JP5872024B2 - 合成フィターゼ変異体 - Google Patents

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Description

本発明は、フィターゼ、フィターゼ酵素をコードするアミノ酸配列、及びフィターゼをコードするヌクレオチド配列、フィターゼの製造及び使用方法、並びにこれらのフィターゼを含む動物飼料に関する。
リンは、生物の成長に必要不可欠な元素である。家畜生産において、良好な成長率を達成するためには、一般に、飼料に無機リンを補わなければならなない。穀物及び豆類においては、リンは主にフィチン酸の形態で蓄えられている。しかしながら、ブタ、家禽、及び魚類等の単胃動物は、フィチン酸塩若しくはフィチン酸を直接吸収することができず、これは、集約的な家畜生産が行われる地域におけるリンの過負荷を意味するフィチン酸の排出につながる。さらに、カルシウム、銅、又は亜鉛等の金属と結合するフィチン酸は、単胃動物の代謝に負の影響を有する物質として作用する。これらの動物のリン酸の欠乏を補い、かつ十分な成長及び十分な健康を確保するために、無機リン酸塩が動物飼料に添加される。この無機リン酸塩の添加は費用がかかり、環境にさらなる悪影響をもたらす。動物飼料中でフィターゼを用いる事によって、フィチン酸は加水分解され、スラリー中のイノシトールリン酸及び無機リン酸塩の含量の低減をもたらす。動物飼料へのフィターゼの添加は、有機リンの利用可能性を改善し、かつ排出されるフィチン酸に結合したリン酸による環境への悪影響を減少させる。文献には、真菌及び細菌の両方を起源とする様々な天然フィターゼが記載されている。
ミオ‐イノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼとも呼ばれるフィターゼは、フィチン酸から少なくとも一つのリン酸残基を開裂することができるホスファターゼの一種である。
EP 420358には、細菌フィターゼのクローニング及び発現が一般的に記載されており、WO 2006/38062には、Citrobacter freundii（シトロバクター・フロインディ）由来の細菌フィターゼが動物飼料への添加物として記載されており、WO 2007/112739には、Citrobacter braakii（シトロバクター・ブラキ）由来の天然フィターゼに基づくフィターゼ並びにその製造法及び動物飼料における使用法が記載されている。
Haefner et al.（Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., Lohscheidt M. and Zelder O, (2005) Biotechnological production and application of phytase. Appl Microbiol Biotechnol 68:588-597）には、ヒト又は動物の栄養学の分野におけるフィターゼの多様な公知の使用について記載されている。さらなるフィターゼの使用、例えばバイオエタノールの生産におけるバイオマス又はデンプンを加水分解するための使用等は、WO 2008/097620に記載されている。
WO 2008/116878及びWO 2010/034835には、Hafnia alvei（ハフニア・アルベイ）由来のフィターゼ、そのタンパク質配列、およびその変異体が記載されている。Zinin et al.（FEMS Microbiology Letters (2004) 236:283-290）には、その配列がアクセッション番号Q6U677としてUNIPROTデータベースに登録されているObesumbacterium proteus（オベサムバクテリウム・プロテウス）由来のフィターゼが開示されている。特許出願WO 2006/043178、WO 2008/097619、及びWO 2008/092901には、様々なButtiauxella（ブティアウクセラ）属由来のフィターゼが記載されている。現在最も高い比活性を有する天然フィターゼとして、Yersinia intermedia（エルシニア・インターメディア）（WO 2007/128160）及びYersinia pestis（エルシニア・ペスティス）（WO 02/048332）由来の天然フィターゼが挙げられる。
しかしながら、これらの現在利用可能なフィターゼは全て、動物飼料添加物の製造に必要な性質を示さない。現在利用可能なフィターゼは、その活性の重大な喪失を伴わずに、動物飼料ペレットの製造に用いるのに十分に熱的に安定ではない。動物飼料ペレットの製造では、一つの物体として家畜に与えるために、フィターゼはさらなる通常の動物飼料成分と共に高温及び高湿度下で圧縮される。salmonella（サルモネラ）属の有効な破壊、及びデンプンのゼラチン化は、製造中の80℃より高い温度でのみ達成される（Amerah et al. Worlds Poulty Science Journal (2011) 67:29-45）。この熱く湿った条件下での圧縮は、重大なフィターゼ活性の損失をもたらす。この活性の喪失を防ぐ一つの方法は、フィターゼ粒子が熱の影響から保護されるようにするための、多くの時間と労力を要するフィターゼ粒子のコーティングである。このフィターゼ添加物のコーティングは、コーティングのために油脂又はポリマーが用いられる結果として、重大な追加コストの原因となる。市販のフィターゼの添加量は一般に、pH5.5での活性測定の結果に基づいて決定され（DIN ISO 30024:2009）、個別の消化管におけるpHに対応するように適合されていない。これは、5.5以外のpH値での活性の変動によって重大な誤った添加量をもたらす。
欧州特許第EP 420358号 国際公開第WO 2006/38062号 国際公開第WO 2007/112739号 国際公開第WO 2008/097620号 国際公開第WO 2008/116878号 国際公開第WO 2010/034835号 国際公開第WO 2006/043178号 国際公開第WO 2008/097619号 国際公開第WO 2008/092901号 国際公開第WO 2007/128160号 国際公開第WO 02/048332号
Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., Lohscheidt M. and Zelder O, (2005) Biotechnological production and application of phytase. Appl Microbiol Biotechnol 68:588-597 Zinin et al , FEMS Microbiology Letters (2004) 236:283-290 Amerah et al. Worlds Poulty Science Journal (2011) 67:29-45 DIN ISO 30024:2009
従って、本発明の目的は、コーティング等の追加の保護手段を伴わず、かつ可能な限り低い活性の喪失しか伴わないでsalmonellaを含まない飼料ペレットの製造において用いられ得る程度に十分な熱安定性を有するフィターゼを提供する事である。本発明のさらなる目的は、様々な動物種の消化管の様々なpH範囲において用いられ得る程度に、かつ飼料成分の変動の結果としてpH範囲が変動した時でも消化管における十分な酵素活性が保たれる程度に、広いpH範囲において可能な限り少ない酵素活性の減少しか伴わないで用いられ得るフィターゼを提供する事である。
これらの目的は、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによって達成される。本発明に従うこれらのフィターゼは、少なくとも80℃の熱安定性を有し、従って、ペレット化の間の熱く湿った条件の結果としての重大な活性の喪失を受けずに、飼料ペレットの製造において用いるのに好適である。
本発明のフィターゼは、さらに、3pH単位にわたる広いpH範囲で、pH5.5で決定される活性の少なくとも50%を保持し、それゆえに用量が5.5での活性に基づいて決定される場合、それらは様々な消化pHを有する多様な動物において、かつ様々な飼料成分と共に、活性の喪失及びそのための動物によるリン酸の排出の増加をもたらす過度に低い用量を伴わずに用いられ得る。
