;和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在一个具体的实施方案中,可代谢能量,粗蛋白,钙,磷,甲硫氨酸,甲硫氨酸加半胱氨酸,和/或赖氨酸的含量是在WO 01/58275的表B中的范围2,3,4或5(R.2-5)中的任一之内。
粗蛋白是以氮(N)乘以因子6.25来计算的,即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25。氮含量由凯氏定氮法测定(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis第14版,Association of Official Analytical Chemists,Washington DC)。
可代谢能量的计算可以基于NRC出版物猪的营养需求,第九次修订版1988,猪营养学小组委员会,动物营养学委员会,农业部,国家科学委员会。国家学术出版社,华盛顿特区,第2-6页(Nutrient requirements in swine,ninth revised edition 1988,subcommittee on swine nutrition,committee on animal nutrition,board of agriculture,national research council.National Academy Press,Washington,D.C.,pp.2-6),以及欧洲家禽饲料能量值表,Spelderholt家禽研究与拓展中心,7361DA Beekbergen,荷兰。Grafisch bedriif Ponsen & looijen bv,Wageningen.ISBN 90-71463-12-5(European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs,Spelderholt centre for poultry research and extension,7361DA Beekbergen,The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv,Wageningen.ISBN 90-71463-12-5)。
在完全动物饮食中的钙,可用磷和氨基酸的饮食含量的计算是基于饲料表,例如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7。
在一个具体的实施方案中,本发明的动物饲料组合物包含至少一种蛋白质。所述蛋白质可以是动物蛋白,例如肉和骨粉,和/或鱼粉;或其可以是植物蛋白。本文所用的术语植物蛋白是指任何化合物,组合物,制备物或混合物,其包括至少一种从植物衍生或起源的蛋白,包括经修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在一个具体的实施方案中,植物蛋白的蛋白含量是至少10,20,30,40,50或60%(w/w)。
植物蛋白可以源自植物蛋白来源,例如豆类和谷类,例如来自豆科(Fabaceae)(豆科(Leguminosae)),十字花科(Cruciferaceae),藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料,例如大豆粉,羽扇豆粉(lupin meal)和油菜籽粉(rapeseed meal)。
在一个具体的实施方案中,植物蛋白来源是来自豆科的一种或多种植物的材料,例如大豆,羽扇豆,豌豆或菜豆。
在另一具体的实施方案中,植物蛋白来源是来自藜科的一种或多种植物的材料,例如甜菜,糖甜菜,菠菜或昆诺阿藜(quinoa)。
植物蛋白来源的其它实例是油菜籽,向日葵子(sunflower seed),棉籽(cotton seed)和甘蓝(cabbage)。
大豆是优选的植物蛋白来源。
植物蛋白来源的其它实例是谷类如大麦,小麦,黑麦,燕麦,玉蜀黍(玉米),稻,黑小麦和高粱。
在更进一步的具体实施方案中,本发明的动物饲料组合物包含0-80%玉蜀黍;和/或0-80%高粱;和/或0-70%小麦;和/或0-70%大麦;和/或0-30%燕麦;和/或0-40%大豆粉;和/或0-25%鱼粉;和/或0-25%肉和骨粉;和/或0-20%乳清。
例如,可以将动物饮食生产为糊状饲料(mash feed)(非颗粒的(non pelleted))或颗粒饲料(pelleted feed)或挤出的饲料(extruded feed)。通常地,将磨碎的饲料物质混合并根据对所讨论的物种的规格(specification)添加足量的必需维生素和矿物质。多肽可以作为固体或液体多肽配制物添加。例如,固体多肽配制物通常在混合步骤之前或期间添加;而液体多肽配制物通常在制粒步骤之后添加。多肽也可以掺合在饲料添加剂或预混物中。
饮食中多肽的终浓度在每千克饮食0.01-200mg多肽蛋白范围内,例如每千克动物饮食5-30mg多肽蛋白的范围。
当然,本发明的肌醇六磷酸酶应当以有效量,即以足够改进溶解和/或改进饲料营养价值的量应用。目前涵盖以一个或多个下列量(剂量范围)来施用多肽:0.01-200;0.01-100;0.5-100;1-50;5-100;10-100;0.05-50或0.10-10——所有的这些范围均为每千克饲料中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数(ppm)。
对于确定每千克饲料的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数,将肌醇六磷酸酶从饲料组合物中纯化出来,而纯化的肌醇六磷酸酶的比活性用相关测定法来测定。象这样的饲料组合物的肌醇六磷酸酶活性也用相同的测定法来测定,并基于这两种测定来计算每千克饲料中肌醇六磷酸酶蛋白的毫克剂量。
相同的理论适用于测定饲料添加剂中的肌醇六磷酸酶多肽蛋白的毫克数。当然,如果可以获得用于制备饲料添加剂或饲料的肌醇六磷酸酶的样品,则从该样品中测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化肌醇六磷酸酶)。
在此描述并要求保护的发明不限于本申请公开的具体实施方案的范围,因为这些实施方案旨在作为对本发明几个方面的说明。意将任何等效的实施方案包括在本发明的范围内。事实上,基于前文所述,对本发明的各种除此处所示和描述之外的修改对于本领域技术人员会是显而易见的。在发生冲突的情况下,以包括定义在内的本文内容为准。
此处引用了多篇参考文献,将它们的公开内容通过提述整体并入。
实施例
使用的化学品是至少试剂级的商业产品。
实施例1:变体的制备,和活性的测定
肌醇六磷酸酶变体的制备
在米曲霉中表达肌醇六磷酸酶变体
使用实施例中包含哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶变体基因的构建体来构建供曲霉属用的表达载体。曲霉属表达载体由基于与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子的表达盒组成。质粒上还存在来自构巢曲霉的曲霉属选择标记amdS,使其能够在乙酰胺作为唯一氮源时生长。将用于肌醇六磷酸酶变体的表达质粒如Lassen等(2001),Applied and EnvironmentalMicorbiology,67,4701-4707中所述转化入曲霉属中。对于每个构建体,将10-20个菌株分离,纯化并在摇瓶中培养。
蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶变体的纯化
