CN115915956A - 饲料组合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了工程化的稳健的高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段。还描述了制备此类工程化的稳健的高Tm植酸酶进化枝及其片段的方法，以及此类工程化的稳健的高Tm植酸酶进化枝及其片段在增强动物性能中的用途。

Description

饲料组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月28日提交的美国临时专利申请号62/982,944的优先权，所述临时专利申请的公开内容通过援引以其全文并入本文。
通过援引并入
将于2021年2月24日创建并同时提交的、以大小为324KB、名称为“20210224_NB41804-WO-PCT_Sequence Listing_ST25”的文件形式提供的序列表通过援引以其全文并入本文。
技术领域
本领域涉及含有工程化的稳健的高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段的饲料组合物和预混物，以及生产这些饲料组合物和预混物以增强动物性能的方法。
背景技术
植酸酶是单胃动物饲料中最常用的外源酶。植酸酶可降低植酸盐的抗营养作用，并提高磷、钙、氨基酸和能量的消化率，以及减少无机磷排泄对环境的负面影响。
植酸盐是谷类和豆类中磷的主要储存形式。然而，单胃动物诸如猪、家禽和鱼不能有效地代谢或吸收其日粮中的植酸盐(或植酸)，因此将其排泄，从而导致畜牧生产密集地区的磷污染。此外，植酸还通过螯合金属剂诸如钙、铜和锌，并与消化道各个区段中的蛋白质和氨基酸形成不溶性复合物，从而在单胃动物中充当抗营养剂。
长期以来一直认为非反刍动物缺乏内源植酸酶，并且因此不能利用植酸盐。但是，内源粘膜磷酸酶和细菌植酸酶已被描述为在家禽的小肠和盲肠中具有活性。Maenz,D.D.；Classen,H.L.，Phytase activity in the small intestinal brush border membraneof the chicken.[鸡小肠刷状缘膜的植酸酶活性]Poult Sci[家禽科学]1998,77,557-63。Abudabos,A.M.,Phytate phosphorus utilization and intestinal phytase activityin laying hens[蛋鸡中的植酸磷利用和肠道植酸酶活性].Italian Journal of AnimalScience[意大利动物科学杂志]2012,11,e8。Zeller,E.；Schollenberger,M.；Kuhn,I.；Rodehutscord,M.。为了给这些动物的生长和健康提供足够的磷酸盐，将无机磷酸盐添加到它们的饮食中。此类添加可能是昂贵的，并且进一步增加了污染问题。
通过植酸酶的作用，植酸盐通常被水解以产生较低级的肌醇磷酸盐和无机磷酸盐。植酸酶用作动物饲料的添加剂，其中它们改善有机磷对于动物的可用性并降低环境的磷酸盐污染(Wodzinski R J,Ullah A H.Adv Appl Microbiol.[应用微生物学进展]42,263-302(1996))。
在文献中已经描述了真菌(Wyss M.等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65(2),367-373(1999)；Berka R.M.等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64(11),4423-4427(1998)；Lassen S.等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]67(10),4701-4707(2001))和细菌(Greiner R.等人Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]303(1),107-113(1993)；Kerovuo等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64(6),2079-2085(1998)；Kim H.W.等人,Biotechnol.Lett.[生物技术快报]25,1231-1234(2003)；Greiner R.等人,Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]341(2),201-206(1997)；Yoon S.J.等人,Enzyme and microbial technol.[酶与微生物技术]18,449-454(1996)；Zinin N.V.等人,FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]236,283-290(2004))来源的多种植酸酶。
在2011年11月8日授予Miasnikov等人的美国专利号8,053,221涉及衍生自细菌布丘氏菌属(Buttiauxella)物种的植酸酶，以及与野生型(亲本)酶相比针对改善的特征选择的和/或工程化的其变体/修饰形式。
在2000年8月29日授予Short的美国专利号6,110,719以及2001年2月6日授予Short等人的美国专利号6,183,740涉及衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)B的植酸酶。
在2016年6月4日授予Sjoeholm等人的美国专利号9,365,840涉及具有植酸酶活性的多肽。
在2011年6月26日授予Lassen等人的美国专利号8,206,962以及在2013年8月13日授予Lassen等人的美国专利号8,507,240涉及哈夫尼菌属(Hafnia)植酸酶变体。
在2013年10月15日授予Haefner等人的美国专利号8,557,552涉及合成植酸酶变体。
国际公布日期为2015年1月29日的WO 2015/012890涉及具有植酸酶活性的多肽。