さらに、本発明に従うフィターゼは、驚くべきことに向上したタンパク質分解安定性を有し、従って、それらは実質的な活性の喪失を伴わずに胃を通過し得、実際の活性部位である腸において、活性が保持される。さらに、本発明に従うフィターゼは、pH2で少なくとも85%の安定性を有し、それゆえに、強酸性域においてほんのわずかな活性喪失のみであることを確実にする。
合成フィターゼは、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列も有し得る。
好適には、本発明に従う合成フィターゼは、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも94%、特に好ましくは95%、及び好ましくは96、97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本目的は、変異体PhV-001のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-002のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-003のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-004のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-005のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-006のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-007のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-008のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-009のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-010のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-011のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-012のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-013のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-014のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-015のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-016のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-017のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-018のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-019のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-020のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-021のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-022のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-023のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-024のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-025のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-026のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-027のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-028のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-029のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-030のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-031のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-032のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-033のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-034のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-035のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-036のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-037のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-038のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-039のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-040のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-041のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-042のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-043のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-044のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-045のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-046のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-047のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-048のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-049のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-050のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-051のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-052のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-053のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-054のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-055のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-056のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-057のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-058のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-059のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-060のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-061のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-062のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-063のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-064のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-065のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-066のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-067のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-068のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-069のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-070のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-071のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-072のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-073のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-074のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-075のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-076のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-077のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-078のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-079のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-080のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-081のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-082のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-083のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-084のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-085のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-086のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-087のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-088のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-089のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-090のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-091のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-092のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-093のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-094のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-095のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-096のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-097のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-098のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-099のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-100のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-101のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-102のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-103のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-104のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-105のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-106のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-107のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-109のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-110のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-111のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-112のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-113のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-114のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-115のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-116のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-117のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-118のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-119のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-120のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