JP5872024B2 - 合成フィターゼ変異体 - Google Patents
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082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼの少なくとも一つを含む本発明に従う動物飼料添加物の、いずれかの動物飼料における使用をさらに含む。この文脈では、使用は、本発明に従うフィターゼ又は本発明に従う動物飼料添加物の添加の後に、残りの飼料成分と共にペレット化する形態で行い得る。飼料ペレットの調製後にこれらのペレットに、特に液体の形態でフィターゼを添加することもまた実行可能である。
、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ、或いは本発明に従う合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは(表1の定義に従う)その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV
-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼの少なくとも一つを含む本発明に従う動物飼料添加物、或いは上記合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは(表1の定義に従う)その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV
-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼの少なくとも一つを含む動物飼料のいずれか一つの、家畜のスラリー中のリン酸含量を減少させるための使用によってさらに達成される。
本発明の様々な態様を以下に示す。
(1)配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ。
(2)配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは94%、及び特に95、96、97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、(1)に記載のフィターゼ。
(3)(1)に記載のフィターゼに比べて少なくとも一つの位置に、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する、(1)又は(2)に記載のフィターゼ。
(4)単離されたフィターゼである、(1)〜(3)のいずれかに記載のフィターゼ。
(5)エルシニア・モレラッティイ(Yersinia mollaretii)及びハフニア属(Hafnia sp.)の二つの野生型フィターゼと比べて、向上したペプシン安定性、向上した熱安定性、並びに/又は向上した比活性を有する、(1)〜(4)のいずれかに記載のフィターゼ。
(6)(1)〜(5)のいずれかに記載のフィターゼの一つをコードする、フィターゼをコードする単離された核酸配列。
(7)a)配列番号25の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有するか、又は
b)a)の配列の一つの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
フィターゼをコードする単離された核酸配列。
(8)(6)又は(7)に記載の核酸配列を含む、組み換え発現ベクター。
(9)(6)若しくは(7)に記載の核酸配列、又は(8)に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
(10)(6)若しくは(7)に記載の核酸配列、又は(8)に記載のベクターを含む、組み換え生産生物。
(11)(1)〜(5)のいずれかに記載のフィターゼの少なくとも一つ、及びさらなる飼料添加物を含む、動物飼料添加物。
(12)(1)〜(5)のいずれかに記載のフィターゼの少なくとも一つを含む、動物飼料。
(13)(1)〜(5)のいずれかに記載のフィターゼ、又は(11)に記載の動物飼料添加物の、動物飼料における使用。
(14)(1)〜(5)のいずれかに記載のフィターゼ、(11)に記載の動物飼料添加物、又は(12)に記載の動物飼料の、家畜のスラリー中のリン酸含量を減少させるための使用。
文献(Huang et al. (2006) A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia intermedia. Biochem Biophys Res Commun 350: 884-889、Shi et al. (2008) A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp. GC21 isolated from grass carp intestine. Aquaculture 275:70-75、及びWO2008116878(実施例1))に類似する方法で、変性オリゴHaf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(配列番号 1)及びHaf1092 5’-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3’(配列番号 2)を用いて、アニーリング温度40℃〜50℃で、PCRを用いて、フィターゼを一連の腸内細菌において探索する。形成されるPCR産物を、同一のアニーリング条件下の、オリゴHaf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(配列番号1)及びHaf1091 5’-GCDATRTTNGTRTCRTG-3’(配列番号3)を用いるセミネステッド(semi-nested)PCRの鋳型として用いる。断片を、Hafnia属の菌株(Hafnia属LU11047)から単離し得る。単離された断片を、製造業者のインストラクションに従って、「TOPO TA Cloning(登録商標)Kit(Invitrogen)」によりサブクローニングし、その後、配列決定する。この部分配列から始めて、フィターゼの完全長配列をいわゆるTAIL-PCR法(Yao-Guang Liu and Robert F. Whittier (1995) Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25, 674-681)により増幅する。この目的のため、以下のオリゴヌクレオチドを用いる。
1.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号4)及び
Haf1167(5’-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3’、配列番号 5)
