JP2022513085A - 改変ロバスト高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片 - Google Patents

改変ロバスト高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片 Download PDF

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Abstract

本明細書では、改変ロバスト高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片が記載される。そのような改変ロバスト高Ｔｍフィターゼ分岐群及びその断片を作成する方法並びに動物の性能を増強することにおけるその使用も記載される。【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７６９７１３号明細書、２０１９年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８５１１２２号明細書及び２０１９年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７７１４号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照による組み込み
２０１９年１１月１５日に作成され、本明細書に添付される、３２４ＫＢのサイズを有する「２０１９１１１５＿ＮＢ４１１７５－ＷＯ－ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称のファイルで提供される配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本分野は、改変ロバスト高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片、そのような改変ロバスト高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片の製造方法並びに動物の性能を増強するためのその使用に関する。
フィターゼは、単胃動物のための食料中で最も一般的に使用される外生酵素である。フィターゼは、フィチン酸塩の栄養阻害作用を減じることができ、リン、カルシウム、アミノ酸及びエネルギーの消化率を向上させることができ、且つ無機リン排出が環境に及ぼす悪影響を減じることができる。
フィチン酸塩は、穀類及びマメ科植物におけるリンの主要貯蔵形態である。しかしながら、ブタ、家禽類及び魚等の単胃動物は、それらの食物中のフィチン酸塩（又はフィチン酸）を効率的に代謝又は吸収することができないため、従って排泄され、強力な家畜生産の領域においてリン汚染をもたらす。更に、フィチン酸は、カルシウム、銅及び亜鉛等の金属物質をキレート化し、消化管の様々な区間においてタンパク質及びアミノ酸との不溶性錯体を形成することにより、単胃動物における栄養阻害剤としても作用する。
長年にわたり、非反芻動物には内因性フィターゼが欠如しており、従ってフィチン酸塩を利用できないと想定されてきた。しかしながら、内因性粘膜ホスファターゼ及び細菌性フィターゼは、家禽類の小腸及び盲腸において活性を有することが記載されている。Ｍａｅｎｚ，Ｄ．Ｄ．；Ｃｌａｓｓｅｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｐｈｙｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ．Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ １９９８，７７，５５７－６３． Ａｂｕｄａｂｏｓ，Ａ．Ｍ．，Ｐｈｙｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｈｙｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌａｙｉｎｇ ｈｅｎｓ．Ｉｔａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，１１，ｅ８． Ｚｅｌｌｅｒ，Ｅ．；Ｓｃｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｋｕｈｎ，Ｉ．；Ｒｏｄｅｈｕｔｓｃｏｒｄ，Ｍ．これらの動物の成長及び健康のために十分なホスファターゼを提供するために、その飼料に無機リン酸塩が添加される。そのような添加は、費用がかさむ可能性があり、更に汚染の問題を増加させる。
フィターゼの作用を通して、フィチン酸塩は、一般に加水分解され、低級イノシトールリン酸塩及び無機リン酸塩を生じさせる。フィターゼは、動物飼料への添加物として有用であり、その場合、フィターゼは、動物の有機リン利用可能率を向上させ、環境のリン汚染を減少させる（Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ Ｒ Ｊ，Ｕｌｌａｈ Ａ Ｈ．Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：２６３－３０２（１９９６））。
多数の真菌（Ｗｙｓｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（２），３６７－３７３（１９９９）；Ｂｅｒｋａ Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（１１），４４２３－４４２７（１９９８）；Ｌａｓｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（１０），４７０１－４７０７（２００１））及び細菌（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３（１），１０７－１１３（１９９３）；Ｋｅｒｏｖｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（６），２０７９－２０８５（１９９８）；Ｋｉｍ Ｈ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５，１２３１－１２３４（２００３）；Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４１（２），２０１－２０６（１９９７）；Ｙｏｏｎ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４４９－４５４（１９９６）；Ｚｉｎｉｎ Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３６，２８３－２９０（２００４））起源のフィターゼが文献に記載されている。
２０１１年１１月８日にＭｉａｓｎｉｋｏｖらに交付された米国特許第８，０５３，２２１号明細書は、野生型（親）酵素と比較して改良された特徴を備えるように選択及び／又は遺伝子操作された、細菌のブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）及びその変異体／改変形態に由来するフィターゼに関する。
２０００年８月２９日にＳｈｏｒｔに交付された米国特許第６，１１０，７１９号明細書及び２００１年２月６日にＳｈｏｒｔらに交付された同第６，１８３，７４０号明細書は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂに由来するフィターゼ酵素に関する。
２０１６年６月４日にＳｊｏｅｈｏｌｍらに交付された米国特許第９，３６５，８４０号明細書は、フィターゼ活性を有するポリペプチドに関する。
２０１１年６月２６日にＬａｓｓｅｎらに交付された米国特許第８，２０６，９６２号明細書及び２０１３年８月１３日にＬａｓｓｅｎらに交付された同第８，５０７，２４０号明細書は、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）フィターゼ変異体に関する。
２０１３年１０月１５日にＨａｅｆｎｅｒらに交付された米国特許第８，５５７，５５２号明細書は、合成フィターゼ変異体に関する。
２０１５年１月２９日の国際公開日を有する国際公開第２０１５／０１２８９０号パンフレットは、フィターゼ活性を有するポリペプチドに関する。
最近の１０年間にわたって新世代のフィターゼが開発されてきた。しかしながら、これらのフィターゼの何れも、コンディショニング及びペレット化前の液体形態の試料に適用された場合、商業的に重要な飼料ペレット化条件下で高レベルのストレスに抵抗するために好適なロバスト性を有していない。従って、商業的ペレット化のために好適である、市販されている熱安定性フィターゼ製品は、乾燥製品であり、多くは、活性を保持するために保護コーティングを有する。しかしながら、液体形態のフィターゼの試料への適用が望ましく、それは、例えば、液体形態で添加されたフィターゼは、飼料を経由して送達されると、動物の体内で均一に分布され、直ちに放出されるからである。しかし、依然として、そのようなフィターゼ及びその断片は、商業的に重要な条件下でコンディショニング及びペレット化前に液体形態で適用された場合にロバストであり、動物の性能を向上させることができる必要がある。
第１実施形態では、配列番号１に規定されたアミノ酸配列と少なくとも８２％の配列同一性を有する、フィターゼ活性を含む改変フィターゼポリペプチド（生合成細菌性６－フィターゼ等）又はその断片が開示される。
第２実施形態では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列が、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片について表１１に規定された少なくとも１２００の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スコアを有する、実施形態１の改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
第３実施形態では、配列番号１に規定されたアミノ酸配列に対応するアミノ酸１４～３２５位と少なくとも７８％の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片が開示される。
第４実施形態では、実施例５に記載される標準的飼中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約５０％の飼料中ペレット化回収率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片（実施形態１、２又は３の改変フィターゼポリペプチド又はその断片等）が開示される。
第５実施形態では、実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約０．７の飼中ペレット化回収率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片（実施形態１、２、３又は４の改変フィターゼポリペプチド又はその断片等）が開示される。
第６実施形態では、前記ポリペプチド又はその断片が、実施例３に記載される示差走査熱量測定アッセイ条件下において、少なくとも約９２．５℃のＴｍ温度を含む、実施形態１、２、３、４又は５の改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
第７実施形態では、前記ポリペプチド又はその断片が、実施例３に記載されるアッセイ条件下において、ｐＨ３．５で少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの比活性を含む、実施形態６の改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
第８実施形態では、ａ）前記フィターゼポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか；又はｂ）前記フィターゼポリペプチドが、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１、２、３、４、５、６又は７の改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
第９実施形態では、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックスが開示され、ここで、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、（ｉ）単独で、又は（ｉｉ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌、若しくは（ｉｉｉ）少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｉｖ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌及び少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｖ）少なくとも１種の他の飼料添加成分を更に含む（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）の何れかで使用され得、及び任意選択的に、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、少なくとも約０．１ｇ／トン飼料の量で存在する。
第１０実施形態では、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された生成宿主において機能的である調節配列を含む組み換え構築物が開示される。
第１１実施形態では、生成宿主は、細菌、真菌、酵母、植物及び藻類からなる群から選択される。
第１２実施形態では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片を生成するための方法であって、
（ａ）生成宿主を実施形態９の組み換え構築物で形質転換させる工程；及び
（ｂ）改変フィターゼポリペプチド又はその断片が生成される条件下で工程（ａ）の生成宿主を培養する工程
を含む方法が開示される。
第１３実施形態では、第１０実施形態の方法によって作製された改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、任意選択的に、生成宿主から回収される。
第１４実施形態では、第１０又は１１実施形態の方法によって得られるフィターゼ含有培養上清が開示される。
第１５実施形態では、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列が開示される。
第１６実施形態では、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための乾燥酵素組成物が記載される。
第１７実施形態では、顆粒状飼料添加組成物である、実施形態１５の乾燥酵素組成物が開示される。
第１８実施形態では、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための液体酵素組成物が記載される。
第１９実施形態では、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼ又はその断片が動物飼料に添加される、動物飼料の栄養価値を向上させるための方法が記載される。
第２０実施形態では、有効量の、実施形態１、２、３、４、５、６、７若しくは８の改変フィターゼポリペプチド又は実施形態９若しくは１０の動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物若しくはプレミックスを動物に投与する工程を含む、１つ以上の評価指数上の動物の性能を向上させるための方法が開示される。
第２１実施形態では、１つ以上の評価指数が、増加した飼料効率、上昇した体重増加、減少した飼料要求率、飼料中の栄養素又はエネルギーの向上した消化率、向上した窒素保持率、壊疽性腸炎の悪影響を回避する向上した能力及び向上した免疫応答からなる群から選択される、実施形態２０の方法が開示される。
第２２実施形態では、動物が、ブタ及び家禽類からなる群から選択される単胃動物である、実施形態２０又は２１の方法が開示される。
第２３実施形態では、ブタが、子ブタ、育成ブタ及び雌ブタからなる群から選択される、実施形態２２の方法が開示される。
第２４実施形態では、家禽類が、七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏、ガチョウ、キジ、ウズラ及びエミューからなる群から選択される、実施形態２２の方法が開示される。
第２５実施形態では、動物が、畜牛、若い子ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、野牛、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、トナカイ、カリブー、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン及びニルガイからなる群から選択される反芻動物である、実施形態２０又は２１の方法が開示される。
（パネルＡ～１ＢＢ）高Ｔｍフィターゼ分岐群のポリペプチド配列に沿った各位置についてのＨＭＭ確率スコアを示す。ＨＭＭについてのコンポジットスコア（ＣＯＭＰ）は、図１Ａの上の３枚のパネルにボールド体で示した。各アミノ酸についての位置（Ｐ）及びコンセンサス（Ｃ）は、第１列のＰ／Ｃの下に示した。 アミノ酸配列における類似性及び相違に基づいて、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド及びその断片を含む様々なフィターゼ間の同系性を示す系統樹を示す。 近縁種であるハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）６－フィターゼについて公表され、リボン図として示された結晶構造を用いてモデリングされた代表的なＴｍ－分岐群フィターゼの三次元構造を示す。
下記の配列は、連邦規則法典第３７巻§§１．８２１～１．８２５（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含有する特許出願のための要件 － 配列規則」）を順守しており、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）、欧州特許条約及び特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２及び４９．５（ａ－ｂｉｓ）並びに実施細則の第２０８章及び附属書Ｃの配列表要件と一致している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データのために使用した記号及びフォーマットは、連邦規則法典第３７巻§１．８２２に規定された規則を順守している。
配列番号１は、改変フィターゼＰＨＹ－１３５９４の予測成熟配列に対応する。
配列番号２は、改変フィターゼＰＨＹ－１０９３１の予測成熟配列に対応する。
配列番号３は、改変フィターゼＰＨＹ－１０９５７の予測成熟配列に対応する。
配列番号４は、改変フィターゼＰＨＹ－１１５６９の予測成熟配列に対応する。
配列番号５は、改変フィターゼＰＨＹ－１１６５８の予測成熟配列に対応する。
配列番号６は、改変フィターゼＰＨＹ－１１６７３の予測成熟配列に対応する。
配列番号７は、改変フィターゼＰＨＹ－１１６８０の予測成熟配列に対応する。
配列番号８は、改変フィターゼＰＨＹ－１１８９５の予測成熟配列に対応する。
配列番号９は、改変フィターゼＰＨＹ－１１９３２の予測成熟配列に対応する。
配列番号１０は、改変フィターゼＰＨＹ－１２０５８の予測成熟配列に対応する。
配列番号１１は、改変フィターゼＰＨＹ－１２６６３の予測成熟配列に対応する。
配列番号１２は、改変フィターゼＰＨＹ－１２７８４の予測成熟配列に対応する。
配列番号１３は、改変フィターゼＰＨＹ－１３１７７の予測成熟配列に対応する。
配列番号１４は、改変フィターゼＰＨＹ－１３３７１の予測成熟配列に対応する。
配列番号１５は、改変フィターゼＰＨＹ－１３４６０の予測成熟配列に対応する。
配列番号１６は、改変フィターゼＰＨＹ－１３５１３の予測成熟配列に対応する。
配列番号１７は、改変フィターゼＰＨＹ－１３６３７の予測成熟配列に対応する。
配列番号１８は、改変フィターゼＰＨＹ－１３７０５の予測成熟配列に対応する。
配列番号１９は、改変フィターゼＰＨＹ－１３７１３の予測成熟配列に対応する。
配列番号２０は、改変フィターゼＰＨＹ－１３７４７の予測成熟配列に対応する。
配列番号２１は、改変フィターゼＰＨＹ－１３７７９の予測成熟配列に対応する。
配列番号２２は、改変フィターゼＰＨＹ－１３７８９の予測成熟配列に対応する。
配列番号２３は、改変フィターゼＰＨＹ－１３７９８の予測成熟配列に対応する。
配列番号２４は、改変フィターゼＰＨＹ－１３８６８の予測成熟配列に対応する。
配列番号２５は、改変フィターゼＰＨＹ－１３８８３の予測成熟配列に対応する。
配列番号２６は、改変フィターゼＰＨＹ－１３８８５の予測成熟配列に対応する。
配列番号２７は、改変フィターゼＰＨＹ－１３９３６の予測成熟配列に対応する。
配列番号２８は、改変フィターゼＰＨＹ－１４００４の予測成熟配列に対応する。
配列番号２９は、改変フィターゼＰＨＹ－１４２１５の予測成熟配列に対応する。
配列番号３０は、改変フィターゼＰＨＹ－１４２５６の予測成熟配列に対応する。
配列番号３１は、改変フィターゼＰＨＹ－１４２７７の予測成熟配列に対応する。
配列番号３２は、改変フィターゼＰＨＹ－１４４７３の予測成熟配列に対応する。
配列番号３３は、改変フィターゼＰＨＹ－１４６１４の予測成熟配列に対応する。
配列番号３４は、改変フィターゼＰＨＹ－１４８０４の予測成熟配列に対応する。
配列番号３５は、改変フィターゼＰＨＹ－１４９４５の予測成熟配列に対応する。
配列番号３６は、改変フィターゼＰＨＹ－１５４５９の予測成熟配列に対応する。
配列番号３７は、改変フィターゼＰＨＹ－１６５１３の予測成熟配列に対応する。
配列番号３８は、ブティアウクセラ・ノアキアエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｎｏａｃｋｉａｅ）ＷＰ０６４５５５３４３．１に対応する。
配列番号３９は、シトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ）ＡＡＳ４５８８４．１に対応する。
配列番号４０は、コクシエラ・バクテリウム（Ｃｏｘｉｅｌｌａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＤＨ４０４６５．１に対応する。
配列番号４１は、腸内細菌科細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ＷＰ０９４３３７２７８．１に対応する。
配列番号４２は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＷＰ００１２９７１１２に対応する。
配列番号４３は、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）ＷＰ０７２３０７４５６．１に対応する。
配列番号４４は、ロウキシエラ・バーデンシス（Ｒｏｕｘｉｅｌｌａ ｂａｄｅｎｓｉｓ）ＷＰ０８４９１２８７１．１に対応する。
配列番号４５は、セラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）ＷＰ００９６３６９８１．１に対応する。
配列番号４６は、エルシニア・アルドベ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｌｄｏｖａｅ）ＷＰ００４７０１０２６．１に対応する。
配列番号４７は、エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）ＷＰ０５０１４０７９０．１に対応する。
配列番号４８は、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）ＷＰ００４３９２１０２．１に対応する。
配列番号４９は、エルシニア・モラレッティイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ）ＷＰ０４９６４６７２３．１に対応する。
配列番号５０は、エルシニア・ローデイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｏｈｄｅｉ）ＷＰ０５０５３９９４７．１に対応する。
配列番号５１は、欧州特許第３２２２７１号明細書に記載の配列番号３に対応する。
配列番号５２は、米国特許第８１０１３９１号明細書に記載の配列番号２に対応する。
配列番号５３は、米国特許第８１０１３９１号明細書に記載の配列番号４に対応する。
配列番号５４は、米国特許第８１０１３９１号明細書に記載の配列番号３５に対応する。
配列番号５５は、米国特許第８１０１３９１号明細書に記載の配列番号４９に対応する。
配列番号５６は、米国特許第８１４３０４６号明細書に記載の配列番号１に対応する。
配列番号５７は、米国特許第８１４３０４６号明細書に記載の配列番号３に対応する。
配列番号５８は、米国特許第８４６０６５６号明細書に記載の配列番号２に対応する。
配列番号５９は、米国特許第８５５７５５５号明細書に記載の配列番号１３に対応する。
配列番号６０は、米国特許第８５５７５５５号明細書に記載の配列番号２４に対応する。
配列番号６１は、米国特許第２０１６００８３７００号明細書に記載の配列番号３に対応する。
配列番号６２は、国際公開第２０１００３４８３５－０００２号パンフレットに記載の配列番号１に対応する。
配列番号６３は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼシグナル配列に対応する。
配列番号６４は、改変フィターゼＰＨＹ－１６８１２の予測成熟配列に対応する。
配列番号６５は、改変フィターゼＰＨＹ－１７４０３の予測成熟配列に対応する。
配列番号６６は、改変フィターゼＰＨＹ－１７３３６の予測成熟配列に対応する。
配列番号６７は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２２５の予測成熟配列に対応する。
配列番号６８は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１８６の予測成熟配列に対応する。
配列番号６９は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１９５の予測成熟配列に対応する。
配列番号７０は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１２４の予測成熟配列に対応する。
配列番号７１は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１８９の予測成熟配列に対応する。
配列番号７２は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２１８の予測成熟配列に対応する。
配列番号７３は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２１９の予測成熟配列に対応する。
配列番号７４は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２０４の予測成熟配列に対応する。
配列番号７５は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２１５の予測成熟配列に対応する。
配列番号７６は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２０１の予測成熟配列に対応する。
配列番号７７は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２０５の予測成熟配列に対応する。
配列番号７８は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２２４の予測成熟配列に対応する。
配列番号７９は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２００の予測成熟配列に対応する。
配列番号８０は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１９８の予測成熟配列に対応する。
配列番号８１は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１９９の予測成熟配列に対応する。
配列番号８２は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２１４の予測成熟配列に対応する。
配列番号８３は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１９７の予測成熟配列に対応する。
配列番号８４は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２２８の予測成熟配列に対応する。
配列番号８５は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２２９の予測成熟配列に対応する。
配列番号８６は、改変フィターゼＰＨＹ－１７１５２の予測成熟配列に対応する。
配列番号８７は、改変フィターゼＰＨＹ－１７２０６の予測成熟配列に対応する。
配列番号８８は、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ＮＣＩＭＢ４１２４８のＮ末端に対応する。
配列番号８９は、Ｃ．ブラアキイ（Ｃ．ｂｒａａｋｉｉ）ＡＡＳ４５８８４のＮ末端に対応する。
配列番号９０は、Ｅ．タルダ（Ｅ．ｔａｒｄａ）ＹＰ００７６２８７２７のＮ末端に対応する。
配列番号９１は、ＰＨＹ－１３５９４のＮ末端に対応する。
配列番号９２は、ＰＨＹ－１３７８９のＮ末端に対応する。
配列番号９３は、ＰＨＹ－１３８８５のＮ末端に対応する。
配列番号９４は、国際公開第２０１００３４８３５－０００２号パンフレットに記載の配列番号１のＣ末端に対応する。
配列番号９５は、Ｙ．モラレッティイ（Ｙ．ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ）ＷＰ０３２８１３０４５のＣ末端に対応する。
配列番号９６は、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ＮＣＩＭＢ ４１２４８のＣ末端に対応する。
配列番号９７は、ＰＨＹ－１３５９４のＣ末端に対応する。
配列番号９８は、ＰＨＹ－１３７８９のＣ末端に対応する。
配列番号９９は、ＰＨＹ－１３８８５のＣ末端に対応する。
配列番号１００は、ＰＨＹ－１３５９４のコア領域に対応する。
配列番号１０１は、ＰＨＹ－１３７８９のコア領域に対応する。
配列番号１０２は、ＰＨＹ－１３８８５のコア領域に対応する。
配列番号１０３は、ＰＨＹ－１６８１２のコア領域に対応する。
配列番号１０４は、米国特許第７０８１５６３号明細書に記載の配列番号４に対応する。
本明細書で引用する全ての特許、特許出願及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示では、多くの用語及び略語が使用される。特に明記しない限り、以下の定義が適用される。
本明細書では、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。例えば、用語１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その」、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用され得る。
用語「及び／又は」及び「又は」は、本明細書では互換的に使用され、他のものを伴う又は伴わない２つの特定の特徴又は成分の各々の特定の開示に関する。従って、本明細書の「Ａ及び／又はＢ」等の語句において使用される用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」等の語句において使用される用語「及び／又は」は、下記の態様：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を含むことが意図されている。
単数形を使用する用語には、複数形が含まれ、その逆も同様である。
用語「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有する」及びそれらの活用形は、互換的に使用され、「含むが、限定されない」ことを意味する。言語「含んでいる」を用いて本明細書にいかなる態様が記載されていても、用語「～からなる」及び／又は「本質的に～からなる」の用語で記載される他の点で類似の態様も提供されていると理解される。
用語「～からなる」は、「含むが、限定されない」ことを意味する。
用語「本質的に～からなる」は、組成物の特定の物質若しくは方法の特定の工程及び物質又は方法の基本的特徴に著しく影響を及ぼさないそれらの追加の物質又は工程を意味する。
本出願を通して、様々な実施形態は、範囲フォーマットで提示され得る。範囲フォーマットでの説明は、単に便宜性及び簡潔性のためであり、本明細書に記載される実施形態の範囲に関する柔軟性のない限定であると見なすべきではないことが理解されるべきである。従って、範囲に関する説明は、詳細に開示した全ての可能性のある部分範囲及びその範囲内の個別の数値を有すると見なすべきである。例えば、例えば１～６の範囲についての説明は、１～２、１～３、１～４及び１～５、２～３、２～４、２～５、２～６、３～４、３～５、３～６等の詳細に開示された部分範囲並びにその範囲内の例えば１、２、３、４、５及び６等の個々の数字を有すると見なすべきである。これは、その範囲の幅とは無関係に当てはまる。
本明細書で使用する用語「約」は、数値又は範囲における変動度、例えば表示値又は範囲の表示限度の１０％以内、５％以内又は１％以内を許容し得る。
用語「フィターゼ」（ミオ－イノシトール６リン酸ホスホヒドロラーゼ）は、フィチン酸の加水分解を触媒する、穀類及び脂肪種子中で見出されるリンの難消化性有機系 － 及び無機リンの使用可能形を遊離する、ホスファターゼ酵素（ミオ－イノシトール６リン酸若しくはＩＰ６）のクラスを意味する。
用語「動物」及び「対象」は、本明細書では互換的に使用され、動物界に属するあらゆる生物を指し、限定なく、哺乳類（ヒトを除く）、非ヒト動物、家庭内動物、家畜、農耕動物、動物園の動物、種畜等が挙げられる。例えば、全ての非反芻動物及び反芻動物を挙げることができる。一実施形態では、動物は、非反芻動物、即ち単胃動物である。単胃動物の例としては、下記：子ブタ、育成ブタ、雌ブタ等のブタ（ｐｉｇ）及びブタ（ｓｗｉｎｅ）；七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏等の家禽類；サケ、マス、ティラピア、ナマズ及びコイ等の魚；並びにエビ及びクルマエビ等の甲殻類が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、動物は、ウシ、幼ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン及びニルガイを含むが、それらに限定されない反芻動物である。
単系統群としても公知である用語「分岐群」は、共通の祖先及び全てのその直系の子孫を有する１つの生物又は関連配列の群を指す。
用語「Ｔｍ」は、タンパク質が変性するか、又は非変性及び変性状態の遊離エネルギーが等しく、集団の半分が非変性であり、残り半分が変性している温度である。酵素の熱変性挙動は、典型的には熱量測定法又は円二色性法、蛍光法若しくは光散乱法等の光学技術を用いて調査される。
用語「高Ｔｍフィターゼ分岐群」は、下記の実施例３において記載する示差走査熱量測定法を用いて、少なくとも９２．５℃のＴｍを有するフィターゼポリペプチド又はその断片の分岐群を指す。用語「高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド」及び「改変フィターゼポリペプチド又はその断片」は、本明細書では互換的に使用される。
用語「ミキサー液適用」及び「ＭＬＡ」は、本明細書では互換的に使用され、動物飼料製造に関し、ここで、熱感受性化合物、詳細には酵素は、コンディショニング及びペレット化前に動物飼料に液体形態で適用することができ、コンディショニング及びペレット化後の飼料中で機能的なままであり得る。
「飼料」は、非ヒト動物によって食べられ、摂取され、消化されることが意図されているか又はそうされることに適したあらゆる天然若しくは人工の常用飼料、食餌又はそのような食餌の成分を意味する。好ましくは、用語「飼料」は、家畜の飼育において動物に給与される製品に関して使用される。用語「飼料」及び「動物飼料」は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用する用語「飼料添加物」は、（例えば、食品（例えば、動物飼料）の品質を向上させるため、動物の性能及び／又は健康を向上させるため且つ／又は食品又は食品内の物質の消化率を増強するために、動物の栄養素中において単独で又は一緒に使用される１種以上の成分、物質（例えば、細胞）の生成物を指す。
本明細書で使用する用語「食品」は、広義で使用され、ヒトのための食品及び食製品並びに非ヒト動物のための食品（即ち飼料）を包含する。