-121のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-122のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-123のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-124のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-125のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-126のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-127のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-128のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-129のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-130のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-131のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-132のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-133のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-134のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-135のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-136のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-137のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-138のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-139のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-140のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-141のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-142のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-143のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-144のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-145のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-146のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
本目的は、変異体PhV-147のアミノ酸配列（表1参照、配列番号24に基づいてカラム2の通りの突然変異）と少なくとも95%、好ましくは96%、好ましくは97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する合成フィターゼによってさらに達成される。
図１は、フィターゼHF598（配列番号24）の熱安定性を示す。該フィターゼをpH5.5で記載の温度で20分間加熱する。冷却後、pH5.5及び37℃で残効性を決定する。相対残効性を決定するために、室温で20分間インキュベートした参照サンプルの活性を100%に設定する。 図２Ａは、フィターゼHF598（配列番号24）及びその幾つかの変異体のpHプロフィールを示す。フィターゼ活性を、各特定のpHで決定する。相対活性データを決定するために、pH5.5で決定した活性を100%に設定する。A）フィターゼをA.nigerで発現させ、培養上清を測定する。 図２Ｂは、フィターゼHF598（配列番号24）の幾つかの変異体のpHプロフィールを示す。フィターゼ活性を、各特定のpHで決定する。相対活性データを決定するために、pH5.5で決定した活性を100%に設定する。B）フィターゼをE. coliに発現させ、Ni-NTAを用いて濃縮後、測定する。 図３は、発現プラスミドpGLA53-HF598のプラスミドマップを示す。 図４は、発現プラスミドpFus5#2のプラスミドマップを示す。 図５は、発現プラスミドpH6-Fus5#2のプラスミドマップを示す。 図６は、発現プラスミドpGLA53-Fus5#2のプラスミドマップを示す。
二つのタンパク質配列又は核酸配列間の同一性は、2011年4月に利用可能なバージョンのプログラムニードル（needle）によって計算される同一性として定義される。ニードルは、ウェブサイトhttp://emboss.sourceforge.net/からダウンロードすることができる、無料で利用可能なプログラムパッケージEMBOSSの一部分である。標準的なパラメーターを用いる：gapopen 10.0（「ギャップ間隙ペナルティ」）、gapextend 0.5（「ギャップ伸長ペナルティ」）、タンパク質の場合にはデータファイルEBLOSUM62（マトリクス）、及びDNAの場合にはデータファイルEDNAFULL（マトリクス）。
一実施形態では、合成フィターゼは、本発明に従う上記フィターゼの一つに対し、少なくとも一つの位置において少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する。
本発明の目的において、「保存的」はアミノ酸のGからA；AからG、S；VからI、L、A、T、S；IからV、L、M；LからI、M、V；MからL、I、V；PからA、S、N；FからY、W、H；YからF、W、H；WからY、F、H；RからK、E、D；KからR、E、D；HからQ、N、S；DからN、E、K、R、Q；EからQ、D、K、R、N；SからT、A；TからS、V、A；CからS、T、A；NからD、Q、H、S；QからE、N、H、K、Rへの置換を意味する。本明細書において、フィターゼの活性が保持される限り、アミノ酸の任意の保存的置換を、他のアミノ酸の任意の保存的置換と組み合わせることが可能である。
有利には、合成フィターゼは単離されたフィターゼである。合成フィターゼが精製され単離されたフィターゼとしてではなく、バイオマスが完全若しくは部分的に分離されたか、又は全く分離されてない発酵液として存在することもまた可能である。本明細書において、発酵液は液体を除くことによって濃縮又は完全に乾燥され得る。これらの未精製又は部分精製されたフィターゼの溶液若しくはフィターゼの固体を、様々な製品の添加物として用いる事が可能である。
本発明に従う合成フィターゼは、有利なことに、配列番号18の合成フィターゼ構築物の構築の基礎となったYersinia mollaretii（エルシニア・モラレッティイ）及びHafnia属の生物の二つの野生型フィターゼと比べてペプシンへの向上した安定性、pH2での改善された酸安定性、活性pH範囲の拡大、並びに／又は向上した熱安定性を有する。
本発明は、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも81%、有利には85%又は90%、特に好ましくは94%、及び特に95、96、97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼをコードする単離された核酸配列もまた含む。
