JP6086614B2 - 生理活性分子の融合 - Google Patents
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Description
例えばブタおよび家禽などの家畜は、どちらも飼料利用率を増大させるために、飼料用酵素が慣例的に補給される動物である。
乳酸桿菌属(Lactobacillus)の構成員、そしてその他の細菌、特にバチルス属(Bacillus)の構成員もまた、鳥類および哺乳類の胃腸管内に頻繁に見られる。細菌が、この開放流環境でコロニー形成できるためには、粘膜への付着が必要条件であると考察される。腸管の上皮細胞は、大型糖タンパク質ムチンを主成分とする、糖タンパク質と糖脂質の複合混合物である、粘液の保護層によって被覆される。粘膜にコロニー形成する細菌は、粘液層内に見られ、また上皮細胞に付着しても見られる。ほとんどの場合、付着はタンパク質によって媒介されることが報告されているが、乳酸桿菌細胞表面の糖類部分は、粘膜成分と相互作用することも記載されている。現在の知識を要約すると、胃腸成分に付着する微生物株の能力は、胃腸粘液またはその主成分ムチンに対する、および腸細胞の脱落によって粘液中に捕捉された、または上皮が損傷を受けた際にアクセスできる、コラーゲンに対する、それらの親和性に基づくことが知られている。(バチルス属(Bacillus)構成員をはじめとする)天然腸細菌は、バイオフィルムを形式して上皮細胞に付着し、バイオフィルムを生成できない細菌よりも顕著により長く腸内に残留できることもまた知られている。したがって自己生成細胞外バイオフィルムマトリックスもまた、微生物株が胃腸成分に付着する能力にとって重要な役割を果たす。
−その典型がスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)(Pfam05738)からのプロテインAである、コラーゲンへの細菌付着を媒介するCna型タンパク質
−クロストリジウムコラゲナーゼの一部である、CBDドメイン。
特に本発明は、好ましくは飼料用または食品用酵素である、ポリペプチドまたは酵素に連結する、腸表面結合ポリペプチド断片に関する。本発明はまた、酵素と腸表面結合ポリペプチド断片からなる融合タンパク質をコードするDNA、核酸コンストラクト、ベクター、およびDNAを含んでなる宿主細胞;ならびにそれらを生成する方法;ならびに例えば動物飼料と動物飼料添加剤におけるその使用にも関する。
特定の実施形態では、本発明の融合フィターゼは、動物の胃腸管内におけるその滞留時間を増大させることによって、参照酵素と比較して、動物中で改善された能力を有する。
本発明はまた、本発明に従った融合タンパク質または融合ポリペプチド、好ましくは融合フィターゼをコードする核酸配列を含んでなる、核酸配列にも関する。
核酸コンストラクトは、制御配列に適合する条件下において、適切な宿主細胞中でコード配列の発現を誘導する1つまたは複数の制御配列と作動可能に連結する、本発明の核酸配列を含んでなる。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、ポリペプチドの生成に関与する、あらゆるステップが含まれるものと理解される。
「発現」という用語は、ポリペプチド、すなわち本発明の融合タンパク質または融合ポリペプチドの生成に関与する、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆるステップを含む。
「宿主細胞」という用語は、本明細書の用法では、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸コンストラクトによる、形質転換、形質移入、形質導入などを受けやすいあらゆる細胞タイプを含む。
本発明は、(a)融合ポリペプチドまたは酵素の生産に寄与する条件下で、宿主細胞を培養するステップと;(b)融合ポリペプチドまたは酵素を回収するステップとを含んでなる、本発明の融合ポリペプチドまたは融合酵素を生産する方法にも関する。
なおもさらなる態様では、本発明は、融合ポリペプチドまたは融合酵素、特に本発明の融合飼料用酵素を含んでなる組成物、ならびにこれらを使用する方法に関する。
動物という用語は、ヒトをはじめとする全ての動物を含む。動物の例は、非反芻動物、および反芻動物である。反芻動物としては、例えばヒツジ、ヤギ、および畜牛、例えば肉牛や乳牛などのウシなどの動物が挙げられる。特定の実施形態では、動物は非反芻動物である。非反芻動物としては、例えば(子ブタ、育成ブタ、および雌ブタをはじめとするが、これに限定されるものではない)ブタ(pig)またはブタ(swine)などの単胃動物;シチメンチョウ、カモ、および(ブロイラーひよこ、産卵鶏をはじめとするが、これに限定されるものではない)ニワトリなどの家禽;(サケ、マス、イズミダイ、ナマズ、およびコイをはじめとするが、これに限定されるものではない)魚;および(エビおよびクルマエビをはじめとするが、これに限定されるものではない)甲殻類が挙げられる。