食品は、用途、及び／又は適用方法、及び／又は投与方法に応じて、溶液の形態であるか又は固体としてのものであり得る。幾つかの実施形態では、本明細書で言及する酵素は、食品若しくは飼料物質として又は食品若しくは飼料物質の調製若しくは生産において使用され得る。
本明細書で使用する用語「食品成分又は飼料成分」には、食品又は食材に添加されるか又は添加され得る処方物が含まれ、また広範な種々の製品に低レベルで使用され得る処方物が含まれる。この食品成分は、用途、及び／又は利用方法、及び／又は投与方法に応じて、溶液の形態であるか又は固体であり得る。本明細書で記載する酵素は、食品成分若しくは飼料成分として又は調製若しくは製造において使用され得る。酵素は、栄養補助食品であるか又は栄養補助食品に添加され得る。単胃動物のための飼料組成物としては、典型的には、フィチン酸塩を含有する植物製品を含む組成物が挙げられる。そのような組成物としては、コーンミール、大豆ミール、菜種ミール、綿実ミール、トウモロコシ、小麦、大麦及びモロコシをベースとする飼料が挙げられる。
本明細書で使用する用語「ペレット化」は、固体、円形、球形及び円筒形タブレット、特に飼料ペレット及び固形の押出し成形動物飼料であり得るペレットの製造を指す。公知の飼料のペレット化製造プロセスの１つの例は、一般に、食品成分又は飼料成分と室温で少なくとも１分間一緒に混合する工程、混合物をサージビンに移送する工程、この混合物を蒸気コンディショナー（即ちコンディショニング）に搬送する工程、任意選択的に蒸気コンディショニングされた混合物をエキスパンダーに移す工程、この混合物をペレットミル又は押出機に移送する工程及び最後にペレットをペレットクーラーに移送する工程を含む。（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．１９９４．Ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ Ｃｏｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ．Ｉｎ Ｆｅｅｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＶ．（ＭｃＥｌｌｈｉｎｅｙ，ｅｄｉｔｏｒ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖａ．，ｐｐ．１１０－１３９）。
用語「ペレット」は、蒸気処理（即ちコンディショニング）等の熱処理及び機械を通したプレス又は押出しを受けている動物飼料の組成物（通常、穀類に由来する）を指す。ペレットは、液体調製物又は乾燥調製物の形態の酵素を組み込むことができる。乾燥調製物は、コーティングされていてもいなくてもよく、顆粒の形態であり得る。用語「顆粒」は、酵素（フィターゼ等、例えば本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチドの何れか）及び他の化学物質、例えば塩類及び糖類であり得、層状顆粒を形成するための流動床アプローチを含む様々な技術の何れかを用いて形成され得る。
本明細書で使用する用語「飼料中ペレット化回収率」、「回収活性率」又は「活性回収率」は、（ｉ）下記のストレス要因：加熱、高圧、高ｐＨ、低ｐＨ、貯蔵、乾燥、界面活性剤への曝露、溶媒への曝露及び機械的ストレスの１つ以上を含む処理後の飼料用酵素の活性と、（ｉｉ）処理前の酵素の活性との比率を指す。活性回収率は、パーセンテージとして表すことができる。活性回収率（％）は、下記のように計算する。
Figure 2022513085000002
フィターゼは、「試料中ペレット化回収率」「回収活性率」、「熱安定性」又は「不活性可逆性」の何れかの向上を示すことによって安定性を示すことができる。
ペレット化実験に関連して、「処理前活性」は、処理を受けるフィターゼに他の点では適応する方法において、処理を受けていないマッシュ中に存在するフィターゼ活性を測定することによって概算することができる。例えば、非処理マッシュ中のフィターゼは、可能性のある相互作用又はそれ自体が指定された処理の外側の他の作用について制御するために、処理マッシュ中のフィターゼと類似の時間にわたり且つ類所の条件下で取り扱われ、貯蔵される。
用語「飼料中ペレット化回収率試験」及び「標準飼料中ペレット化試験」は、本明細書では互換的に使用され、コンディショニング及びペレット化の熱処理に抵抗するための飼料用酵素の安定性を測定又は評価するための試験を指す。
例えば、そのような飼料中ペレット化回収率試験は、下記の実施例５に規定されている。
固体又は液体調製物中での決定に関連する用語フィターゼ活性は、ＩＳＯ２００９フィターゼアッセイ － 国際規格ＩＳＯ／ＤＩＳ ３００２４：１－１７，２００９に見出される、フィターゼ活性を決定するための標準アッセイでも規定されている、３７℃でｐＨ５．５での反応条件下で１分間中の、５．０ｍＭのフィチン酸ナトリウム基質（イネ由来）からの１μモル（マイクロモル）の無機オルトリン酸塩を遊離させるために必要とされる酵素の量１ＦＴＵ（フィターゼ単位）であると規定されている。
代わりに、本明細書で使用する１単位のフィターゼ（Ｕ）は、それぞれ実施例３において例示したマラカイトグリーンアッセイにおいて２５℃、ｐＨ５．５又は３．５の反応条件下で１分間中の、０．２ｍＭのフィチン酸ナトリウム基質（イネ由来）から１マイクロモルの無機オルトリン酸塩を遊離する酵素の量であると規定され得る。
本明細書で使用する用語「比活性」は、１ｍＬ当たりの酵素単位を単位ｍｇ／ｍＬの（全）タンパク質濃度で割った数である。このため、比活性値は、通常、単位／ｍｇとして引用される。代わりに、比活性は、１ｍＬ当たりの酵素単位を、単位がｍｇ／ｍＬであるフィターゼの濃度で割った数である。
本明細書で使用する用語「示差走査熱量測定法」又は「ＤＳＣ」は、試料及び参照物質の温度を増加させるために必要とされる熱量の差が温度の関数として測定される、熱分析技術である。試料及び標準物質は、両方が実験を通してほぼ同一温度で維持される。一般に、ＤＳＣ分析のための温度プログラムは、試料保持器温度が時間の関数として直線的に上昇するように設計されている。参照試料は、走査対象の温度範囲にわたって明確に規定された熱容量を有していなければならない。
用語「プレバイオティクス」は、１つ又は限られた数の有益な細菌の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することにより、宿主に有益な影響を及ぼす非消化性食品成分を意味する。
本明細書で使用する用語「直接給与生菌」（「ＤＦＭ」）は、十分な数で適用された場合、そのレシピエントに利益を付与できる生きた（生存性）微生物、即ちプレバイオティクスの起源である。ＤＦＭは、細菌株等のそのような微生物の１種以上を含み得る。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸菌及び酵母が含まれる。そのため、用語ＤＦＭは、下記：直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与酵母又はそれらの組み合わせの１種以上を包含する。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、胞子を形成する独特のグラム陽性桿菌である。これらの胞子は、極めて安定性であり、熱、水分及びｐＨ範囲等の環境条件に耐えることができる。これらの胞子は、動物によって摂取されると活性な栄養細胞に発芽し、ミール及びペレット化飼料で使用され得る。乳酸菌は、病原体に対して拮抗性である乳酸を生成するグラム陽性球菌である。乳酸菌は、やや熱に弱いと思われるため、それらは、ペレット化飼料で使用されない。乳酸菌の種類には、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。
用語「プロバイオティクス」、「プロバイオティクス培養物」及び「ＤＦＭ」は、本明細書では互換的に使用され、例えば十分な数で摂取されるか、又は局所的に塗布された場合、宿主生物に有益な影響を与える、即ち宿主生物に健康、消化性及び／又は性能の利益等の１つ以上の明白な健康上の利益を与えることによって有益な影響を与える生きた微生物（例えば、細菌又は酵母を含む）を定義する。プロバイオティクスは、１つ以上の粘膜表面での微生物バランスを向上させ得る。例えば、この粘膜表面は、腸、尿路、気道又は皮膚であり得る。本明細書で使用する用語「プロバイオティクス」は、免疫系の有益な分岐を刺激することができ、同時に粘膜表面、例えば腸の炎症反応を減少させることができる生きた微生物を包含する。プロバイオティクス摂取に関して、下限も上限も存在しないが、１日量として少なくとも１０６～１０１２、好ましくは少なくとも１０６～１０１０、好ましくは１０８～１０９ｃｆｕが、対象において有益な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。
本明細書で使用する用語「ＣＦＵ」は、「コロニー形成単位」を意味し、コロニーが単一の前駆細胞に由来する細胞の凝集体を表す生存細胞の尺度である。
用語「単離された」は、自然に発生せず、且つ単離体が精製されている程度を反映しないが、天然形態又は天然環境からの単離又は分離を意味する形態又は環境中の物質を意味する。単離物質の非限定的な例には、（１）天然に存在しない物質、（２）天然にそれが結び付いている天然に存在する成分の１つ以上又は全部から少なくとも部分的に除去されている物質、例えば、限定されないが、宿主細胞、改変酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子；（３）天然に見出される物質に対してヒトの手によって改変されている物質；又は（４）天然にそれが結び付いている他の成分に対して、その物質の量を増加させることによって改変されている物質が含まれる。用語「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」及び「単離核酸断片」は、互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖の、任意選択的に合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基であるＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡのポリマー形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
用語「精製する」、「精製された」及び精製は、望ましくない成分、物質汚染、混合又は不完全から実質的に純粋又は清潔にさせることを意味する。例えば、核酸又はポリペプチドに適用される精製は、一般に、当技術分野においてよく知られた分析技術によって決定された他の成分を実質的に含まない核酸又はポリペプチドを示す（例えば、精製されたポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液及び／又は密度勾配遠心分離法に供された媒体において個別のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されて」いる。精製核酸又はポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％（例えば、モルベースでの重量パーセント）以上純粋である。これに関連して、組成物は、精製又は濃縮手法の適用後、ある分子の濃度が実質的に増加している場合、その分子について濃縮されている。用語「濃縮された」は、組成物中に化合物、ポリペプチド、細胞、核酸又は他の特定の材料若しくは成分が出発組成物より高い相対濃度又は絶対濃度で存在することを意味する。
用語「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。アミノ酸に対して、本開示全体を通して、生物学的命名法に関するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ連合委員会に準拠して定義された１文字又は３文字コードを使用する。１文字のＸは、２０種のアミノ酸の何れかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によってコードできることも理解される。変異は、親アミノ酸の一文字コード、続いて位置番号、その後、変異アミノ酸の１文字コードによって名付けることができる。例えば、８７位でのグリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表示される。改変を記載する場合、位置の後に括弧内に列挙されたアミノ酸が続く場合、列挙したアミノ酸の何れかによるその位置での置換のリストを示している。例えば、６（Ｌ，Ｉ）は、６位をロイシン又はイソロイシンで置換できることを意味する。ときに、１つの配列内において、置換を定義するためにスラッシュ（／）を使用し、例えば、Ｆ／Ｖは、特定の位置がその位置でフェニルアラニン又はバリンを有する可能性があることを示す。
用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟形態若しくは前駆体形態の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、一般的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮＲ末端に位置する。シグナル配列は、内因性又は外来性であり得る。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質に存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「成熟」形態という用語は、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を含まないタンパク質、ポリペプチド又は酵素の機能的形態を指す。
アミノ酸配列又は核酸配列に関連した用語「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配列が天然又は天然型配列であることを示す。本明細書において使用する用語「天然型」は、自然に見出される何れかのもの（例えば、タンパク質、アミノ酸又は核酸配列）を指す。逆に、用語「天然に存在しない」は、天然に見出されないもの（例えば、実験室で産生されたか又は野生型配列の改変で産生された組み換え核酸及びタンパク質配列）を指す。
アミノ酸残基の位置に関連して本明細書において使用する「～に対応している」、又は「～に対応する」、又は「対応する」は、タンパク質若しくはペプチド中の列挙された位置におけるアミノ酸残基又はタンパク質若しくはペプチド中の列挙された残基と類似の、相同の又は均等なアミノ酸残基を指す。本明細書で使用する「～に対応する領域」は、一般に、関連タンパク質又は参照タンパク質における類似の位置を指す。
「～に由来する」及び「～から得られる」という用語は、対象の生物の株によって産生されるか又は産生できるタンパク質だけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、そのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で産生されるタンパク質も指す。更に、この用語は、合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、対象のタンパク質を同定できる特性を有するタンパク質を指す。
用語「アミノ酸」は、タンパク質又はポリペプチドの基本的化学構造単位を意味する。特定のアミノ酸を同定するために本明細書で使用する略語は、表１に見出すことができる。
Figure 2022513085000003
当業者であれば、本明細書に開示したアミノ酸配列が、開示したアミノ酸配列に関連する機能を保持しながら修飾できることを認識するであろう。例えば、所定の部位で化学的に均等なアミノ酸の生成を生じさせるが、コードされたタンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない遺伝子の改変が一般的であることは、当技術分野で周知である。
用語「コドン最適化」は、様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子又はコーディング領域を意味するため、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変化させずに宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための核酸分子の遺伝子又はコーディング領域内のコドンの変化を意味する。
用語「遺伝子」は、コーディング配列に先行する調節配列（５’非コーディング配列）及び後続する配列（３’非コーディング配列）を含む、特異タンパク質を発現する核酸分子を意味する。「天然遺伝子」は、自己の調節配列と共に自然で見出される遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではない、自然に一緒に見出されることのない調節配列及びコーディング配列を含む任意の遺伝子を意味する。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列及びコーディング配列を含む可能性があるか、又は同一起源に由来するが、自然に見出されるのと異なる方法で配列された調節配列及びコーディング配列を含む可能性がある。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム内でその自然の場所にある天然遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、宿主生物内で通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物中に導入されている遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非天然生物内に挿入された天然遺伝子又はキメラ遺伝子を含むことができる。「トランス遺伝子」は、形質転換手技によってゲノム内に導入されている遺伝子である。
用語「イントロン」は、最終ＲＮＡ産物の成熟中にＲＮＡスプライシングによって取り除かれる遺伝子内の任意のヌクレオチド配列を意味する。用語「イントロン」は、遺伝子内のＤＮＡ配列及びＲＮＡ転写産物内の対応する配列の両方を意味する。
用語「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を意味する。「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’－非コーディング配列）、コーディング配列内又はコーディング配列の下流（３’－非コーディング配列）に位置しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を含み得る。
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の機能によって影響されるような単一核酸配列上での核酸配列の会合を意味する。例えば、プロモーターは、そのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、即ちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合、コーディング配列と作動可能に連結している。コーディング配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結され得る。
用語「調節配列」又は「制御配列」は、本明細書では互換的に使用され、生物内の特異的遺伝子の発現を増加又は減少させることのできるヌクレオチド配列のセグメントを意味する。調節配列の例としては、プロモーター、シグナル配列、オペレーター等が挙げられるが、それらに限定されない。上述のように、調節配列は、目的のコーディング配列／遺伝子にセンス又はアンチセンス方向に作動可能に連結され得る。
「プロモーター」又は「プロモーター配列」は、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する調節配列を意味する。プロモーターは、誘導性プロモーター又は構成的プロモーターであり得る。本発明において使用される好ましいプロモーターは、誘導性プロモーターであるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１である。
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、例えば転写の終結などのｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする配列を含む。
本明細書で使用する用語「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への移動又は導入を指す。核酸分子は、ＤＮＡの直鎖形態又は環状形態として導入され得る。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであるか、又はそれは、産生宿主のゲノムに組み込まれ得る。形質転換核酸を含有する生成宿主は、「形質転換された」、若しくは「組み換え」、若しくは「トランスジェニック」生物又は「形質転換体」と呼ばれる。
用語「組み換え」及び「改変された」は、例えば、化学合成により、又は遺伝子工学手法による核酸の単離セグメントの操作により、本来であれば別々の核酸配列の２つのセグメントを人工的に組み合わせることを指す。例えば、１つ以上のセグメント又は遺伝子が、自然に又は実験室操作の何れかで、異なる分子から、同一分子の別の部分から又は人工的配列から挿入されているＤＮＡは、遺伝子に、次に生物に新たな配列の導入をもたらす。用語「組み換え」、「トランスジェニック」、「形質転換された」、「遺伝子操作された」又は「外来遺伝子発現のために改変された」は、本明細書では互換的に使用される。
用語「組み換え構築物」、「発現構築物」、「組み換え発現構築物」及び「発現カセット」は、本明細書では互換的に使用される。組み換え構築物は、天然に一緒に見出されるとは限らない、核酸断片、例えば調節配列及びコーディング配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、構築物は、異なる起源に由来する調節配列及びコーディング配列を含み得るか、又は同一起源に由来するが、天然に見出されるのと異なる方法で配列された調節配列及びコーディング配列を含み得る。そのような構築物は、それのみで使用され得るか又はベクターと共に使用され得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者によく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者であれば、宿主細胞を問題なく形質転換し、選択し、且つ繁殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝要素について熟知している。当業者であれば、様々な独立形質転換事象が様々なレベル及びパターンの発現を生じさせる可能性があること（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ４：２４１１－２４１８；ＤｅＡｌｍｅｄｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８－８６）、及び従って、多数の事象が、典型的には所望の発現レベル及びパターンを提示するラインを入手するためにスクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング、酵素若しくは活性分析及び／又は表現型分析を含む標準の分子生物学的、生化学的及び他の分析法により行われ得る。
用語「生成宿主」、「宿主」及び「宿主細胞」は、本明細書では互換的に使用され、組み換え構築物が遺伝子を発現するためにその中に安定性又は一過性で導入できる、ヒトであろうと非ヒトであろうと、任意の生物又はその細胞を意味する。この用語は、増殖中に発生する変異に起因して親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を含む。
「パーセント同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野では、「同一性」は、場合により、一連のそのような配列間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸の数により決定される、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」及び「類似性」は、限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）に記載された方法を含む、公知の方法によって容易に計算することができる。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に入手できるコンピュータープログラムにおいて成文化されている。
本明細書で使用する「％同一性」、又は「パーセント同一性」、又は「ＰＩＤ」は、タンパク質配列の同一性を指す。パーセント同一性は、当技術分野で公知の標準的手法を使用して決定し得る。有用なアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－４１０，１９９０；及びＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７，１９９３を参照されたい）が挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、数種の検索パラメーターを使用するが、その殆どは、デフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性に関して最も関連する配列を見出すが、２０未満の残基のクエリ配列には推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９－３４０２，１９９７；及びＳｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２９：２９９４－３００５，２００１）。核酸配列検索のための典型的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターとしては、隣接ワード閾値＝１１；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝－３）；ギャップオープニング＝５；及びギャップエクステンション＝２が挙げられる。アミノ酸配列検索のための典型的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターとしては、ワードサイズ＝３；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープニング＝１１；及びギャップエクステンション＝１が挙げられる。パーセント（％）アミノ酸配列同一性値は、適合する同一残基の数を「参照配列」の残基の総数で割ることにより決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「参照」配列を「クエリ」配列と呼ぶ。
本明細書で使用する「相同タンパク質」又は「相同フィターゼ」は、一次、二次及び／又は三次構造において明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質がアラインされた場合の、直鎖アミノ酸配列における類似性を指すことができる。タンパク質配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰ及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用し、０．００１の閾値（Ｅ値カットオフ）で実施することができる。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，Ｍａｄｄｅ ＴＬ，Ｓｈａｆｆｅｒ ＡＡ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ．Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ ＢＬＡＳＴ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９７ Ｓｅｔ １；２５（１７）：３３８９－４０２）。これらの情報を使用して、タンパク質配列を分類することができる。
配列アラインメント及びパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．７．０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラム又はＥＭＢＯＳＳ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅを使用して実施することができる（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ；Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）：２７６－２７７（２０００））。配列の多重アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬアラインメント法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ；例えば、バージョン１．８３等）（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１－１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０（１９９４）；及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ経由でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手できるＣｈｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１３）：３４９７－５００（２００３））を使用してデフォルトのパラメーターで行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アラインメントについての好適なパラメーターとしては、ギャップイグジスタンスペナルティ＝１５、ギャップエクステンション＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝－１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４及びＫＴＵＰＬＥ＝１が挙げられる。一実施形態では、高速又は低速アラインメントは、低速アラインメントのデフォルト設定が使用される。代わりに、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）を使用するパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝１０、ギャップエクステンション＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ウィンドウ＝５及びトップダイアゴナルズセイブド＝５も使用するように更に修正することができる。代わりに、多重配列アラインメントは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（登録商標）バージョン１０．２．４からのＭＡＦＦＴアラインメントを、デフォルト設定、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ１．５３及びオフセット値０．１２３を用いて引き出すことができる。
ＭＵＳＣＬＥプログラム（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｅｄｇａｒ．“ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ”．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００４）３２（５）：１７９２－１７９７）は、多重配列アラインメントアルゴリズムの更に別の例である。
図２に示した系統樹又は進化樹は、アミノ酸配列における類似性及び相違に基づいて、改変フィターゼポリペプチド及びその断片を含む様々なフィターゼ間の同系性を示している。
配列類似性を同定する別の方法は、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を生成することである。ＨＭＭは、観察されたデータ（例えば、ＤＮＡ又はアミノ酸配列）が、幾つかの（隠れ）内部状態の１つによって生成された一連のアウトプット（又は発光）上でモデリングされる確率論的フレームワークである。ＨＭＭは、多重ＤＮＡ配列アラインメントの統計的解析のために頻回に使用される。それらは、特に、ＯＲＦ、挿入、欠失、置換及びタンパク質ドメイン等のゲノム特徴を同定するために使用することができる。ＨＭＭは、相同性を同定するためにも使用することができ；例えば、広範に使用されるＰｆａｍデータベース（Ｐｕｎｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）は、ＨＭＭを使用して同定されたタンパク質ファミリーのデータベースである。ＨＭＭは、最初に１９９０年に作製された（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，１９９７）配列比較ツールであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）よりも有意により正確であり得る。従って、配列類似性を同定するために隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を生成する目的で、実施例４に示した高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片のポリペプチド配列を使用した。
用語「改変フィターゼポリペプチド」は、そのポリペプチドが自然に発生せず、且つフィターゼ活性を有することを意味する。
改変フィターゼポリペプチドの断片は、改変フィターゼポリペプチドのように機能することができる、即ちそれがフィターゼ活性を保持している改変フィターゼポリペプチドの一部分又は部分配列であることに留意されたい。
用語「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用する「発現ベクター」は、好適な宿主中でタンパク質を発現させることができる好適な制御配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。このような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的オペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。
本明細書で使用する用語「発現」は、前駆体形態又は成熟形態の何れかでの機能的最終産物（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質）の生成を意味する。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を更に指し得る。
遺伝子の発現は、遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体又は成熟タンパク質への翻訳を包含する。「成熟」タンパク質は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、即ち一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチド又はプロペプチドが除去されているポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、即ちプレペプチド及びプロペプチドが依然として存在している産物を指す。プレペプチド及びプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであり得るが、これに限定されない。「安定的形質転換」は、核ゲノム及びオルガネラゲノムの両方を含む、宿主生物のゲノム内に核酸断片を移動させることを指し、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす。対照的に、「一過性形質転換」は、宿主生物の核又はＤＮＡ含有オルガネラ内への核酸断片の移動を指し、組み込まれた遺伝形質又は安定な遺伝形質を伴わない遺伝子の発現をもたらす。
従って、一実施形態では、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド及びその断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された生成宿主において機能的である調節配列を含む組み換え構築物が開示される。