本発明は、配列番号25の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有し、フィターゼ活性を有する酵素をコードする単離された核酸配列、又は配列番号25の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する上記配列の一つの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を同様に含む。特定の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号25と90%より高い、特に少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、又は99%の同一性を有する。
本発明は、本発明に従う核酸配列の一つを含む組み換え発現ベクターをさらに含む。
本発明は本発明に従う核酸配列の一つを含むか、又は本発明に従う組み換え発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞を同様に含む。
本目的は、本発明に従う核酸配列の一つを含むか、又は本発明に従う組み換え発現ベクターを含む、非ヒト生産生物である組み換え生産生物によってさらに達成される。組み換え生産生物は、特に好ましくは、Aspergillus（アスペルギルス）、Pichia（ピチア）、Trichoderma（トリコデルマ）、Hansenula（ハンセヌラ）、Saccharomyces（サッカロミセス）、Bacillus（バチルス）、Escherischia（エッシェリシア）、Kluyveromyces（クルイベロマイセス）、Schizosaccharomyces（シゾサッカロミセス）属のうちの一つである。
本発明は、本発明に従う少なくとも一つのフィターゼ、特に配列番号24又は（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-1
20、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列又はそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ、並びにさらに、例えばウシ、家禽、又はブタにとっての通常の飼料添加物、例えばビタミン、ミネラル、若しくは他の添加物を含む動物飼料添加物をさらに含む。
本発明は、本発明に従う少なくとも一つの上記合成フィターゼ、特に配列番号24又は（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、P
hV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼを、通常の飼料成分と共に含む動物飼料をさらに含む。この文脈における可能な飼料成分は、肉牛、乳牛、家禽又はブタの肥育のための飼料ペレットにおいて慣習的に用いられる全ての飼料成分である。
本発明は、本発明に従う上記合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120
、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ、又は本発明に従う合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-
082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼの少なくとも一つを含む本発明に従う動物飼料添加物の、いずれかの動物飼料における使用をさらに含む。この文脈では、使用は、本発明に従うフィターゼ又は本発明に従う動物飼料添加物の添加の後に、残りの飼料成分と共にペレット化する形態で行い得る。飼料ペレットの調製後にこれらのペレットに、特に液体の形態でフィターゼを添加することもまた実行可能である。
本発明は、本発明に従う上記合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120
、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ、或いは本発明に従う合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV
-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼの少なくとも一つを含む本発明に従う動物飼料添加物、或いは上記合成フィターゼ、特に配列番号24若しくは（表1の定義に従う）その変異体PhV-001、PhV-002、PhV-003、PhV-004、PhV-005、PhV-006、PhV-007、PhV-008、PhV-009、PhV-010、PhV-011、PhV-012、PhV-013、PhV-014、PhV-015、PhV-016、PhV-017、PhV-018、PhV-019、PhV-020、PhV-021、PhV-022、PhV-023、PhV-024、PhV-025、PhV-026、PhV-027、PhV-028、PhV-029、PhV-030、PhV-031、PhV-032、PhV-033、PhV-034、PhV-035、PhV-036、PhV-037、PhV-038、PhV-039、PhV-040、PhV-041、PhV
-042、PhV-043、PhV-044、PhV-045、PhV-046、PhV-047、PhV-048、PhV-049、PhV-050、PhV-051、PhV-052、PhV-053、PhV-054、PhV-055、PhV-056、PhV-057、PhV-058、PhV-059、PhV-060、PhV-061、PhV-062、PhV-063、PhV-064、PhV-065、PhV-066、PhV-067、PhV-068、PhV-069、PhV-070、PhV-071、PhV-072、PhV-073、PhV-074、PhV-075、PhV-076、PhV-077、PhV-078、PhV-079、PhV-080、PhV-081、PhV-082、PhV-083、PhV-084、PhV-085、PhV-086、PhV-087、PhV-088、PhV-089、PhV-090、PhV-091、PhV-092、PhV-093、PhV-094、PhV-095、PhV-096、PhV-097、PhV-098、PhV-099、PhV-100、PhV-101、PhV-102、PhV-103、PhV-104、PhV-105、PhV-106、PhV-107、PhV-109、PhV-110、PhV-111、PhV-112、PhV-113、PhV-114、PhV-115、PhV-116、PhV-117、PhV-118、PhV-119、PhV-120、PhV-121、PhV-122、PhV-123、PhV-124、PhV-125、PhV-126、PhV-127、PhV-128、PhV-129、PhV-130、PhV-131、PhV-132、PhV-133、PhV-134、PhV-135、PhV-136、PhV-137、PhV-138、PhV-139、PhV-140、PhV-141、PhV-142、PhV-143、PhV-144、PhV-145、PhV-146、若しくはPhV-147の一つと対応するアミノ酸配列若しくはそれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼの少なくとも一つを含む動物飼料のいずれか一つの、家畜のスラリー中のリン酸含量を減少させるための使用によってさらに達成される。
記載されている実施形態は、本発明を例示し、本発明のより良い理解をもたらすことを意図しており、決して限定するものと解釈されるものではない。本発明のさらなる特徴は、従属請求項と併せて下記の好適な実施形態に関する説明から明確になる。この文脈では、本発明の各特徴は、一実施形態では、各場合において個別に、又は共に実施され得、少しも本発明を記載の実施形態に限定するものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲に明記されている。
本発明の様々な態様を以下に示す。
（１）配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ。
（２）配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは94%、及び特に95、96、97、98、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（1）に記載のフィターゼ。