在过去十年中已经开发了新一代的植酸酶。但是，这些植酸酶在调节和制粒之前以液体形式应用于饲料中时，都不具有合适的稳健性，以在商业相关的饲料制粒条件下承受高水平的胁迫。因此，市场上适用于商业制粒的热稳定植酸酶产品是干燥的产品，并且许多具有保护性涂层以保持活性。然而，期望将液体形式的植酸酶应用于饲料，因为例如以液体形式添加的植酸酶在通过饲料递送时将均匀地分布并立即在动物中释放。仍然需要这样的植酸酶及其片段，所述植酸酶及其片段在商业相关的条件下在调节和制粒之前以液体形式应用时是稳健的，并且仍然能够改善动物性能。
发明内容
在一些方面，本文提供了一种动物饲料丸粒或预混物，其包含：
工程化的植酸酶多肽或其包含植酸酶活性的片段，所述植酸酶多肽或其片段与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少82％的序列同一性；以及
液体或固体载剂。在一些实施例中，所述载剂包含水、甘油、甘油酯、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇中的一种或多种。在一些实施例中，所述载剂是选自由藻酸盐、明胶、纤维素衍生物、多糖、糖蜜和啤酒糟(vinasses)组成的组的一种或多种水胶体。在一些实施例中，所述载剂是以下中的一种或多种：糖蜜、原糖蜜(protamolasses)、啤酒糟、液体发酵副产物、液体玉米浆、液体小麦酒糟、液体玉米酒糟、液体大麦酒糟、谷物酒糟、液体玉米麸质粉、来自乙醇加工的液体副产物、来自谷物加工的液体副产物、来自麸质生产的液体副产物。在一些实施例中，所述载剂能够被熔化。在一些实施例中，所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种载剂：动物油或脂肪、植物油或脂肪、甘油三酯、游离脂肪酸、动物蜡、蜂蜡、羊毛脂、贝壳蜡、虫白蜡、植物蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、杨梅蜡、甘蔗蜡、矿物蜡、合成蜡、天然和合成树脂以及它们的混合物。在一些实施例中，所述脂肪酸是选自由以下组成的组的一种或多种：中链脂肪酸(MCFA)、月桂酸、C8+C10混合物、丁酸、乳酸、丙酸、甲酸和琥珀酸。在一些实施例中，所述脂肪是动物脂肪或油和/或植物脂肪或油。在一些实施例中，所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：低芥酸菜籽油、棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、大豆油、葵花油、红花油、椰子油、棕榈油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和菜籽油。在一些实施例中，所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：完全硬化的棕榈油、完全硬化的菜籽油、完全硬化的棉籽油和完全硬化的大豆油。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述植物脂肪或油是棕榈油或完全硬化的棕榈油。在一些实施例中，所述液体载剂是液体乳清、液体脱乳糖乳清、液体酸乳清、液体奶、来自工业清洁的液体奶、液体加工奶中的一种或多种。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是卵磷脂、卵磷脂甘油混合物或卵磷脂脂肪酸混合物中的一种或多种。在一些实施例中，所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种化合物：赖氨酸、赖氨酸硫酸盐、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。在一些实施例中，所述载剂是甲硫氨酸。在一些实施例中，甲硫氨酸呈L-甲硫氨酸的形式，或呈合成的甲硫氨酸源的形式，诸如OLM(即DL-甲硫氨酸)或所有其盐形式、其类似物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸或所有其盐形式)、其衍生物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸异丙酯或任何其他酯)或其混合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是蛋白质的水解产物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是液体载剂。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是固体载剂。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述丸粒进一步包含维生素和/或矿物质。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述工程化的植酸酶多肽或其片段呈颗粒形式。
在其他方面，本文提供了一种用于产生动物饲料丸粒或预混物的方法，所述方法包括组合(a)工程化的植酸酶多肽或其包含植酸酶活性的片段，所述植酸酶多肽或其片段与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少82％的序列同一性；以及(b)液体或固体载剂。在一些实施例中，所述载剂包含水、甘油、甘油酯、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇中的一种或多种。在一些实施例中，所述载剂是选自由藻酸盐、明胶、纤维素衍生物、多糖、糖蜜和啤酒糟组成的组的一种或多种水胶体。在一些实施例中，所述载剂是以下中的一种或多种：糖蜜、原糖蜜、啤酒糟、液体发酵副产物、液体玉米浆、液体小麦酒糟、液体玉米酒糟、液体大麦酒糟、谷物酒糟、液体玉米麸质粉、来自乙醇加工的液体副产物、来自谷物加工的液体副产物、来自麸质生产的液体副产物。在一些实施例中，所述载剂能够被熔化。在一些实施例中，所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种载剂：动物油或脂肪、植物油或脂肪、甘油三酯、游离脂肪酸、动物蜡、蜂蜡、羊毛脂、贝壳蜡、虫白蜡、植物蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、杨梅蜡、甘蔗蜡、矿物蜡、合成蜡、天然和合成树脂以及它们的混合物。