2.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号 4)及び
Haf1168(5’-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3’、配列番号 6)
3.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号 4)及び
Haf1169(5’-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3’、配列番号 7)
5'末端の増幅:
1.Haf1077(5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8)及び
Haf1170(5’- CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3’、配列番号 9)
2.Haf1077(5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8)及び
Haf1171(5’- GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3’、配列番号 10)
3.Haf1077(5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8)及び
Haf1172(5’- CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3’、配列番号 11)。
フィターゼFus5#2のクローニング
Hafnia属LU11047の染色体DNAから、フィターゼの1〜1074塩基の断片(配列番号14)をPCRによる増幅する。ヌクレオチド1057〜1323を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、Yersinia mollaretii ATCC43969の推定フィターゼ(又は酸性ホスファターゼ)のDNA配列であるNCBI Sequence ID ZP_00824387に由来する。これを、Yersinia mollaretii ATCC43969の染色体DNAから第二のフィターゼ断片(配列番号15)を増幅するために用いる。二つのフィターゼ断片の増幅において、用いるオリゴにより、Hafniaの断片の3'末端及びYersiniaの断片の5'末端の両方で、互いのフィターゼ断片に対し20bpの重複が生じる。この方法では、該二つの断片をPCR融合により組み合わせて、合成フィターゼFus5#2をコードする配列番号16のフィターゼ配列を得ることができる。該フィターゼに由来する配列番号17のアミノ酸配列では、SignalP 2.0のソフトウェアによりアミノ酸1〜33がシグナルペプチドになると予測される。成熟フィターゼFus5#2(配列番号18)は、配列番号19のヌクレオチド配列によりコードされる。
フィターゼ活性をマイクロタイタープレートにおいて決定する。酵素サンプルを反応緩衝液(250mM酢酸Na、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH5.5)において希釈する。10μLの酵素溶液を、37℃で1時間、140μLの基質溶液(反応緩衝液中に6mMフィチン酸Na(Sigma P3168)を含む)と共にインキュベートする。反応を、150μlのトリクロロ酢酸溶液(15% w/w)の添加により停止させる。遊離したリン酸を検出するために、20μlの反応停止した反応溶液を280μLの調製したばかりの呈色試薬(60 mM L-アスコルビン酸(Sigma A7506)、2.2 mMモリブデン酸アンモニウム四水和物、325 mM H2SO4)で処理し、50℃で25分間インキュベートし、その後820nmの吸光度を決定した。ブランク値のために、基質緩衝液自身を、37℃でインキュベートし、トリクロロ酢酸による反応停止後に10μLの酵素サンプルのみを添加する。呈色反応を、残りの測定と類似の方法で行う。遊離したリン酸の量は、既知濃度のリン酸溶液を用いる呈色反応の検量線により決定する。
フィターゼ発現カセットを含むプラスミドを有するE. coli BL21(DE3)株を、アンピシリン(100mg/L)を補ったLB培地において37℃で増殖させる。フィターゼの発現を、0.6のOD(600nm)で、1mMのIPTGの添加により誘導する。4時間の誘導後、10%(v/v)の10×BugBuster溶液(Novagen)を添加し、混合物を15分間室温でインキュベートする。遠心後、上清をフィターゼ活性の決定の為に用いる。
6×Hisラベルしたフィターゼ変異体を精製するために、誘導されたフィターゼを発現するE. coli培養ブロスを300mM NaCl、(製造業者であるRoche Applied Scienceのインストラクションに従って)EDTAを含まないCompleteTMプロテアーゼインヒビター、及び10%(v/v)10×BugBuster溶液(Novogen)で処理し、混合物を室温で15分間インキュベートする。遠心後、上清を製造業者のインストラクションに従ってNi-NTAカラム/KIT(Qiagen)に結合させる。洗浄ステップ後の溶出を、冷たい溶出緩衝液(50mM酢酸Na緩衝液、300mM NaCl、500mMイミダゾール、1 mM CaCl2)を用いて行う。タンパク質含量の決定の前に、サンプルを、透析によるpH 5.5の2mMクエン酸ナトリウムへの緩衝液交換に供する。
フィターゼFus5#2をAspergillus nigerにおいて発現させるために、非コード3'-glaA領域に隣接する、A. nigerのグルコアミラーゼ(glaA)プロモーターの制御下にフィターゼ遺伝子を含む発現構築物を最初に調製する。この方法では、構築物はA. nigerの3'-glaA領域への挿入が意図される。細胞外タンパク質の分泌のために用いられるシグナル配列は、A. ficuumフィターゼのシグナル配列である。発現構築物の為に用いられるベースは、EP0635574B1においてより詳細に記載されるプラスミドpGBGLA-53(WO9846772ではpGBTOPFYT-1とも呼ばれる)である。当業者に公知のPCRベースのクローニング技術により、pGBGLA-53中の、アミノ酸配列ASRNQSSから始まる成熟フィターゼタンパク質をコードするA. ficuumフィターゼの遺伝子断片を、成熟Fus5#2フィターゼをコードする配列番号19の遺伝子断片に置換する。これにより、プラスミドpGLA53-Fus5#2(配列番号23)が生じる。生じるプラスミドからHindIIIを用いて単離される直線状発現カセットと、プラスミドpGBLA50(EP0635574B1)/pGBAAS-1(同じプラスミドのWO9846772での名前)から単離されるamdSマーカーカセットの、glaA欠損A. niger発現株への共形質転換、及びその後の振盪フラスコでのフィターゼの発現を、該二つの引用特許の明細書に記載されている通りに行う。培養上清におけるフィターゼ活性を、細胞の遠心除去後に毎日決定する。最大活性は3日目〜6日目の間に達成される。