この組み換え構築物は、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド及びその断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された生成宿主において機能的である調節配列を含み得る。更に、生成宿主は、細菌、真菌、酵母、植物又は藻類からなる群から選択される。好ましい生成宿主は、糸状菌であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）である。
代わりに、Ｃｈｏｎｇ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１０８：１６．３０．１－１６．３０．１１に記載された無細胞タンパク質合成法を使用することも可能であり得る。
本明細書では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片を生成するための方法であって、
（ａ）生成宿主を、本明細書に記載される組み換え構築物で形質転換させる工程；及び
（ｂ）改変フィターゼポリペプチド又はその断片が生成される条件下で工程（ａ）の生成宿主を培養する工程
を含む方法も記載される。
任意選択的に、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、生成宿主から回収され得る。
別の態様では、フィターゼ含有培養上清は、本明細書に開示した方法の何れかによって得ることができる。
別の実施形態では、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかをコードするポリヌクレオチド配列が記載される。
発現ベクターに含有させることができる可能性のある開始制御領域又はプロモーター候補は、多数あり、当業者に周知である。「構成的」プロモーターは、殆どの環境及び発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」又は「抑制性」プロモーターは、環境的又は発生的調節下で活性なプロモーターである。幾つかの実施形態では、プロモーターは、当技術分野において公知であるように、炭素、窒素又は他の栄養素利用性、温度、ｐＨ、オスモル濃度、重金属の存在、阻害剤の濃度、ストレス又は上記の組み合わせを含むが、それらに限定されない環境因子における変化に起因して誘導性又は抑制性である。幾つかの実施形態では、誘導性又は抑制性プロモーターは、当技術分野において公知であるように、所定の炭素源のレベル、所定のエネルギー源のレベル、所定の異化代謝産物のレベル又は上記の組み合わせ等の代謝因子によって誘導性又は抑制性である。
一実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとって天然であるプロモーターである。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が宿主である幾つかの例では、プロモーターは、アクセッション番号Ｄ８６２３５を付してＧｅｎＢａｎｋに預託されているｃｂｈ１プロモーター等の天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターであり得る。真菌の発現のために有用なプロモーターの他の好適な非限定的例としては、Ｐ．クリソゲナス（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｓ）ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｘｙｎ１及びｘｙｎ２抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）プロモーター（例えば、Ｇｒａｅｓｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：７５３－７５６を参照されたい）、グルコース抑制性ＰＣＫ１プロモーター（例えば、Ｌｅｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｇｅｎｅ，１９２：２３５－２４０を参照されたい）、誘導性マルトース、グルコース抑制性ＭＥＴ３プロモーター（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｅｕｋａｒｙ．Ｃｅｌｌ，５：６３８－６４９を参照されたい）、ｐＫｉプロモーター及びｃｐｃ１プロモーターが挙げられる。有用なプロモーターの他の例としては、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる（例えば、Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５ ４：２３０６－２３１５及びＢｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１５８１－１５８５を参照されたい）。更に、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｘｌｎ１遺伝子のプロモーターも有用であり得る（例えば、欧州特許出願公開第１３７２８０（Ａｌ）号明細書を参照されたい）。
転写終結を制御するＤＮＡ断片も、好ましい産生宿主細胞にネイティブな様々な遺伝子に由来し得る。所定の実施形態では、終結制御領域の包含は、任意選択的である。所定の実施形態では、発現ベクターは、好ましい宿主細胞に由来する終結制御領域を含む。
用語「生成宿主」、「生成宿主細胞」、「宿主細胞」及び「宿主株」は、本明細書では互換的に使用され、フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はＤＮＡ構築物のために好適な宿主を意味する。生成宿主の選択は、細菌、真菌、酵母、植物又は藻類からなる群から選択され得る。典型的には、選択は、改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードする遺伝子及びその起源に左右されるであろう。
詳細には、宿主菌株は、好ましくは、糸状菌細胞である。本発明の好ましい実施形態では、「宿主細胞」は、糸状菌株及び特にトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）又はアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）菌株の細胞及び細胞から作り出されたプロトプラストの両方を意味する。
用語「糸状菌」は、真菌門亜門の全ての糸状菌形態を指す（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）、これらの真菌は、キチン、セルロース及び他の複合多糖類から構成される細胞壁を備える栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態学的に、生理学的に及び遺伝学的に酵母とは別個である。糸状菌による栄養成長は、菌糸伸長であり、炭素異化作用は、絶対嫌気性である。本発明では、糸状菌親細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（以前にはＴ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）及び現在ではハイポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）としても公知である）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）；ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、フミコラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ．）（例えば、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ））； クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）（例えば、Ｃ．ラクノウェンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ））、グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例えば、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）及びＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）、ヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．）及びエメリセラ種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｓｐ．）（例えば、更にＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉ．２２８：２１－２６を参照されたい）を含むが、それらに限定されない種の細胞であり得る。
本明細書で使用する用語「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」又は「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）」は、以前又は現在ではトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）と分類される任意の真菌属を意味する。
発現カセットは、生成宿主中、特に微生物生成宿主の細胞中に含めることができる。産生宿主細胞は、真菌ファミリー内で見出され、且つ広範囲の温度、ｐＨ値及び溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主であり得る。例えば、細菌、酵母、植物、藻類又は糸状菌等の真菌の何れも発現ベクターを好適に寄生させ得ると考えられる。
生成宿主細胞内への発現ベクターの包含は、細胞内、細胞外又は細胞の内側及び外側の両方の組み合わせで存在できるように、目的のタンパク質を発現させるために使用し得る。細胞外発現は、細胞内発現により生成したタンパク質の回収方法よりも、醗酵生成物からの所望のタンパク質の回収を容易にさせる。
核酸をアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、例えば、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）若しくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｈ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）等の糸状菌内に形質転換させるための方法は、当技術分野において周知である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属宿主細胞の形質転換に適した手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書に記載されている。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属宿主細胞を形質転換させるための好適な手順は、例えば、Ｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：１１４－１２１に記載されている。宿主トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）の菌株内へのＤＮＡの取り込みは、カルシウムイオン濃度に左右される。一般に、約１０ｍＭのＣａＣｌ２～５０ｍＭのＣａＣｌ２が取り込み溶液内で使用される。取り込み溶液中にカルシウムイオンを含む必要の他に、一般に含まれる他の化合物は、緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）；１ｍＭのＥＤＴＡ）又は１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．０）バッファー（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは、細胞膜を融解させ、そこで培地の内容物がトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）菌株の細胞質中に送達されることを許容し、プラスミドＤＮＡが核に運ばれると考えられている。この融合は、宿主染色体内に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーをそのまま残すことが多い。
通常、形質転換では、１０５～１０７／ｍＬ、好ましくは２×１０６／ｍＬの密度での透過性処理を受けているトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）プロトプラスト又は細胞を含有する懸濁液が使用される。適切な溶液中（例えば、１．２Ｍのソルビトール及び５０ｍＭのＣａＣｌ２）の１００μＬの容量のこれらのプロトプラスト又は細胞は、所望のＤＮＡと混合される。一般には、高濃度のＰＥＧが取り込み溶液に加えられる。プロトプラスト懸濁液には、０．１～１容量の２５％のＰＥＧ４０００を加えることができる。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５容量を添加することが好ましい。例えば、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加物も、取り込み溶液に加えると形質転換を補助することができる。同様の手順は、他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書及び同第６，２６８，３２８号明細書を参照されたい（これらは、両方とも参照により組み込まれる）。
好ましくは、遺伝的に安定性の形質転換体は、それによりフィターゼポリペプチド又はその断片をコードする核酸が宿主細胞株染色体内に安定性で統合されるベクター系を用いて構築される。形質転換体は、次に、公知の技術によって精製される。
発現ベクターが細胞内に導入された後、遺伝子導入細胞又は形質転換細胞は、プロモーター配列の制御下、遺伝子の発現に好都合な条件下で培養される。
一般に、細胞は、生理学的塩及び栄養素を含有する標準培地中で培養される（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１－８６，１９８８及びＩＩｍｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８－１３０６を参照されたい）。一般的に商業的に調製された培地（例えば、酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロス、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス及びサブローデキストロース（ＳＤ）ブロスは、何れも本発明において見出される。
培養条件も標準的である（例えば、培養は、所望レベルのフィターゼ発現が達成されるまで、振とう培養又は発酵槽内の適切な培地中のおよそ２８℃でインキュベートされる）。所定の糸状菌のための好ましい培養条件は、当技術分野で公知であり、科学文献中において且つ／又はアメリカンタイプカルチャーコレクション及び真菌遺伝学ストックセンター等の真菌の起源から見出すことができる。
真菌増殖が樹立された後、細胞は、フィターゼ及び特に本明細書で定義したフィターゼの発現を誘発又は許容するために有効な条件に曝露される。フィターゼコーディング配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、誘導剤（例えば、糖、金属塩又は抗菌剤）がフィターゼ発現を誘導するために効果的な濃度で培地に添加される。宿主細胞から分泌された改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、全ブロス調製物として、最小生産後プロセッシングと共に使用することができる。
組み換え微生物の使用済み全醗酵ブロスの調製は、改変フィターゼポリペプチド又はその断片の発現をもたらす、当技術分野で知られた任意の培養法を使用して達成することができる。
用語「使用済み全発酵ブロス」は、本明細書では培養培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）及び細胞バイオマスを含む発酵材料の未分画内容物であると定義されている。用語「使用済み全発酵ブロス」は、当技術分野において周知の方法を使用して溶解又は透過化されている細胞バイオマスも含むと理解される。
発酵後に発酵ブロスが得られ、フィターゼ溶液を得るために、微生物細胞及び残留する生発酵材料を含む様々な懸濁固体は、フィターゼ用液を得るための従来の分離技術によって除去される。濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心分離後に行われる限外濾過、抽出又はクロマトグラフィー等が一般に使用される。
任意選択的に、生成宿主から所望のタンパク質を回収することが可能である。別の態様では、培養上清を含有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、当業者に公知である方法の何れかを使用することによって得られる。
これらの技術の例としては、親和性クロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ ｅｔ ａ．，（１９８４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１６：２１５）、高解像度出力を備える物質を用いるイオン交換（Ｍｅｄｖｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８０８：１５３）を含むイオン交換クロマトグラフィー（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３６：３７；Ｆｌｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｅｕｒ．（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３１４；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ ｅｔ ａｌ，（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：３３６；及びＥｌｌｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３９６：３０７）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ，（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８６５：１２３を参照されたい）；二相分配法（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７：２８７を参照されたい）；エタノール沈降法；逆相ＨＰＬＣ、シリカ上又はＤＥＡＥ等のカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマト分画法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及びゲル濾過法（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５）が挙げられるが、それらに限定されない。所望の精製度は、改変フィターゼポリペプチド又はその断片の使用に依存して変動するであろう。幾つかの実施形態では、精製は、必要とされないであろう。
他方では、回収を最適化するために改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含有する溶液を濃縮することが望ましい場合がある。未濃縮溶液の使用は、典型的には、濃縮又は精製酵素沈殿物を収集するための培養時間の増加を必要とする。酵素含有溶液は、所望の酵素レベルが得られるまで、従来型の濃縮技術を使用して濃縮される。酵素含有溶液の濃縮は、本明細書で考察した手法の何れかによって達成され得る。濃縮及び精製の典型的な方法には、回転真空濾過及び／又は限外濾過が含まれるが、それらに限定されない。
更に、所望のタンパク質産物の濃縮は、例えば、金属ハロゲン化物沈殿剤等の沈殿剤を使用して実施され得る。金属ハロゲン化物沈殿剤である塩化ナトリウムは、保存料としても使用できる。金属ハロゲン化物沈殿剤は、改変フィターゼポリペプチド又はその断片を沈殿させるための有効量で使用される。酵素の沈殿を誘発するために有効な最小有効量及び最適有効量の金属ハロゲン化物の選択並びにインキュベーション時間、ｐＨ、温度及び酵素の濃度を含む最高回収率のための沈殿条件の選択は、ルーチンの試験を実施した後に容易に当業者に明白になるであろう。一般に、少なくとも約５重量／体積％（％ｗ／ｖ）～約２５重量／体積％、通常、少なくとも８重量／体積％の金属ハロゲン化物が濃縮酵素溶液に添加される。
酵素を沈殿させるための別の代替法は、有機化合物を使用することである。典型的な有機化合物沈殿剤としては、４－ヒドロキシ安息香酸、４－ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４－ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル及びこれらの有機化合物の２種以上のブレンドが挙げられる。有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン化物沈殿剤の添加前、それと同時又はそれに引き続いて実施することができ、両方の沈殿剤である有機化合物及び金属ハロゲン化物の添加は、連続的又は同時に実施することができる。一般に、有機沈殿剤は、４－ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩及び４－ヒドロキシ安息香酸の直鎖状又は分枝状アルキルエステル（ここで、アルキル基は、１～１２個の炭素原子を含有する）並びにこれらの有機化合物の２種以上のブレンドからなる群から選択される。追加の有機化合物としては、４－ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルパラベンと呼ばれる）、４－ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルパラベンと呼ばれる）も含まれるが、それらに限定されない。詳細な説明については、例えば、米国特許第５，２８１，５２６号明細書を参照されたい。有機化合物沈殿剤の添加は、ｐＨ、温度、濃度、沈殿剤、タンパク質濃度及びインキュベーション時間に関する沈殿条件の高い柔軟性という利点を提供する。一般に、少なくとも約０．０１重量／体積％及び約０．３重量／体積％以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素溶液に添加される。
インキュベーション期間後、濃縮又は精製酵素が次に分離性顔料及び他の不純物から分離され、従来型分離技術、例えば濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空濾過、限外濾過、圧縮濾過、膜貫通精密濾過、クロスフロー精密濾過等によって収集される。酵素沈殿物の別の濃縮又は精製は、沈殿物を水で洗浄することによって得ることができる。例えば、濃縮又は精製酵素沈殿物は、金属ハロゲン化物沈殿剤を含有する水又は金属ハロゲン化物及び有機化合物沈殿剤を含有する水で洗浄される。
ときに、発現ベクターにより遺伝子欠損が治癒され得る発現宿主から遺伝子を欠失させることが有利である。１つ以上の不活性化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることが望ましい場合、公知の方法を使用することができる（例えば、米国特許第５，２４６，８５３号明細書、同第５，４７５，１０１号明細書及び国際公開第９２／０６２０９号パンフレットに開示された方法）。遺伝子不活性化は、挿入不活化又は本来の目的で遺伝子を機能させなくする任意の他の手段で（遺伝子が機能性タンパク質を発現することができないように）全部又は一部を欠損させることによって行うことができる。
クローン化されている、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）又は他の糸状菌宿主由来の任意の遺伝子（例えば、ｃｂｈ１遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子、ｅｇｌ１遺伝子及びｅｇｌ２遺伝子）は、欠失され得る。幾つかの実施形態では、遺伝子欠失は、当技術分野で公知の方法により、不活性化対象の所望の遺伝子の１つの形態をプラスミドに挿入することによって達成され得る。欠失プラスミドは、その後、所望の遺伝子コーディング領域の内部である適切な制限酵素部位で切断され、遺伝子コーディング配列又はその部分は、選択可能マーカーと置換される。遺伝子座から欠失させるべきフランキングＤＮＡ配列（好ましくは約０．５～２．０ｋｂ）は、マーカー遺伝子の何れかの側に留まっている。適切な欠失プラスミドは、一般に、単一線形ピースとして取り除かれるべきフランキングＤＮＡ配列及び選択可能なマーカー遺伝子を含む、断片が欠失遺伝子を含有することを可能にするために、その中に存在する固有の酵素部位を有するであろう。
使用した宿主細胞に応じて、転写後及び／又は翻訳後修飾がなされ得る。転写後及び／又は翻訳後修飾の１つの非限定的な例は、ポリペプチドの「クリッピング」又は「切断」である。別の例では、このクリッピングは、本明細書に記載の成熟フィターゼポリペプチドの取り込みをもたらし、更にＮ末端又はＣ末端アミノ酸を除去して、酵素活性を保持するフィターゼの切断形態の生成をもたらし得る。
転写後又は翻訳後修飾の他の例としては、ミリストイル化、グリコシル化、切断、脂質化及びチロシン、セリン又はトレオニンのリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、タンパク質が受け得る転写後又は翻訳後修飾のタイプは、タンパク質がその中で発現する宿主生物に左右され得ることを理解するであろう。
発現後のポリペプチドの更なる配列修飾が起こる可能性がある。これには、酸化、脱グリコシル化、糖化等が含まれるが、それらに限定されない。糖化は、特に３０℃を超える温度及び中性又はアルカリ性ｐＨでのグルコース又は他の還元糖とのインキュベーションを受けた場合、フィターゼの活性に影響を及ぼし得ることが公知である。リシン残基を排除するためのタンパク質工学は、そのような修飾を防止するために使用することができる。これの１つの例は、米国特許第８，５０７，２４０号明細書に見出すことができる。例えば、酵母発現は、明白に分子量の増加を生じさせる高グリコシル化ポリペプチドを生じさせ得る。更に、２０１３年８月１５日の国際公開日を有する国際公開第２０１３／１１９４７０号パンフレット（本明細書に参照により組み込まれる）は、グリコシル化の増加に起因すると考えられる安定性の増加を有するフィターゼに関する。
本明細書で使用する用語「グリコシル化」は、グリカンの分子、例えばタンパク質への付着を意味する。グリコシル化は、酵素反応である可能性がある。形成された付着は、共有結合を通したものであり得る。語句「高度にグリコシル化された」は、多数の部位において且つ全て又はほぼ全ての利用可能なグリコシル化部位、例えばＮ連結グリコシル化部位においてグリコシル化されている酵素等の分子に関する。代わりに又は加えて、語句「高度にグリコシル化された」は、全部又は実質的に全部のＮ結合グリコシル化部位で広範な解糖分岐（特定のＮ結合グリコシル化部位と結び付いている解糖部分のサイズ及び数等）に関し得る。幾つかの実施形態では、改変フィターゼポリペプチドは、全部又は実質的に全部のコンセンサスＮ結合グリコシル化部位（即ちＮＸＳ／ＴコンセンサスＮ結合グリコシル化部位）でグリコシル化されている。
本明細書で使用する用語「グリカン」は、多糖若しくはオリゴ糖又は糖タンパク質等の複合糖質の炭水化物部分を指す。グリカンは、単糖残基のホモポリマー又はヘテロポリマーであり得る。それらは、直鎖又は分岐状分子であり得る。
フィターゼは、様々な程度のグリコシル化を有する可能性がある。そのようなグリコシル化は、貯蔵中及び適用中の安定性を向上させ得ることが公知である。広範である。
本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかの活性は、上記で考察したように決定することができる。
当業者であれば理解するであろうように、酵素は、常に飼料工場の過酷な環境における脅威下で脆弱なタンパク質である。極度の温度、圧力、摩擦、ｐＨ及び微生物活動は、飼料に添加される酵素を分解又は破壊し得る。酵素活動へのストレスは、殆どがプロセッシングのコンディショニング及びペレット化期中に直面する。例えば、飼料は、ペレット化前のコンディショニング中にその熱エネルギーの大部分を吸収する。しかしながら、コンディショニング装置からペレットダイを通した通過も飼料を加熱する。例えば、飼料処方、ダイの厚さ、ダイの速度、ダイの仕様（穴の径及び形状）、初期プロセッシング温度、ペレット化能力等の多数の因子がダイを通した温度上昇に寄与し得る。
従って、工業規模での飼料ペレット化中の条件は、変動し得る。ペレット化条件におけるこれらの変動に酵素が抵抗する能力又はロバスト性は、極めて重要である。当業者であれば、コンディショニング温度が飼料工場毎に変動し得ることを理解するであろう。更に、ペレット化プロセスが実施される条件を決定する際、地域の法律の必要性を考慮に入れるべきである。例えば、デンマークの法律は、家禽用飼料の８１℃でのペレット化を要求している（Ｍｉｌｊｏ－ｏｇ Ｆｏｄｅｖａｒｅｍｉｎｉｓｔｅｒｉｅｔ，ｆｏｄｅｖａｒｅｓｔｙｒｅｌｓｅｎ，ｊ．ｎｒ．２０１７－３２－３１－００３７８）。
更に、より優れた耐久性及び微粒子の減少等のペレット品質を増加させるため並びにペレットプレス能力を増加させるために、工業界では、より高温ペレット化条件を使用することができる。従って、コンディショニング及びペレット化前に飼料中に組み込まれた場合に８０℃を超える広範囲の温度にわたる一貫した活性のペレットを生成できるロバストなフィターゼに対する必要が存在する。これは、本明細書に記載されるように液体適用フィターゼ及び固体適用フィターゼの両方について重要である。
飼料酵素が受ける可能性がある実際のストレスに影響を及ぼし得るコンディショニング温度を超える因子としては、飼料原料、飼料工場の地理的場所、使用される装置、ダイのサイズ、ペレット化助剤の使用、蒸気制御、温度制御及び任意の他のペレット化ストレスを減少されるような方法で飼料を修飾する任意の他の外因性酵素の存在等の任意の他の商業的に重要なペレット化条件が挙げられるが、それらに限定されない。
これらのストレス因子は、ペレット化後に適用される液体形態の酵素の適用をもたらす高温又はスーパーコンディショニングに向かう傾向によって更に複合化される。
コンディショニング及びペレット化前に液体として適用され得るようにロバストな酵素を工学的に作り出せたらどうなるであろうか。
用語「ロバスト」及び「ロバスト性」は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片が、工業的飼料製造におけるコンディショニング及びペレット化プロセスにおける変動に抵抗する能力を意味する。高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片の一部としての本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、コンディショニング及びペレット化前の液体形態の飼料に適用され得るそのようなロバストな酵素の例である。
換言すると、新規な改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、コンディショニング及びペレット化前に液体形態又は未処方、非被覆、非保護固体形態で適用された場合、未処方、非被覆、非保護形態での工業用飼料ペレット化プロセスにおけるそのような変動に抵抗することができる。
用語「液体」、「液体形態」及び「液体調製物」は、互換的に使用され、酵素がコンディショニング及びペレット化前に任意の方法で飼料に液体形態で適用され得ることを意味する。
ロバストな改変フィターゼポリペプチド又はその断片を液体形態の飼料に適用することは、被覆顆粒としてのそのようなフィターゼを適用することと比較して有益であると考えられる。この被覆顆粒は、高温のコンディショニング及びペレット化のために好適なフィターゼ製品を作製するための最新の商業的アプローチである。ロバストな酵素の液体適用の利点として、１）酵素は、それが飼料と相互作用し得る前に被覆顆粒から遊離される必要がないため、動物による摂取後に直ちに作用し始めるであろうこと、２）飼料全体への酵素の分布が改良されているため、従って少量の飼料を食べる幼若動物にとって特に重要である、動物への酵素のより一貫性の送達を保証すること、３）飼料中の均一な分布は、飼料中の酵素を測定することをより容易にさせること、及び４）本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片等のロバストなフィターゼの場合、飼料中に既に存在するフィターゼの分解を開始させられることが挙げられる。
換言すると、新規な改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、極めてロバストであるため、それらは工業的飼料製造において使用されるコンディショニング及びペレット化のストレスに抵抗するように工学的に改変されていることから、コンディショニング及びペレット化前に特殊なコーティング又は処方を飼料に適用することが必要とされないと考えられる。従って、本明細書に記載される新規な改変フィターゼポリペプチド又はその断片のロバスト性は、非被覆顆粒若しくは粒子として適用され得るか、又はそれらが液体中に入れられた場合に非被覆及び非保護となるようなロバスト性である。
改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、保護コーティングの特定の必要を伴わず、固体担体上で費用をかけずに処方することができ、それでもなおコンディショニング及びペレット化プロセスを通して活性を維持できることに留意されたい。固体形態で適用された場合に追加の熱安定性を提供するための保護コーティングは、より過酷な条件が使用される場合又は例えば９０℃を超えるスーパーコンディショニング飼料の場合におけるような条件がそれを正当化する所定の領域に必要とされる場合にペレット化安定性を得るために有益である。
本明細書で開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、系統発生分析、部位評価ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、高スループットスクリーニング及び統計的分析を含む、タンパク質工学の分野において公知である方法及び技術の組み合わせを用いて引き出された。
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８２％の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片に関する。
当業者であれば、そのような少なくとも８２％の配列同一性は、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％も含むことを理解するであろう。
当業者であれば、少なくとも７９％の配列同一性は、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％も含むことを理解するであろう。
更に、下記の幾つかの実施形態では、
ａ）配列番号２、３、８、１０、１２、１８、１９、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３３及び／又は３６のアミノ酸配列と少なくとも８１％（例えば８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性も有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片、
ｂ）配列番号１、４、５、７、９、１１、１４、１５、１７、２１、２５、３４及び／又は３５のアミノ酸配列と少なくとも８２％（例えば８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性も有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片；
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８３％（例えば、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性も有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片；
ｄ）配列番号６、２２及び／又は６４のアミノ酸配列と少なくとも７９％（例えば、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性も有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片；及び／又は
ｅ）配列番号１６、２０、２３、２９及び／又は３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性も有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片