将含肌醇六磷酸酶变体的发酵上清液通过0.22μm截留值(cut-off)的FastPES Bottle顶部滤器过滤。将所得溶液用水稀释以使体积加倍并用乙酸将pH调节至4.5。在某些情况下所述溶液变得有些浑浊(cloudy),而这通过经由截留值0.22μm的Fast PES Bottle顶部滤器过滤来去除。
在预处理之后,通过在S Sepharose上的层析来纯化所述肌醇六磷酸酶变体,在XK26柱中约30ml,使用50mM乙酸钠pH 4.5作为缓冲液A,并使用50mM乙酸钠+1MNaCl pH 4.5作为缓冲液B。使用磷酸酶测定法(见下文)分析来自柱的级分的活性,并汇集有活性的级分。
最后,将含有纯化的肌醇六磷酸酶变体的溶液使用带有30kDa截留膜的Amicon ultra-15过滤设备浓缩。
分子量,如通过SDS-PAGE估计的,为大约45kDa且纯度>95%。
磷酸酶活性的测定
将75微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液分配到微量滴定板(例如NUNC269620)的孔中,并加入75微升底物(关于底物的制备,将2片5mg对硝基苯基磷酸片剂(Sigma,Cat.No.N-9389)溶解在10ml 0.1M乙酸钠缓冲液,pH5.5中)。将平板密封并温育15分钟,在37℃以750rpm摇动。在温育期之后添加75微升终止试剂(终止试剂是0.1M四硼酸二钠水溶液)并且在微量滴定板分光光度计上测量在405nm的吸光度。将一个磷酸酶单位定义为在给定反应条件下每分钟释放1微摩尔磷酸根的酶活性(扣除缓冲液空白)。在测试条件下测定1微摩尔对硝基酚的吸光度为56AU(AU=吸收单位)。
肌醇六磷酸酶活性的测定
将75微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液(适当地在0.25M乙酸钠,0.005%(w/v)Tween-20.pH5.5中稀释)分配到微量滴定板的孔中,例如NUNC269620,并加入75微升底物(通过将100mg来自稻的肌醇六磷酸钠(AldrichCat.No.274321)溶解在10ml 0.25M乙酸钠缓冲液,pH 5.5中来制备)。将平板密封,并在37℃以750rpm摇动温育15分钟。温育之后,加入75微升终止试剂(所述终止试剂是通过混合10ml钼酸盐溶液(0.25%(w/v)氨溶液中的10%(w/v)七钼酸铵),10ml钒酸铵(0.24%来自Bie&Berntsen的商品,Cat.No.LAB17650)和20ml 21.7%(w/v)硝酸来制备的),并且在微量滴定板分光光度计中测量在405nm的吸光度。将肌醇六磷酸酶活性表示为以FYT为单位,一个FYT为在上述条件下每分钟释放1微摩尔无机正磷酸根的酶量。通过参考从无机磷酸盐的适当稀释液制作的标准曲线或参考从已知活性的肌醇六磷酸酶制备物(这样的具有已知活性的标准酶制备物可从Novozymes A/S,Krogshoejvej 36,DK-2880 Bagsvaerd索取获得)的稀释液制作的标准曲线来获得测量的肌醇六磷酸酶活性的绝对值。
实施例2:比活性
基于相对于250mM乙酸钠,pH 5.5透析的高度纯化的样品来测定肌醇六磷酸酶变体的比活性。预先在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测纯度,显示只存在一个组分。
蛋白浓度通过如下氨基酸分析来测定:将样品的等分试样在抽空的玻璃管中在6N HCl,0.1%苯酚中在110℃水解16小时。用Applied Biosystems420A氨基酸分析系统按照制造商的说明书操作来定量所得的氨基酸。从氨基酸的量,能够计算在水解的等分试样中的蛋白的总质量和(由此得到)浓度。
如实施例1(“肌醇六磷酸酶活性的测定”)中所述以FYT单位来测定肌醇六磷酸酶活性,而将比活性计算为肌醇六磷酸酶活性,所述肌醇六磷酸酶活性以每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白的FYT单位来测量。
实施例3:温度稳定性
菌株和质粒
使用大肠杆菌DH12S(可从Gibco BRL获得)用于酵母质粒拯救。
pJHP000是在TPI启动子调控下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体,其构建自WO 01/92502中描述的pJC039,其中已经插入了所述蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶基因。
将酿酒酵母YNG318:MATa Dpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2,his 4-539用于肌醇六磷酸酶变体表达。其记载在J.Biol.Chem.272(15),pp 9720-9727,1997中。
培养基和底物
10X基础溶液:不含氨基酸的酵母氮基底(DIFCO)66.8g/l,琥珀酸盐100g/l,NaOH 60g/l。
SC-葡萄糖:20%葡萄糖(即,终浓度为2%=2g/100ml)100ml/l,5%苏氨酸4ml/l,1%色氨酸10ml/l,20%酪蛋白氨基酸25ml/l,10X基础溶液100ml/l。将所述溶液使用孔径为0.20微米的滤器除菌。将琼脂和H2O(约761ml)一起高压灭菌,并将单独灭菌的SC-葡萄糖溶液加入至所述琼脂溶液。
YPD:细菌用蛋白胨20g/l,酵母提取物10g/l,20%葡萄糖100ml/l。
PEG/LiAc溶液:40%PEG400050ml,5M乙酸锂1ml。
DNA操作
除非另行说明,否则DNA操作和转化使用分子生物学的标准方法如Sambrook等(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,Cold SpringHarbor lab.Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.等(编)″Current protocols in Molecular Biology″,John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.and Cutting,S.M.(编)中所述进行。
酵母转化
酵母转化通过乙酸锂方法进行。将0.5微升载体(通过限制内切核酸酶消化)和1微升PCR片段混合。在冰上解冻YNG318感受态细胞。将100微升所述细胞,所述DNA混合物和10微升载体DNA(Clontech)在12ml聚丙烯管(Falcon 2059)中混合。加入0.6ml PEG/LiAc溶液并轻柔混合。在30℃和200rpm温育30分钟。在42℃(热休克)温育30分钟。转移至Eppendorf管并离心5秒。去除上清液并溶解在3ml YPD中。在200rpm于30℃温育所述细胞悬液45分钟。将所述悬液倾倒入SC-葡萄糖平板并在30℃温育3天以产生菌落。酵母总DNA通过Nucleic acids research vol.20,No.14(1992)3790中描述的Robzyk和Kassir的方法提取。
DNA测序
供DNA测序用的大肠杆菌转化通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser)进行。DNA质粒通过碱法(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor)或用质粒试剂盒制备。通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。使用PTC-200DNA Engine进行PCR。使用ABI PRISMTM 310 GeneticAnalyzer用于全部DNA序列的测定。