在一些实施例中，所述脂肪酸是选自由以下组成的组的一种或多种：中链脂肪酸(MCFA)、月桂酸、C8+C10混合物、丁酸、乳酸、丙酸、甲酸和琥珀酸。在一些实施例中，所述脂肪是动物脂肪或油和/或植物脂肪或油。在一些实施例中，所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：低芥酸菜籽油、棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、大豆油、葵花油、红花油、椰子油、棕榈油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和菜籽油。在一些实施例中，所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：完全硬化的棕榈油、完全硬化的菜籽油、完全硬化的棉籽油和完全硬化的大豆油。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述植物脂肪或油是棕榈油或完全硬化的棕榈油。在一些实施例中，所述液体载剂是液体乳清、液体脱乳糖乳清、液体酸乳清、液体奶、来自工业清洁的液体奶、液体加工奶中的一种或多种。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是卵磷脂、卵磷脂甘油混合物或卵磷脂脂肪酸混合物中的一种或多种。在一些实施例中，所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种化合物：赖氨酸、赖氨酸硫酸盐、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。在一些实施例中，所述载剂是甲硫氨酸。在一些实施例中，甲硫氨酸呈L-甲硫氨酸的形式，或呈合成的甲硫氨酸源的形式，诸如OLM(即DL-甲硫氨酸)或所有其盐形式、其类似物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸或所有其盐形式)、其衍生物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸异丙酯或任何其他酯)或其混合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是蛋白质的水解产物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是液体载剂。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述载剂是固体载剂。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括组合维生素和/或矿物质。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述工程化的植酸酶多肽或其片段呈颗粒形式。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，所述方法进一步包括(c)将植酸酶和载剂的组合制粒。
附图说明
图1A-1BB(栏A至1BB)显示了高Tm植酸酶进化枝的多肽序列的每个位置的HMM概率评分。HMM的综合评分(COMP)以粗体显示在图1A的顶部3栏。每个氨基酸的位置(P)和共有序列(consensus)(C)在P/C下的第1列中显示。
图2描绘了系统发生树，其基于氨基酸序列的相似性和差异显示了包括本文所述的工程化的植酸酶多肽及其片段在内的各种植酸酶之间的相关性。
图3描绘了代表性高Tm进化枝植酸酶的三维结构，其使用公布的紧密相关的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)6-植酸酶的晶体结构建模并显示为条带图。
以下序列遵循37 C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)、以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)细则第5.2和49.5(a-bis)条、以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822所示的规则。
SEQ ID NO:1对应于工程化的植酸酶PHY-13594的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:2对应于工程化的植酸酶PHY-10931的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:3对应于工程化的植酸酶PHY-10957的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:4对应于工程化的植酸酶PHY-11569的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:5对应于工程化的植酸酶PHY-11658的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:6对应于工程化的植酸酶PHY-11673的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:7对应于工程化的植酸酶PHY-11680的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:8对应于工程化的植酸酶PHY-11895的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:9对应于工程化的植酸酶PHY-11932的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:10对应于工程化的植酸酶PHY-12058的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:11对应于工程化的植酸酶PHY-12663的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:12对应于工程化的植酸酶PHY-12784的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:13对应于工程化的植酸酶PHY-13177的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:14对应于工程化的植酸酶PHY-13371的预测的成熟序列