が提供されるとも言及することができる。
別の態様では、ポリペプチドは、改変フィターゼポリペプチドのコアドメイン又は改変フィターゼポリペプチドのコアドメイン断片を含む。「コアドメイン断片」は、本明細書では、ポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端から１つ以上のアミノ酸が欠失しているポリペプチドであると定義されている。本明細書で使用する語句「コアドメイン」は、ポリペプチドの構造及び機能（例えば、フィチン酸加水分解等）を維持するために必要とされるアミノ酸を包含するポリペプチド領域を指す。コアドメイン内のアミノ酸は、限定なく、ｐＨ等の様々な条件下で熱安定性又は触媒活性を向上させるために更に修飾することができる。幾つかの非限定的実施形態では、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片のコアドメインは、配列番号１のアミノ酸１４～３２５位に対応する。他の非限定的実施形態では、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸１３～３２６位、１２～３２７位、１１～３２８位、１０～３２９位、９～３３０位、８～３３１位、７～３３２位、６～３３３位、５～３３４位、４～３３５位、３～３３６位、２～３３７位又は１～３３８位に対応する。他の実施形態では、コアドメインのＮ末端は、配列番号１のアミノ酸１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位又は２５位に対応し、及びコアドメインのＣ末端は、配列番号１のアミノ酸３１５位、３１６位、３１７位、３１８位、３１９位、３２０位、３２１位、３２２位、３２３位、３２４位、３２５位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３６位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４５位、３４６位、３４７位、３４８位、３４９位、３５０位、３５１位、３５２位、３５３位、３５４位、３５５位、３５６位、３５７位、３５８位、３５９位、３６０位、３６１位、３６２位、３６３位、３６４位、３６５位、３６６位、３６７位、３６８位、３６９位、３７０位、３７１位、３７２位、３７３位、３７４位、３７５位、３７６位、３７７位、３７８位、３７９位、３８０位、３８１位、３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、３９２位、３９３位、３９４位、３９５位、３９６位、３９７位、３９８位、３９９位、４００位、４０１位、４０２位、４０３位、４０４位、４０５位、４０６位、４０７位、４０８位、４０９位、４１０位、４１１位、４１２位又は４１３位に対応する。
従って、本明細書では、
ｆ）配列番号６及び／又は６４のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも７８％（例えば、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する、改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片；
ｇ）配列番号２、８、２７及び／又は３７のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも７９％（例えば、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する、改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片；
ｈ）配列番号３、１０、１２、１８、２５、２６、２８、３０、３２、３５、６５、７０及び／又は８６のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも８１％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する、改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片；
ｉ）配列番号１、４、５、７、９、１１、１３－１７、２１、２２、３１、３３、３４、３６、６４、６６～６９及び／又は７１～８４のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも８２％（例えば、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する、改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片；
ｊ）配列番号１９、２０、２３及び／又は２４のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも８３％（例えば、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する、改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片；及び／又は
ｋ）配列番号２９のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも８４％（例えば、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１のアミノ酸位置に対応する、改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片
も提供される。
更に別の態様では、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８２％の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチドについて表１１に規定された少なくとも約１２００（例えば、少なくとも約１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０又は１８００）の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スコアを有するアミノ酸配列も有する可能性がある。
更に他の態様では、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、そのポリペプチド配列内の１つ以上の位置で１つ以上の特異的アミノ酸置換を含み得る。従って、幾つかの実施形態では、本明細書では、３０（Ｌ、Ｉ）、３７Ｙ、４５Ｐ、８９Ｔ、１８２Ｒ、１９４Ｍ、１９５Ｆ、２０２Ｓ、２２８Ｙ、２５６Ｈ、２６１Ｈ及び２９８Ｖからなる群から選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）のアミノ酸置換を含む改変フィターゼポリペプチド又はその断片が提供され、ここで、それらの位置は、配列番号１又は５７の番号付けに対応する。
更に又は加えて、改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、３Ｔ、６Ｓ、９Ｑ、７３Ｉ、７６Ｋ、７８Ｓ、１１８Ｑ、１２３Ａ、１３０Ｖ、１６３Ｐ、１８６Ｄ、１８７Ｋ、２０９Ａ、２８４Ｓ、２８８Ａ、２８９Ｒ、３３７Ｖ、３４５Ａ及び３４７Ｋからなる群から選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１）のアミノ酸置換を含み得、ここで、それらの位置は、配列番号１の番号付けに対応する。幾つかの実施形態では、改変フィターゼポリペプチドは、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択される。
１つ以上のアミノ酸置換を含有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、前記１つ以上のアミノ酸置換を含んでいないフィターゼポリペプチド又はその断片と比較して、向上した熱安定性（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％以上（これらの数値間に含まれる全てのパーセンテージを含む）の何れか又は向上した活性（例えばｐＨ５．５での活性と比較してｐＨ３．５での向上した比活性及び／若しくは活性）（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％以上（これらの数値間に含まれる全てのパーセンテージを含む）の何れかを含むが、それらに限定されない１つ以上の向上又は増強した特性を示し得る。
更に他の態様では、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、ｐＨ３．５対ｐＨ５．５でのフィターゼの活性（例えば、比活性）間の比率を増加させる１つ以上の置換（例えば、上記に開示した置換の１つ以上）を有し得る。その結果として、幾つかの実施形態では、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、ｐＨ５．５での活性（例えば、比活性）と比較してｐＨ３．５での約１．２以上（例えば、約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０以上の何れか等）の活性の比率（例えば、比活性）を有する。
更に記載されるのは、標準飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡ中に適用された場合、少なくとも５０％の飼料中ペレット化回収率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片である。更に、本明細書に記載される少なくとも５０％の飼料中ペレット化回収率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、配列番号１に規定されたアミノ酸と少なくとも８２％の配列同一性も有することができる。
飼料中ペレット化回収率は、約５０％～約１００％、詳細には約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の何れかの範囲であり得る。
幾つかの実施形態では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、９５℃で固体として適用された場合、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、７０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の飼料中ペレット化回収率を有する。
当業者であれば、飼料中ペレット化回収率は、使用する飼料のタイプ、使用するコンディショニング及びペレット化条件、例えば温度及び含水量、活性を決定するために使用したアッセイ等に基づいて変動し得ることを理解するであろう。
本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、標準飼料中ペレット化試験を使用して、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも０．７の飼料中ペレット化回収率を有する。この比率は、約０．７、０．８、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８及び０．９９を含む。
別の実施形態では、ａ）配列番号６０；ｂ）Ａ２５Ｆ及びＧ１５７Ｒ置換を備える配列番号６０；ｃ）配列番号１０４；及び／又はｄ）配列番号１０４のアミノ酸２２～４３１と比較して、３０秒間わたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５．０の飼料中ペレット化回収率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
別の実施形態では、ａ）配列番号６０；ｂ）Ａ２５Ｆ及びＧ１５７Ｒ置換を備える配列番号６０；ｃ）配列番号１０４；及び／又はｄ）配列番号１０４のアミノ酸２２～４３１と比較して、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５．０の飼料中ペレット化回収率の比率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、実施例３に記載される示差走査熱量測定アッセイ条件を用いて、少なくとも９２．５℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、約１００℃又は約１０１℃のＴｍ温度を更に含むことができ、結果は、実施例４に提供した。
別の実施形態では、ａ）配列番号６０；ｂ）Ａ２５Ｆ及びＧ１５７Ｒの置換を備える配列番号６０；ｃ）配列番号１０４；及び／又はｄ）配列番号１０４のアミノ酸２２～４３１と比較して、示差走査熱量測定法によって測定して少なくとも約１．０８、１．１０、１．１２、１．１４、１．１６、１．１８又は１．２０、２．１、２．４、２．７、３．０又は３．３のＴｍ温度の比率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片が開示される。
別の態様では、本明細書に開示した改変ポリペプチド又はその断片の何れかは、実施例４に記載される条件等のアッセイ条件下において、ｐＨ３．５で少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの比活性を含む。比活性範囲（ｐＨ３．５でのＵ／ｍｇ）には、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、２０００等が含まれるが、それらに限定されない。
別の態様では、本明細書に開示した改変ポリペプチド又はその断片の幾つかは、実施例４に記載される条件等のアッセイ条件下において、ｐＨ５．５で少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの比活性を含む。比活性範囲（ｐＨ５．５でのＵ／ｍｇ）には、約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、２０００等が含まれるが、それらに限定されない。
更に別の態様では、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、約３．０以下のｐＨで液体形態において安定性であり得る。これは、下記で考察するように、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片が動物の消化管を通過する場合に極めて重要である。
別の実施形態では、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかを含む動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックスが記載される。
重要なことに、飼料添加酵素、例えばフィターゼは、動物の消化管を通過するにつれて極めて過酷な、即ち低ｐＨ及び消化酵素の存在等の条件を受けることになる。ペプシンは、単胃動物の胃腸管中に存在する最も重要なタンパク質分解消化酵素の１つである。ペプシンは、低い特異性及び酸性領域における高ｐＨ耐性（ｐＨ８．０までｐＨ１．５～６．０で安定性である）を有する。本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、ペプシンに対して大きく抵抗性であり、これは、優れたインビボ性能にとって不可欠である。
本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかを含む動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックスは、（ｉ）単独で、又は（ｉｉ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌、若しくは（ｉｉｉ）少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｉｖ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌及び少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｖ）少なくとも１種の他の飼料添加成分を更に含む（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）の何れかで使用され得、及び任意選択的に、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、少なくとも約０．１ｇ／トン飼料の量で存在する。
用語「飼料添加物」、「飼料添加成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」及び／又は「飼料添加成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）」は、本明細書では互換的に使用される。
飼料添加物は、飼料の品質及び動物起源由来の食品の品質を向上させるため又は動物の性能及び健康を向上させるため、例えば供給物質の消化率の増加を提供するために、動物栄養において使用される製品であると説明できる。
飼料添加物は、それらが自然により多く食べたいと思うように動物の食欲を刺激する感覚的添加物等の多数のカテゴリーに分類される。栄養上の添加物は、動物の食餌に欠乏している可能性がある特定の栄養素を提供する。畜産学的添加物は、飼料中の添加物を通して動物の食餌の総合的価値を向上させる。
そのような飼料添加物の例としては、プレオバイオティクス、精油（例えば、限定なく、チモール及び／又はシンナムアルデヒド等）、脂肪酸、短鎖脂肪酸、例えばプロピオン酸及び酪酸等、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸等が挙げられるが、それらに限定されない。
飼料添加組成物又は処方物は、タンパク質、ペプチド、スクロース、ラクトース、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、ソルビン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、ソルビン酸マグネシウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン及びプロピルパラベンからなる群から選択される少なくとも１種の成分も含み得る。
少なくとも１種の他の酵素（即ち本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかに加えて）は、キシラナーゼ、アミラーゼ、別のフィターゼ、β－グルカナーゼ及び／又はプロテアーゼを含み得るが、それらに限定されない飼料添加組成物又は処方物に含めることができる。
キシラナーゼは、直鎖状多糖β－１，４－キシランをキシロースに分解する、従って植物細胞壁の主要成分の１つであるヘミセルロースに分解する酵素のクラスに与えられた名称である。キシラナーゼ、例えばエンド－β－キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）は、キシランの主鎖を加水分解する。
一実施形態では、キシラナーゼは、任意の商業的に利用可能なキシラナーゼであり得る。好適には、キシラナーゼは、エンド－１，４－Ｐ－ｄ－キシラナーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．８であると分類される）又は１，４β－キシロシダーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．３７であると分類される）であり得る。一実施形態では、本開示は、エンドキシラナーゼ、例えばエンド－１，４－Ｐ－ｄ－キシラナーゼ及び他の酵素と組み合わせた、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む組成物に関する。本明細書で言及した全てのＥ．Ｃ．酵素分類は、本明細書に組み込まれる国際生化学・分子生物学連合のＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ－－Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ（１９９２）－ＩＳＢＮ ０－１２－２２６１６４－３に提供された分類に関する。
別の実施形態では、キシラナーゼは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｎａ）、テリノマイセス属（Ｔｈｅｒｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来のキシラナーゼであり得る。更に別の実施形態では、キシラナーゼは、何れもＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販で入手できる製品であるＡｘｔｒａ ＸＡＰ（登録商標）又はＡｖｉｚｙｍｅ １５０２（登録商標）内のキシラナーゼであり得る。一実施形態では、キシラナーゼは、２種以上のキシラナーゼの混合物であり得る。更に別の実施形態では、キシラナーゼは、エンド－１，４－β－キシラナーゼ又は１，４－β－キシロシダーゼである。
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れか及びキシラナーゼを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、１０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０及び７５０超のキシラナーゼ単位／ｇ組成物を含む。
一実施形態では、組成物は、５００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、６０００～６５００、６５００～７０００、７０００～７５００、７５００～８０００及び８０００超のキシラナーゼ単位／ｇ組成物を含む。
１キシラナーゼ単位（ＸＵ）は、ｐＨ５．３及び５０℃で、オートスペルト－キシラン基質から１分間当たり０．５μｍｏｌの還元糖同等物（ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）アッセイ還元糖法によるキシロースとして）を遊離する酵素の量であると理解されるであろう。（Ｂａｉｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２３，（３），Ｍａｙ １９９２，２５７－２７０）。
アミラーゼは、鎖がより短いマルトース等のオリゴ糖にデンプンを加水分解できる酵素のクラスである。グルコース部分は、次に、元のデンプン分子からよりもマルトースをモノグリセリド又はグリコシルモノグリセリドに容易に転移させることができる。用語アミラーゼは、α－アミラーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．１）、Ｇ４－形成アミラーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．６０）、β－アミラーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．２）及びγ－アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２：１．３）を含む。アミラーゼは、細菌起源若しくは真菌起源又は化学的修飾若しくはタンパク質改変突然変異体由来であり得る。
一実施形態では、アミラーゼは、２種以上のアミラーゼの混合物であり得る。別の実施形態では、アミラーゼは、１種のアミラーゼ、例えばバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα－アミラーゼ及び１種のアミラーゼ、例えばバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のα－アミラーゼであり得る。一実施形態では、α－アミラーゼは、何れもＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販で入手できる製品であるＡｘｔｒａ ＸＡＰ（登録商標）又はＡｖｉｚｙｍｅ １５０２（登録商標）内のα－アミラーゼであり得る。更に別の実施形態では、アミラーゼは、ペプシン耐性α－アミラーゼ、例えばペプシン耐性トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）等）α－アミラーゼであり得る。好適なペプシン耐性α－アミラーゼは、英国特許出願第１０１１５１３．７号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）及びＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５３０１８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）において教示されている。
１アミラーゼ単位（ＡＵ）は、ｐＨ６．５及び３７℃で１分間当たり水不溶性架橋デンプンポリマー基質から１ｍｍｏｌのグリコシド結合を遊離させる酵素の量であることが理解されるであろう（これは、１ＡＵを決定するためのアッセイであると言うことができる）。
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片及びアミラーゼの何れかを含む組成物に関する。一実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片、キシラナーゼ及びアミラーゼの何れかを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、１０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０及び７５０超のアミラーゼ単位／ｇ組成物を含む。
一実施形態では、組成物は、５００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、６０００～６５００、６５００～７０００、７０００～７５００、７５００～８０００、８０００～８５００、８５００～９０００、９０００～９５００、９５００～１００００、１００００～１１０００、１１０００～１２０００、１２０００～１３０００、１３０００～１４０００、１４０００～１５０００及び１５０００超のアミラーゼ単位／ｇ組成物を含む。
本明細書で使用する用語プロテアーゼは、ペプチダーゼ又はプロテイナーゼと同義語である。プロテアーゼは、サブチリシン（Ｅ．Ｇ．３．４．２１．６２）、又はバシロリシン（Ｅ．Ｇ．３．４．２４．２８）、又はアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｇ．３．４．２１．ｘ）、又はケラチナーゼ（Ｅ．Ｇ．３．４．Ｘ．Ｘ）であり得る。一実施形態では、プロテアーゼは、サブチリシンである。好適なプロテアーゼとしては、動物、野菜又は微生物起源のプロテアーゼが挙げられる。
化学修飾変異体又はタンパク質改変変異体も適合する。このプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、例えばアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。一実施形態では、本明細書では、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れか及び１種以上のプロテアーゼを含む組成物が提供される。
アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシン、特にバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来のプロテアーゼ、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９（例えば、米国特許第６，２８７，８４１号明細書）、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８である（例えば、国際公開第８９／０６２７９号パンフレットを参照されたい）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属プロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号パンフレット及び同第９４／２５５８３号パンフレットを参照されたい）である。有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット及び国際公開第９８／２０１１５号パンフレットで説明された変異体も挙げられるが、それに限定されない。
一実施形態では、プロテアーゼは、サブチリシン、バシロリシン、アルカリセリンプロテアーゼ、ケラチナーゼ及びノカルジオプシス属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）プロテアーゼからなる群から選択される。
１プロテアーゼ単位（ＰＵ）は、基質（０．６％のカゼイン溶液）からｐＨ７．５（４０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／乳酸バッファー）及び約４０℃で１分間中の１マイクログラムのフェノール性化合物（チロシン当量として表されれる）を遊離させる酵素の量であることが理解されるであろう。これは、１ＰＵを決定するためのアッセイと称することができる。
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れか及びプロテアーゼを含む組成物に関する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れか並びにキシラナーゼ及びプロテアーゼを含む組成物に関する。更に別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れか並びにアミラーゼ及びプロテアーゼを含む組成物に関する。更に別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れか並びにキシラナーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼを含む組成物に関する。
一実施形態では、組成物は、１０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０及び７５０超のプロテアーゼ単位／ｇ組成物を含む。
一実施形態では、組成物は、５００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～２５００、２５００～３０００、３０００～３５００、３５００～４０００、４０００～４５００、４５００～５０００、５０００～５５００、５５００～６０００、６０００～６５００、６５００～７０００、７０００～７５００、７５００～８０００、８０００～８５００、８５００～９０００、９０００～９５００、９５００～１００００、１００００～１１０００、１１０００～１２０００、１２０００～１３０００、１３０００～１４０００、１４０００～１５０００及び１５０００超のプロテアーゼ単位／ｇ組成物を含む。
少なくとも１種の直接給与生菌（ＤＦＭ）は、少なくとも１種の生存微生物、例えば生存細菌株、又は生存酵母、又は生存真菌を含む。好ましくは、ＤＦＭは、少なくとも１種の生存細菌を含む。
このＤＦＭは、胞子形成細菌株であり得、従って、用語ＤＦＭは、胞子、例えば細菌胞子で構成され得るか、又は細菌胞子を含有し得る。従って、本明細書で使用する用語「生存微生物」は、内生胞子又は分生子等の微生物胞子を含み得る。代わりに、本明細書で記載された飼料添加組成物中のＤＦＭは、微生物胞子、例えば内生胞子若しくは分生子で構成されていなくてもよいか、又は内生胞子若しくは分生子を含んでいなくてもよい。
微生物は、天然型微生物又は形質転換微生物であり得る。
本明細書に記載のＤＦＭは、以下の属：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）及びメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）並びにこれらの組み合わせの１つ以上からの微生物を含み得る。
ＤＦＭは、好ましくは、以下のバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から選択される１つ以上の細菌株を含む。
本明細書で使用する「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」は、当業者に公知であるように、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」内の全ての種、例えば、限定されないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含む。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）が分類学的再編成を受け続けていることは、認識されている。従って、この属は、現在ではゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と呼ばれているバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又は現在ではパエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）と呼ばれているバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）を含むが、それらに限定されない、再分類されている種を含むことが意図されている。ストレスに満ちた環境条件下での抵抗性内生胞子の生成は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の決定的な特徴であると考えられるが、この特徴は、最近命名されたアリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）及びビルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも当てはまる。
別の態様では、ＤＦＭは、以下のラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）：ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）並びにそれらの組み合わせと更に組み合わせることができる。
ＤＦＭは、以下のラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）：ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒｉ）、ラクトバチルス・ビフィダス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｅｕｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）及びラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）並びにこれらの何れかの組み合わせと更に組み合わせることができる。
更に別の態様では、ＤＦＭは、以下のビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）：ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィディウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・アングラツム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｇｕｌａｔｕｍ）並びにこれらの任意の組み合わせと更に組み合わせることができる。
以下の種：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）及びペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｓｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プロピオニバクテリウム・トエニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）種及びこれらの組み合わせの細菌を挙げることができる。
本明細書に記載の、１種以上の細菌株を含む直接給与微生物は、同じタイプ（属、種及び株）のものであり得るか、又は属、種及び／若しくは株の混合物を含み得る。