（３）（１）に記載のフィターゼに比べて少なくとも一つの位置に、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する、（1）又は（2）に記載のフィターゼ。
（４）単離されたフィターゼである、（1）〜（3）のいずれかに記載のフィターゼ。
（５）エルシニア・モレラッティイ（Yersinia mollaretii）及びハフニア属（Hafnia sp.）の二つの野生型フィターゼと比べて、向上したペプシン安定性、向上した熱安定性、並びに／又は向上した比活性を有する、（1）〜（4）のいずれかに記載のフィターゼ。
（６）（1）〜（5）のいずれかに記載のフィターゼの一つをコードする、フィターゼをコードする単離された核酸配列。
（７）a）配列番号25の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有するか、又は
b）a）の配列の一つの相補鎖と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
フィターゼをコードする単離された核酸配列。
（８）（6）又は（7）に記載の核酸配列を含む、組み換え発現ベクター。
（９）（6）若しくは（7）に記載の核酸配列、又は（8）に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
（１０）（6）若しくは（7）に記載の核酸配列、又は（8）に記載のベクターを含む、組み換え生産生物。
（１１）（1）〜（5）のいずれかに記載のフィターゼの少なくとも一つ、及びさらなる飼料添加物を含む、動物飼料添加物。
（１２）（1）〜（5）のいずれかに記載のフィターゼの少なくとも一つを含む、動物飼料。
（１３）（1）〜（5）のいずれかに記載のフィターゼ、又は（11）に記載の動物飼料添加物の、動物飼料における使用。
（１４）（1）〜（5）のいずれかに記載のフィターゼ、（11）に記載の動物飼料添加物、又は（12）に記載の動物飼料の、家畜のスラリー中のリン酸含量を減少させるための使用。
Hafnia属LU11047のフィターゼのクローニング
文献（Huang et al. (2006) A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia intermedia. Biochem Biophys Res Commun 350: 884-889、Shi et al. (2008) A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp. GC21 isolated from grass carp intestine. Aquaculture 275:70-75、及びWO2008116878（実施例1））に類似する方法で、変性オリゴHaf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’（配列番号 1）及びHaf1092 5’-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3’（配列番号 2）を用いて、アニーリング温度40℃〜50℃で、PCRを用いて、フィターゼを一連の腸内細菌において探索する。形成されるPCR産物を、同一のアニーリング条件下の、オリゴHaf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’（配列番号1）及びHaf1091 5’-GCDATRTTNGTRTCRTG-3’（配列番号3）を用いるセミネステッド（semi-nested）PCRの鋳型として用いる。断片を、Hafnia属の菌株（Hafnia属LU11047）から単離し得る。単離された断片を、製造業者のインストラクションに従って、「TOPO TA Cloning（登録商標）Kit（Invitrogen）」によりサブクローニングし、その後、配列決定する。この部分配列から始めて、フィターゼの完全長配列をいわゆるTAIL-PCR法（Yao-Guang Liu and Robert F. Whittier (1995) Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25, 674-681）により増幅する。この目的のため、以下のオリゴヌクレオチドを用いる。
3'末端の増幅：
１．Haf1165（5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号4）及び
Haf1167（5’-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3’、配列番号 5）
２．Haf1165（5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号 4）及び
Haf1168（5’-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3’、配列番号 6）
３．Haf1165（5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号 4）及び
Haf1169（5’-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3’、配列番号 7）
5'末端の増幅：
１．Haf1077（5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8）及び
Haf1170（5’- CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3’、配列番号 9）
２．Haf1077（5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8）及び
Haf1171（5’- GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3’、配列番号 10）
３．Haf1077（5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8）及び
Haf1172（5’- CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3’、配列番号 11）。
得られるDNA断片を「TOPO TA Cloning（登録商標）Kit（Invitrogen）」によりクローニングし、配列決定する。そのヌクレオチド配列は、Hafnia属LU11047のフィターゼをコードする配列番号12の遺伝子である。それに由来する配列番号13のアミノ酸配列は、WO200811678のHafnia alvei（ハフニア・アルベイ）フィターゼのフィターゼ配列と98%の同一性を有する。SignalP 2.0のソフトウェアを用いて、アミノ酸1〜33がシグナルペプチドであると予測される。従って、成熟酵素は34位のセリンから始まる。
1.合成フィターゼFus5#2
フィターゼFus5#2のクローニング
Hafnia属LU11047の染色体DNAから、フィターゼの1〜1074塩基の断片（配列番号14）をPCRによる増幅する。ヌクレオチド1057〜1323を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、Yersinia mollaretii ATCC43969の推定フィターゼ（又は酸性ホスファターゼ）のDNA配列であるNCBI Sequence ID ZP_00824387に由来する。これを、Yersinia mollaretii ATCC43969の染色体DNAから第二のフィターゼ断片（配列番号15）を増幅するために用いる。二つのフィターゼ断片の増幅において、用いるオリゴにより、Hafniaの断片の3'末端及びYersiniaの断片の5'末端の両方で、互いのフィターゼ断片に対し20bpの重複が生じる。この方法では、該二つの断片をPCR融合により組み合わせて、合成フィターゼFus5#2をコードする配列番号16のフィターゼ配列を得ることができる。該フィターゼに由来する配列番号17のアミノ酸配列では、SignalP 2.0のソフトウェアによりアミノ酸1〜33がシグナルペプチドになると予測される。成熟フィターゼFus5#2（配列番号18）は、配列番号19のヌクレオチド配列によりコードされる。