SEQ ID NO:15对应于工程化的植酸酶PHY-13460的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:16对应于工程化的植酸酶PHY-13513的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:17对应于工程化的植酸酶PHY-13637的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:18对应于工程化的植酸酶PHY-13705的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:19对应于工程化的植酸酶PHY-13713的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:20对应于工程化的植酸酶PHY-13747的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:21对应于工程化的植酸酶PHY-13779的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:22对应于工程化的植酸酶PHY-13789的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:23对应于工程化的植酸酶PHY-13798的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:24对应于工程化的植酸酶PHY-13868的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:25对应于工程化的植酸酶PHY-13883的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:26对应于工程化的植酸酶PHY-13885的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:27对应于工程化的植酸酶PHY-13936的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:28对应于工程化的植酸酶PHY-14004的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:29对应于工程化的植酸酶PHY-14215的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:30对应于工程化的植酸酶PHY-14256的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:31对应于工程化的植酸酶PHY-14277的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:32对应于工程化的植酸酶PHY-14473的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:33对应于工程化的植酸酶PHY-14614的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:34对应于工程化的植酸酶PHY-14804的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:35对应于工程化的植酸酶PHY-14945的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:36对应于工程化的植酸酶PHY-15459的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:37对应于工程化的植酸酶PHY-16513的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:38对应于诺氏布丘氏菌(Buttiauxella noackiae)WP064555343.1。
SEQ ID NO:39对应于布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)AAS45884.1。
SEQ ID NO:40对应于柯克斯体科(Coxiellaceae)细菌RDH40465.1。
SEQ ID NO:41对应于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)WP094337278.1。
SEQ ID NO:42对应于大肠杆菌WP 001297112。
SEQ ID NO:43对应于蜂房哈夫尼菌WP 072307456.1。
SEQ ID NO:44对应于Rouxiella badensis WP 084912871.1。
SEQ ID NO:45对应于沙雷氏菌属(Serratia)物种WP 009636981.1。
SEQ ID NO:46对应于阿氏耶尔森氏菌(Yersinia aldovae)WP 004701026.1。
SEQ ID NO:47对应于弗氏耶尔森氏菌(Yersinia frederiksenii)WP050140790.1。
SEQ ID NO:48对应于克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)WP004392102.1。