肌醇六磷酸酶表达载体的构建
使用引物对(HafPhyF和HafPHyR)扩增哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶基因。将所得PCR片段与用限制酶消化而去除了特异腐质霉角质酶基因成熟部分的pJC039载体一起引入酿酒酵母YNG318。
HafPhyF(34聚物)
CTCCTGAACTTGTTGCCCGGTCGGATACAGCCCC
HafPhyR(39聚物)
ATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAGGGGAGCTGACATG
回收来自SC-葡萄糖平板上酵母转化体的称作pJHP000的质粒,并测定内部序列以确认肌醇六磷酸酶基因。
酵母文库和定点变体的构建
酵母中的文库和定点变体通过SOE PCR方法(通过重叠延伸剪接(Splicing by Overlap Extension),参见“PCR:A practical approach”,207-209页,Oxford University press,McPherson,Quirke,Taylor编)构建,其后进行酵母的体内重组。
用于扩增和测序的通用引物
使用下述引物通过SOE方法连同简并引物(AM34+反向引物和AM35+正向引物)一起制备含有任意突变的片段的DNA片段,或只是扩增完整的天冬酰胺酶基因(AM34+AM35)。
AM34 TAGGAGTTTAGTGAACTTGC
AM35 TTCGAGCGTCCCAAAACC
通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。将所得的纯化片段与载体消化产物混合。将混合的溶液引入酿酒酵母以通过体内重组构建文库或定点变体。
文库筛选(初级膜测定法)
将酵母文库在含乙酸纤维素膜(上方)和Biodyne C(来自Pall gelman)膜(下方)的SC-葡萄糖平板上在30℃培养至少3天。将BiodyneC膜转移至预温育的含20mM乙酸盐缓冲液,pH4.0的平板并在特定温度温育1-2小时(在WT为主链(backbone)的情况下为50℃)。
然后,去除所述膜并浸入新鲜的底物溶液(10ml 20mM乙酸盐缓冲液,pH4.0;0.01g,α-萘基磷酸盐(sigma);0.02g,Fast Garnet GBC(sigma))。从乙酸纤维素膜分离对应于在Biodyne C膜上显现红色的位置的酵母克隆。
文库筛选(二级相对活性选择)
将乙酸纤维素膜上的酵母克隆接种至96孔微量滴定板的孔中并在28℃培养3天。在37℃和更高的温度(60,62,64,66℃等)测量肌醇六磷酸酶活性以测定在特定温度下的相对活性。然后选择具有较高相对活性的克隆并确认所述序列。
将标准品,水平对照和样品移液至MTP或8条纹管中 | 10μl |
加入预加热的(50℃)底物 | 200μl |
将8条纹管或MTP置于37,60和64℃(或以上)的MTP温育箱中 | 30分钟 |
取出35μl,将其加入100μl的终止络合试剂并混合5-20秒 | 35+100μl |
使样品等候测量 | 5-30分钟 |
OD测量于 | 750nm |
底物,肌醇六磷酸钠溶液2.0mM(每次)
100ml制备实例:
肌醇六磷酸钠0.1847g
0.1M乙酸盐缓冲液,pH4.0补足至100ml
络合试剂
200ml的制备实例:
FeSO4.7H2O 14.64g
七钼酸铵溶液补足至200ml
终止-络合试剂
600ml终止-络合试剂的制备实例
0.5M H2SO4 200ml
络合试剂400ml
七钼酸铵溶液
1000ml的制备实例:
(NH4)6Mo7O24.4H2O 10.0g
硫酸32ml
脱矿物质水补足1000ml
结果在下面提供。表明相对活性的一栏首先提供变体的相对活性,之后是测定中使用的参照肌醇六磷酸酶的相对活性。所述参照或者是野生型或者是变体第62,69,84,104,105,113和/或138号。当野生型的残余活性非常低时,所述变体通常用作参照。
结果
实施例4.热稳定性
将蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶(如实施例1中所述纯化)的蛋白质样品的等分试样或者使用预装的PD-10柱脱盐并缓冲液交换成20mM乙酸钠,pH4.0,或者以2-3h步骤继之以过夜步骤相对2x500ml 20mM乙酸钠,pH 4.0在4℃透析。将样品以0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2个A280单位。使用透析缓冲液作为示差扫描量热法(DSC)中的参照。使用真空抽吸并搅拌约10分钟来为样品脱气。
DSC扫描是对MicroCal VP-DSC从20到90℃以1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行的。使用MicroCal Origin软件(4.10版)进行数据处理,并将变性温度Td(也称为熔化温度Tm)定义为热谱图中峰顶处的温度。
蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶变体的DSC结果归纳在下表3中。
表3.蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶的比较性热稳定性
实施例5.温度概貌
基本上如上所述(“肌醇六磷酸酶活性的测定”)测定蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶和变体在20-90℃温度范围中的温度概貌(肌醇六磷酸酶作为温度的函数)。然而,酶反应(100微升含肌醇六磷酸酶的酶溶液+100微升底物)在PCR管中而非微量滴定板中进行。在15分钟反应时间之后,在期望的温度下,将管冷却至20℃持续20秒并将150微升的各反应混合物转移至微量滴定板。加入75微升终止试剂并在微量滴定板分光光度计中测量405nm处的吸光度。结果归纳在下表4中。为各个温度给出的数值是相对于最优值标准化的相对活性(以%表示)。
表4:相对温度概貌
以在75℃的稳定性排序
表5:在75℃的加热稳定性,相对于最大活性的活性
实施例6.pH概貌
在2.0至7.5的pH范围内(以0.5个pH单位为间隔)在37℃测定pH概貌,如上文在“肌醇六磷酸酶活性的测定”部分中所述,只是使用缓冲液混合物(50mM甘氨酸,50mM乙酸和50mM Bis-Tris)代替0.25M乙酸钠pH5.5缓冲液之外。结果归纳在下表1中。对于范围在2.0-7.5的各个pH给出的值是相对于最优值标准化的以%表示的相对活性。
表6:在37℃的相对pH概貌
实施例7:蒸汽稳定性
方法1
使用以下测定法评估在蒸汽处理之后肌醇六磷酸酶分子的残余活性:
将20μL的各种经纯化的酶样品分配至96(1x8 StripwellTM)孔板(Corning,Lowell,MA,USA)的单个孔中,随即在真空离心(Genevac EZ-1Plus,Genevac Ltd,Suffolk,UK)中蒸干。在内径为27x18x20cm的密闭styropor容器中进行蒸汽温育。将样品(在开放的支板中(in open strips))置于容器顶部上方约10cm处的金属支架上,从而不与水接触。
向容器内倒入1升沸水,盖上盖子并使用固定在容器盖子上的温度计监控所产生蒸汽的温度。温育从将水倒入容器时起进行60秒。在此期间,温度升高至大约85℃。温育后立即将样品在冰上冷却,重悬并使用对硝基苯基磷酸(pNPP)比色测定法(Sigma,Broendby,DK)评估肌醇六磷酸酶活性。将各个酶样品与未经蒸汽处理的相似样品比较以计算残余活性。