E. coliの発現プラスミドにクローニングするために、NdeI制限切断部位を配列番号16のフィターゼDNA断片の5'末端に付加し、HindIII制限切断部位及び終止コドンを3'末端に付加する。このために追加的に必要な配列は、配列番号16のフィターゼを鋳型として用い、使用するプライマーを介してPCR反応により導入する。これらの切断部位を用いて、フィターゼをコードする遺伝子をE. coli 発現ベクターpET22b（Novagen）にクローニングする。NdeI制限切断部位を用いる事により、及び終止コドンを導入することにより、pelBシグナル配列をベクターから除き、プラスミドに存在する6×Hisタグのリードスルーが阻まれる。このようにして得られるプラスミドpFus5#2（配列番号20）を、E. coli BL21（DE3）株（Invitrogen）に形質転換する。
フィターゼタンパク質の精製の改善のために、N末端6×Hisタグを有するフィターゼ変異体をクローニングする。6×Hisタグだけでなく、BamHI切断部位も導入し、かつ成熟フィターゼタンパク質をコードする配列番号19の配列のための鋳型として作用するセンスオリゴプライマーH6：5’-ctatggatccgcatcatcatcatcatcacagtgataccgcccctgc-3’（配列番号21）を用いて、PCR産物を増幅する。PCR産物の3'末端に、終止コドン及びNdeI制限切断部位を同じアンチセンスオリゴを用いて再度導入する。このようにして生じる断片を、BamHI/NdeIによりpET22bベクターにクローニングし、プラスミドpH6-Fus5#2（配列番号22）を得、これをE. coli BL21(DE3）に同様に形質転換する。この構築物の場合には、pET22bに含まれるpelBシグナル配列を、ペリプラズムへの輸送のために用いる。
フィターゼアッセイ
フィターゼ活性をマイクロタイタープレートにおいて決定する。酵素サンプルを反応緩衝液（250mM酢酸Na、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH5.5）において希釈する。10μLの酵素溶液を、37℃で1時間、140μLの基質溶液（反応緩衝液中に6mMフィチン酸Na（Sigma P3168）を含む）と共にインキュベートする。反応を、150μlのトリクロロ酢酸溶液（15% w/w）の添加により停止させる。遊離したリン酸を検出するために、20μlの反応停止した反応溶液を280μLの調製したばかりの呈色試薬（60 mM L-アスコルビン酸（Sigma A7506）、2.2 mMモリブデン酸アンモニウム四水和物、325 mM H2SO4）で処理し、50℃で25分間インキュベートし、その後820nmの吸光度を決定した。ブランク値のために、基質緩衝液自身を、37℃でインキュベートし、トリクロロ酢酸による反応停止後に10μLの酵素サンプルのみを添加する。呈色反応を、残りの測定と類似の方法で行う。遊離したリン酸の量は、既知濃度のリン酸溶液を用いる呈色反応の検量線により決定する。
Escherichia coli（大腸菌）での発現
フィターゼ発現カセットを含むプラスミドを有するE. coli BL21（DE3）株を、アンピシリン（100mg/L）を補ったLB培地において37℃で増殖させる。フィターゼの発現を、0.6のOD（600nm）で、1mMのIPTGの添加により誘導する。4時間の誘導後、10%（v/v）の10×BugBuster溶液（Novagen）を添加し、混合物を15分間室温でインキュベートする。遠心後、上清をフィターゼ活性の決定の為に用いる。
Niアフィニティークロマトグラフィーによる精製
6×Hisラベルしたフィターゼ変異体を精製するために、誘導されたフィターゼを発現するE. coli培養ブロスを300mM NaCl、（製造業者であるRoche Applied Scienceのインストラクションに従って）EDTAを含まないCompleteTMプロテアーゼインヒビター、及び10%（v/v）10×BugBuster溶液（Novogen）で処理し、混合物を室温で15分間インキュベートする。遠心後、上清を製造業者のインストラクションに従ってNi-NTAカラム／KIT（Qiagen）に結合させる。洗浄ステップ後の溶出を、冷たい溶出緩衝液（50mM酢酸Na緩衝液、300mM NaCl、500mMイミダゾール、1 mM CaCl2）を用いて行う。タンパク質含量の決定の前に、サンプルを、透析によるpH 5.5の2mMクエン酸ナトリウムへの緩衝液交換に供する。
Aspergillus niger（クロコウジカビ）での発現
フィターゼFus5#2をAspergillus nigerにおいて発現させるために、非コード3'-glaA領域に隣接する、A. nigerのグルコアミラーゼ（glaA）プロモーターの制御下にフィターゼ遺伝子を含む発現構築物を最初に調製する。この方法では、構築物はA. nigerの3'-glaA領域への挿入が意図される。細胞外タンパク質の分泌のために用いられるシグナル配列は、A. ficuumフィターゼのシグナル配列である。発現構築物の為に用いられるベースは、EP0635574B1においてより詳細に記載されるプラスミドpGBGLA-53（WO9846772ではpGBTOPFYT-1とも呼ばれる）である。当業者に公知のPCRベースのクローニング技術により、pGBGLA-53中の、アミノ酸配列ASRNQSSから始まる成熟フィターゼタンパク質をコードするA. ficuumフィターゼの遺伝子断片を、成熟Fus5#2フィターゼをコードする配列番号19の遺伝子断片に置換する。これにより、プラスミドpGLA53-Fus5#2（配列番号23）が生じる。生じるプラスミドからHindIIIを用いて単離される直線状発現カセットと、プラスミドpGBLA50（EP0635574B1）／pGBAAS-1（同じプラスミドのWO9846772での名前）から単離されるamdSマーカーカセットの、glaA欠損A. niger発現株への共形質転換、及びその後の振盪フラスコでのフィターゼの発現を、該二つの引用特許の明細書に記載されている通りに行う。培養上清におけるフィターゼ活性を、細胞の遠心除去後に毎日決定する。最大活性は3日目〜6日目の間に達成される。
2.フィターゼFus5#2のフィターゼ変異体
フィターゼの変異体を、配列番号19の遺伝子配列のPCRによる突然変異により作製する。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」（Stratagene）を、特異的突然変異を行うために用いる。配列番号19のコーディング配列全体、あるいはその一部のみでのランダム突然変異を、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」（Stratagene）により行う。突然変異率は、用いる鋳型DNAの量により1-5個の突然変異の所望の量に設定する。複数の突然変異を、各突然変異の目標の組み合わせにより、又は幾つかの突然変異サイクルの連続的な実行により作製する。
作製されるフィターゼ変異体を、フィターゼ活性及び熱安定性について、ハイスループットな能力を有するアッセイにおいて試験する。このために、pET22bベースの発現構築物による形質転換後に得られるE. coli BL21（DE3）クローンを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいてLB培地（2%グルコース、100mg/Lアンピシリン）中でインキュベート（30°C、900 rpm、振盪機の可動域2 mm）する。誘導を、約0.5のOD（600 nm）において1 mM IPTGで4時間行う。その後、10%（v/v）の10×BugBuster溶液（Novogen）を添加し、混合物を15分間室温でインキュベートする。フィターゼ活性、及び20分の温度ストレス後の残効性を決定する。