本明細書で開示される特定の実施形態は、本発明のいくつかの態様の例証であることが意図されるので、本明細書で記載され特許請求される本発明の範囲は、これらの実施形態によって限定されない。あらゆる同等の実施形態は、本発明の範囲内であることが意図される。確かに、前述の記述から、当業者には、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が明白になるであろう。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
最初の段落では、一般手法を要約する。
本発明のバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)株は、B.サブティリス(B.subtilis)168(trpC2)(GenBank AL009126)の原栄養株誘導体である、1A747株(Bacillus Genetic Stock Center,The Ohio State University,Columbus,Ohio 43210 USA)に由来する。
B.サブティリス(B.subtilis)のための標準最少培地(MM)は、1×Spizizen塩、0.04%ナトリウムグルタミン酸、および0.5%グルコースを含有する。標準固体完全培地は、トリプトン血液寒天ブロス(TBAB、Difco)である。標準液体完全培地は、子牛肉浸出液−酵母抽出物ブロス(VY)である。これらの培地の組成について下で述べる。
TBAB培地:33gのDifcoトリプトン血液寒天ベース(カタログ番号0232)、1Lの水。高圧蒸気滅菌。
VY培地:25gのDifco子牛肉浸出液ブロス(カタログ番号0344)、5gのDifco酵母抽出物(カタログ番号0127)、1Lの水。高圧蒸気滅菌。
最少培地(MM):100mlの10×Spizizen塩;10mlの50%グルコース;1mlの40%グルタミン酸ナトリウム、水で1Lにする。
10×Spizizen塩:140gのK2HPO4;20gの(NH4)2SO4;60gのKH2PO4;10gのNa3クエン酸・2H2O;2gのMgSO4・7H2O;水で1Lにする。
10×VFB最少培地(10×VFBMM):2.5gのグルタミン酸Na;15.7gのKH2PO4;15.7gのK2HPO4;27.4gのNa2HPO4・12H2O;40gのNH4Cl;1gクエン酸;68gの(NH4)2SO4;水で1Lにする。
微量成分溶液:1.4gのMnSO4・H2O;0.4gのCoCl2・6H2O;0.15gの(ΝΗ4)6Μo7O24・4Η2O;0.1gのAICl3・6H2O;0.075gのCuCl2・2H2O;水で200mlにする。
Fe溶液:0.21gのFeSO4・7H2O;水で10mlにする。
CaCl2溶液:15.6gのCaCl2・2H2O;水で500mlにする。
Mg/Zn溶液:100gのMgSO4・7H2O;0.4gのZnSO4・7H2O;水で200mlにする。
VFB MM培地:100mlの10×VFBMM;10mlの50%グルコース;2mlの微量成分溶液;2mlのFe溶液;2mlのCaCl2溶液;2mlのMg/Zn溶液;882mlの無菌蒸留水。
バイオフィルムの成長を促進するMSgg培地:2.5mMのKH2PO4、2.5mMのK2HPO4、100mMのMOPS、2mMのMgCl2、700μΜのCaCl2、50μΜのMnCl2、1μΜのZnCl2、50μΜのFeCl3、2μΜのチアミン、0.5%グリセロール、0.5%グルタミン酸、50μg/mlのトリプトファン、50μg/mlのフェニルアラニン。
標準遺伝子および分子生物学技術は、一般に当該技術分野で既知であり、以前記載されている。DNA形質転換、PBS1普遍形質導入、およびその他の標準B.サブティリス(B.subtilis)遺伝子技術もまた、一般に当該技術分野で既知であり、以前記載されている。(Harwood and Cutting,1992)。
VY培地中における37℃で24時間の培養に続いて、培養物を6000rpmで10分間遠心分離した。タンパク質を濃縮するために、His標識対象タンパク質を含有する上清に、4℃での緩慢な添加を通じて80%の硫酸アンモニウムを添加した。10,000rpmで15分間の遠心分離後、ペレットタンパク質を5mLの20mMのトリスHCl、20mMのイミダゾール、500mMのNaCl、pH7.4緩衝液中に回収してから、4℃において1Lの同一緩衝液中で2回連続透析した。濾過後、濃縮タンパク質をヒスチジン親和性クロマトグラフィーカラム(HisTrap Fast Flow、GE Healthcare)に注入した。His標識対象タンパク質を製造会社の推奨事項に従って、当業者によって知られているように精製した。SDS−PAGEを通じて同定された、対象タンパク質を含有する画分を透析して、微量のイミダゾールを除去した。