结果示于下表7和8中。
表7:通过方法1测定的蒸汽稳定性
方法2
在这些实验中使用了修改的设置,因而蒸汽由蒸汽发生器提供并被导入盒中。当温度达到时将置于平板上的样品通过抽屉插入盒中。插入样品之后温度下降4℃。温育进行30秒,同时温度大约保持恒定在90℃。其后快速将平板从盒中取出,并将样品置于冰上。如方法1中所述分析样品。
表8:通过方法2测定的蒸汽稳定性
实施例8:糖化残余活性(Glycation Residual activity)
通过糖化失活
通过将纯化的肌醇六磷酸酶变体与葡萄糖一起温育来研究糖化的作用。为此,将0.1M HEPES pH 7.5中0.5mg/ml的酶与1M葡萄糖混合并在50℃温育5小时。在温育之前和之后测量磷酸酶活性并将结果显示在下表9中。
表9:糖化的修饰
突变 | 残余活性 |
Wt | 18% |
K26Q | 55% |
K26R | 47% |
以上显示的结果表明野生型酶受到糖化的强烈抑制(18%残余活性)。位置K26的变体显然在此方面大大改善,受到影响较小。
实施例9:制粒稳定性测试
制粒稳定性的测量
将约50g酶颗粒与10kg饲料在小型水平混合器中预混合10分钟。将这种预混物与90kg饲料在大型水平混合器中混合10分钟。将饲料从混合器中以大约300kg/小时的速率导入调节器(具有蒸汽注入的级联混合器)。调节器通过注入蒸汽将饲料加热至95℃(在出口处测量)。在调节器中的停留时间为30秒。将饲料从调节器导入配备有3.0x35mm水平模具的Simon Heesen压制机并压成长度约15mm的小粒。压制之后将小粒置于空气冷却机中冷却15分钟。
饲料配制物:
74.0% 经研磨的玉米
5.0% 大豆油
20.7% 经烘烤的大豆碴(Toasted soy grits)
0.3% 矿物质和维生素的Solivit Mikro 106预混物
12% 含水量
测试1
由下述组成的粉末:
1.5kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.75kg糖粘合剂,Avedex W80
11.552kg精细研磨的硫酸钠
在混合器FM 50中与造粒液(granulation liquid)一起形成颗粒,所述造粒液由下述组成:
0.75kg糖粘合剂,Avedex W80
2.49kg肌醇六磷酸酶哈夫尼菌属野生型浓缩物
0.45kg水
以美国专利号4,106,991的实施例1中描述的方式进行造粒。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量在1%以下并进行筛分以获得颗粒范围在250μm至850μm的产物。最后,将所述产物以美国专利号4,106,991实施例22中所述的方式用10%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试2
由下述组成的粉末:
1.6kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
12.027kg精细研磨的硫酸钠
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
3.5kg Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R变体浓缩物
0.02kg水
如上所述进行造粒,干燥和筛分。最后,将产物按照上述方式用9%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试3
由下述组成的粉末:
1.6kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
12.013kg精细研磨的硫酸钠
在混合器FM 50中与造粒液一起形成颗粒,所述造粒液由下述组成:
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
3.2kg肌醇六磷酸酶变体2浓缩物
0.30kg水
如上所述进行造粒,干燥和筛分。最后,将产物按照上述方式用9.8%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试4
由下述组成的粉末:
1.6kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
12.225kg精细研磨的硫酸钠
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
3.50kg E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R变体浓缩物
如上所述进行造粒,干燥和筛分。最后,将产物按照上述方式用9.0%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试5
由下述组成的粉末:
1.6kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
12.225kg精细研磨的硫酸钠
在混合器FM 50中与造粒液一起形成颗粒,所述造粒液由下述组成:
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
3.50kg Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R变体浓缩物
如上所述进行造粒,干燥和筛分。最后,将产物按照上述方式用9.0%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试6
由下述组成的粉末:
1.6kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
12.435kg精细研磨的硫酸钠
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
3.50kg Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R变体浓缩物
0.30kg水
如上所述进行造粒,干燥和筛分。最后,将产物按照上述方式用9.7%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
测试7
由下述组成的粉末:
1.6kg纤维状纤维素,Arbocel BC200
0.80kg糖粘合剂,Avedex W80
12.193kg精细研磨的硫酸钠
0.64kg糖粘合剂,Avedex W80
3.50kg肌醇六磷酸酶变体5变体浓缩物
0.16kg水
如上所述进行造粒,干燥和筛分。最后,将产物按照上述方式用8.3%棕榈油和22%碳酸钙涂覆。
在制粒试验中在95℃调节器的出口测试在测试1至测试7中产生的样品。使用分析方法EB-SM 0559.02版本01(可从Novozymes索取获得)测量制粒之前和制粒之后在饲料粒中的肌醇六磷酸酶含量。发现了以下肌醇六磷酸酶的残余活性:
表10:制粒稳定性
结论是所述变体与参照测试1相比改进了制粒稳定性。
实施例10:在体外模型中在动物饲料中的性能
将本发明的多种肌醇六磷酸酶变体在动物饲料中的性能在体外模型中与参照蛋白如SEQ ID NO:2的性能比较。体外模型模拟单胃动物体内的胃肠环境并与在动物试验中在体内获得的结果很好地关联。在此实施例中使用的版本模拟作物和雏鸡的胃。如下进行比较:
如实施例1的“肌醇六磷酸酶活性的测定”中所述测定变体样品中的肌醇六磷酸酶活性。