SEQ ID NO:49对应于莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)WP 049646723.1。
SEQ ID NO:50对应于罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)WP 050539947.1。
SEQ ID NO:51对应于EP 322271中的SEQ ID NO:3。
SEQ ID NO:52对应于US 8101391中的SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:53对应于US 8101391中的SEQ ID NO:4。
SEQ ID NO:54对应于US 8101391中的SEQ ID NO:35。
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SEQ ID NO:63对应于里氏木霉(T.reesei)天冬氨酸蛋白酶信号序列。
SEQ ID NO:64对应于工程化的植酸酶PHY-16812的预测的成熟序列。
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SEQ ID NO:83对应于工程化的植酸酶PHY-17197的预测的成熟序列。
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SEQ ID NO:85对应于工程化的植酸酶PHY-17229的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:86对应于工程化的植酸酶PHY-17152的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:87对应于工程化的植酸酶PHY-17206的预测的成熟序列。
SEQ ID NO:88对应于布丘氏菌NCIMB 41248N-末端。
SEQ ID NO:89对应于布氏柠檬酸杆菌AAS45884 N-末端。
SEQ ID NO:90对应于迟钝爱德华菌(E.tarda)YP007628727 N-末端。
SEQ ID NO:91对应于PHY-13594N-末端。
SEQ ID NO:92对应于PHY-13789N-末端。
SEQ ID NO:93对应于PHY-13885N-末端。
SEQ ID NO:94对应于WO 2010034835-0002中的C-末端SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:95对应于莫氏耶尔森氏菌WP032813045 C-末端。
SEQ ID NO:96对应于布丘氏菌NCIMB 41248C-末端。
SEQ ID NO:97对应于PHY-13594C-末端。
SEQ ID NO:98对应于PHY-13789C-末端。
SEQ ID NO:99对应于PHY-13885C-末端。
SEQ ID NO:100对应于PHY-13594核心区域。
SEQ ID NO:101对应于PHY-13789核心区域。
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SEQ ID NO:103对应于PHY-16812核心区域。
SEQ ID NO:104对应于US 7081563中的SEQ ID NO:4。
具体实施方式
引用的所有专利、专利申请和出版物均通过援引以其全文并入本文。
在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另外特别说明，以下定义适用。
如本文所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。例如，术语“一种/一个(a/an)”、“所述/该(the)”、“一种或多种/一个或多个(one or more)”和“至少一种/至少一个(at least one)”在本文中可互换使用。
术语“和/或”以及“或”在本文中可互换使用，并且是指两个指定的特征或组分中的每一个具有或不具有另一个的特定公开。因此，如在本文中的短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如短语“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
使用单数形式的词包括复数形式，反之亦然。
术语“包含/包括(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有”以及它们的变形可互换使用，并且意指“包括但不限于”。应当理解，无论在何处用语言“包含”来描述方面，也都提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的类似方面。
术语“由……组成”意指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”意指组合物的指定材料或方法的指定步骤，以及那些不会对材料或方法的基本特性产生实质性影响的附加材料或步骤。
贯穿本申请，各种实施例可以范围的形式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为对本文所述的实施例的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为是具有确切公开的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围诸如1至6的描述应被认为具有确切公开的子范围，诸如1至2、1至3、1至4和1至5、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5、和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用，术语“约”可允许值或范围的一定程度的可变性，例如在规定值或范围的规定极限的10％以内、5％以内或1％以内。
术语“植酸酶”(肌醇六磷酸磷酸水解酶)是指催化植酸(肌醇六磷酸或IP6)(在谷物和油料种子中发现的一种难消化的有机形式的磷)的水解并释放可用形式的无机磷的一类磷酸酶。