Han Woo et al.(2003)によって記載されるように、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼ活性を50℃およびpH4で評価した。最初に、75μLのサンプルを、300μLの反応緩衝液、100mMのC4H6O4、2mMのC6H18O24P6、1mMのCaCl2、pH4と共に、50℃でインキュベートした。30分後に375μLの15%トリクロロ酢酸(v/w)を添加して、酵素反応を停止させた。次に450μLの蒸留水と、500μLの600mMのH2SO4、100mMのC6H7NaO6、4mMの(NH4)6Mo7O24の溶液と共に、50μLの停止予備反応液を50℃で20分間インキュベートすることで、放出されたオルトリン酸塩を測定した。次に光学濃度を820nmで測定した。次に以下の式に従って、酵素活性を測定した:
活性(U/L)=[(ODsample−ODblank)×希釈係数]/(係数cat×30分間)
一次抗体である抗HisTag(Santa Cruz Biotechnologies)と、二次抗体であるペルオキシダーゼ共役抗ウサギ抗体(Sigma)とを使用して、ELISA手順に従って、I型およびIV型コラーゲンへの結合アッセイを実施した。製造会社の推奨事項に従って、ECL Plusキット(GE Healthcare)により顕色を行った。当業者に良く知られているドットブロット手順に従って、タンパク質を予備スポットしてブロットを形成した。
「タンパク質精製」の節に記載されるように精製した後、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)のバイオフィルム結合領域TasAと、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を、VY培地中で一晩調製されたバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BSP1バイオフィルム形成株の前培養に混合した。同一手順に従って、しかしTasA_BSP1−Phy融合タンパク質をバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BSP1の前培養に混合するのを省いて、対照を調製した。それぞれの混合物の100μLを、0.5%寒天を添加したMSgg培地の表面に注ぐ。静置培養物を22℃で5日間培養して、バイオフィルム形成を誘発した。次に無菌ループによってバイオフィルムを採取して、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BSP1バイオフィルムに組み込まれなかったTasA_BSP1−Phyタンパク質融合物を排除するために、20mMのトリス−HCl、300mMのNaCl、および1mMのCaCl2からできた溶液で3回洗浄した。次に「フィターゼ活性試験」の節に記載されるように、フィターゼ活性アッセイのために、バイオフィルムを反応緩衝液に懸濁した。
本実施例は、野生の有益な株B.サブティリス(B.subtilis)BSP1中で同定されたCna型コラーゲン結合領域と、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)3個の結合モチーフを潜在的に含有して、36個の最初のAA(シグナルペプチド)が欠失した、1076個のAA Cna−型コラーゲン結合タンパク質をコードするB.サブティリス(B.subtilis)BSP1遺伝子配列
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphyloccus aureus)コラーゲン結合領域Cnaと、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)30個の最初のAA(シグナルペプチド)が欠失した、313個のAAコラーゲン結合タンパク質をコードするスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)cna配列
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、Cna_BSP1−phy融合物を過剰発現するようにデザインされた、B.サブティリス(B.subtilis)BSPB29株の構築について記載する。
本実施例は、Cna−phyを過剰発現するようにデザインされた、B.サブティリス(B.subtilis)BSPB32株の構築について記載する。
本実施例は、デニトロバクテリム・デトキシフィカンス(Denitrobacterium detoxificans)(Dr.Stanton,,National Animal Disease Ctr,USDA−Agricultural Research Service,Ames,Iowa,USAからの提供)のコラーゲン結合領域Cnaと、α−アミラーゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)771個のAAコラーゲン結合タンパク質をコードする、デニトロバクテリム・デトキシフィカンス(Denitrobacterium detoxificans)Dd01g014920配列
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の38個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子amyL