将来自雏鸡喂食试验的饲料粒(含玉米、大豆粉和大豆油作为主要成分)在40℃和pH 4.6预温育5分钟,然后加入合适剂量的肌醇六磷酸酶(对测试的所有肌醇六磷酸酶使用了相同的剂量以允许进行比较),例如125-1000肌醇六磷酸酶单位FYT/kg饲料,或在对照样品中加入缓冲液。5分钟温育之后,加入胃蛋白酶(3000U/g饲料)的HCl溶液并以这种方式使pH降至3。然后将样品在40℃再温育5分钟。
终止反应,并通过加入HCl至终浓度为0.5M并在40℃温育2小时,然后进行一个冻融循环和在40℃的1小时温育来提取肌醇六磷酸和肌醇磷酸盐。
通过高效离子层析如Chen等在Journal of Chromatography A(2003)vol.1018,pp.41-52中所述分离肌醇六磷酸和肌醇磷酸盐,并如Skoglund等在J.Agric.Food Chem.(1997),vol.45,pp.431-436中所述进行定量。
然后将肌醇六磷酸盐的降解计算为经肌醇六磷酸酶处理的和未经处理的样品之间肌醇-6-磷酸盐结合磷(IP6-P)上的差异。将变体的相对性能计算为由野生型肌醇六磷酸酶导致的肌醇六磷酸盐降解的百分比。
肌醇六磷酸酶变体的相对降解(表11)显示变体都能在所采用的体外系统中降解肌醇-6-磷酸盐。某些候选物的表现优于野生型(例如变体:D92Y/E100W/A217G/H363R,变体:Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,变体:Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R),而其它在体外不如野生型有效(例如变体:K207Q)。
表11.来自基于大豆/玉米的饮食的IP6-P体外降解。将变体的肌醇六磷酸盐降解计算为占由野生型肌醇六磷酸酶导致的肌醇六磷酸盐降解的百分比。
*对于这些数据,在250FYT/kg测试了wt
实施例11:在体内的猪试验中的性能
比较性评估分级量的两种蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶变体对饲育猪的粪便消化率和磷和钙的排泄的作用。
使用初始体重43.55±4.35kg的六十四头Large White×Landrace猪。
将动物圈养在环境受控的房间内的落地式猪圈笼(floor-pen cage)中。每个猪圈具有用塑料覆盖的焊接线地板(plastic-coated welded wire floor)并配备有两个喷水嘴和四个不锈钢个体化喂食器。室温为21-22℃且湿度百分比为50%。
在14天的适应期内,给猪喂食配制成提供只来自植物来源的磷(P)的基础饮食。在这段时期之后,将它们分为16个相等的组,每组4只动物。
给它们喂食12天的基础饮食或补充有1000,2000U/kg和4000U/kg的蜂房哈夫尼菌野生型肌醇六磷酸酶,有500,1000和2000U/kg的Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R变体或有500,1000和2000U/kg 的Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R变体的这种饮食。
以0.4%浓度向所有饮食添加不可消化的示踪物(氧化铬),允许计算P和钙(Ca)的消化率。在猪圈饲料消耗控制之下,将饲料以醪的形式任意(ad libitum)分配,并且使动物自由获取饮用水。Ca的消化率不对随饮用水摄入的Ca进行修正。
在第二个时间段的第12天测量粪便的P,Ca和Cr浓度。在该日期之前最后3天期间,在一天的相同时间以大约相同的量,单独采样粪便。如此,针对各个饮食处理以及针对各个标准,进行了总共12个单独的测定。根据标准Association of Official Analytical Chemists(1990)方法使用Vista-MPXICP-OES分光光度计测定全部矿物质。计算所述3天期间的矿物质的表观消化率(占摄入的%)。
补充了酶的动物的平均P粪便浓度非常显著地低于对摄入对照饮食的动物所观察到的(a)。
P消化率是剂量依赖性的并且在全部补充组中通过五种肌醇六磷酸酶得到了非常显著的改善(b)。在补充了4000U/kg蜂房哈夫尼菌野生型的饮食中和在2000U/kg的JHP113组中观察到最高的P消化率。
P的粪便排泄在全部补充了肌醇六磷酸酶的动物中并且对于所有测试的包含水平均显著降低(c)。
在4000U/kg蜂房哈夫尼菌野生型组中的表观吸收的P高于针对饲育猪推荐的2.25g/kg,并且分别为2000U/kg和4000U/kg的JHP113和“C.braakii”野生型与之非常接近(d)。
与没有补充的对照相比被认为是得到消化的补充性P的P当量(equivalence),在全部五种补充了肌醇六磷酸酶的饮食中均非常显著高于对照(e)。
对于所有测试的酶并且在所有包含水平,Ca消化率得到了改进并且Ca的粪便排泄率降低(f)。
用4000U/kg的包含水平的蜂房哈夫尼菌野生型在这些参数上观察到了最大效力,而当比较1000U/kg和2000U/kg补充量的效力时Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R变体表现得最好。
结果示于下表12
表12:关于消化率参数的残余水平
Claims (42)
1.一种肌醇六磷酸酶,其与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-413具有至少76%同一性并且其包含在至少一个选自下述的位置中的至少一个修饰:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412和413,
其中所述位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶的位置,条件是所述肌醇六磷酸酶不是具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)肌醇六磷酸酶。
2.权利要求1的肌醇六磷酸酶,其包含在选自下述的至少一个位置中的至少一个修饰:139,1,8,41,45,49,54,66,72,76,77,78,95,101,109,131,143,148,152,162,163,176,179,187,192,201,207,217,221,234,239,242,245,251,261,293,294,303,304,308,325,346,348,363,369,370,396,401,403,其中所述位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶的位置,条件是所述肌醇六磷酸酶不是具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶。
3.权利要求1的肌醇六磷酸酶,其包含在选自下述的至少一个位置中的至少一个修饰:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413;和在选自下述的至少一个位置中的至少一个另外的修饰:1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,139,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413;其中所述位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶的位置,条件是所述肌醇六磷酸酶不是具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的蜂房哈夫尼菌肌醇六磷酸酶。