代わりに、ＤＦＭは、国際公開第２０１２１１０７７８号パンフレットで開示され、以下のように要約された生成物又は微生物：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）２０８４株アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＬＳＳＡＯ１株アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１５Ａ－Ｐ４ ＡＴＣＣ株アクセッション番号ＰＴＡ－６５０７（Ｅｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯ（登録商標）（以前にはＡｖｉｃｏｒｒ（登録商標）として公知である）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株Ｃ３１０２（Ｃａｌｓｐｏｒｉｎ（登録商標）由来）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＰＢ６（Ｃｌｏｓｔａｔ（登録商標）由来）；バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）（８Ｇ－１３４）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ １０４１５（ＳＦ６８）（Ｃｙｌａｃｔｉｎ（登録商標）由来）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株Ｃ３１０２（Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）＆ＧａｌｌｉｐｒｏＭａｘ（登録商標）由来）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｇａｌｌｉｐｒｏ（登録商標）Ｔｅｃｔ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｐｏｕｌｔｒｙ ｓｔａｒ（登録商標）由来）；ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び／又はエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｐｒｏｔｅｘｉｎ（登録商標）由来）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＳＴ７１３（Ｐｒｏｆｌｏｒａ（登録商標）由来）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＣＥＣＴ－５９４０（Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）＆Ｅｃｏｂｉｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ由来）；エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＳＦ６８（Ｆｏｒｔｉｆｌｏｒａ（登録商標）由来）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＢｉｏＰｌｕｓ２Ｂ（登録商標）由来）；乳酸菌７エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（Ｌａｃｔｉｆｅｒｍ（登録商標）由来）；バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株（ＣＳＩ（登録商標）由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｙｅａ－Ｓａｃｃ（登録商標）由来）；エンテロコッカス属（Ｂｉｏｍｉｎ ＩＭＢ５２（登録商標）由来）；ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｓｐ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｂｉｏｍｉｎ Ｃ５（登録商標）由来）；ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（Ｂｉａｃｔｏｎ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｏｒａｌｉｎ Ｅ１７０７（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（２種の菌株）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＤＳＭ １１０３（Ｐｒｏｂｉｏｓ－ｐｉｏｎｅｅｒ ＰＤＦＭ（登録商標）由来）；ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）及びラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）（Ｓｏｒｂｉｆｌｏｒｅ（登録商標）由来）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ａｎｉｍａｖｉｔ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｂｏｎｖｉｔａｌ（登録商標）由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ ＳＢ ２０（登録商標）由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ ＳＣ０＆ＳＣ１０（登録商標）ＭＥ由来）；ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ）（Ｂａｃｔｏｃｅｌｌ由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡｃｔｉＳａｆ（登録商標）（以前のＢｉｏＳａｆ（登録商標））由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＣＹＣ Ｓｃ４７（Ａｃｔｉｓａｆ（登録商標）ＳＣ４７由来）；クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｍｉｙａ－Ｇｏｌｄ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｆｅｃｉｎｏｒ及びＦｅｃｉｎｏｒ Ｐｌｕｓ（登録商標）由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＣＹＣ Ｒ－６２５（ＩｎｔｅＳｗｉｎｅ（登録商標）由来）；サッカロミセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｔ（登録商標）由来）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（Ｐｒｏｖｉｔａ（登録商標）由来）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＰｅｐＳｏｙＧｅｎ－Ｃ（登録商標）由来）；バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（Ｔｏｙｏｃｅｒｉｎ（登録商標）由来）；バチルス・セレウス変種トヨイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．ｔｏｙｏｉ）ＮＣＩＭＢ ４０１１２／ＣＮＣＭＩ－１０１２（ＴＯＹＯＣＥＲＩＮ（登録商標）由来）又は他のＤＦＭ、例えばバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＢｉｏＰｌｕｓ（登録商標）ＹＣ由来）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＧａｌｌｉＰｒｏ（登録商標）由来）のように要約された生成物又は微生物：の１種以上の生成物と組み合わせることができる。
ＤＦＭは、Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓから市販されているＥｎｖｉｖａ（登録商標）ＰＲＯと組み合わせることができる。Ｅｎｖｉｖａ Ｐｒｏ（登録商標）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株２０８４アクセッション番号ＮＲＲｌ Ｂ－５００１３、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株ＬＳＳＡＯ１アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０１０４及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株１５Ａ－Ｐ４ ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－６５０７の組み合わせである（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７５４，４６９Ｂ号明細書で教示されている）。
本明細書に記載のＤＦＭは、以下の属：サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）由来の酵母と組み合わせることも可能である。
好ましくは、本明細書に記載されるＤＦＭは、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）、好ましくはＧＲＡＳ承認されている微生物を含む。
当業者であれば、食品及び／又は農業産業で使用され、且つ一般に動物による消費に適していると考えられる、本明細書で説明されている属内の微生物の特定の種及び／又は株を容易に認識するであろう。
幾つかの実施形態では、ＤＦＭは、熱に耐えられる、即ち耐熱性であることが重要である。これは、飼料がペレット化される場合に特に当てはまる。従って、別の実施形態では、このＤＦＭは、例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）を含む耐熱性細菌等の耐熱性微生物であり得る。
他の態様では、ＤＦＭは、胞子産生細菌、例えばバチルス属（Ｂａｃｈｉｌｌｉ）、例えばバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）を含むことが望ましい場合がある。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）は、増殖条件が不都合であり、熱、ｐＨ、湿度及び消毒剤に対して極めて抵抗性である場合に安定性の内生胞子を形成することができる。
本明細書で説明したＤＦＭは、病原性微生物（例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、及び／又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び／又はサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）、及び／又はカンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．））の腸内確立を低減又は予防し得る。換言すると、このＤＦＭは、抗病原性であり得る。本明細書で使用する用語「抗病原性」は、ＤＦＭが病原体の作用（負の効果）に対抗することを意味する。
上述したように、ＤＦＭは、任意の好適なＤＦＭであり得る。例えば、以下のアッセイ「ＤＦＭアッセイ」を使用すると、微生物のＤＦＭへの適合性を決定することができる。本明細書で使用するＤＦＭアッセイは、米国特許出願公開第２００９／０２８００９０号明細書でより詳細に説明されている。疑義を避けるために、本明細書で教示される「ＤＦＭアッセイ」に従って阻害株（又は抗病原性ＤＦＭ）として選択されるＤＦＭは、本開示に従った使用に好適なＤＦＭであり、即ち本開示に係る飼料添加組成物での使用に好適なＤＦＭである。
チューブに代表的なクラスター由来の代表的な病原体（例えば細菌）をそれぞれ播種した。
この播種したチューブに、好気的又は嫌気的に増殖させた潜在的ＤＦＭの上清を添加し（但し、コントロールの場合にはチューブに上清を添加しない）、インキュベートする。インキュベーション後、コントロール及び上清処理済のチューブの光学密度（ＯＤ）を各病原体に関して測定した。
次いで、コントロール（上清を少しも含まない）と比較して低いＯＤを生じる（潜在的ＤＦＭ）菌株のコロニーを阻害性株（又は抗病原性ＤＦＭ）として分類することができる。従って、本明細書で使用するＤＦＭアッセイは、米国特許出願公開第２００９／０２８００９０号明細書でより詳細に説明されている。
好ましくは、このＤＦＭアッセイにおいて使用した代表的病原体は、下記：クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、例えばウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、及び／又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び／又はサルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、及び／又はカンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）の１つ（以上）であり得る。好ましい一実施形態では、アッセイは、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、及び／又はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、及び／又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、好ましくはウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及び／又はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、より好ましくはウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の１つ以上を用いて実施される。
抗病原性ＤＦＭは、以下の細菌の１種以上を含み、それらは、国際公開第２０１３０２９０１３号パンフレット：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株アクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０５１０、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ）９１８株ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０５０８及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ）１０１３株ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＲＲＬ Ｂ－５０５０９に記載されている。
ＤＦＭは、培養物及び担体（使用される場合）として調製され得、リボンミキサー又はパドルミキサーに加えて約１５分にわたり混合され得るが、このタイミングは、増減され得る。これらの成分は、培養物と担体との均一な混合物が得られるようにブレンドされる。最終製品は、好ましくは、乾燥した流動性粉末である。次いで、１種又は複数の細菌株を含むＤＦＭを（好ましくは本明細書で説明された酵素と同時に）動物飼料若しくは飼料プレミックスに添加するか、動物のための水に添加するか、又は当技術分野で既知の他の方法で投与する。
ＤＦＭ混合物中での個々の菌株の包含は、１％～９９％の割合であり得、好ましくは２５％～７５％の割合であり得る。
動物飼料でのＤＦＭの好適な投与量は、約１×１０３ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０１０ＣＦＵ／ｇ飼料の範囲であり得、好適には約１×１０４ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０８ＣＦＵ／ｇ飼料の範囲であり得、好適には約７．５×１０４ＣＦＵ／ｇ飼料～約１×１０７ＣＦＵ／ｇ飼料の範囲であり得る。
別の態様では、ＤＭＦは、飼料原料中において、約１×１０３ＣＦＵ／ｇ飼料を超えて投与され、好適には約１×１０４ＣＦＵ／ｇ飼料を超えて投与され、好適には約５×１０４ＣＦＵ／ｇ飼料を超えて投与され、好適には約１×１０５ＣＦＵ／ｇ飼料を超えて投与され得る。
ＤＦＭは、飼料添加組成物中において、約１×１０３ＣＦＵ／ｇ組成物～約１×１０１３ＣＦＵ／ｇ組成物で投与され、好ましくは１×１０５ＣＦＵ／ｇ組成物～約１×１０１３ＣＦＵ／ｇ組成物で投与され、より好ましくは約１×１０６ＣＦＵ／ｇ組成物～約１×１０１２ＣＦＵ／ｇ組成物で投与され、最も好ましくは約３．７５×１０７ＣＦＵ／ｇ組成物～約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ組成物で投与され得る。別の態様では、ＤＦＭは、飼料添加組成物中において、約１×１０５ＣＦＵ／ｇ組成物を超えて投与され、好ましくは約１×１０６ＣＦＵ／ｇ組成物を超えて投与され、最も好ましくは約３．７５×１０７ＣＦＵ／ｇ組成物を超えて投与され得る。一実施形態では、ＤＦＭは、飼料添加組成物中において、約２×１０５ＣＦＵ／ｇ組成物を超えて投与され、好適には約２×１０６ＣＦＵ／ｇ組成物を超えて投与され、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／ｇ組成物を超えて投与される。
更に別の実施形態では、動物飼料において使用するための、単独で又は少なくとも１種の直接給与生菌と組み合わせて、又は少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は少なくとも１種の直接給与生菌及び少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、本明細書に記載されるフィターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む顆粒状飼料添加物が開示され、ここで、飼料添加組成物は、顆粒状粒子等の任意の形態であり得る。そのような顆粒状粒子は、高剪断造粒、ドラム式造粒、押出し、球形化、流動床凝集、流動床スプレーコーティング、スプレー乾燥、凍結乾燥、小球化、スプレー冷却、回転盤噴霧化、コアセルベーション、錠剤化又は上記のプロセスの任意の組み合わせの群から選択されるプロセスによって製造され得る。
更に、顆粒状飼料添加組成物の粒子は、５０μ（ミクロン）超～２０００μ未満の平均粒径を有し得る。
当業者であれば、動物飼料は、家禽累、ブタ、反芻動物、水産養殖及びペットのためのトウモロコシ、小麦、ソルガム、大豆、菜種、ヒマワリ等の植物材料又はこれらの植物材料若しくは植物タンパク質源の何れかの混合物を含み得ることを理解するであろう。成長、飼料摂取量及び飼料効率等の動物性能パラメーターだけではなく、更に向上した均質性は、動物畜舎のアンモニア濃度を低下させ、従って福祉を向上させ、且つ動物の健康状態が向上されるであろうと企図されている。
従って、動物飼料の栄養価値を向上させるための方法が開示され、ここで、本明細書に記載される改変フィターゼ又はその断片は、動物飼料に添加することができる。
本明細書で使用する語句「有効量」は、１種以上の評価指標で動物に向上した性能を付与するために必要とされる、単独で又は１種以上の他の活性薬剤（例えば、限定なく、１種以上の追加の酵素、１種以上のＤＦＭ、１種以上の精油等）と組み合わせての何れかでの活性薬剤（例えば、フィターゼ、例えば本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチドの何れか）の量に関する。
本明細書で使用する用語「動物の性能」は、飼料効率、及び／又は動物の体重増加、及び／又は飼料要求率、及び／又は飼料中の栄養素の消化率（例えば、アミノ酸消化率）、及び／又は飼料中の可消化エネルギー若しくは代謝エネルギー、及び／又は窒素保持、及び／又は動物が壊疽性腸炎の悪影響を回避する能力、及び／又は対象の免疫応答等、限定なく任意の評価指数によって決定することができる。
動物の性能の特徴としては、体重；増量；質量；体脂肪率（％）；身長；体脂肪分布；成長；成長速度；卵のサイズ；卵の重量；卵の質量；産卵率；ミネラル吸収率；ミネラル排泄、ミネラル保持率；骨の密度；骨の強度；飼料要求率（ＦＣＲ）；平均１日飼料摂取率（ＡＤＦＩ）；平均１日増量（ＡＤＧ）保持及び／又は銅、ナトリウム、リン、窒素及びカルシウムの何れか１種以上の分泌；アミノ酸保持率又は吸収率；無機質化、骨石灰化屠体収率及び屠体の質が挙げられるが、それらに限定されない。
「１種以上の評価指標で向上した動物の性能の向上」が意味するのは、飼料中での飼料添加組成物の使用によって生じる、前記飼料添加組成物を含まない飼料と比較した、本明細書に記載される飼料添加組成物を含む飼料の使用の結果として生じる、対象における増加した飼料効率、及び／又は上昇した体重増加、及び／又は減少した飼料要求率、及び／又は飼料中の栄養素若しくはエネルギーの向上した消化率、及び／又は向上した窒素保持、及び／又は壊疽性腸炎の悪影響を回避する向上した能力、及び／又は向上した免疫応答である。
好ましくは、「動物の性能の向上」は、増加した飼料効率、及び／又は上昇した体重増加、及び／又は減少した飼料要求率を意味する。本明細書で使用する用語「飼料効率」は、一定の期間中、動物に食物を適宜給与するか又は規定量の食物を給与する場合に起こる、動物の体重増加の量を指す。本明細書で使用する「評価指標における向上」又は「向上した評価指標」は、動物の定義における評価指標化で列挙したパラメーターの少なくとも１つにおける向上を指す。
「飼料効率の増加」は、飼料中における本発明に係る飼料添加組成物の使用による、前記飼料添加組成物が存在せずに給与された動物と比較した、飼料摂取の単位当たりの体重増加の上昇を意味する。
本明細書で使用する用語「飼料要求率」は、動物の体重を規定量だけ増加させるために動物に給与される飼料の量を指す。
飼料要求率の向上は、より低い飼料要求率を意味する。
「より低い飼料要求率」又は「飼料要求率の向上」が意味するのは、飼料中での飼料添加組成物の使用により、飼料が前記飼料添加組成物を含まない場合に動物の体重を同量だけ増加させるために必要とされる飼料の量と比較して、動物の体重を規定量だけ増加させるために動物に給与する必要がある飼料の量が低いことである。
性能パラメーターにおける向上は、使用される飼料がフィターゼを含まない対照と比較したものであり得る。
用語「脛骨灰分」は、骨石灰化についての定量方法に関する。このパラメーターは、リンが不足しているか（例えば、含量は、リン欠乏性陰性対照食事において低くなければならない）、又は十分であるか（例えば、フィターゼ処置における含量は、ブロイラーにおけるリン要件を満たす陽性対照に匹敵する）についての指示を与える。
用語「リン欠乏飼料」は、リンのレベルが動物の栄養要件を満たすために十分ではない食餌、米国学術研究会議（ＮＲＣ）又はブロイラー畜産家による推奨レベルよりはるかに低いリンのレベルを備えて処方された飼料を指す。動物飼料は、最適な成長のために必要とされるよりも低いレベルのミネラルを含有する。食餌にリンが欠乏している場合、カルシウムも動物によって摂取されないであろう。過剰のＣａは、不良なリン（Ｐ）消化率をもたらす可能性があり、不溶性のミネラル－フィターゼ錯体の形成に寄与するＰ及びＣａの両方の欠乏は、骨格完全性の低下、正常以下の成長及び最終的に体重減少を誘発し得る。
用語「無機質化」又は「無機質化」は、ミネラル沈着又はミネラルの遊離を含む。ミネラルは、動物の身体から沈着又は遊離され得る。ミネラルは、飼料から遊離され得る。ミネラルは、動物の食餌において必要な任意のミネラルを含み得、且つカルシウム、銅、ナトリウム、リン、鉄及び窒素を含み得る。好ましい一実施形態では、本発明の食品又は飼料中の改変フィターゼポリペプチド又はその断片の仕様は、動物の身体内、特に骨内のカルシウム沈着の増加をもたらす。
本明細書で使用する栄養素消化率は、消化管又は消化管の特定の区域、例えば小腸から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化率は、対象に投与されたものと、対象の糞便中に出るものとの間の差異として測定され得るか、又は対象に投与されたものと、消化管の特定の区域（例えば、回腸）の消化管内容物中に残存するものと間の差異として測定され得る。
本明細書で使用する栄養素消化率は、ある期間中の栄養素の摂取と、排泄物の総回収量による排泄された栄養素との間の差異により測定され得るか；又は動物により吸収されず、且つ全消化管で若しくは消化管のある区域で消失した栄養素の量を研究者が算出することを可能にする不活性マーカーの使用により測定され得る。そのような不活性マーカーは、二酸化チタン、酸化クロム又は酸不溶性灰分であり得る。消化率は、飼料中の栄養素の百分率として表され得るか、又は飼料中の栄養素の質量単位当たりの可消化栄養素の質量単位として表され得る。
本明細書で使用する栄養素消化率は、デンプン消化率、脂肪消化率、タンパク質消化率及びアミノ酸消化率を包含する。可消化リン（Ｐ）は、動物による回腸の末端で吸収される全Ｐ摂取量又は便中に排泄されない全Ｐ摂取量の比率である回腸可消化Ｐであると定義できる。
本明細書で使用する用語「生存数」は、生存している対象の数を意味する。用語「生存数の向上」は、「死亡数の減少」の別の言い方である。
本明細書で使用する用語「屠体収率」は、食肉処理の商業プロセス又は試験プロセス後の生体重に占める割合としての屠体の量を意味する。用語「屠体」は、頭部、内臓、肢の一部及び羽又は皮膚が除去された、食物用に食肉処理されている動物の身体を意味する。本明細書において使用する用語「採肉歩留まり」は、生体重の比率としての食用肉の量又は生体重の比率としての規定の切り出し肉の量を意味する。
用語「枝肉品質」及び「肉品質」は、互換的に使用され、組成の質（赤身対脂肪比）並びに外観、におい、硬度、肉汁の多さ、柔軟性及び風味等の嗜好性を指す。例えば、「木質胸肉」を有していない家禽を生産する。「木質胸肉」は、米国内の鳥肉の小さい比率における筋肉異常を原因とする品質問題である。この状態は、品質不良な質感を伴う、触ると固く色が青ざめていることが多い鶏の胸肉を生じさせる。木質胸肉は、人々にとっての健康又は安全性の懸念を引き起こすことはなく、鶏自体の福祉が悪影響を受けることはない。
「体重増加の増加」は、飼料添加組成物が存在しない飼料が給与される動物と比較した、前記飼料添加組成物を含む飼料の給与時の動物の体重増加を指す。
これに関連して、用語「ペットフード」は、限定されるものではないが、家庭用動物、例えばイヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット；鳥類ペット、例えばカナリア、インコ及びオウム；爬虫類ペット、例えばカメ、トカゲ及びヘビ；水生動物、例えば熱帯魚及びカエルのための食品を意味すると理解されるものとする。
用語「動物飼料組成物」、「飼料」、「飼料原料」及び「家畜飼料」は、互換的に使用され、下記：ａ）穀類、例えば小粒穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、カラス麦及びこれらの組み合わせ）並びに／又は大粒穀物（例えば、トウモロコシ若しくはソルガム）；ｂ）穀類の副産物、例えばトウモロコシグルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）（特にトウモロコシベースの可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米ふすま、もみ殻、カラス麦殻、パーム核及びシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、綿、菜種、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマ等の供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油脂；並びに／又はｅ）ミネラル及びビタミンを含む群から選択される１種又は複数の飼料材料を含み得る。
本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片又はそのような改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片を含む飼料添加組成物は、飼料中に又は飼料の調製において使用され得る。
従って、本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかを含む動物飼料中に使用するための乾燥酵素組成物について記載される。
本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかを含む動物飼料中に使用するための液体酵素組成物についても記載される。
用語「飼料添加組成物」及び「酵素組成物」は、本明細書では互換的に使用される。
飼料は、使用、及び／又は適用様式、及び／又は投与様式に応じて、溶液の形態であるか又は固体若しくは半固体としてのものであり得る。
好ましい一実施形態では、本発明に記載される飼料添加組成物は、飼料原料を形成するために飼料成分と混合される。
本明細書で使用する用語「飼料成分」は、飼料の全部又は一部を意味する。飼料の一部は、飼料原料の１種の成分を意味し得るか、又は飼料の複数の成分、例えば２種、又は３種、又は４種以上を意味し得る。
一実施形態では、用語「飼料成分」は、プレミックス又はプレミックス構成要素を包含する。好ましくは、飼料は、家畜飼料又はそのプレミックス、配合飼料又はそのプレミックスであり得る。飼料添加組成物は、配合飼料、配合飼料成分と混合され得るか、或いは配合飼料のプレミックス又は家畜飼料、家畜飼料成分若しくは家畜飼料のプレミックスに混合され得る。
家畜飼料は、切断されている植物を包含する。更に、家畜飼料には、サイレージ、圧縮及びペレット化飼料、油及び混合飼料並びに更に胚芽穀粒及びマメ類が含まれる。
好適には、本明細書で言及されているプレミックスは、微量成分（例えば、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵生成物及び他の必須成分）から構成される組成物であり得る。プレミックスは、通常、市販の飼料にブレンドするのに適した組成物である。
本明細書で使用する用語「接触した」は、改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片（又は改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片の何れかを含む組成物）の生成物（例えば、飼料）への間接的又は直接的適用を指す。使用し得る適用方法の例としては、飼料添加組成物を含む物質中で生成物を処理する方法、飼料添加組成物を生成物と混合することにより直接適用する方法、飼料添加組成物を生成物の表面に噴霧する方法又は生成物を飼料添加組成物の調製物中に浸漬する方法が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、本発明の飼料添加組成物は、好ましくは、生成物（例えば、飼料原料）と混合される。代わりに、飼料添加組成物は、飼料原料のエマルション又は原料成分に含め得る。一部の適用のためには、組成物は、影響を受ける／処理される製品の表面上において又は表面に利用可能にされることが重要である。これにより、この組成物が性能上の利益を付与することが可能になる。
幾つかの態様では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、食品又は飼料の前処理のために使用することができる。例えば、１０～３００％の水分を有する飼料は、好気性条件下において、１分間～７２時間又は嫌気性条件下で１日間～２カ月間にわたり、５～８０℃、好ましくは２５～５０℃、より好ましくは３０～４５℃で改変フィターゼポリペプチド又はその断片と混合及びインキュベートされる。前処理された材料は、動物に直接給餌され得る（いわゆる液体給餌）。前処理された材料は、６０～１２０℃の高温でペレット化することもできる。改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、真空コーターによって飼料又は食品材料に含浸させることができる。
本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片（又はそのような改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片を含む組成物）の何れかは、制御された量の前記酵素と共に生成物（例えば、飼料原料又は飼料原料の生原料）を散在させ、コーティングし、且つ／又は含浸させるために適用され得る。
別の態様では、この飼料添加組成物は、粉末を生成するために均質化され得る。粉末は、当技術分野において公知の他の成分と混合され得る。粉末又は粉末を含む混合物は、ダイに通して押し出すことができ、得られたストランドは、可変長の好適なペレットに切断される。
任意選択的に、ペレット化工程は、ペレットの形成前に蒸気処理又はコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物は、コンディショナー（例えば、蒸気注入を有するミキサー）に入れることができる。この混合物は、コンディショナー中で６０～１００℃等の特定の温度まで加熱されるが、典型的な温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃又は９５℃であろう。滞留時間は、数秒間～数分間で変動し得る。本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片（又はそのような改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片を含む組成物）の何れかは、任意の適切な飼料材料に添加するために好適であることが理解されるであろう。
他の実施形態では、顆粒は、飼料ペレット化プロセスを使用して飼料中に導入できるが、飼料前処理プロセスは、最大数分間までにわたって７０℃～９５℃、例えば８５℃～９５℃で実施することができる。
幾つかの実施形態では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、純粋酵素タンパク質に基づいて１ｐｐｂ（１０億分率）～１０（ｗ／ｗ）％の範囲内で飼料中に存在し得る。幾つかの実施形態では、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、１～１００ｐｐｍ（百万分率）の範囲内で飼料原料中に存在する。好ましい用量は、飼料生成物若しくは飼料組成物１トン当たり又は最終試料生成物中の改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片の最終用量１～２０ｐｐｍ当たり１～２０ｇの改変フィターゼポリペプチド又はその断片である。
好ましくは、飼料中に存在する改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、大まかには改変フィターゼポリペプチド又はその断片０．１～２０ｍｇ（タンパク質）／ｋｇに対応する少なくとも約５０～１０，０００ＦＴＵ／ｋｇでなければならない。
範囲には、上記で考察した下限及び上限範囲の任意の組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。
本明細書に記載される改変フィターゼポリペプチド又はその断片及び組成物の何れかを含む処方物及び／又は調製物は、この処方物が活性フィターゼ酵素を含むことを保証するための任意の好適な方法で製造することができる。そのような処方物は、被覆／保護されていない可能性がある液体、乾燥粉末又は顆粒であり得るか、又はプロセス条件に依存して熱保護コーティングの使用を含む可能性がある。上述したように、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、保護コーティングの特別な必要を伴わず、固体担体上で費用をかけずに処方することができ、それでもなおコンディショニング及びペレット化プロセスを通して活性を維持できることに留意されたい。固体形態で適用された場合に追加の熱安定性を提供するための保護コーティングは、より過酷な条件が使用される場合又は例えば９０℃を超えるスーパーコンディショニング飼料の場合におけるような条件がそれを正当化する場合、所定の領域で必要とされる場合にペレット化安定性を得るために有益である。
本明細書に記載の飼料添加組成物は、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（ＴＰＴ顆粒と呼ばれる）、又は同第１９９７／０１６０７６号パンフレット、又は同第１９９２／０１２６４５号パンフレット（これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載の乾燥粉末又は顆粒に調製することができる。
一実施形態では、飼料添加組成物は、コア；活性物質（例えば、本明細書に開示した改変フィターゼポリペプチドの何れか等のフィターゼ）；及び少なくとも１種のコーティングを含む飼料組成物のための顆粒として処方され得、顆粒の活性物質は、ａ）飼料ペレット化プロセス、ｂ）蒸気加熱飼料前処理工程、ｃ）貯蔵、ｄ）非ペレット化混合物中の成分としての貯蔵、並びにｅ）微量ミネラル、有機酸、還元糖、ビタミン類、塩化コリン及び酸性又は塩基性の飼料基剤ミックス又は飼料プレミックスを生じさせる化合物から選択される少なくとも１種の化合物を含む飼料基剤ミックス又は飼料プレミックス中の成分としての貯蔵の１つ以上から選択された条件を受けた後、少なくとも５０％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも８０％の活性を維持する。