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、精製Cna_BSP1−phy融合物のI型およびIV型コラーゲンへの生体外結合を実証する。
本実施例は、精製Cna−phy融合物のI型およびIV型コラーゲンへの生体外結合を実証する。
本実施例は、コラーゲン結合ドメインを含有する融合物が、生体外で、その他の細胞外マトリックス(ECM)タンパク質、すなわちラミニン、フィブロネクチン、およびフィブリノーゲンにもまた結合できることを実証する。
本実施例は、コラーゲンに結合する融合物が、顕著なフィターゼ活性を示すことを実証する。
本実施例は、クロストリジウム・ヒストリティカム(Clostridium histolyticum)コラゲナーゼのコラーゲン結合領域CBDと、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)colHのS2BおよびS3ドメインからの215個のAAをコードするクロストリジウム・ヒストリティカム(Clostridium histolyticum)配列(Yoshihara et al.,1994)
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、ラクトバチルス・ロイテリー(Lactobacillus reuteri)1063のムチン結合領域と、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)Genebank AF120104配列内の位置549と位置939の間のラクトバチルス・ロイテリー(Lactobacillus reuteri)1063Mub1(RI+RII反復)390AA(Roos and Jonsson,2002)
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、MubBP(RI+RII)−phyを過剰発現するようにデザインされた、B.サブティリス(B.subtilis)BSPB33株の構築と、その精製について記載する。
本実施例は、精製MubBP(RI+RII)−phy融合物とムチンとの生体外結合を実証する。
本実施例は、ラクトバチルス・ロイテリー(Lactobacillus reuteri)1063のムチン結合領域R5およびR6と、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)Genebank AF120104配列内の位置2105と位置2475の間のラクトバチルス・ロイテリー(Lactobacillus reuteri)1063のR5+R6反復370個のAA(Roos and Jonsson,2002)
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)GGのSpaBからの付着領域と、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)配列LGG_00443の位置27と位置203の間のラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)GG付着ドメイン177個のAA
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)(Lactobacillus platarum)マンノース(manose)特異的付着MsaのconA様レクチンドメインと、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、合成遺伝子について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)Msaからのコンカナバリン(concavalin)様レクチンドメイン:配列EHS83650内の位置263と位置517の間の257個のAA
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、野生の有益な株B.サブティリス(B.subtilis)BSP1のTasAタンパク質と、サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter braakii)フィターゼのアミノ末端との融合物を過剰発現するようにデザインされた、遺伝子配列について記載する。
−)B.サブティリス(B.sutbilis)amyQからのプロモーター領域
−)B.サブティリス(B.subtilis)ytwD遺伝子からのシグナルペプチド(32個の最初のAAをコードする)
−)停止コドンが欠失した、(バイオフィルムマトリックスの主要構成要素をコードする)261個のAA TasAタンパク質をコードするB.サブティリス(B.subtilis)BSP1遺伝子配列
−)10個のアラニンスペーサー(PvuII制限部位を含む)
−)最初の22個のAA15(シグナルペプチド)が欠失した、コドンペア最適化サイトロバクター・ブラアキイ(Citrobacter brakii)フィターゼ遺伝子appA