4.权利要求1-3中任一项的肌醇六磷酸酶,其中所述一个或多个修饰选自:
1P,Q,*1aG,*1aP,*1aS,*1bP,*1bS,*1cS,1QGPS,1QS,8L,C,M,Y,9K,P,S,10V,12S,R,16V,18K,25A,26R,Q,H,27A,28A,29P,R,K,A,30P,L,31I,32Q,I,L,33C,N,35C,A,36C,37D,R,K,38A,41T,Q,45P,48H,W,N,49L,54C,G,55E,59R,K,63C,64S,66C,68L,69E,L,70E,72A,74S,75A,76R,V,N,77K,G,W,Q,78G,R,K,Q,S,T,79L,81E,82S,83G,89A,92Y,93P,E.N,95P,A,96N,V,97R,98S,100W,101C,103A,109D,G,111R,K,S,112S,115L,M,R,K,116S,T,N,117A,Q,118A,N,E,P,T,119D,K,E,120G,L,I,M,121A,S,T,G,K,122A,S,T,K,123P,M,V,A,T,128N,R,130L,131R,Q,132T,V,134V,136Q,137L,138N,V,139C,R,140P,143C,V,144R,146I,148R,150C,151D,152A,G,T,I,160G,162N,R,163P,K,168V,172C,173N,175N,S,176C,Q,R,177C,178C,E,179C,L,W,181L,185R,K,186S,T,187E,190N,192A,193R,195L,198E,199C,201C,G,V,202A,K,203Y,206G,T,A,207N,L,Q,R,208A,208T,209S,211T,R,215S,217S,G,219M,L,221T,G,224C,227Q,228C,Q,230E,234L,R,C,V,E,235P,236C,239R,K,242S,243P,244P,245E,246N,247D,W,248T,249S,T,251S,D,E,R,256D,A,258Y,259C,260L,261F,A,Q,A,266V,268R,270R,284P,285D,286T,287P,288P,289W,293R,K,N,294L,298S,299R,301M,303L,304V,308A,310L,312A,313L,314G,316P,A,318E,319L,320N,325C,K,326C,331C,S,T,335E,343C,344K,346S,T,347R,348D,E,S,R,354L,355S,T,356F,358C,360P,Q,362M,363C,R,K,V,365K,366T,368C,369SD,370C,374C,P,376E,378K,380,382S,T,383N,394N,395E,396D,E.K,401N,403N,和411S。
5.权利要求1-4中任一项的肌醇六磷酸酶,其中,进一步地,位置180和189之间的氨基酸残基已经由长度为4,5,6,7或8个氨基酸残基的小肽替代,特别是五肽QADKP,GEDKP,NGISA,IAGKS,KEKHQ,KEKQQ,KEKKV,或KTDKL。
6.权利要求1-5中任一项的肌醇六磷酸酶,其中,进一步地,位置115和124或127之间的氨基酸残基已经由长度为5,6,7,8,9,10或11个氨基酸残基的小肽替代,特别是八肽TQADTSSP或选自下组的肽:HQEKMGTMDPT,HQQDIKQVDSL,HQPEIGKMDPV,TQADTSSPDPL,HQQDIKQADPL,TQTDT S SPDPL,和NQADLKKTDPL。
7.权利要求1-6中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含选自下述的至少一个修饰:8C,33C,35C,36C,54C,63C,66C,101C,139C,143C,201C,150C,172C,176C,177C,178C,179C,224C,228C,236C,259C,325C,326C,331C,358C,363C,368C,370C,374C。
8.权利要求7的肌醇六磷酸酶,其包含选自下述的至少一组修饰:8C/343C,139C/201C,33C/179C,33C/178C,35C/172C,36C/177C,36/C176C,143C/201C,54C/101C,63C/368C,66C/370C,224C/236C,150C/259C,326C/331C,325C/358C/,228C/363C,368C/374C。
9.权利要求7或8的肌醇六磷酸酶,其包含在选自下述位置中的至少一个另外的修饰:1,4,5,6,7,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,37,38,39,40,41,45,48,49,55,59,64,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,144,145,146,147,148,149,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,173,175,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,227,230,233,234,235,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,335,344,345,346,347,348,354,355,356,360,362,364,365,366,367,369,371,372,373,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413。
10.权利要求1-9中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:29P,30P,93P,95P,140P,163P,235P,243P,244P,284P,287P,288P,316P,和360P。
11.权利要求1-10中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:8L,9K,12S,16V,27A,30L,32Q,37D,38A,41T,48W,49L,54G,55E,75A,77K,78G,93E,103A,109D,128N,130L,132T,134V,136Q,137L,173N,176Q,195L,198E,206T,207N,209S,211T,215S,219M,221T,227Q,228Q,248T,258Y,260L,261Q,310L,313L,314G,316A,318E,319L,320N,335E,354L,356F,360Q,362M,251S,363R,365K,366T,369S,374P,376E,378K,和411S。
12.权利要求1-11中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:9R,29R,K,37R,K,59R,K,69E,70E,78R,K,81E,93E,111R,K,115R,K,119D,185R,K,230E,239R,245E,251D,E,293R,K,348D,E,363R,K,395E,和396D,E。
13.权利要求1-12中任一项的肌醇六磷酸酶,其是SEQ ID NO:2的肌醇六磷酸酶的变体。