术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用，并且是指属于动物界的任何生物体，且包括但不限于哺乳动物(不包括人)、非人动物、家畜、牲畜、农场动物、动物园动物、种畜等。例如，可以提及所有非反刍动物和反刍动物。在一个实施例中，所述动物是非反刍动物，即单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。
术语“进化枝”，也称为单系群，是指具有共同祖先及其所有直系后代的一组生物体或相关序列。
术语“Tm”是蛋白质变性、或未折叠和折叠状态的自由能相等且一半群体未折叠而另一半群体折叠时的温度。通常使用量热法或光学技术(例如圆二色性、荧光或光散射)研究酶的热解折叠行为。
术语“高Tm植酸酶进化枝”是指使用如下文实例3中所述的差示扫描量热法的Tm为至少92.5°的植酸酶多肽或其片段的进化枝。术语“高Tm植酸酶进化枝多肽”和“工程化的植酸酶多肽及其片段”在本文可互换地使用。
术语“混合机液体应用(mixer liquid application)”和“MLA”在本文中可互换使用，并且是指动物饲料生产，其中热敏化合物(特别是酶)可在调节和制粒之前以液体形式应用于动物饲料并在调节和制粒后在饲料中保持功能。
“饲料”意指任何天然或人工饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其意在或适合于分别被非人动物食用、摄取、消化。优选地，术语“饲料”用于指在饲养家畜时饲喂动物的产品。术语“饲料”和“动物饲料”在本文可互换地使用。
如本文所用，“饲料添加剂”是指在营养物中单独或一起使用的一种或多种成分、物质(例如细胞)的产物，例如以改善食物(例如，动物饲料)的质量、改善动物的性能和/或健康和/或增强食物或食物中物质的消化率。
如本文所用，术语“食物”以广义使用-并且涵盖用于人的任何形式的食物和食物产品以及用于动物的食物(即饲料)。
食物或饲料可以是溶液形式或固体形式，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。在一些实施例中，本文提及的酶可用作食物或饲料物质或用于食物或饲料物质的制备或生产。
如本文所用，术语“食物或饲料成分”包括添加到或可添加到食物或食料中的制剂，并且包括可在各种产品中以低水平使用的制剂。食物成分可以是溶液形式或固体形式，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。本文所述的酶可用作食物或饲料成分或用于制备或生产。这些酶可添加到或可不添加到食物补充剂中。用于单胃动物的饲料组合物通常包括包含植物产品的组合物，该植物产品含有植酸盐。此类组合物包括但不限于玉米粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、玉蜀黍、小麦、大麦和高粱基饲料。
如本文所用，术语“制粒”是指可以是固体、圆形、球形和圆柱形片剂的丸粒，特别是饲料丸粒和固体挤出动物饲料的生产。已知饲料制粒制造工艺的一个实例通常包括在室温下将食物或饲料成分混合在一起至少1分钟，将混合物转移到缓冲仓中，将混合物输送到蒸汽调节器(即调节)中，任选地将经蒸汽调节的混合物转移到膨胀器中，将混合物转移到制粒机或挤出机中，最后将丸粒转移至丸粒冷却器中。(Fairfield,D.1994.第10章,Pelleting Cost Center.In Feed Manufacturing Technology IV.[制粒成本中心，饲料制造技术IV](McEllhiney编辑),American Feed Industry Association,Arlington,Va.[美国饲料工业协会，弗吉尼亚州阿灵顿],第110-139页)。
术语“丸粒”是指已经受热处理，诸如蒸汽处理(即调节)并通过机器压制或挤出的动物饲料的组合物(通常衍生自谷物)。该丸粒可掺入有液体配制品或干燥配制品的形式的酶。干燥配制品可以是涂覆的或未涂覆的，并且可以是颗粒形式。术语“颗粒”用于由酶(例如植酸酶，例如本文公开的任何工程化的植酸酶多肽)和其他化学物质(例如盐和糖)组成的颗粒，并且可以使用多种技术(包括流化床制粒方法以形成层状颗粒)中的任一种形成。
术语“进料制粒回收率”、“回收活性”或“活性回收率”是指(i)在涉及一种或多种以下应激物的处理后饲料酶的活性：加热、增压、增高pH、降低pH、储存、干燥、暴露于一种或多种表面活性剂、暴露于一种或多种溶剂和机械应力与(ii)处理之前酶的活性的比率。回收活性可以表示为百分比。回收活性百分比计算如下：
Figure BDA0003908349840000171
植酸酶可以通过显示改善“进料制粒回收率”、“回收活性”、“热稳定性”或“无活性可逆性”中的任一种来表现稳定性。
在制粒实验的上下文中，“处理前的活性”可以通过以与经过处理的植酸酶相匹配的方式测量未经过处理的醪液中存在的植酸酶活性来近似估算。例如，未处理的醪液中的植酸酶的处理和储存时间以及条件与已处理的醪液中的植酸酶相似，以控制可能在指定处理本身之外的可能的相互作用或其他影响。
术语“进料制粒回收率测试”和“标准进料制粒测试”在本文中可互换地使用，并且是指对饲料酶承受调节和制粒的热处理的稳定性进行测量或评估的测试。
例如，在下面的实例5中提出了这种进料制粒回收率测试。
与在固体或液体配制品中的确定有关的术语植酸酶活性意指1FTU(植酸酶单位)，其被定义为在37℃、pH 5.5的反应条件下在一分钟内从5.0mM植酸钠底物(来自稻)中释放1微摩尔无机正磷酸盐所需的酶的量，这也在ISO 2009植酸酶测定(一种用于确定植酸酶活性的标准测定，见国际标准ISO/DIS 30024:1-17,2009)中进行了定义。
替代性地，如本文所用的，一单位植酸酶(U)可定义为在如实例3所示的孔雀绿测定法中的反应条件(25℃，pH分别为5.5或3.5)下，在一分钟内从0.2mM植酸钠底物(从稻)释放1微摩尔无机正磷酸盐的酶量。
如本文所用，术语“比活性”是每毫升(ml)酶单位的数目除以以mg/ml为单位的(总)蛋白质浓度。因此，比活性值通常以单位/mg表示。替代性地，术语“比活性”是每毫升(ml)酶单位的数目除以以mg/ml为单位的植酸酶浓度。