フィターゼの変異体を、配列番号19の遺伝子配列のPCRによる突然変異により作製する。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」(Stratagene)を、特異的突然変異を行うために用いる。配列番号19のコーディング配列全体、あるいはその一部のみでのランダム突然変異を、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」(Stratagene)により行う。突然変異率は、用いる鋳型DNAの量により1-5個の突然変異の所望の量に設定する。複数の突然変異を、各突然変異の目標の組み合わせにより、又は幾つかの突然変異サイクルの連続的な実行により作製する。
熱不活性化曲線を記録するために、反応緩衝液(250mM酢酸Na、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH 5.5)に希釈した酵素サンプルを、各温度で20分間加熱し、その後4℃まで冷却する。熱処理を経ていない参照サンプルを20分間室温で放置し、その後同様に4℃まで冷却する。熱による前処理の後に、サンプルの酵素活性をフィターゼアッセイにより決定する。参照サンプルの活性を100%に標準化する。様々なフィターゼ変異体の熱安定性を、いわゆるT50値により特徴づける。T50は、熱処理を経ていない参照サンプルと比べて、熱不活性化後に50%の残効性がまだ存在している温度を示す。℃で表される、二つのフィターゼ変異体の熱安定性の変化はそれぞれのT50値の差に起因する。
pHプロフィールを決定するために、希釈塩酸を用いてpH値1.5〜7の範囲にした、改変反応緩衝液(100mM酢酸Na、100mMグリシン、100mMイミダゾール、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20)を、フィターゼアッセイのために用いる。相対活性を決定するために、pH5.5で測定された活性を100%に設定する。結果を表2及び3に示す。
pH2での安定性を決定するために、フィターゼサンプルを緩衝液(250mMグリシン、3mg/mL BSA、pH2)において30U/mLまで希釈する。サンプルを37℃で30分間インキュベートする。その後、サンプルを直接、反応緩衝液(250mM酢酸Na、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH5.5)でフィターゼ活性決定の最適測定範囲(約0.6 U/mL)まで希釈し、フィターゼ活性を測定する。参照のために、サンプルを同時に30U/mLの濃度で反応緩衝液において37℃で30分間インキュベートし、フィターゼ活性を同様に分析する。pHストレスを与えたサンプルの活性を、100%の安定性として設定する参照値により標準化する。Natuphos(登録商標)(BASF)を、市販のフィターゼとの比較の為に、アッセイにおいて同様に用いる。
ペプシンに対する安定性を決定するために、ペプシンを含む緩衝液(250mMグリシン、3mg/mL BSA、pH2、10 mg/mLペプシン(Sigma P-7000、445U/mg))においてフィターゼサンプルを30U/mLまで希釈する。サンプルを37℃で30分間インキュベートする。その後、サンプルを直接、反応緩衝液(250mM酢酸Na、1 mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH5.5)でフィターゼ活性決定の最適測定範囲(約0.6U/mL)まで希釈し、フィターゼ活性を決定する。参照のために、サンプルを同時に30U/mLの濃度でpH5.5の反応緩衝液において37℃で30分間インキュベートし、フィターゼ活性を同様に分析する。ペプシン処理したサンプルの活性を100%の安定性として設定する参照値により標準化する。Natuphos(登録商標)(Natuphos(登録商標) 10000L、BASF SE)を、市販のフィターゼとの比較の為に、同様にアッセイにおいて用いる。
Claims (13)
- 配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ。
- 配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のフィターゼ。
- 請求項1に記載のフィターゼに比べて少なくとも一つの位置に、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する、請求項1又は2に記載のフィターゼ。
- 単離されたフィターゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のフィターゼ。
- エルシニア・モラレッティイ(Yersinia mollaretii)及びハフニア属(Hafnia sp.)の二つの野生型フィターゼと比べて、向上したペプシン安定性、向上した熱安定性、並びに/又は向上した比活性を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のフィターゼ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼの一つをコードする、フィターゼをコードする単離された核酸。
- a)配列番号25の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する核酸配列を有する、
フィターゼをコードする単離された核酸。 - 請求項6又は7に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
- 請求項6若しくは7に記載の核酸、又は請求項8に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
- 請求項6若しくは7に記載の核酸、又は請求項8に記載のベクターを含む、非ヒト組み換え生産生物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼの少なくとも一つ、及びさらなる飼料添加物を含む、動物飼料添加物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼの少なくとも一つを含む、動物飼料。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼ、又は請求項11に記載の動物飼料添加物の、動物飼料における使用。
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