14.权利要求13的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:F8C,D33C,T35C,P36C,E54C,F63C,E66C,A101C,K139C,H143C,I201C,A150C,L172C,K176C,S177C,P178C,Y179C,F224C,H228C,A236C,L259C,G325C,Q326C,P331C,T358C,H363C,L368C,L370C,和A374C。
15.权利要求14的肌醇六磷酸酶,其包含至少一组选自下述的修饰:F8C/D343C,K139C/I201C,Y179C/D33C,P178C/D33C,L172C/T35C,S177C/P36C,K176C/P36C,H143C/I201C,E54C/A101C,F63C/L368C,E66C/L370C,F224C/A236C,A150C/L259C,P331C/Q326C,T358C/G325C,H228C/H363C,和L368C/A374C。
16.权利要求13-15中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:Q29P,T30P,Q93P,K95P,S140P,A163P,V235P,E243P,Q244P,S284P,T287P,S288P,M316P,和A360P。
17.权利要求13-16中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:F8L,Q9K,K12S,L16V,M27A,T30L,R32Q,H37D,Q38A,E41T,Y48W,I49L,E54G,H55E,P75A,D77K,N78G,Q93E,L103A,Q109D,H128N,V130L,A132T,I134V,S136Q,M137L,D173N,K176Q,M195L,R198E,N206T,K207N,A209S,E211T,G215S,T219M,A221T,E227Q,H228Q,S248T,D258Y,M260L,S261Q,I310L,I313L,S314G,M316A,G318E,M319L,T320N,A335E,M354L,Y356F,A360Q,L362M,K251S,H363R,Q365K,A366T,T369S,A374P,S376E,R378K,和Q411S。
18.权利要求13-17中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:D111R,K,K251D,E,D293R,K,Q93E,Q230E,P348D,E,L395E,Q69E,Q70E,Q245E,S396D,E,T81E,N119D,Q29R,LYS,H37R,K,H363R,K,N239R,Q9R,H115R,K,L59R,K,N78R,K,和I185R,K。
19.权利要求13-18中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:K12R,Q,K26R,Q,K45P,K76R,Q,K97R,Q,K131R,Q,K139R,Q,K148R,Q,K176R,Q,K187E,K207L,K234R,Q,K251R,Q,K268R,Q,K299R,Q,K347R,Q,S261A,T308A,T25A,T28A,T30L,T219L,T120L,N202A,N206A,N270R,Q,N312A,N119D,Q256A,Q29A,Q121A,Q122A,Q117A,Q118A,Y48W,和Y179L。
20.权利要求13-19中任一项的肌醇六磷酸酶,其包含至少一个选自下述的修饰:1P,S1QGPS,S1QS,F8M,F8Y,Q9S,K26H,D33C,T35A,E41Q,Y48H,I49L,G72A,P75N,K76N,D77Q,N78Q,N78T,A89A,D92Y,T98S,E100W,Q109G,H115M,K131Q,A132V,D138N,K139C,V146I,T152A,T152G,T152I,Q162N,Q162R,A163K,P175S,Q181L,G186S,S192A,I201G,I201V,K207Q,K207R,V208T,A217G,K234E,K234V,N239K,T242S,N247D,N247W,Q256D,I266V,R289W,I294L,I303L,A304V,G346S,P348R,T369D,S396K,L401N,S403N。
21.权利要求1-20中任一项的肌醇六磷酸酶,其具有与参照或亲本肌醇六磷酸酶相比在热性能包括加热稳定性,温度稳定性,热稳定性,蒸汽稳定性,制粒稳定性和/或温度概貌方面的改进的性质和/或改进的效力,包括改进的pH概貌,改进的比活性,改变的糖基化模式,改进的在动物饲料中的性能,和/或其并入了潜在的蛋白酶切割位点和/或糖基化位点的变化。
22.一种用于产生与SEQ ID NO:2具有至少76%同一性的参照或亲本肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸酶变体的方法,其中所述变体在下述位置中的一个或多个中展现出至少一个取代,插入或缺失:139,1,4,5,6,7,8,9,10,12,16,18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,35,36,37,38,39,40,41,45,48,49,54,55,59,63,64,66,68,69,70,71,72,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,89,91,92,93,95,96,97,98,100,101,103,108,109,110,111,112,113,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,128,130,131,132,133,134,136,137,138,140,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,158,159,160,161,162,163,168,172,173,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,189,190,192,193,194,195,196,198,199,200,201,202,203,204,205,206,207,208,209,211,215,217,219,221,224,227,228,230,233,234,235,236,238,239,240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,251,256,258,259,260,261,266,268,270,279,284,285,286,287,288,289,290,292,293,294,295,296,297,298,299,301,303,304,308,310,312,313,314,316,318,319,320,322,324,325,326,331,335,343,344,345,346,347,348,354,355,356,358,360,362,363,364,365,366,367,368,369,370,371,372,373,374,375,376,378,382,383,384,385,386,387,388,389,390,391,394,395,396,397,400,401,403,404,406,408,409,411,412,和413,其中所述位置对应于具有SEQ ID NO:2的氨基酸1-413的肌醇六磷酸酶的位置,所述方法包括