如本文所用，术语“差示扫描量热法”或“DSC”是一种热分析技术，其中增加样品和参考物温度所需的热量的差异作为温度的函数来测量。在整个实验中，样品和参考物均保持在几乎相同的温度下。通常，DSC分析的温度程序被设计成使得样品架温度作为时间的函数线性增加。参考样品在待扫描的温度范围内应具有明确定义的热容量。
术语“益生菌”意指通过选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主的不可消化的食物成分。
如本文所用，术语“直接饲喂微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)微生物的来源，当以足够数量应用时可赋予其接受者益处，即益生菌。DFM可包含一种或多种此类微生物，诸如细菌菌株。DFM的类别包括芽孢杆菌、乳酸菌和酵母。因此，术语DFM涵盖以下中的一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母以及它们的组合。
芽孢杆菌纲(Bacilli)是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可承受环境条件，诸如热、水分和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄取时萌发成有活性的营养细胞，并且可用于粉和丸粒日粮中。乳酸菌是产生对病原体有拮抗作用的乳酸的革兰氏阳性球菌。由于乳酸菌似乎有点热敏感，所以它们不用于丸粒日粮。乳酸菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus)。
术语“益生菌”、“益生菌培养物”和“DFM”在本文中可互换使用，并定义当例如以足够数量摄取或局部应用时有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一种或多种可证明的健康益处诸如健康、消化、和/或性能益处)的活微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用，术语“益生菌”还涵盖可刺激免疫系统的有益分支并同时减少粘膜表面(例如肠道)中的炎症反应的活微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但已表明，至少106-1012、优选地至少106-1010、优选地108-109cfu作为日剂量将在受试对象中有效地实现有益的健康效果。
如本文所用，术语“CFU”意指“集落形成单位”并且是有活力的细胞的量度，其中集落代表衍生自单个祖细胞的细胞的集合。
术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式的或环境中的物质，并且不反映分离物被纯化的程度，而是表示与天然形式或天然环境的分离或分开。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从与其天然相关的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除的任何物质，包括但不限于任何宿主细胞、酶、工程化的酶、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于自然界中发现的物质经人工改造的物质；或(4)通过增加物质相对于与其天然相关的其他成分的量而修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换使用并且是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”和纯化(purification)意指去除不需要的组分、材料污染物、混合物或瑕疵使得基本上纯净或干净。例如，纯化当应用于核酸或多肽时通常表示如通过本领域熟知的分析技术确定的基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经受密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，基于摩尔的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子浓度的大幅度增加时，组合物中的分子得到富集。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生化命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature)(JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十种氨基酸中的任一种。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。突变可由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，括号中列出的氨基酸后面的位置指示在该位置处被任何列出的氨基酸取代的列表。例如，6(L，I)意指位置6可被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V指示该位置可能有苯丙氨酸或缬氨酸。
术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。
关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组/工程化的核酸和蛋白序列、或野生型序列的修饰)。
如本文所用，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或correspondsto或correspond to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或者与蛋白质或肽中所列举的残基类似、同源或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。