顆粒に関して、少なくとも１種のコーティングは、顆粒の少なくとも５５重量／重量％を占める水分水和物質を含み得；及び／又は少なくとも１種のコーティングは、２種のコーティングを含み得る。２種のコーティングは、水分水和コーティング及び水分バリアコーティングであり得る。幾つかの実施形態では、水分水和コーティングは、顆粒の２５重量／重量％～６０重量／重量％であり得、水分バリアコーティングは、顆粒の２重量／重量％～１５重量／重量％であり得る。水分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン及びマルトデキストリンから選択され得、水分バリアコーティングは、ポリマー、ガム、ホエイ及びデンプンから選択され得る。
他の実施形態では、顆粒は、飼料ペレット化プロセスを使用して飼料中に導入できるが、飼料前処理プロセスは、最大数分間までにわたって７０℃～９５℃、例えば８５℃～９５℃で実施することができる。
飼料添加組成物は、コア；活性剤であって、貯蔵後及び顆粒が成分である蒸気加熱ペレット化プロセス後、少なくとも８０％の活性を保持する顆粒の活性剤；水分バリアコーティング；及び顆粒の少なくとも２５重量／重量％である水分水和コーティングを含む動物飼料のための顆粒であって、蒸気加熱ペレット化プロセス前に０．５未満の水分活性を有する顆粒に処方化され得る。
顆粒は、ポリマー及びガムから選択される水分バリアコーティングを有し得、水分水和物質は、無機塩であり得る。水分水和コーティングは、顆粒の２５重量／重量％～４５重量／重量％であり得、水分バリアコーティングは、顆粒の２重量／重量％～１０重量／重量％であり得る。
代わりに、組成物は、消費に適した液体処方物中に存在し、好ましくは、そのような液体消費物は、下記：バッファー、塩、ソルビトール及び／又はグリセロールの１種以上を含有する。
更に、飼料添加組成物は、例えば、粉砕小麦等の担体基質上に酵素を適用する、例えばスプレーすることによって処方され得る。
一実施形態では、飼料添加組成物は、プレミックスとして処方され得る。ごく一例ではあるが、プレミックスは、１種以上のミネラル類及び／又は１種以上のビタミン類等の１種以上の飼料成分を含み得る。
一実施形態では、直接給与生菌（「ＤＦＭ」）及び／又は改変フィターゼポリペプチド若しくはその断片は、下記：少なくとも１種のマルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、小麦又は小麦成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビン酸塩、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びこれらの混合物の少なくとも１種から選択される少なくとも１種の生理学的に許容される担体と共に処方化され得る。
改変フィターゼポリペプチド又はその断片の何れかは、顆粒適用、例えば非食品／飼料適用、例えばエタノール産生のための顆粒の加工処理において有用な可能性があることに留意されたい。
本明細書で開示されている組成物及び方法の非限定的な例としては、下記が挙げられる：
１．配列番号１に規定されたアミノ酸配列と少なくとも８２％の配列同一性を有する、フィターゼ活性を含む改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
２．改変フィターゼポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列は、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片について表１１に規定された少なくとも約１２００の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スコアを有する、実施形態１の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
３．配列番号１に規定されたアミノ酸配列のアミノ酸１４～３２５位と少なくとも７８％の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
４．実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約５０％の飼料中ペレット化回収率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片（実施形態１、２又は３の改変フィターゼポリペプチド又はその断片等）。
５．実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約５０％の飼料中ペレット化回収率を有する、実施形態１又は２の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
６．実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約０．７の飼料中ペレット化回収率の比率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片（実施形態１、２、３、４又は５等）。
７．実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約０．７の飼料中ペレット化回収率の比率を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片（実施形態１、２、３、４、５又は６等）。
８．実施例３に記載される示差走査熱量測定アッセイ条件を用いて、少なくとも約９２．５℃のＴｍ温度を含む、実施形態１、２、３、４、５、６又は７の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
９．実施例３に記載されるアッセイ条件下において、ｐＨ３．５で、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの比活性を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７又は８の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
１０．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックスであって、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、（ｉ）単独で、又は（ｉｉ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌、若しくは（ｉｉｉ）少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｉｖ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌及び少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｖ）少なくとも１種の他の飼料添加成分を更に含む（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）の何れかで使用され得、及び任意選択的に、改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、少なくとも約０．１ｇ／トン飼料の量で存在する、動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックス。
１１．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された生成宿主において機能的である調節配列を含む組み換え構築物。
１２．生成宿主は、細菌、真菌、酵母、植物及び藻類からなる群から選択される、実施形態１１の組み換え構築物。
１３．改変フィターゼポリペプチド又はその断片を生成するための方法であって、
（ａ）生成宿主を実施形態１１の組み換え構築物で形質転換させる工程；及び
（ｂ）改変フィターゼポリペプチド又はその断片が生成される条件下で工程（ａ）の生成宿主を培養する工程
を含む方法。
１４．改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、任意選択的に、生成宿主から回収される、実施形態１３による方法。
１５．実施形態１３又は１４の方法によって得られるフィターゼ含有培養上清。
１６．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列。
１７．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９の改変フィターゼポリペプチド又はその断片又はその断片を含む動物飼料中で使用するための乾燥酵素組成物。
１８．顆粒状飼料添加組成物である、実施形態１７の乾燥酵素組成物。
１９．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための液体酵素組成物。
２０．動物飼料の栄養価値を向上させるための方法であって、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９の改変フィターゼ又はその断片は、動物飼料に添加される、方法。
２１．１つ以上の評価指数上の動物の性能を向上させるための方法であって、有効量の、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９の改変フィターゼポリペプチド又は実施形態１０若しくは１１の動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物若しくはプレミックスを動物に投与する工程を含む方法。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
本開示は、下記の実施例において更に定義される。これらの実施例は、好ましい実施形態を示しているが、例示するためにのみ提供されていることを理解すべきである。上記の考察及び実施例から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認し得、且つ本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合するように様々な変更形態及び修正形態をなし得る。
実施例１
フィターゼ分子の生成
フィターゼ遺伝子を生成するためのＤＮＡ操作は、当技術分野において知られている分子生物学技術を用いて実施した。様々なフィターゼのためのコーディング配列に対応するポリヌクレオチド断片は、真菌発現宿主トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））のために好ましいコドンを用いて合成し、ＰＣＲ技術を用いてランダムに再構築した。ｐｅｐ１イントロンによって人工的に中断されるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）（配列番号６３）由来のｐｅｐ１アスパラギン酸プロテアーゼ由来のシグナル配列は、各フィターゼ遺伝子のＮ末端（５’末端）で導入した。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組み換え技術を使用して、供給業者の勧告に従ってｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）内にこれらの遺伝子を導入した。生じたエントリープラスミドをデスティネーションベクターｐＴＴＴｐｙｒ２により組み換えると最終発現ベクターが生じた。ｐＴＴＴｐｙｒ２は、ｐｙｒＧ遺伝子がｐｙｒ２遺伝子と置換されている以外、以前に記載されたｐＴＴＴｐｙｒＧベクターに類似している（ＰＣＴ公報の国際公開第２０１１／０６３３０８号パンフレット）。ベクターｐＴＴＴｐｙｒ２は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーター領域、アスペルギルス・インデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びａｍｄＳ選択マーカー、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカー並びにＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）由来のテロメア配列（複製用）を含有している。これらのプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）内で増殖させ、ＤＮＡを生成して配列を検証した。
ハイスループットの形質転換、植菌、発酵及び採取を含む全ての真菌操作は、９６ウエルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）内で実施した。プラスミドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－プロトプラスト法を用いて、好適なＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主菌株内に形質転換させた。手短には、総量５０μＬ中におよそ０．５～２μｇのＤＮＡ及び５×１０６個のプロトプラストを含有する形質転換混合物を２００μＬの２５％のＰＥＧ溶液により処理し、その後、等量の１．２Ｍのソルビトール／１０ｍＭのＴｒｉｓ／１０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．５）溶液により希釈した。次に、浸透圧を維持するためにソルビトールを含有する液体増殖培地中でプロトプラストを再生させた。１００μＬの形質転換混合物は、ソルビトール（０．３０Ｍ～０．８４Ｍ）が補給された３００μＬの最小培地を含有する９６ウエルのＭＴＰに移した。プレートは、真菌の菌糸体が形成されるまで、湿度８０％を伴う２８℃のシェーカーインキュベーター内で３日間増殖させた。必要に応じて、１０ｍＭのアセトアミドを含む新鮮最小培地に選択圧を強化するために２０μＬの増殖培養液を移し、更に２日間増殖させた。
フィターゼタンパク質を発現させるために、形質転換Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）菌株を次のように培養した：２０μＬの液体培養を使用して、９６ウエルのＭＴＰ内に、４００μＬの生産培地（９ｇ／Ｌのカザミノ酸、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳバッファー（ｐＨ５．５）、０．２５％のＴ．ｒｅｅｓｅｉ（Ｔ．リーゼイ）微量元素（１００％：１７５ｇ／Ｌのクエン酸（無水）、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３）に植菌した。ＭＴＰは、上述と同一の増殖条件下のシェーカーインキュベーター内でインキュベートした。５日間発酵させた後、培養物は、親水性ＰＶＤＦ膜を用いる遠心分離によって濾過すると浄化上清が得られたため、これを組み換えフィターゼ酵素の分析のために使用した。
実施例２
フィターゼ酵素の調製及び特性解析
タンパク質の精製及び標準化
組み換えフィターゼ酵素をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｓｅｅｉ）菌株は、上述したように培養し、浄化上清を使用してフィターゼ酵素を精製した。濾過した培養上清は、洗浄用バッファー（２５ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５）を用いて５倍に希釈し、ＭＴＰフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔディープウエルフィルタープレートの９６ウエルのＭＴＰ、０．４５μＭの親水性膜、＃ＭＤＲＬＮ０４１０）を用いて平衡化したカチオン交換樹脂（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ ４０Ｓ、Ｂｉｏ－Ｗｏｒｋｓ製）上に装填した。ＭＴＰを遠心分離機に配置し、灌流液は、１分間の遠心分離（１００×ｇ）中に廃棄した。フィターゼタンパク質試料は、１分間の遠心分離（１００×ｇ）中に溶出バッファー（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を使用して溶出させた。タンパク質精製工程からの試料は、９６ウエルのＵＶ ＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ，３６３５）中の１００μＬの最終容量に酢酸ナトリウムバッファー（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）により５倍に希釈した。試料の吸光度を２８０ｎｍで測定し、タンパク質濃度は、０～１７５０ｐｐｍの範囲内に及ぶ公知の濃度を備えるフィターゼタンパク質の標準曲線に従って計算した。決定されたタンパク質濃度に基づいて、精製からの全試料は、下記に記載するアッセイにおいて使用するまで、９６ウエルのＭＴＰ中のバッファー（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５））中の１５０ｐｐｍの標的まで希釈し、５℃で貯蔵した。
各試料中のフィターゼタンパク質濃度は、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって決定した。標準化試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣ上のＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００カラム（ＳＢ－Ｃ３ ２．１×５０ｍｍ）上に装填した。溶媒Ａ（０．１体積／体積％のＴＦＡ水溶液）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．０７％のＴＦＡ）の勾配は、表２に従って適用した。試料注入量は、１０μＬであり、カラム温度は、６０℃であり、流速は、１ｍＬ／分であった。溶離液の吸光度を２２０ｎｍで測定し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して統合した。フィターゼ試料のタンパク質濃度は、０～３５０ｐｐｍの範囲をカバーする公知の濃度を備えるフィターゼタンパク質の標準曲線上で決定した。
Figure 2022513085000004
試料であるフィターゼＰＨＹ－１１８９５、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１２６６３並びに市販製品のＱｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５Ｇ及びＮａｔｕｐｈｏｓ Ｅ１００００Ｇ（実施例５に記載される抽出方法）の精製は、下記のように実施した。試料は、ＰＤ１０カラム（バッファー（１０～３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））を用いて予備平衡化した）上でバッファー交換し、引き続いて疎水性相互作用クロマトグラフィーＨＩＣを用いて精製した。試料に依存して、下記のＨＩＣカラムの１つを使用した（フェニルＨＰ ＸＫ２６又はＨｉＴｒａｐフェニルＨＰ又はフェニル１５、ＨＲ５／５）。ＨＩＣカラムは、ローディングバッファー（１．０～１．３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中で予備平衡化した。結合フィターゼタンパク質は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中の硫酸アンモニウムの線形勾配を使用して溶出させた。ＨＩＣカラムから収集した分画は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ Ｍ、ＸＫ５０／３５又はＰＤ１０カラム（バッファー１０～３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて予備平衡化）の何れかを用いてバッファー交換した。全精製フィターゼ試料（フィターゼＰＨＹ－１１８９５、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１２６６３並びに市販製品Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５Ｇ及びＮａｔｕｐｈｏｓ Ｅ １００００ Ｇ）の抽出物の最終純度は、９５％を超えると推定される。最終精製試料中のタンパク質濃度は、２８０ｎｍで分光光度計によって吸光度を測定し、計算吸光係数を使用することによって決定した。２種の市販製品（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５Ｇ及びＮａｔｕｐｈｏｓ Ｅ １００００ Ｇ）のために、２種の密接に関連する公衆フィターゼ配列（配列番号６１及び配列番号６０）の計算減衰係数を使用した。モル吸光係数は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（登録商標）ソフトウエアバージョン１０．２．４を用いて計算した。
実施例３
フィターゼ酵素についてのインビトロアッセイ
下記のアッセイは、高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ペプチド及びその断片並びに市販で入手できるフィターゼの様々な特性を測定するために使用した。
参照フィターゼ活性（ＦＴＵ）
フィターゼ試料を参照フィターゼ活性法（ＦＴＵ）によって活性についてアッセイした。下記の修正ＩＳＯ３００２４手順：「Ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｕｆｆｓ － Ｄｔｅｒｎｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（動物飼料原料－フィターゼ活性の決定）」を使用した：分析のために準備するために、液体フィターゼ試料は、下記のＦＴＵフィターゼアッセイにおける線形範囲のホスファターゼ標準曲線内で測定値を得るために、アッセイバッファー（２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ２及び０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ５．５）中で希釈した。固体試料について、１．０ｇの試料を計量し、１００ｍＬのアッセイバッファー中で２０分間にわたりマグネティックスターラー上で混合することによって抽出した。上清をろ過（ガラスファイバーフィルター、ＧＡ－５５、Ａｄｖａｎｔｅｃ）後に収集し、およそ０．０４ＦＴＵ／ｍＬに更に希釈した。試料の分析は、下記の手順に従って実施した：１ｍＬの希釈フィターゼ試料をアッセイバッファー中の２ｍＬの７．５ｍＭのＩＰ６基質溶液（Ｒｉｃｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＡＺ Ｉｍｐｏｒｔ ａｎｄ Ｅｘｐｏｒｔ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｏｒｉｅｎｔ Ｐｈｙｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ製のフィターゼナトリウム＃Ｚ０２０１３０１１８１）と混合し、３７℃で６０分間にわたり水浴中でインキュベートした。２ｍＬの酸性モリブデン酸／バナジン酸試薬を用いて反応を停止させ、無機リン酸塩の含量を分光光度法によって４１５ｎｍで定量した。結果は、フィターゼ試料の吸光度からバッファーブランクの吸光度を減じることによって補正した。リン酸塩の標準曲線は、無水リン酸水素カリウムから生成し、これを使用して各試料からの遊離リン酸塩の量を計算した。１ＦＴＵを１分当たり１μモルのリン酸塩を生成するフィターゼ酵素の量であると定義した。
ｐＨ３．５又は５．５でのＩＰ６基質上への比活性
フィターゼは、ＩＰ６基質溶液（Ｒｉｃｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＡＺ Ｉｍｐｏｒｔ ａｎｄ Ｅｘｐｏｒｔ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｏｒｉｅｎｔ Ｐｈｙｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ製のフィターゼナトリウム、＃Ｚ０２０１３０１１８１）を使用してフィターゼ活性についてアッセイした。ｐＨ５．５で評価するために、１５０ｐｐｍの濃度でのフィターゼ酵素試料を分析前に３８４ＭＴＰ中の１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、０．０２５％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．０５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．５の０．１８ｐｐｍの最終濃度に連続希釈した。１００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０２５％のＴｗｅｅｎ ２０及び０．０５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ５．５）中の４７μＬのＩＰ６基質（０．２０ｍＭ）を３８４ＭＴＰの各ウエルに添加し、３μＬの希釈フィターゼ酵素試料を５０μＬの最終容量に対して添加した。
ｐＨ３．５での活性を評価するために、１５０ｐｐｍの濃度でのフィターゼ酵素試料は、分析前に３８４ＭＴＰ中の１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、０．０２５％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．０５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ５．５）の０．１１ｐｐｍの最終濃度に連続希釈した。１００ｍＭのグリシン、０．０２５％のＴｗｅｅｎ ２０及び０．０５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ３．３）中の４７μＬのＩＰ６基質（０．２０ｍＭ）を３８４ＭＴＰの各ウエルに添加し、３μＬの希釈フィターゼ酵素試料を５０μＬの最終容量に対して添加した。
ＭＰＴ反応プレートを連続的に混合しながら（１４００ｒｐｍ）ｉＥＭＳシェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内の２５℃で１０分間にわたりインキュベートし、４５μＬのＰｉ Ｂｌｕｅ停止試薬（ＰｉＢｌｕｅ（商標）リン酸塩アッセイキット、ＰＯＰＢ－ＤＰ，ＢｉｏＡｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳ）の添加によって反応を停止させた。プレートを混合して密封し、その後、ｉＥＭＳシェーカー（６５０ｒｐｍ）内で２５℃、３０分間にわたって発色させるためにインキュベートした。インキュベーション後、プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で６２０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって発色を決定した。各フィターゼ試料のＩＰ６基質への活性は、３回の反復試験の平均値として、０～３５０ｐｐｍの範囲に及ぶ公知の濃度及び活性を有するフィターゼタンパク質の近似標準曲線に基づいて計算した。引き続いて各フィターゼ試料のμモル（リン酸塩）／ｍｇ／分での比活性は、ｐＨ３．５又は５．５での活性を（実施例２に記載されるように）ＲＰ－ＨＰＬＣによって決定されたフィターゼのタンパク質濃度で割ることによって計算した。
表３Ｂ及び表２１上に記載されるフィターゼ変異体について、サンプル調製及び活性分析は、本明細書に記載されるように実施した。精製タンパク質（実施例２）のアリコートをバッファー（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中で１００ｐｐｍの標的濃度に希釈し、その後、１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、０．０２５％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．０５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ５．５）を使用して０．１ｐｐｍの最終濃度に連続希釈した。引き続いて、ｐＨ５．５及び３．５での活性は、３８４ウエルのＭＴＰの代わりに９６ウエルのＭＴＰ中で行ったこと以外、実施例３に記載されるように決定した（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０２５％のＴｗｅｅｎ ２０及び０．０５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ５．５中で７０μＬのＩＰ６基質（０．２０ｍＭ）を希釈酵素の１０μＬのアリコートと反応させた。反応は、１７０μＬのＰｉ Ｂｌｕｅ試薬を使用して停止させた）。
ＤＳＣによる融解温度（Ｔｍ）の決定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、ＭｉｃｒｏＣａｌ（商標）ＶＰ－キャピラリーＤＳＣシステム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。ＤＳＣは、タンパク質及び他の生体分子の安定性を特徴付けるための強力な分析ツールである。ＤＳＣは、溶液中の熱誘導性構造転移のエンタルピー（ΔＨ）及び温度（Ｔｍ）を測定する。１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中で０．４ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈したフィターゼタンパク質試料を調製した。これらのタンパク質試料４００μＬ並びに同一量のタンパク質非含有バッファーを含有する参照物質を９６ウエルプレートに添加した。このプレートを１０℃に維持した温度制御式オートサンプラー区画内に入れた。タンパク質試料及び参照物質は、１分間当たり２℃の走査速度で２０～１２０℃に走査した。融解温度（Ｔｍ）は、折り畳まれた状態から折り畳まれていない状態への転移のピーク最大値にある温度として決定した。Ｔｍにおける最大変動は、±０．２℃であった。ＯＲＩＧＩＮソフトウエアパッケージ（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をベースライン値減算及びＴｍ値の計算のために使用した。
実施例４
フィターゼ酵素の比活性及び熱安定性評価
実施例１及び実施例２に記載される方法を用いて生成した高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片の試料を対象に、実施例３に記載される方法を用いて、ｐＨ３．５及び５．５でのそれらの比フィターゼ活性及びそれらの熱安定性について評価した。本試験には市販のフィターゼ製品であるＱｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ（登録商標）（ＡＢ Ｖｉｓｔａ）及びＮａｔｕｐｈｏｓ（登録商標）１００００ Ｅ（ＢＡＳＦ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）を含めた。これらの２種の製品を選択したのは、それらが市販で入手できる中で最も本質的に熱安定性製品であるからである。表３Ａ及び３Ｂは、μモル（リン酸塩）／ｍｇ／分としてのｐＨ３．５及びｐＨ５．５での比活性及びＤＳＣによって測定された℃での熱安定性（Ｔｍ）についての試験結果を提供しており、ここで、ＮＤは、数値が決定されなかったことを示す。結果は、全ての高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片が市販製品のＴｍをはるかに超えるＴｍ値を提示することを示している。これらの高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片は、ｐＨ５．５での市販製品の比活性に匹敵するか又はより高い比活性を示している。ｐＨ３．５での高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片の比活性は、全部が市販製品より高い。より高い熱安定性は、ＭＬＡに特にペレット化条件又は固体処方物に適用した場合、高度に有益であり得る。酸性ｐＨでのより高い比活性は、単胃動物の消化管内に存在する酸性条件下では高度に有益であり得る。
Figure 2022513085000005
Figure 2022513085000006
Figure 2022513085000007
高解像度質量分析法（ＭＳ）は、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片である、ＰＨＹ－１３５９４、ＰＨＹ－１１８９５、ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３８８５、ＰＨＹ－１３９３６、ＰＨＹ－１４００４、ＰＨＹ－１４２５６及びＰＨＹ－１４２７７（配列番号１、８、１１、１７、２２、２６、２７、２８、３０、３１）のアミノ酸配列を確証するために実施した。ＭＳ分析は、配列番号：１、８、１１、１７、２２、２６、２７、２８、３０、３１の予測Ｃ末端を確証した。更に、ＭＳ分析は、配列番号：１、８、１１、１７、２２、２６、２７、２８、３０、３１のＮ末端の切断を解明した。最も一般的に観察されるＮ末端アミノ酸は、予測成熟配列と比較して第４位に相当するが、２、３、５、６、７、９、１０位での切断も観察された。
実施例５
フィターゼ酵素のペレット化安定性試験
高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片の飼料中ペレット化回収率試験は、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｄｒ．Ｓｔｅｎｄｅｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）ペレット化施設で実施された。飼料中ペレット化回収率は、特異的試料マトリックス、コンディショニング及びペレット化条件、活性を決定するために使用されたアッセイ等を含む数種の因子に左右されることに留意されたい。
フィターゼ酵素の飼料中ペレット化回収率：ＰＨＹ－１１８９５、ＰＨＹ－１１９３２、ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１３５９４、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３８８５、ＰＨＹ－１３９３６、ＰＨＹ－１４２５６、ＰＨＹ－１４２７７及び参照物質である市販のフィターゼＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ ５Ｇ（ＡＢ Ｖｉｓｔａ）及びＮａｔｕｐｈｏｓ（登録商標）Ｅ １００００ Ｇ（ＢＡＳＦ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）を測定した。参照物質の市販のフィターゼ試料の液体試料は、１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５を用いて粉末生成物であるＱｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５ Ｇ及びＮａｔｕｐｈｏｓ Ｅ １００００ Ｇからフィターゼ酵素を抽出することによって得た。液体フィターゼ酵素試料の活性は、実施例３に記載し、それに従って飼料内に投与した参照フィターゼ活性アッセイ（ＦＴＵ）を用いて測定した。ペレット化安定性試験のための固体試料は、下記の手順に従って全粒小麦担体にＰＨＹ－１１８９５、ＰＨＹ－１１９３２、ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３８８５の液体試料を適用することによって作製した。粉砕した全粒小麦をギザギザのナイフブレードを装備したクープミキサーに移した。液体フィターゼ試料（最大４０体積／重量％）は、混合しながら粉砕した全粒小麦粉末に添加した。液体フィターゼ試料及び粉砕した全粒小麦粉末の混合物は、トレイの上に載せ、４０℃のオーブン内で８～１０時間にわたり乾燥させた。乾燥させた後、固体フィターゼ生成物は、０に設定したローラー間隙を備えるＢｕｅｈｌｅｒミル（モデルＭＬＴ ２０４）を用いて粉砕した。参照物質の市販の生成物試料Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５ Ｇは、固体（そのままで）として比較のために飼料内に投与した。固体フィターゼ生成物の分析は、参照フィターゼ活性アッセイ（ＦＴＵ）を用いて実施し（ＦＴＵ）、それに従って生成物を飼料内に投与した。
飼料組成物は、６２．５％のトウモロコシ、３１％の大豆ミール、４．４％の大豆油、１．２％の石灰石、０．５％のＶＩＴ／ＭＩＮ（Ｆａｒｍｉｘ Ｌｅｇｈｅｎｎｅｎ ｐｒｅｍｉｘ）及び０．４％の塩化ナトリウムを含むトウモロコシ／大豆飼料であった。飼料の含水量は、約１２～１４重量／重量％であった。１２０ｋｇ～２００ｋｇの上述したプレミックス飼料は、５ＦＴＵ／ｇの飼料中の最終フィターゼ濃度に達するまで、１０分間にわたり室温（２２～２４℃）の水平リボンミキサー内で液体（ＭＬＡ）又は固体フィターゼ酵素飼料何れかと混合した。飼料に添加した液体フィターゼ試料の量は、０．２～０．５重量／重量％であった。