−)トロンビン(thrombine)切断部位、ヘキサヒスチジンタグ、2個の連続停止コドン、およびNhel切断部位をそれぞれ含有する、56個のbp配列。
本実施例は、tasA_BSP1−phy融合物を過剰発現するようにデザインされた、B.サブティリス(B.subtilis)BSP1−28株の構築について記載する。
本実施例は、細菌バイオフィルムに結合する融合物が、顕著なフィターゼ活性を示すことを実証する。図6(TasA_BSP1−Phy融合タンパク質が添加された、B.サブティリス(B.subtilis)BSP1バイオフィルムのフィターゼ活性)は、B.サブティリス(B.subtilis)に結合する、フィターゼ酵素活性のヒストグラムを示す。洗浄後、バイオフィルム結合融合物のフィターゼ活性は、「一般手法」に記載されるように評価される。TasA_BSP1−Phy融合タンパク質をバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)BSP1バイオフィルム形成株の前培養に混合するのを省いて調製された対照は、B.サブティリス(B.subtilis)の内在性フィターゼ活性を示す。TasA_BSP1−Phy融合タンパク質(720U/mgの全タンパク質)と共にインキュベートされたバイオフィルム中でアッセイされたフィターゼ活性は、B.サブティリス(B.subtilis)BSP1の内在性フィターゼ活性よりも顕著に高い。この追加的な活性は、バイオフィルム結合フィターゼに起因する。フィターゼの1単位は、1分間で、ナトリウムフィチン酸から1μmolの無機リン酸塩を放出するのに要する、酵素量と規定された。
Claims (16)
- 酵素に連結した腸表面結合ポリペプチド断片を含んでなる融合タンパク質であって、
前記腸表面結合ポリペプチド断片が、粘液結合タンパク質の断片である、融合タンパク質。 - 前記酵素が、フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−グルカナーゼ及びセルラーゼからなる群より選択される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記酵素がフィターゼである、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記粘液結合タンパク質が、ラクトバチルス由来である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記粘液結合タンパク質の断片が、ラクトバチルス・ロイテリー1063のムチン結合領域、ラクトバチルス・プランタルムのマンノース特異的付着MsaのconA様レクチンドメイン、及びラクトバチルス・ラムノーサスGGのSpaBの付着領域からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離核酸。
- 適切な発現宿主における融合タンパク質生成を誘導する、1つまたは複数の制御配列と作動可能に連結した、請求項6に記載の核酸配列を含んでなる核酸コンストラクト。
- 請求項7に記載の核酸コンストラクトを含んでなる、組換え発現ベクター。
- 請求項7に記載の核酸コンストラクトおよび/または請求項8に記載の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
- (a)請求項9に記載の宿主細胞を培養して、前記融合タンパク質を含んでなる上清を生成するステップと、
(b)前記融合タンパク質を回収するステップと
を含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質を生成する方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含んでなる、組成物。
- 顆粒または微粒の形態である、請求項11に記載の組成物。
- 請求項11に記載の組成物、または請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質の少なくとも1つと、
(a)少なくとも1つの脂溶性ビタミン;
(b)少なくとも1つの水溶性ビタミン;および/または
(c)少なくとも1つの微量ミネラル
を含んでなる動物飼料組成物。 - 請求項11に記載の組成物、または請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質の少なくとも1つが飼料に添加される、動物飼料の栄養価を改善する方法。
- 請求項11に記載の組成物、または請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質を動物に投与するステップを含んでなる、動物における飼料利用率を高める方法(但し、動物がヒトである方法を除く。)。
- 動物(但し、ヒトを除く。)における飼料利用率を高めるための、請求項11に記載の組成物、または請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
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