このようにして作製されるフィターゼHF598（配列番号24）及びその変異体を、前記セクションに記載の手順と類似する方法でE. coli発現ベクターpET22b（Novagen）にクローニングし、その後、E. coli BL21（DE3）株により発現させる。さらに、Aspergillus nigerのための好適な発現構築物を、A. nigerへの形質転換後にフィターゼが発現され得るようにクローニングする。成熟変異体HF598（配列番号24）をコードし、A. niger（GENEART AG, Regensburg）のコドン使用頻度に適合させた合成遺伝子（配列番号25）を用いると、プラスミドpGla53-HF598（配列番号26）が得られる。
熱安定性（T 50 ）の決定
熱不活性化曲線を記録するために、反応緩衝液（250mM酢酸Na、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH 5.5）に希釈した酵素サンプルを、各温度で20分間加熱し、その後4℃まで冷却する。熱処理を経ていない参照サンプルを20分間室温で放置し、その後同様に4℃まで冷却する。熱による前処理の後に、サンプルの酵素活性をフィターゼアッセイにより決定する。参照サンプルの活性を100%に標準化する。様々なフィターゼ変異体の熱安定性を、いわゆるT50値により特徴づける。T50は、熱処理を経ていない参照サンプルと比べて、熱不活性化後に50%の残効性がまだ存在している温度を示す。℃で表される、二つのフィターゼ変異体の熱安定性の変化はそれぞれのT50値の差に起因する。
表1：フィターゼHF598（図1を参照されたい）及びその変異体の℃における熱安定性（T50）。配列番号24中の変化は、［もとのアミノ酸］［位置］［新しいアミノ酸］の形態でそれぞれのアミノ酸の置換により特定される。記号「-」は、該当アミノ酸の欠失を示す。アミノ酸の位置の番号は、常に配列番号24に関する。
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pHプロフィールの決定
pHプロフィールを決定するために、希釈塩酸を用いてpH値1.5〜7の範囲にした、改変反応緩衝液（100mM酢酸Na、100mMグリシン、100mMイミダゾール、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20）を、フィターゼアッセイのために用いる。相対活性を決定するために、pH5.5で測定された活性を100%に設定する。結果を表2及び3に示す。
表2：フィターゼHF598及びその変異体のpHプロフィール。フィターゼをA.nigerで発現させ、培養上清から直接測定する。フィターゼ活性を、pH5.5で決定した活性の相対値として%で示す（図2Aを参照されたい）。
Figure 0005872024
表3：幾つかのフィターゼ変異体のpHプロフィール。フィターゼを大腸菌で発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。フィターゼ活性を、pH5.5で決定した活性の相対値として%で示す（図2Bを参照されたい）。
Figure 0005872024
pH2での安定性の決定
pH2での安定性を決定するために、フィターゼサンプルを緩衝液（250mMグリシン、3mg/mL BSA、pH2）において30U/mLまで希釈する。サンプルを37℃で30分間インキュベートする。その後、サンプルを直接、反応緩衝液（250mM酢酸Na、1mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH5.5）でフィターゼ活性決定の最適測定範囲（約0.6 U/mL）まで希釈し、フィターゼ活性を測定する。参照のために、サンプルを同時に30U/mLの濃度で反応緩衝液において37℃で30分間インキュベートし、フィターゼ活性を同様に分析する。pHストレスを与えたサンプルの活性を、100%の安定性として設定する参照値により標準化する。Natuphos（登録商標）（BASF）を、市販のフィターゼとの比較の為に、アッセイにおいて同様に用いる。
表4：フィターゼHF598及びその変異体、並びにフィターゼFus5#2及び市販のフィターゼNatuphos（登録商標）のpH2での安定性の決定。＞90%の安定性を有するサンプルを、「安定」として表す。不安定なサンプル間のより段階的な区別のためには、測定された安定性を%で示す。
Figure 0005872024
ペプシンに対する安定性の決定
ペプシンに対する安定性を決定するために、ペプシンを含む緩衝液（250mMグリシン、3mg/mL BSA、pH2、10 mg/mLペプシン（Sigma P-7000、445U/mg））においてフィターゼサンプルを30U/mLまで希釈する。サンプルを37℃で30分間インキュベートする。その後、サンプルを直接、反応緩衝液（250mM酢酸Na、1 mM CaCl2、0.01%ツイーン20、pH5.5）でフィターゼ活性決定の最適測定範囲（約0.6U/mL）まで希釈し、フィターゼ活性を決定する。参照のために、サンプルを同時に30U/mLの濃度でpH5.5の反応緩衝液において37℃で30分間インキュベートし、フィターゼ活性を同様に分析する。ペプシン処理したサンプルの活性を100%の安定性として設定する参照値により標準化する。Natuphos（登録商標）（Natuphos（登録商標） 10000L、BASF SE）を、市販のフィターゼとの比較の為に、同様にアッセイにおいて用いる。
表5：幾つかのフィターゼ変異体、並びにフィターゼFus5#2及び市販のフィターゼNatuphos（登録商標）のペプシンへの安定性の決定。＞80%の安定性を有するサンプルを、「安定」として表す。不安定なサンプル間のより段階的な区別のためには、測定された安定性を%で示す。
Figure 0005872024

Claims (13)

  1. 配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有するフィターゼ。
  2. 配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のフィターゼ。
  3. 請求項１に記載のフィターゼに比べて少なくとも一つの位置に、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を有する、請求項1又は2に記載のフィターゼ。
  4. 単離されたフィターゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のフィターゼ。
  5. エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）及びハフニア属（Hafnia sp.）の二つの野生型フィターゼと比べて、向上したペプシン安定性、向上した熱安定性、並びに／又は向上した比活性を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のフィターゼ。
  6. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼの一つをコードする、フィターゼをコードする単離された核酸。
  7. a）配列番号25の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する核酸配列を有する、
    フィターゼをコードする単離された核酸。
  8. 請求項6又は7に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
  9. 請求項6若しくは7に記載の核酸、又は請求項8に記載のベクターを含む、組み換え宿主細胞。
  10. 請求項6若しくは7に記載の核酸、又は請求項8に記載のベクターを含む、非ヒト組み換え生産生物。
  11. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼの少なくとも一つ、及びさらなる飼料添加物を含む、動物飼料添加物。
  12. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼの少なくとも一つを含む、動物飼料。
  13. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のフィターゼ、又は請求項11に記載の動物飼料添加物の、動物飼料における使用。
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