混合した後、飼料試料を含有するフィターゼは、ＫＡＨＬカスケードミキサー内で６０℃、８０℃、８５℃、９０℃又は９５℃の何れかで３０秒間にわたりコンディショニングした。本明細書で使用する用語「コンディショニング」は、試料／酵素混合物を混合する工程及び３０秒間の保持時間にわたり６０℃、８０℃、８５℃、９０℃又は９５℃の標的温度に達するまで同一物を蒸気で処理する工程を意味する。コンディショニング温度は、蒸気をそこから２ａｔｍの圧力で試料／酵素混合物に差し向ける３基の蒸気弁を調整することによって手作業で制御した。温度は、コンディショナーの出口で標的温度±０．３℃で維持した。この蒸気コンディショニングは、通常、６０～９５℃のコンディショニング温度で飼料の含水量を２～５．５重量％増加させる。コンディショニング工程の直後、試料／酵素混合物は、半径が３ｍｍ×３５ｍｍのダイ及び７．５ｋＷのモーターを装備したＳｉｍｏｎ Ｈｅｅｓｅｎペレットプレス内でペレットに成形した。飼料のスクリュー速度は、およそ３００ｋｇ／時の生産速度を達成するために調整し、ローラー速度は、５００ｒｐｍに設定した。システムは、ペレットダイが作動可能になるまで加温するための標的コンディショニング温度に達した後およそ８分間は回転するに任せた。続いて５～７．５ｋｇのペレット化飼料試料を収集し、孔あき底板を備える冷却ボックス内で１５分間にわたり１５００ｍ３（空気）／時の周囲気流を用いて直ちに冷却した。冷却中、ペレット滴の含水量は、蒸気コンディショニング前のフィターゼ含有飼料混合物のレベルに匹敵するレベルに低下する（マッシュ飼料）。飼料は、ＩＳＯ＿６４９７＿２００２に従って飼料分割機を使用してコンパクト化し、フィターゼ回収率を下記のように決定した。
マッシュ飼料及びペレット両方のフィターゼ含有飼料試料は、Ｒｅｔｃｈ検査室用ミル（０．７５ｍｍのふるいを装備したモデルＺＭ２００）を用いて粉砕し、引き続いてＩＳＯ ３００２４手順：「動物飼料原料 － フィターゼ活性の決定（Ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｕｆｆｓ － Ｄｔｅｒｎｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」の修正版である下記の方法を用いてフィターゼ活性を測定するために分析した。
飼料試料からフィターゼ酵素を抽出するために、２０．０ｇ（＋／－０．０５ｇ）の粉砕マッシュ飼料及びペレット化飼料を１００ｍＬの抽出用バッファー（２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０（ｐＨ５．５））と室温で２０分間、ロータリーミキサーで混合した。ろ過（ガラス繊維フィルター、ＧＡ－５５、Ａｄｖａｎｔｅｃ製）後に上清を収集した。下記のＦＴＵフィターゼアッセイにおいてフィン酸塩標準曲線の線形範囲内で測定値を得るために、上清を更に抽出用バッファー中で希釈した（０．０４ＦＴＵ／ｍＬ）。
１ｍＬの希釈抽出フィターゼ試料を抽出用バッファー中の２ｍＬの７．５ｍＭのＩＰ６（Ｒｉｃｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＡＺ Ｉｍｐｏｒｔ ａｎｄ Ｅｘｐｏｒｔ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｏｒｉｅｎｔ Ｐｈｙｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏ．Ｌｔｄ製のフィターゼナトリウム＃Ｚ０２０１３０１１８１）基質溶液と混合し、３７℃で６０分間にわたり水浴中でインキュベートした。２ｍＬの酸性モリブデン酸／バナジン酸試薬を用いて反応を停止させ、無機リン酸塩の遊離を分光光度法によって４１５ｎｍで定量した。結果は、対応する時間０の試料（６０分間にわたり３７℃でインキュベートされなかった飼料）の吸光度を減じることによって補正した。リン酸塩の標準曲線を無水リン酸水素カリウムから生成し、これを各試料からの遊離リン酸塩の量を計算するために使用した。１単位（ＦＴＵ）は、１分当たり１μモルのリン酸塩を生成するフィターゼ酵素の量であると定義した。飼料中ペレット化回収率（％）は、次の式：（１ペレットのフィターゼ活性（ＦＴＵ／ｇ）÷マッシュ飼料のフィターゼ活性（ＦＴＵ／ｇ））×１００を使用して計算した。
表４は、表３に示されている温度６０、８０、８５、９０及び９５℃でＭＬＡにおいて適用されたフィターゼ酵素の飼料中ペレット化回収率（％）を列挙している。９５℃でのペレット化回収率は、ＭＬＡにおいて適用された全部の試験した高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片について少なくとも５０％であった。比較のために、抽出した市販の参照フィターゼであるＱｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ及びＮａｔｕｐｈｏｓ Ｅ １００００は、同一条件下ではるかに低い飼料中ペレット化回収率、つまりそれぞれ１５％及び２５％を提示した。これらのデータは、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片の高いロバスト性を例示している。
６０℃では、ＭＬＡにおいて適用された場合の飼料中ペレット化回収率は、試験した全部の高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片について７１％～８５％の間である。本明細書に開示したロバストなフィターゼが６０℃でコンディショニングされ、引き続いてペレット化された場合、６０℃のコンディショニング温度がロバストなフィターゼのＴｍより３０℃低い場合に１５～２９％の活性を失うことは当初は矛盾すると思われる。これは、コンディショナー内の熱不活化には関連していないことを示唆しており、初期の消失が、温度が８０℃に上昇した場合に限定された追加の消失のみが生じるという事実によって更に裏付けられる。理論に拘束されることなく、他の酵素（フィターゼ及びキシラナーゼ；Ｔｒｉａｌ ｒｅｐｏｒｔ ８７５：Ｄａｎｉｓｈ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆Ｆｏｏｄ Ｃｏｕｎｃｉｌ、国際公開第２０１４１２０６３８号パンフレット及びＮｏｖｕｓ Ｉｎｓｉｇｈｔ，Ｉｓｓｕｅ ３，２０１５）について、コンディショニング及びペレット化後に飼料から抽出／回収するのが困難であるごく少量のフィターゼ及びキシラナーゼが存在し得ると考えられ、記載されてきた。しかしながら（再び理論に拘束されることなく）この回収不能な分画の少なくとも一部は、動物において依然として生物活性である － 換言すると、回収不可能な分画は熱応力のために非可逆性で不活化され得ない。むしろ、回収不可能な分画がインビトロでは抽出できないような方法で飼料中において結合していると（再び理論に拘束されることなく）考えられている。代わりに、（再び理論に拘束されることなく）事実上全てのフィターゼ酵素タンパク質が抽出され、コンディショニング及びペレット化に起因して、インビトロアッセイにおいて測定した場合、フィターゼの明白に低い活性が存在すると考えられる。理論に拘束されることなく、乾燥及び／又は被覆形態と比較してＭＬＡにフィターゼを適用することは、飼料との直接的物理的相互作用に起因してフィターゼのこの回収不可能であるが生体活性である形態の大きさを増加させるであろうと考えられる。
ＭＬＡにおいて適用されたフィターゼの熱ロバスト性を評価するための適切な方法は、コンディショニング及びペレット化前後の飼料内の回収可能活性を比較することではなく、むしろコンディショニング温度の商業的に関連する範囲内にある例えば８０℃等の低い及び例えば９５℃等の高いコンディショニング温度でのコンディショニング及びペレット化後、フィターゼ活性の回収を比較することであることが分かる。
Figure 2022513085000008
表５は、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較した、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合の飼料中ペレット化回収率の比率を示している。ＭＬＡにおいて適用された高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片について、９５℃での飼料中ペレット化回収率の比率は、３０秒間にわたり８０℃でＭＬＡへの適用と比較して０．７２～０．９８であった。抽出した市販の参照物質であるフィターゼＮａｔｕｐｈｏｓ Ｅ １００００についての対応する数は、０．３２であった。このデータは、本明細書に開示した高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片が、市販の関連温度範囲内のコンディショニング温度における変化に対して高度にロバストであることを示している。
Figure 2022513085000009
表６は、固体として適用された場合の、フィターゼＰＨＹ－１１８９５、ＰＨＹ－１１９３２、ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３８８５及びＱｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５Ｇの９５℃での飼料中ペレット化回収率を示している。全ての高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片は、粉砕全粒小麦担体に固体として適用された場合、９５℃で少なくとも６４％の飼料中ペレット化回収率を有する。市販の粉末製品Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｌｕｅ ５Ｇは、同一条件で試験した場合に５８％の回収率を有する。
Figure 2022513085000010
実施例６
フィターゼ酵素のインビボ評価
ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１１８９５の性能評価
フィターゼＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１１８９５のインビボ性能をブロイラーにおいて評価した。試験は、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ大学で実施した。８種の食餌療法を試験した：ブロイラーの栄養要件を満たすように処方した陽性対照飼料（ＰＣ）、可消化リン（ＰＣより０．１６％ポイント低い）及び可消化カルシウム（ＰＣより０．１９％ポイント低い）を欠乏性で処方した陰性対照（ＮＣ）並びに５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇで投与されるＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１１９３２若しくはＰＨＹ－１１８９５フィターゼが補給されるＮＣ。表７は、本試験で使用した計算及び分析栄養値の食品構成を提供している。
Figure 2022513085000011
１日齢のＣｏｂｂ ５００雄性ブロイラーを、１ペン当たりヒヨコ３０羽を含む１０複製ペンを各々含有する食餌療法に割り当てた。飼料は、トウモロコシ、大豆ミール及び米ヌカをベースにして、マッシュ形態であった。第２１日に、１複製ペン当たり５羽の鶏を取り出し、無脂肪の脛骨灰分を決定するために脛骨を収集した。飼料は、３期の給餌プログラムに従って処方した（離乳期０～１０日齢、育成期１１～２１日齢及び仕上期２２～４２日齢）。飼料及び水は、４２日間の試験期間を通して随意に摂取させた。
データはＡＮＯＶＡを用いて分析し、療法平均値は、チューキーＨＳＤ検定を用いて分離したが、Ｐ＜０．０５を統計的有意と見なされる。次の性能パラメーター：ＡＤＧ（平均１日増体量）、ＡＤＦＩ（平均１日摂餌量）及びＦＣＲ（飼料要求率）は、０～４２日間の試験期間から計算した。表８は、様々な用量で様々なフィターゼが補給された飼料が給餌されたブロイラーについての０～４２日齢中の成長性能試験結果及び２１日齢に測定された脛骨灰分率を示している。ＮＣ飼料におけるリン（Ｐ）及びカルシウム（Ｃａ）の減少は、ＰＣと比較して低いＡＤＧ、ＡＤＦＩ及び脛骨灰分含量並びに高いＦＣＲと相関している。試験した全フィターゼ：ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１１８９５は、ＮＣ飼料と比較してブロイラーにおけるＡＤＧ、ＡＤＦＩ、脛骨灰分率及びＦＣＲを向上させた。平均すると、ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１１８９５フィターゼを用いた療法は、ＮＣ飼料と比較して、５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇの用量で飼料を与えた場合、ＡＤＧを１２及び１４％、ＡＤＦＩを８及び１０％、ＦＣＲを３．３及び３．７％、脛骨灰分率を９及び９．７％それぞれ向上させた。更に、全フィターゼは、全パラメーターに関してＰＣ飼料より優れているか又は統計的有意に相違しないかの何れかの機能を果たした。これらのデータは、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片（ＰＨＹ－１２６６３、ＰＨＹ－１１９３２及びＰＨＹ－１１８９５）がブロイラーの骨格成長及び性能を有意に向上させられることを証明している。
Figure 2022513085000012
ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１４００４及びＰＨＹ－１３８８５の性能評価。
ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１４００４及びＰＨＹ－１３８８５のインビボ性能は、ＡＨ Ｐｈａｒｍａ（Ｈｅｂｒｏｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）でブロイラーにおいて評価された。ブロイラーの栄養要件を満たした陽性対照飼料（ＰＣ）及び陰性対照飼料（ＮＣ）を含む１０種の療法を試験した。ＮＣ飼料は、可消化リン（無機リンを含まない、ＰＣより０．２４％ポイント低い）、カルシウム（ＰＣより０．１９％ポイント低い）、可消化ＡＡ（Ｌｙｓ、Ｍｅｔ＋Ｃｙｓ、Ｔｈｒ各々についてＰＣより０．０４％、０．０３％及び０．０３％ポイント低い）及びＭＥ（ＰＣと比べて６９ｋｃａｌ／ｋｇ低い）を不足させて処方した。
ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１４００４及びＰＨＹ－１３８８５の性能は、２種の用量である５００又は１０００ＦＴＵ／ｋｇ（飼料）が含まれるＮＣ飼料において個別に試験した。雄性ブロイラー（Ｒｏｓｓ ３０８）の雛には、０～５日齢に同一プレスターター食を給餌、それらのブロイラーは６～１５日齢中に試験試料を摂取した。食餌療法は、１ケージ当たり８羽の鶏を収容して、１療法当たり９ケージに無作為割り付けした。食餌は、トウモロコシ、小麦、大豆ミール、菜種ミール及び米ヌカをベースとした（飼料成分は、表９に示した）。
Figure 2022513085000013
体重及び飼料摂取量は、第６日及び第１５日に記録した。最後の４日間中、排泄物を毎日収集し、計量し、ケージ内にプールした。１ケージ当たりのプール排泄物は、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ９６５．１７に従ってリン（Ｐ）保持測定のために使用した。第１５日に、１ケージ当たり鶏６羽から右脛骨を収集し、脛骨灰分率測定のために使用した。
データは、ＡＮＯＶＡを用いて分析し、療法平均値は、チューキーＨＳＤ検定を使用して分離した。Ｐ＜０．０５は、統計的有意差と見なされた。表１０は、ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１４００４及びＰＨＹ－１３８８５の性能に及ぼす作用を示している。脛骨灰分率は、１５日齢に測定し、リン保持率は、ブロイラーにおいて１１～１５日齢に測定した。試験した全フィターゼ：ＰＨＹ－１３７８９、ＰＨＹ－１３６３７、ＰＨＹ－１４００４及びＰＨＹ－１３８８５は、ブロイラーのＡＤＧ、ＡＤＦＩ、脛骨灰分率及びリン保持率をＮＣと比較して向上させた。
Figure 2022513085000014
フィターゼＰＨＹ－１３７８９は、それぞれ５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇで投与された場合、ＮＣと比較して、ＡＤＧを５．４及び８．４％、ＦＣＲを３．４及び５．１％、脛骨灰分率を４．６及び８．８％、リン保持率を１５．３及び３５．４％向上させた。フィターゼＰＨＹ－１３６３７は、それぞれ５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇで投与された場合、ＮＣと比較して、ＡＤＧを６．１及び８．６％、ＦＣＲを３．８及び５．７％、脛骨灰分率を６．３及び９．６％、リン保持率を１７．７及び３５．８％向上させた。フィターゼＰＨＹ－１４００４は、それぞれ５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇで投与された場合、ＮＣと比較して、ＡＤＧを４．５及び７．５％、ＦＣＲを３．３及び５％、脛骨灰分率を６．５及び１０．１％、リン保持率を１９．３及び３６．４％向上させた。フィターゼＰＨＹ－１３８８５は、それぞれ５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇで投与された場合、ＮＣと比較して、ＡＤＧを５．６及び７．８％、ＦＣＲを３．６及び５．４％、脛骨灰分率を５．５及び９．８％、リン保持率を１７．７及び３６．９％向上させた。平均すると、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片は、ＮＣと比較して、ＡＤＧを５．４及び８．１％、ＦＣＲを３．５及び５．３％、脛骨灰分率を５．７及び９．６％及びリン保持率を１７．５及び３６．１％向上させた。試験した全用量で全フィターゼは、本試験でのＮＣの栄養素の大きい減少（無機リンの完全な除去並びにＣａ、ｄｉｇ ＡＡ及びＭＥの減少）にもかかわらず、ＡＤＧ、ＡＤＦＩ及びＦＣＲに関する性能ではＰＣとの統計的有意ではない差を示した。全フィターゼは、５００ＦＴＵ／ｋｇでのＰＨＹ－１３７８９及びＰＨＹ－１３８８５を除いて、ＰＣと類似の脛骨灰分含量を有していた。Ｐ摂取量のパーセンテージとしてのリン保持率は、ＰＣと比較して全フィターゼ療法群において改善された。脛骨灰分率及びＰ保持率の結果は、これらのフィターゼがリンを放出することに有効であることを確証している。
２回の試験からの結果は、試験した全Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド又はその断片が動物性能において大きい向上を提供することを示している。
実施例７
新規なフィターゼ酵素分岐群の同定
配列類似性を同定する目的で、実施例３に示した高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片のポリペプチド配列を使用して隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を生成した。Ｔｈｅ ＭＵＳＣＬＥバージョン３．８．３１（ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．Ｒ．Ｃ Ｅｄｇａｒ（２００１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ３２：１７９２）を配列アラインメントのために、デフォルトパラメーターを用いて使用した。続いて、多重配列アラインメントからＨＭＭを生成するために、ＨＭＭビルダーソフトウエアＨＭＭＥＲバージョン３．１ ｂ１（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ／で入手可能）を使用した。２種のパラメーター：Ｐｒｉｏｒｓ＝なし及び重量＝なしのみを使用した．使用したコマンドは、次の通りであった：／ｕｓｒ／ｂｉｎ／ｈｍｍｂｕｉｌｄ－－ｐｎｏｎｅ－－ｗｎｏｎｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ＿ｆｏｒ＿ｆｉｌｉｎｇ＿ｄｒａｆｔ＿５．ｈｍｍ Ｖａｒｉａｎｔｓ＿ｆｏｒ＿ｆｉｌｉｎｇ＿ｄｒａｆｔ＿５．ｆｓａ、ここで、ｗｎｏｎｅ＝相対的重量なし（全配列は、指定された一様な重量である）、及びｐｎｏｎｅ＝ｐｒｉｏｒｓを使用しない、及びパラメーターは、頻度である。全確率パラメーターは、丸めた小数点の右側への５桁の精度を備える陰性自然対数確率として保存される。例えば、確率は、０：２５ ｌｏｇ０：２５＝１：３８６２９として保存される。ゼロ確率の特別な例は、＊記号として保存される。図１（パネルＡ～１ＢＢ）は、高Ｔｍフィターゼ分岐群フィターゼのポリペプチド配列に沿った各位置についてのＨＭＭ確率スコアを示している。ＨＭＭについてのコンポジットスコア（ＣＯＭＰ）は、図１Ａの上の３つのパネル上にボールド体で示されている。各アミノ酸についての位置（Ｐ）及びコンセンサス（Ｃ）は、第１列のＰ／Ｃの下に示した。コンセンサス高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド配列は、図１上に示したＨＭＭから生成し、配列番号６４として列挙した。
次に、ＨＭＭを使用して、公衆データベース及び特許において入手できるフィターゼ配列を含んでいる、およそ７０００単位の広域セットのフィターゼについてのＨＭＭ配列スコアを生成した。ランク及び配列スコアの熱安定性との相関（ＤＳＣによるＴｕｎｆｏｌｄ及びＴｍ）を様々な配列について比較した（データは示していない）。この分析に基づくと、新規な高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチドは、全部が、表３Ａ及び３Ｂ上に列挙したフィターゼについて表１１上に例示したように、１２００より大きいＨＭＭ配列スコアを有している。
Figure 2022513085000015
Figure 2022513085000016
Figure 2022513085000017
表１１に列挙した高Ｔｍフィターゼ分岐群酵素の予測成熟配列の多重配列アラインメント：公衆に開示された微生物フィターゼを含む［ＰＨＹ－１３５９４（配列番号１）；ＰＨＹ－１０９３１（配列番号２）；ＰＨＹ－１０９５７（配列番号３）；ＰＨＹ－１１５６９（配列番号４）；ＰＨＹ－１１６５８（配列番号５）；ＰＨＹ－１１６７３（配列番号６）；ＰＨＹ－１１６８０（配列番号７）；ＰＨＹ－１１８９５（配列番号８）；ＰＨＹ－１１９３２（配列番号９）；ＰＨＹ－１２０５８（配列番号１０）；ＰＨＹ－１２６６３（配列番号１１）；ＰＨＹ－１２７８４（配列番号１２）；ＰＨＹ－１３１７７（配列番号１３）；ＰＨＹ－１３３７１（配列番号１４）；ＰＨＹ－１３４６０（配列番号１５）；ＰＨＹ－１３５１３（配列番号１６）；ＰＨＹ－１３６３７（配列番号１７）；ＰＨＹ－１３７０５（配列番号１８）；ＰＨＹ－１３７１３（配列番号１９）；ＰＨＹ－１３７４７（配列番号２０）；ＰＨＹ－１３７７９（配列番号２１）；ＰＨＹ－１３７８９（配列番号２２）；ＰＨＹ－１３７９８（配列番号２３）；ＰＨＹ－１３８６８（配列番号２４）；ＰＨＹ－１３８８３（配列番号２５）；ＰＨＹ－１３８８５（配列番号２６）；ＰＨＹ－１３９３６（配列番号２７）；ＰＨＹ－１４００４（配列番号２８）；ＰＨＹ－１４２１５（配列番号２９）；ＰＨＹ－１４２５６（配列番号３０）；ＰＨＹ－１４２７７（配列番号３１）；ＰＨＹ－１４４７３（配列番号３２）；ＰＨＹ－１４６１４（配列番号３３）；ＰＨＹ－１４８０４（配列番号３４）；ＰＨＹ－１４９４５（配列番号３５）；ＰＨＹ－１５４５９（配列番号３６）；ＰＨＹ－１６５１３（配列番号３７）］；ＰＨＹ－１６８１２（配列番号６４）；ＰＨＹ－１７４０３（配列番号６５）；ＰＨＹ－１７３３６（配列番号６６）；ＰＨＹ－１７２２５（配列番号６７）；ＰＨＹ－１７１８６（配列番号６８）；ＰＨＹ－１７１９５（配列番号６９）；ＰＨＹ－１７１２４（配列番号７０）；ＰＨＹ－１７１８９（配列番号７１）；ＰＨＹ－１７２１８（配列番号７２）；ＰＨＹ－１７２１９（配列番号７３）；ＰＨＹ－１７２０４（配列番号７４）；ＰＨＹ－１７２１５（配列番号７５）；ＰＨＹ－１７２０１（配列番号７６）；ＰＨＹ－１７２０５（配列番号７７）；ＰＨＹ－１７２２４（配列番号７８）；ＰＨＹ－１７２００（配列番号７９）；ＰＨＹ－１７１９８（配列番号８０）；ＰＨＹ－１７１９９（配列番号８１）；ＰＨＹ－１７２１４（配列番号８２）；ＰＨＹ－１７１９７（配列番号８３）；ＰＨＹ－１７２２８（配列番号８４）；ＰＨＹ－１７２２９（配列番号８５）；ＰＨＹ－１７１５２（配列番号８６）；及びＰＨＹ－１７２０６（配列番号８７）：［ブティアウクセラ・ノアキアエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｎｏａｃｋｉａｅ）ＷＰ０６４５５５３４３．１（配列番号３８）；シトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ）ＡＡＳ４５８８４．１（配列番号３９）；コクシエラ・バクテリウム（Ｃｏｘｉｅｌｌａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＤＨ４０４６５．１（配列番号４０）；腸内細菌科細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ＷＰ０９４３３７２７８．１（配列番号４１）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＷＰ００１２９７１１２（配列番号４２）；ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）ＷＰ０７２３０７４５６．１（配列番号４３）；ロウキシエラ・バーデンシス（Ｒｏｕｘｉｅｌｌａ ｂａｄｅｎｓｉｓ）ＷＰ０８４９１２８７１．１（配列番号４４）；セラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）ＷＰ００９６３６９８１．１（配列番号４５）；エルシニア・アルドベ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｌｄｏｖａｅ）ＷＰ００４７０１０２６．１（配列番号４６）；エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）ＷＰ０５０１４０７９０．１（配列番号４７）；エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）ＷＰ００４３９２１０２．１（配列番号４８）；エルシニア・モラレッティイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ）ＷＰ０４９６４６７２３．１（配列番号４９）；エルシニア・ローデイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｏｈｄｅｉ）ＷＰ０５０５３９９４７．１（配列番号５０）；ＥＰ３２２２７１４－０００３ ＡＰＰＭフィターゼ（配列番号５１）；ＵＳ８１０１３９１－０００２（配列番号５２）；ＵＳ８１０１３９１－０００４（配列番号５３）；ＵＳ８１０１３９１－００３５（配列番号５４）；ＵＳ８１０１３９１－００４９（配列番号５５）；ＵＳ８１４３０４６－０００１（配列番号５６）；ＵＳ８１４３０４６－０００３（配列番号５７）；ＵＳ８４６０６５６－０００２（配列番号５８）；ＵＳ８５５７５５５－００１３（配列番号５９）；ＵＳ８５５７５５５－００２４（配列番号６０）；ＵＳ２０１６００８３７００－０００３（配列番号６１）；ＷＯ２０１００３４８３５－０００２（配列番号６２）］は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（登録商標）バージョン１０．２．４においてＭＡＦＦＴアラインメントを用いて作成した。このＭＡＦＦＴ配列アラインメントに基づき、配列関係を示している系統樹は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｔｒｅｅ Ｂｕｉｌｄｅｒ ｉｎ Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（登録商標）バージョン１０．２．４を用いて生成し、図２に示した。
実施例８
鶏におけるフィターゼ酵素のインビボ評価
本実施例では、栄養的に適正な何も補給されていない飼料と比較した場合の、ブロイラーの脛骨灰分率及びＰの回腸可消化率（ＡＩＤ Ｐ）への、Ｃａ及びＰが減少している基底飼料に添加されたトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の遺伝子組み換え菌株によって生成された代表的な生合成細菌性６－フィターゼの有用性を評価した。更に、飼料摂取量、成長性能及び飼料要求率に関する観察を実施した。
材料及び方法
実験飼料及び対照飼料：トウモロコシ及び大豆ミールをベースとする陽性対照（ＰＣ）飼料は、離乳期（第１～２１日）及び仕上期（第２２～４２日）の栄養素の推奨要件（Ｐ及びＣａにおいて適正）を満たすように処方した［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ．９ｔｈ ｒｅｖ．ｅｄ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；１９９４］。陰性対照（ＮＣ）飼料は、カルシウム（Ｃａ）を減少させ、離乳期ではそれぞれ２．０ｇ／ｋｇ及び１．９ｇ／ｋｇ並びに仕上期ではそれぞれ２．０ｇ／ｋｇ及び１．８ｇ／ｋｇの利用可能なリンを含めて処方した。表１２を参照されたい。全離乳期飼料は、不消化マーカーとして二酸化チタン（４ｇ／ｋｇで添加した）を含有していた。陰性対照飼料は、独立型飼料として又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の遺伝子組み換え菌株によって生成された２５０、５００若しくは１０００ＦＴＵ／ｋｇの生合成細菌性６－フィターゼが補給された飼料として試験した。飼料は、マッシュ形態で鳥に随意に提供した。
Figure 2022513085000018
Figure 2022513085000019
鳥の収容及び実験デザイン：雌雄混合（５０％の雄性、５０％の雌性）のＣｏｂｂ ５００ブロイラーの雛は、飲用水を介して感染性気管支炎及びニューキャッスル病に対してワクチン接種を完了している商業的孵化場から孵化日に入手した。感染性ファブリキウス嚢病に対するワクチンは、飲用水を介して第１１～１４日に投与された。鳥は、各ペンがほぼ同等の体重の鶏を含有するように、初期体重（ＢＷ）に基づいて平飼いのペンに割り当てた。計１１７６羽の鳥は、１ペン当たり２４羽の鳥を含めて４９のペンに割り付け、９ペンはＮＣ、１０ペンは他の全部の療法に割り付け、各ペンは完全に無作為化デザインで５０％の雄性及び５０％の雌性を含んでいた。ペンは、ＬＤ１８：６の照明状況及び初期温度３５℃を備え、第２８日には２４℃に低下させた、環境的に制御されたブロイラーハウス内に配置した。
試料採取及び測定：全飼料の代表的な部分試料を乾燥物質（ＤＭ）、粗タンパク質（ＣＰ）、粗脂肪（ＣＦ）、灰分、Ｐ、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、Ｃａ、ナトリウム（Ｎａ）、フィチン酸塩及びフィターゼについて分析した。
体重及び飼料摂取量（ＦＩ）は、ペンベースで第１、２１及び４２日に測定し、これを使用してＢＷ、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）及び死亡率で補正した飼料要求率（ＦＣＲ）を計算した。死亡率をチェックし、１日１回記録した。
第２１日及び第４２日に、鳥４羽（２羽の雄性、２羽の雌性、雌雄は試料採取時点に決定した）及び６羽（雄性３羽及び雌性３羽）はそれぞれ、１ペン当たりランダムに選択し、ＣＯ２ガスによって屠殺し、それらの左脛骨は脱脂脛骨灰分率を決定するために収集し、且つ（ペン毎に）プールした。回腸消化物は、第２１日に安楽死させた鳥から収集し、ペン毎にプールし、Ｌａｂｃｏｎｃｏ ＦｒｅｅＺｏｎｅ １２＋脱水装置（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）上で冷凍した。乾燥飼料及び消化物試料は、不活性マーカーとしての二酸化チタンを使用して栄養素消化率を計算するためにＰ及びＣａ含量について分析した。
化学分析：試料は、全分析のために２回ずつ分析した：飼料及び回腸消化物中の栄養素は、下記の方法：粗タンパク質、ＮＥＮ－ＥＮ－ＩＳＯ １６６３４［ＮＥＮ－ＩＳＯ ６４９２，ｅｎ．Ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ － Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；１９９９］；粗脂肪、ＮＥＮ－ＩＳＯ ６４９２［ＮＥＮ－ＩＳＯ ６８６５，ｅｎ．Ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｕｆｆｓ－－Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｆｉｂｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ－－Ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；２０００］；粗繊維、ＮＥＮ－ＩＳＯ ６８６５［ＮＥＮ－ＥＮ－ＩＳＯ １６６３４，ｅｎ．Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄｉｎｇ Ｓｔｕｆｆ － Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｕｓｉｎｇ Ｄｕｍａｓ ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；２００８］に従って分析した。飼料中のリン、Ｃａ、マグネシウム、カリウム及びナトリウム並びに消化物中のＰ及びＣａは、ＡＯＡＣ ２０１１．１４［ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ２０１１．１４：Ｃａｌｃｉｕｍ，Ｃｏｐｐｅｒ，Ｉｒｏｎ，Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，Ｍａｎｇａｎｅｓｅ，Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｏｄｉｕｍ及びＺｉｎｃ ｉｎ Ｆｏｒｔｉｆｉｅｄ Ｆｏｏｄ ＰｒｏｄｕｃｔｓＯｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；２０１１］に従ってマイクロ波消化及び誘導結合プラズマ発光分光分析法（ＯＥＳ）によって分析した。飼料中のフィチン酸リン（ＰＰ［イノシトール６リン酸塩（ＩＰ６）］）濃度及び飼料中のフィターゼ活性は、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．［Ｙｕ，Ｓ，Ｃｏｗｉｅｓｏｎ，Ａ，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｃ，Ｐｌｕｍｓｔｅａｄ，Ｐ，Ｄａｌｓｇａａｒｄ，Ｓ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｈｙｔａｔｅ ａｎｄ ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｓｔｅｒｓ（ＩＰ１－５）ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＰ５ ｉｓｏｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｓｉｎ．Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ ２０１２；９０：１８２４－１８３２］によって記載された方法を用いて、ＤｕＰｏｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって決定された。１フィターゼ単位（ＦＴＵ）は、ｐＨ５．５及び３７℃でフィチン酸ナトリウム基質から１分間当たり１μモルの無機オルトリン酸塩を放出する酵素の量であると定義された［ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ２０００．１２：Ｐｈｙｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｆｅｅｄ：Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ．Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ；２０００］．
脛骨灰分率は、下記に記載する方法を用いて測定した：腓骨、筋肉及び結合組織を切除し、骨は１００℃で少なくとも１２時間乾燥させ、その後、７～８時間にわたりジエチルエーテル中で脱脂し、風乾した。脱脂脛骨は、少なくとも１２時間にわたり１００℃で再び乾燥させ、次に２４時間にわたり６００℃のセラミックるつぼ内で灰化させた。
計算：飼料要求率（ＦＣＲ）は、第０～２１日、第２２～４２日及び第０～４２日に全ＢＷＧ及び全飼料摂取量（死亡時体重について補正した）に基づいて計算した。ＡＤＧ及びＡＦＤＩは、死亡率の補正によって計算し、例えばＡＤＦＩは、各期における全飼料摂取量によって計算し、給餌の総日数で割った。死亡率で補正したＡＤＧは、死亡率で補正したＦＣＲで割った死亡率で補正したＡＤＦＩから計算した。