a)以使编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA或基因编码所述取代,插入和/或缺失的方式突变所述DNA或基因,
b)将所述DNA或基因可操作地连接至一个或多个指导所述肌醇六磷酸酶在合适的表达宿主中产生的调控序列以创建DNA构建体或重组表达载体,
c)将所述构建体或载体转移至合适的宿主,
d)培养所述宿主以产生变体肌醇六磷酸酶,和
e)回收所述肌醇六磷酸酶。
23.权利要求22的方法,其中产生的变体具有在热性能包括加热稳定性,温度稳定性,热稳定性,蒸汽稳定性,制粒稳定性和/或温度概貌方面的改进的性质,和/或改进的效力,包括改进的pH概貌,改进的比活性,改变的糖基化模式,改进的在动物饲料中的性能,和/或其并入了潜在的蛋白酶切割位点和/或糖基化位点的变化。
24.权利要求22或23的方法,其中所述修饰选自下述取代或插入:1P,Q,*1aG,*1aP,*1aS,*1bP,*1bS,*1cS,1QGPS,1QS,8L,C,M,Y,9K,P,S,10V,12S,R,16V,18K,25A,26R,Q,H,27A,28A,29P,R,K,A,30P,L,31I,32Q,I,L,33C,N,35C,A,36C,37D,R,K,38A,41T,Q,45P,48H,W,N,49L,54C,G,55E,59R,K,63C,66C,68L,69E,L,70E,74S,72A,75A,76R,V,N,77K,G,W,Q,78G,R,K,Q,S,T,79L,81E,82S,83G,89A,92Y,93P,E,N,95P,A,96N,V,97R,98S,100W,101C,103A,109D,G,111R,K,S,112S,115L,M,R,K,116S,T,N,117A,Q,118A,N,E,P,T,119D,K,E,120G,L,I,M,121A,S,T,G,K,122A,S,T,K,123P,M,V,A,T,128N,R,130L,131R,Q,132T,V,134V,136Q,137L,138N,V,139C,R,140P,143C,V,144R,146I,148R,150C,151D,152A,G,T,I,160G,162N,R,163P,K,168V,172C,173N,175N,S,176C,Q,R,177C,178C,E,179C,L,W,181L,185R,K,186S,T,187E,190N,192A,193R,195L,198E,199C,201C,G,V,202A,K,203Y,206G,T,A,207N,L,Q,R,208A,208T,209S,211T,R,215S,217S,G,219M,L,221T,G,224C,227Q,228C,Q,230E,234L,R,C,V,234E,235P,236C,239R,K,242S,243P,244P,245E,246N,247D,W,248T,249S,T,251S,D,E,R,256D,A,258Y,259C,260L,261F,A,Q,A,266V,268R,270R,284P,285D,286T,287P,288P,289W,293R,K,N,294L,298S,299R,301M,303L,304V,308A,310L,312A,313L,314G,316P,A,318E,319L,320N,325C,K,326C,331C,S,T,335E,343C,344K,346S,T,347R,348D,E,S,R354L,355S,T,356F,358C,360P,Q,362M,363C,R,K,V,365K,366T,368C,369S,D,370C,374C,P,376E,378K,380,382S,T,383N,394N,395E,396D,E,K,401N,403N,和411S。
25.权利要求22-24中任一项的方法,其中产生权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶。
26.一种分离的核酸序列,其包含编码权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶的核酸序列。
27.一种核酸构建体,其包含与一个或多个指导所述肌醇六磷酸酶在合适的表达宿主中产生的调控序列可操作地连接的权利要求26的核酸序列。
28.一种重组表达载体,其包含权利要求26的核酸构建体。
29.一种重组宿主细胞,其包含权利要求27的核酸构建体和/或权利要求28的表达载体。
30.一种用于产生权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶的方法,包括
(a)培养权利要求29的宿主细胞以产生包含肌醇六磷酸酶的上清液;和(b)回收所述肌醇六磷酸酶。
31.一种转基因植物或植物部分,其能够表达权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶。
32.一种转基因非人动物或其产品或成分(element),其能够表达权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶。
33.一种组合物,其包含至少一种权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶,和
(a)至少一种脂溶性维生素;
(b)至少一种水溶性维生素;和/或
(c)至少一种痕量矿物质。
34.权利要求33的组合物,其还包含选自下组的酶中的至少一种酶:淀粉酶,肌醇六磷酸酶,磷酸酶,木聚糖酶,半乳聚糖酶,α-半乳糖苷酶,蛋白酶,磷脂酶和/或β-葡聚糖酶。
35.权利要求32-34中任一项的组合物,其为动物饲料添加剂。
36.一种动物饲料组合物,其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并且包含权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求33-35中任一项的组合物。
37.一种用于改进动物饲料的营养价值的方法,其中向所述饲料添加权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求32-36中任一项的组合物。
38.一种用于降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法,包括喂食动物有效量的权利要求36的饲料。
39.一种用于植物蛋白处理的方法,包括向至少一种植物蛋白或蛋白来源添加权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求32-36中任一项的组合物的步骤。
40.权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶或权利要求32-36中任一项的组合物在动物饲料中;在动物饲料的制备中;用于改进动物饲料的营养价值;用于降低动物粪便中的肌醇六磷酸盐水平;用于植物蛋白处理;或用于从肌醇六磷酸酶底物释放磷的用途。
41.一种用于产生发酵产物的方法,包括(a)使用发酵微生物在权利要求1-21中任一项的肌醇六磷酸酶存在下发酵含糖材料,和(b)从经发酵的含糖材料产生发酵产物或发酵副产物。
42.权利要求41的方法,其中所述发酵产物为乙醇,啤酒,葡萄酒或干酒糟(DDG)。
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