Ｐ及びＣａの見かけの回腸消化率（ＡＩＤ、％）は、不活性マーカーとしての二酸化チタンを使用して、下記の式：
ＡＩＤ＝１－［（Ｔｉｄ／Ｔｉｉ）×（Ｎｉ／Ｎｄ）］
（式中、Ｔｉｄは、飼料中のチタン濃度であり、Ｔｉｉは、回腸消化物中のチタン濃度であり、Ｎｉは、回腸消化物中の栄養素（Ｐ又はＣａ）濃度であり、Ｎｄは、飼料中の栄養素濃度である）
に基づいて計算した。全分析値は、ｇ／ｋｇ（乾燥物質）として表示した。
統計的分析：データは、実験単位としてのペン毎に報告した。データは、無作為化デザインでの療法の作用を調査するために、ＪＭＰ １４．０のＦｉｔ Ｍｏｄｅｌプラットフォーム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，１９８９－２０１９）を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。平均値の分離は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｈｏｎｅｓｔの有意差検定を用いて達成した。フィターゼ用量を増加させながらの一次及び二次応答は、直交多項式を用いて分析した。差は、Ｐ＜０．０５である場合に統計的有意であると見なされた；Ｐ＜０．１０は、１つの傾向と見なした。
結果
飼料の分析：最終試料中で分析されたフィターゼ活性は、標的用量レベルを確証した（表１３）。基底（対照）飼料中のＣＰの分析値は、計算値の１０％以内であった。ＮＣ飼料中のＰ含量の達成された減少は標的減少に忠実に従っていた：分析値に基づくと、全Ｐ含量は離乳期飼料中では１．８ｇ／ｋｇ及び仕上期飼料中では２．３ｇ／ｋｇ減少した。
Figure 2022513085000020
分析フィターゼ活性（ＦＴＵ／ｋｇ）は、ＰＣ、ＮＣ、ＮＣ＋２５０ＦＴＵ／ｋｇ、ＮＣ＋５００ＦＴＵ／ｋｇ及びＮＣ＋１，０００ＦＴＵ／ｋｇそれぞれについて、離乳期には４３、２４、２８２、４８０、８８２及び仕上期には＜５０、＜５０、２５３、５９４、１１１０であった。飼料中のフィターゼ活性は、ＤｕＰｏｎｔ Ｆｅｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｒａｂｒａｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋによって分析した。
栄養素消化率：ＰのＡＩＤは、ＰＣ飼料と比較して、ＮＣ飼料が給餌されたトリにおいて有意に減少しなかった（表１４）。５００ＦＴＵ／ｋｇ以上の用量レベルにおいて、フィターゼの補給は、ＮＣと比較してＡＩＤ Ｐを増加させ、１０００ＦＴＵ／ｋｇでは、フィターゼは、ＰＣと比較してＰのＡＩＤを向上させた（Ｐ＜０．０５）。ｇ／ｋｇベースで表示すると、飼料中の回腸消化物中Ｐは、５００ＦＴＵ／ｋｇ以上の用量で投与されるとフィターゼによって向上された（５００ＦＴＵ／ｋｇでの＋１．３９ｇ／ｋｇ対ＮＣ及び１０００ＦＴＵ／ｋｇでの＋１．７６ｇ／ｋｇ対ＮＣ；Ｐ＜０．０５）。これらの用量レベルでは、飼料中のｇ／ｋｇとして表示された可消化Ｐは、ＰＣ飼料の可消化Ｐと同等であった。ＣａのＡＩＤは食餌療法によっては影響を受けなかったが、フィターゼ用量が０から１０００ＦＴＵ／ｋｇに増量されると線形で増加する傾向を示した（Ｐ＜０．１０）。
Figure 2022513085000021
脛骨灰分率：脛骨灰分率に食餌療法が及ぼす作用は、高度に有意であり（Ｐ＜０．００１）、表１５に提示した。ＰＣと比較して、ＮＣ飼料が給餌された鳥は、第２１日及び第４２日に減少した脛骨灰分率を示した（それぞれ－６．７及び－４．１％ポイント；Ｐ＜０．０５）。ＮＣと比較して、フィターゼの補給は全３種の用量レベルで第２１日及び第４２日の両方で試料採取した脛骨灰分率を向上させた（Ｐ＜０．０５）；全フィターゼ療法における脛骨灰分率は、ＰＣと同等であった。
Figure 2022513085000022
飼料摂取量及び成長性能：食餌療法が飼料摂取量、体重及び飼料要求率に及ぼす作用についても表１５に提示した。療法は、全成長期（離乳期、仕上期、総合；全例においてＰ＜０．０１）中の全反応測定値に影響を及ぼした。死亡率について、統計的有意差は、全く観察されなかった（データは示していない）。
ＰＣと比較して、ＮＣ飼料が給餌された鳥は、第２１日及び第４２日に減少したＢＷ、仕上期中及び総合的に増加したＦＣＲ及び全期中に減少したＡＤＧ及びＡＤＦＩを示した（Ｐ＜０．０５）。
任意の用量レベルでの実験的フィターゼの補給は、鳥がＮＣ飼料におけるＰ不足を克服させ、それらがフィターゼ用量とは無関係に、全期中のＰＣと同等であったように、全期中のＡＤＦＩ、ＢＷ及びＡＤＧ並びにＦＣＲを向上させた（Ｐ＜０．０５）。実験的フィターゼの１，０００ＦＴＵ／ｋｇの用量レベルは、第４２日に２．７４ｋｇの平均ＢＷ及び１．６２６の平均総ＦＣＲを備える鳥を生成した（ＰＣにおける１．６６１に対して）。
結論として、本試験は、実験的変異体フィターゼが、ＭＣＰ由来の無機Ｐが１．８～１．９ｇ／ｋｇ減少させて処方された飼料に添加され、２５０～１０００ＦＴＵ／ｋｇの用量レベルで投与された場合、成長性能、脛骨灰分率及び回腸Ｐ消化率を栄養上適正な飼料と同等に維持することに有効であることを証明した。有益な作用は、１０００ＦＴＵ／ｋｇで最大であった。リン酸一カルシウムからのリン置換値は、可消化リンにおいて観察された増加に基づいて、それぞれ５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇ（ＭＣＰ由来の１．３９～１．７６ｇ／ｋｇの可消化Ｐと同等）での飼料１ｋｇ当たり１．６４～２．０７ｇであると推定された。
実施例９
ブタにおけるフィターゼ酵素のインビボ評価
本試験の目的は、骨灰分率及び無機質化並びに成長性能への、ＭＣＰ由来の無機Ｐの添加と比較して、無機リン酸塩が添加されていないトウモロコシ－大豆ミールをベースとする飼料が給餌された離乳した子ブタにおける代表的な実験的生合成細菌性６－フィターゼを用いた栄養補給の有効性を評価することであった。比較目的で、本試験には現在ある市販のフィターゼを含めた。第２の目的は、試験した設定においてフィターゼの可消化Ｐ当量値を決定することであった。
材料及び方法
実験用飼料及び対照飼料：トウモロコシ及びＳＢＭをベースとする陽性対照（ＰＣ）飼料は、体重が１０～２５ｋｇ（ＮＲＣ，２０１２）の子ブタの栄養要件を満たすために、２．９ｇ／ｋｇの可消化Ｐ及び７．０ｇ／ｋｇのＣａを含有するように処方した（表１６）。陰性対照（ＮＣ）飼料は、無機リン（１．１ｇ／ｋｇの可消化Ｐ）を含まず、Ｃａを減量させて（５．０ｇ／ｋｇ）処方した。ＮＣは独立型飼料として、更に市販のフィターゼの５００若しくは１，０００ＦＴＵ／ｋｇの飼料、２５０、５００若しくは１，０００ＦＴＵ／ｋｇの実験的フィターゼを補給して、又は可消化Ｐ含量が１．８、２．５及び２．９ｇ／ｋｇである飼料に均等である（後者は、ＰＣ飼料を構成する）、３レベル（＋）（ＭＣＰ由来の０．７、＋１．４及び＋１．８ｇ／ｋｇの可消化Ｐ）でＭＣＰが添加された場合について試験した。これは、計９種の食餌療法を生成した。Ｃａ対Ｐ比を１．２～１．３の範囲内に維持するために、ＭＣＰ補給飼料には追加の石灰石を添加した（表１６）。市販のフィターゼは、本明細書でＰｈｙＢと記載される、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（Ａｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ、ＤｕＰｏｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で発現させたブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）由来の細菌性６－フィターゼであった。実験的フィターゼは、本明細書でＰｈｙＸとして記載される生合成細菌性フィターゼであった。ＰｈｙＸは、ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）（ＤｕＰｏｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対して配列バイアスを備える祖先復元によって組み立てられたコンセンサス細菌性フィターゼ遺伝子の生合成変異体を発現する真菌（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））生産菌株を用いた発酵によって生成した。飼料は、子ブタにマッシュ形態で随意に提供され、水は自由に摂取することができた。
Figure 2022513085000023
Figure 2022513085000024
ブタ、収容及び実験デザイン：実験手順は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵ並びにスペイン国の研究における動物の管理及び使用に関する指針（Ｂ．Ｏ．Ｅ．ｎｕｍｂｅｒ ２５２，Ｒｅａｌ Ｄｅｃｒｅｔｏ ２０１０／２００５）を順守していた。計１６２頭の交差Ｐｉｅｔｒａｉｎ ｘ（ラージホワイト種×ランドレース種）の雌雄混合（５０％が雄性、５０％が雄性）の２１匹の離乳期（初期体重（ＢＷ）は６±１ｋｇ）の子ブタを入手し、４２日齢（ＢＷ約１０～１１ｋｇ）になるまで一般的な前離乳期適応飼料を給餌した。子ブタは次に体重及び性に基づいてブロック化し、完全無作為化ブロックデザインで、ブタ２匹／ペン及び９ペン／療法群でペンに割り付けた。試験飼料は、４２日齢から７０日齢までブタに投与した。ペンは、温度を最初は３０℃、その後、１週間に付き１℃低下させる環境調節された動物飼育室に、一緒にグループ分けした。
試料採取及び測定：全飼料の代表的な部分試料を乾燥物質（ＤＭ）、有機物質（ＯＭ）、粗タンパク質（ＣＰ）、エーテル抽出物（ＥＥ）、灰分、無機質、フィチン酸塩及びフィターゼについて分析した。
実験開始前にブタを個別に計量し、平均１日増体量（ＡＤＧ）を計算するために、再び第１４日及び第２８日に計量した。飼料消失量を第１４日及び第２８日に評価し、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）を計算するために使用した。飼料要求率（ＦＣＲ）は、ＡＤＦＩ及びＡＤＧから計算した。
試験の第２８日に、１ペン当たり１匹の子ブタをペントバルヒタールナトリウムの静脈内過量投与によって安楽死させ、中手骨／中足骨の骨灰分率及び無機質化（Ｃａ及びＰ）を決定するために、前脚及び左脚から右足を切除した。足は、分析まで－２０℃で保管した。
化学分析：全サンプルを２回ずつ分析した。飼料中の乾燥物質、灰分率、ＣＰ及びエーテル抽出物は、ＡＯＡＣ（２０００ａ）法（それぞれ、９２５．０９、９４２．０５、９６８．０６及び９２０．３９）に従って分析した。窒素含量は、窒素ＦＰ－５２８分析装置（Ｌｅｃｏ ｃｏｒｐ．，Ｓｔ Ｊｏｓｅｐｈ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を使用してＤｕｍａｓ手順によって決定した。有機物質（ＯＭ）は、ＤＭと灰分率との差として計算した。飼料中の外因性フィターゼ活性の分析は、Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）に従って実施した。１フィターゼ単位（ＦＴＵ）は、５．５の標準ｐＨ及び３７℃の温度で０．００５１ｍｏｌ／Ｌのフィチン酸ナトリウムから１分間当たり１モルの無機リン酸塩を遊離させるフィターゼの量であると定義された（ＡＯＡＣ、２０００ｂ）。
骨灰分率は、右前足及び後足それぞれからの中手骨ＩＩＩ／ＩＶ及び中足骨ＩＩＩ／ＩＶ両方について決定した。抽出後、骨は最初に２ｋＮのロードセルを装備したＩｎｓｔｒｏｎ試験システム（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ，ＵＳ）モデル２５１９－１０６を用いる３点機械的検査においてそれらの完全性を特徴付けるために使用した。外因性剛性、最終力、変位及び吸収エネルギー等の生化学的パラメーターは、骨の完全性を特徴付けるために使用した（Ｔｕｒｎｅｒ，２００６）。次に、骨を使用して１０３℃で４時間にわたりオーブン内でそれらのＤＭ含量を決定し、次にそれらを２００℃で３時間にわたりオーブン式乾燥機内で焼き、その後、５５０℃で７２時間にわたりマッフル炉内に導入し、それらの灰分含量を決定した。中手骨由来の灰分は、次に乳棒と乳鉢を使用して粉砕し、硫酸消化後の誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓモデル７７００Ｘ）による無機質（Ｃａ、Ｐ、Ｍｇ）決定のために、ＳＣＴ Ｌａｂ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｒｉｄａ，Ｓｐａｉｎ）に送付した。飼料からの無機質組成（Ｔｉ、Ｃａ、Ｐ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｚｎ及びＣｕ）についても、ＳＣＴ ｌａｂのＩＣＰ－ＭＳ（Ｐａｃｑｕｅｔｔｅ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、２０１８）によって灰分試料上で分析された。
統計的分析：データは、実験単位としてのブタに基づいていた骨灰分及率及び骨強度を除き、実験単位としてのペンに基づいていた。データは、無作為化デザインでの療法の作用を調査するために、ＪＭＰ １４．０のＦｉｔ Ｍｏｄｅｌプラットフォーム（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，１９８９－２０１９）を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。平均値の分離は、チューキーのＨＳＤ（Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定を用いて達成した。更に、両方向ＡＮＯＶＡ分析は、５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇの２種の用量レベルで２種のフィターゼを比較するために因子「フィターゼ」（ＰｈｙＧ対ＰｈｙＢ）及び用量（５００及び１０００）を用いて分析を実施した。フィターゼ用量を増加させながらの一次及び二次応答は、直交多項式を用いて分析した。更に、線形回帰は、中手骨灰分、ＡＤＧ及びＦＣＲについて添加させるＭＣＰ由来の可消化Ｐ（例えば、ＮＣ、ＮＣ＋０．７、ＮＣ＋１．４及びＮＣ＋１．８ｇ／ｋｇ（ＭＣＰ由来の可消化Ｐ）を増加させながら実施した。可消化Ｐ当量は、所定のフィターゼ用量でＹ値を適用し、対応するＸ値を計算することによって計算した。差は、Ｐ＜０．０５である場合に統計的有意であると見なされた；Ｐ＜０．１０は、１つの傾向と見なされた。
結果
飼料の分析：飼料中の栄養素の分析値を表１７に提示した。ＮＣ飼料中のフィターゼ活性は５０ＦＴＵ／ｋｇであり、これはフィターゼ交差汚染が存在しないことを示していた。フィターゼ補給飼料中の活性は、活性が標的用量に対してそれぞれ－２０及び＋２７％であった療法ＮＣ＋ＰｈｙＸ ２５０及びＮＣ＋ＰｈｙＸ ５００を除いて、標的値の１０％以内であった。添加されたＭＣＰ由来のＰを含有するＮＣ飼料の分析Ｐ含量は、ＭＣＰ添加の目標レベルに基づく予測値に近かった。
Figure 2022513085000025
骨灰分の無機質及び骨強度：７０日齢（実験の第２８日）時、中手骨灰分率、Ｃａ及びＰ含量は、ＰＣと比較して基底ＮＣ飼料が給餌された子ブタにおいて減少した（Ｐ＜０．０５；表１８）。両方のフィターゼ及び全用量レベルの補給は、骨灰分率及び骨Ｐ含量（％）をＮＣと比較して向上させた（Ｐ＜０．０５）。５００及び１０００ＦＴＵ／ｋｇでは、中手骨灰分率及び骨Ｐ含量は、ＰＣと同等であった。０（ＮＣ）から１，０００ＦＴＵ／ｋｇへのＰｈｙＸの用量の増加は、第２８日に中手骨における一次及び二次増加を生じさせた（Ｐ＜０．０５）。中手骨Ｃａ含量は、フィターゼの補給による影響を受けなかった。一次応答は、飼料中のＭＣＰ－Ｐレベルを増加させた場合の中手骨灰分率及びＰ含量について観察された（Ｐ＜０．０５）。中足骨灰分含量は、中手骨灰分率の結果と同一の応答を示した。
Figure 2022513085000026
中手骨の生体力学的パラメーターに食餌療法が及ぼす影響は、表１８に提示した。最終力（Ｎ）は、他の全療法と比較してＮＣにおいてより低かった（Ｐ＜０．０５）。全用量レベルでの全フィターゼ療法は、ＮＣと比較して最終力を向上させた。１０００ＦＴＵ／ｋｇでの両方のフィターゼは、ＰＣと比較して同一最終力を維持した。５００ＦＴＵ及び１０００ＦＴＵでの両方のフィターゼは、ＮＣと比較して剛性（ｍＰａ）を向上させ、１０００ＦＴＵ／ｋｇは、飼料１ｋｇ当たり１．８ｇのＭＣＰ由来の追加の可消化Ｐを含有するＰＣと比較して、剛性（ｍＰａ）及び吸収エネルギー（Ｊ）を維持した。２種のフィターゼにわたって２種の用量レベルを比較すると、１０００ＦＴＵ／ｋｇでのフィターゼは、５００ＦＴＵ／ｋｇでのフィターゼと比較して、より大きい骨灰分率、最終力（Ｎ）、剛性（ｍＰａ）及び吸収エネルギー（Ｊ）を示した（Ｐ＜０．０５）。フィターゼ源及び用量レベル間で相互作用は見出されなかった。
成長性能：成長性能に食餌療法が及ぼす影響は、表１９に提示した。第０～１４日中のＡＤＦＩを除いて（傾向、Ｐ＝０．０８）、全成長性能応答測定値は、ＰＣ飼料と比較して、ＮＣ飼料が給餌された子ブタでは損なわれた（ＡＤＧ及びＡＤＦＩは低下した；ＦＣＲは増加した）（Ｐ＜０．０５）。
実験の第１期中（第０～１４日）、１，０００ＦＴＵ／ｋｇでのＰｈｙＸ及びＰｈｙＢは、何れもＮＣと比べてより大きいＡＤＧ及び低下したＦＣＲ（Ｐ＜０．０５）を示し、ＭＣＰ由来のＰが添加された１．８ｇ／ｋｇを含有したＰＣ飼料と同等であった。
実験の第２期中（第１５～２８日）、２５０ＦＴＵ／ｋｇ以上でのＰｈｙＸは、ＮＣと比べてＡＤＧを向上させ、５００ＦＴＵ／ｋｇ以上は、ＮＣと比べてＦＣＲを向上させた（Ｐ＜０．０５）。ＰｈｙＢも、両方の用量レベルでＮＣと比較してＡＤＧ及びＦＣＲを向上させた（Ｐ＜０．０５）。５００ＦＴＵ／ｋｇ以上では、両方のフィターゼは、ＭＣＰ由来のＰが添加された１．８ｇ／ｋｇを含有しているＰＣと同等のＡＤＧ ＦＣＲ値を生成した。
Figure 2022513085000027
全期中（第０日～２８日）、全用量レベルでの両方のフィターゼは、ＮＣと比較してＡＤＧを向上させ、両方のフィターゼは、５００ＦＴＵ／ｋｇ以上でＮＣと比較してＦＣＲを向上させた（Ｐ＜０．０５）。何れかのフィターゼについて、５００ＦＴＵ／ｋｇ以上では、ＡＤＧ及びＦＣＲは、ＭＣＰ由来のＰが添加された１．８ｇ／ｋｇを含有するＰＣと同等であった。更に、０～１，０００ＦＴＵ／ｋｇへのＰｈｙＸの用量の増加は、全期中にＡＤＧにおける一次及び二次増加並びにＦＣＲの減少を生じさせた。一次応答は、飼料中のＭＣＰ－Ｐレベルを増加させた場合の中手骨灰分率及びＰ含量について観察された（Ｐ＜０．０５）。２種のフィターゼにわたる２種の用量レベルの比較では、ＦＣＲは、５００ＦＴＵ／ｋｇと比較して１０００ＦＴＵ／ｋｇで低かった（１．５９対１．６６、Ｐ＜０．０５）。より高いＡＤＧの傾向は、５００ＦＴＵ／ｋｇと比較して１０００ＦＴＵ／ｋｇで観察され（６３５対５９０、Ｐ＝０．０８）、飼料摂取量に関する差は、見出されなかった（データは示されていない）。フィターゼ源及び用量レベル間で相互作用は見出されなかった。
無機Ｐ当量：ＰｈｙＸ及びＰｈｙＢの食餌可消化Ｐ当量値（ｇ／ｋｇ（飼料））は、応答パラメーターとしての骨灰分率、ＡＤＧ及びＦＣＲに基づいて、参照物質としてのＭＣＰ由来の可消化Ｐの増加に対する観察された応答を使用して計算された。ＭＣＰ由来の可消化Ｐを増加させることに対する応答は、全３種の応答測定値に対して線形であり陽性であった（Ｐ＜０．００１；表２０）。使用した応答パラメーターとは無関係に、計算可消化Ｐ当量値は、フィターゼ用量の増加に伴って増加し、１，０００ＦＴＵ／ｋｇで最大であった（表２０）。この用量レベルでの可消化Ｐ当量値は、ＰｈｙＢについてよりＰｈｙＸについての方が高く（平均交差応答パラメーター１．８３ｇ／ｋｇ対１．６６ｇ／ｋｇ、それぞれ）、ＡＤＧについて最高であり、応答パラメーターとしての骨灰分率に対して最低であった。
Figure 2022513085000028
結論として、本試験は、無機Ｐが添加されていないトウモロコシ－大豆ミールをベースとする飼料に５００若しくは１，０００ＦＴＵ／ｋｇの用量レベルで添加された実験的フィターゼ（ＰｈｙＸ）（１．８ｇ／ｋｇのＭＣＰ由来の可消化Ｐと共に２．９ｇ／ｋｇの可消化Ｐを含有する）が栄養的に適正である飼料と同等の子ブタ中手骨灰分率、骨Ｐ含量及び成長性能を維持することに有効であることを証明した。応答は、実験的フィターゼが米及び米ヌカを含有するトウモロコシ－ＳＢＭをベースとする飼料が給餌された離乳期の子ブタにおける飼料中の推定１．８３ｇ／ｋｇの可消化Ｐに置換し得たと推定された、１，０００ＦＴＵ／ｋｇの用量レベルで最大であった。
実施例１０
キメラ高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチドのデザイン及び評価
実施例４に記載される高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチド（ＰＨＹ－１３５９４、ＰＨＹ－１３７８９及びＰＨＹ－１３８８５）のＮ末端及びＣ末端でのスワッピング／置換領域の寄与を評価するために一連のキメラポリペプチドを設計した．本試験のために、Ｎ末端は配列番号１による残基１～１３として規定し、コア領域は、配列番号１による残基１４～３２５として規定し、及びＣ末端は配列番号１による、実施例７に記載される各ポリペプチドの末端への残基３２６であると規定する。これらのタンパク質は、実施例１に記載される方法を用いて生成し、浄化培養上清の試料を使用して、熱安定性をＤＳＣにより、且つｐＨ３．５及びｐＨ５．５でのフィターゼ比活性を、実施例３に記載される方法を用いて測定した。比較のためにＰＨＹ－１３５９４、ＰＨＹ－１３７８９及びＰＨＹ－１３８８５フィターゼを用いて、ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）（ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ＮＣＩＭＢ ４１２４８、配列番号８８）、Ｃ．ブラキイ（Ｃ．ｂｒａｋｉｉ）（シトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ）ＡＡＳ４５８８４、配列番号８９）及びＥ．ピスシシダ（Ｅ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）（エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）ＹＰ００７６２８７２７、エドワードシエラ・ピスシシダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）ＷＰ＿０１５４６１２９１．１、配列番号９０）において見出されたＨＡＰフィターゼのＮ末端領域を含有するキメラ分子を創出する作用。同様に、比較のためにＰＨＹ－１３５９４、ＰＨＹ－１３７８９及びＰＨＹ－１３８８５を使用して、Ｈ．ａｌｖｅｉ（ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）ＷＯ２０１００３４８３５－０００２、配列番号９４）、Ｙ．モラレッティ（Ｙ．ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ）（エルシニア・モラレッティ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ）ＷＰ０３２８１３０４５、配列番号９５及びブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ）（ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ＮＣＩＭＢ ４１２４８、配列番号９６）において見出されたＨＡＰフィターゼのＣ末端を含有するキメラ分子を創出する作用。使用したフィターゼコア領域は、下記：ＰＨＹ－１３５９４について配列番号１００、ＰＨＹ－１３７８９について配列番号１０１、ＨＹ－１３８８５について配列番号１０２の通りである。表２１は、試験した様々なキメラ構築物について記載し、熱安定性、ｐＨ３．５での比活性並びにｐＨ５．５と比較したｐＨ３．５での比活性の比率を記載している。表２１に示したように、評価した３種の高ＴｍフィターゼのＮ末端又はＣ末端何れかにおける修飾は、極めて類似の熱安定性を備える酵素を生じさせるが、これは、これらの高Ｔｍフィターゼの熱安定性を維持するための構造的決定因子がコア領域のアミノ酸配列内に存在することを示している。表２１上に記載された全高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチドは、更に実施例２に記載されるアッセイを用いて試験した場合に１００ＦＴＵ／ｍｇ超を提示する。
Figure 2022513085000029
例示するために、図３は、近縁種であるハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）６－フィターゼ（ＰＤＢエントリーコード：４ＡＲＯ、ミオ－イノシトールヘキサキス硫酸塩との錯体中のフィターゼ）について公表され、リボン図として示された結晶構造を用いてモデリングされた代表的なＴｍ－分岐群フィターゼの三次元構造を示している。このモデルは、ＭＯＥ（ｖ２０１３．０８，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）を用いて構築し、ＰｙＭｏｌソフトウェアプログラム（バージョン１．８．４．２，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を用いて可視化した。ブラックで描出したのは「コア」ドメインであり、ライトグレイトーンで描出したのは本明細書に示した実験において置換／スワップされたＮ末端及びＣ末端領域である。このモデルは、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）６－フィターゼの結晶構造を用いて、Ａｒｉｚａ ｅｔ ａｌ（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔａｔｅ ｂｙ ｔｈｅ ６－Ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ：Ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ，ＰＬＯＳ，８：１－１３）によって提示された構造に基づく多重配列アラインメントと一致している。

Claims (36)

  1. 配列番号１に規定されたアミノ酸配列と少なくとも８２％の配列同一性を有する、フィターゼ活性を含む改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  2. 前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列は、高Ｔｍフィターゼ分岐群ポリペプチドについて表１１に規定された少なくとも約１２００の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）スコアを有する、請求項１に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  3. 配列番号１に規定されたアミノ酸配列に対応するアミノ酸１４～３２５位と少なくとも７８％の配列同一性を有する改変フィターゼポリペプチド又はそのコアドメイン断片。
  4. 実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたって９５℃でミキサー液適用（ＭＬＡ）において適用された場合、少なくとも約５０％の飼料中ペレット化回収率を有する、請求項１～３の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  5. 実施例５に記載される標準的飼料中ペレット化回収率試験を用いて、３０秒間にわたる８０℃でのＭＬＡにおける適用と比較して、３０秒間にわたって９５℃でＭＬＡにおいて適用された場合、少なくとも約０．７の飼料中ペレット化回収率を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  6. 実施例３に記載される示差走査熱量測定アッセイ条件を用いて、少なくとも約９２．５℃のＴｍ温度を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  7. 実施例３に記載されるアッセイ条件下において、ｐＨ３．５で少なくとも約１００Ｕ／ｍｇの比活性を含む、請求項６に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  8. 前記フィターゼポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１若しくは２又は４～７の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  9. 前記フィターゼポリペプチドは、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１若しくは２又は４～７の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片。
  10. 請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックスであって、前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、（ｉ）単独で、又は（ｉｉ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌、若しくは（ｉｉｉ）少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｉｖ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌及び少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｖ）少なくとも１種の他の飼料添加成分を更に含む（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）の何れかで使用され得、及び任意選択的に、前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、少なくとも約０．１ｇ／トン飼料の量で存在する、動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックス。
  11. 請求項６～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックスであって、前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、（ｉ）単独で、又は（ｉｉ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌、若しくは（ｉｉｉ）少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｉｖ）少なくとも１種の細菌株を含む直接給与生菌及び少なくとも１種の他の酵素と組み合わせて、又は（ｖ）少なくとも１種の他の飼料添加成分を更に含む（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）の何れかで使用され得、及び任意選択的に、前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、少なくとも約０．１ｇ／トン飼料の量で存在する、動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物又はプレミックス。
  12. 請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された生成宿主において機能的である調節配列を含む組み換え構築物。
  13. 請求項６～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された生成宿主において機能的である調節配列を含む組み換え構築物。
  14. 前記生成宿主は、細菌、真菌、酵母、植物及び藻類からなる群から選択される、請求項１２に記載の組み換え構築物。
  15. 前記生成宿主は、細菌、真菌、酵母、植物及び藻類からなる群から選択される、請求項１３に記載の組み換え構築物。
  16. 改変フィターゼポリペプチド又はその断片を生成するための方法であって、
    （ａ）生成宿主を、請求項１２に記載の組み換え構築物で形質転換させる工程；及び
    （ｂ）前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片が生成される条件下で工程（ａ）の前記生成宿主を培養する工程
    を含む方法。
  17. 改変フィターゼポリペプチド又はその断片を生成するための方法であって、
    （ａ）生成宿主を、請求項１３に記載の組み換え構築物で形質転換させる工程；及び
    （ｂ）前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片が生成される条件下で工程（ａ）の前記生成宿主を培養する工程
    を含む方法。
  18. 前記改変フィターゼポリペプチド又はその断片は、任意選択的に、前記生成宿主から回収される、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 請求項１６又は１７に記載の方法によって得られるフィターゼ含有培養上清。
  20. 請求項１８に記載の方法によって得られるフィターゼ含有培養上清。
  21. 請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列。
  22. 請求項６～９の何れか一項に記載のフィターゼ活性を有する改変フィターゼポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列。
  23. 請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための乾燥酵素組成物。
  24. 請求項６～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための乾燥酵素組成物。
  25. 顆粒状飼料添加組成物である、請求項２３に記載の乾燥酵素組成物。
  26. 顆粒状飼料添加組成物である、請求項２４に記載の乾燥酵素組成物。
  27. 請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための液体酵素組成物。
  28. 請求項６～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又はその断片を含む動物飼料中で使用するための液体酵素組成物。
  29. 動物飼料の栄養価値を向上させるための方法であって、請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼ又はその断片は、動物飼料に添加される、方法。
  30. 動物飼料の栄養価値を向上させるための方法であって、請求項６～９の何れか一項に記載の改変フィターゼ又はその断片は、動物飼料に添加される、方法。
  31. １つ以上の評価指数上の動物の性能を向上させるための方法であって、有効量の、請求項１～９の何れか一項に記載の改変フィターゼポリペプチド又は請求項１０若しくは１１に記載の動物飼料、飼料原料、飼料添加組成物若しくはプレミックスを動物に投与する工程を含む方法。
  32. 前記１つ以上の評価指数は、増加した飼料効率、上昇した体重増加、減少した飼料要求率、飼料中の栄養素又はエネルギーの向上した消化率、向上した窒素保持率、壊疽性腸炎の悪影響を回避する向上した能力及び向上した免疫応答からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記動物は、ブタ及び家禽類からなる群から選択される単胃動物である、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. 前記ブタは、子ブタ、育成ブタ及び雌ブタからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記家禽類は、七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏、ガチョウ、キジ、ウズラ及びエミューからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記動物は、畜牛、若い子ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、野牛、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、トナカイ、カリブー、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン及びニルガイからなる群から選択される反芻動物である、請求項３１又は３２に記載の方法。
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