术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可由其生产的蛋白质，而且还指由从此类菌株分离的DNA序列编码并在含有此类DNA序列的宿主生物体中产生的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特性的蛋白质。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在表1中可以找到本文中使用的缩写以识别特定氨基酸。
表1.单个字母和三个字母的氨基酸缩写
Figure BDA0003908349840000221
本领域普通技术人员将认识到，可对本文公开的氨基酸序列进行修饰，同时保留与所公开的氨基酸序列相关的功能。例如，在本领域中熟知的，导致在给定位点处产生化学等价的氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性的基因改变是常见的。
术语“密码子优化的”，当它指用于转化各种宿主的基因或核酸分子的编码区时，是指改变基因或核酸分子的编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变DNA编码的多肽。
术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不是在自然界中一起被发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。
术语“内含子”意指在最终RNA产物成熟期间通过RNA剪接去除的基因内的任何核苷酸序列。术语“内含子”是指基因内的DNA序列和RNA转录物中的相应序列。
术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列有效地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接到调控序列上。
术语“调控序列”或“控制序列”在本文中可互换地使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列能以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列/基因。
“启动子”或“启动子序列”是指参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。用于本发明的优选的启动子是里氏木霉(Trichoderma reesei)cbh1，其是诱导型启动子。
所述“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。
如本文所用，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入宿主生物体中。核酸分子可作为线性或环状形式的DNA引入。核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可整合到生产宿主的基因组中。含有转化核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。
术语“重组”和“工程化的”是指例如通过化学合成或通过经基因工程技术操纵分离的核酸片段来将两个原本分离的核酸序列片段进行人工组合。例如，其中已天然地或通过实验室操纵插入了来自不同分子、来自相同分子的另一部分或人工序列的一个或多个片段或基因的DNA，导致在基因中和随后在生物体中引入新序列。术语“重组”、“转基因”、“转化的”、“工程化的”、“基因工程化的”和“经修饰用于外源基因表达”在本文中可互换使用。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段的人工组合，例如，并非一起存在于在自然界中的调控和编码序列。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可单独使用或可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可使用质粒载体。熟练的技术人员很清楚为了成功转化、选择和繁殖宿主细胞载体上必须存在的遗传元件。熟练的技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可能导致不同的表达水平和模式(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生物学学会会刊]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol Gen Genetics[分子和普通遗传学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件以获得显示所需表达水平和模式的品系。此类筛选可使用标准分子生物学、生物化学以及其他测定来完成，包括DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶或活性测定以及/或者表型分析。
术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在本文中可互换使用，并且是指任何植物、生物体、或任何植物或生物体的细胞，无论是人还是非人，重组构建体可稳定或瞬时引入其中以表达基因。该术语涵盖由于在繁殖期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何子代。
术语“百分比同一性”是如通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列串之间匹配的核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，这些方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,NY[牛津大学出版社，纽约州](1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press,NY[学术出版社，纽约州](1993)；Computer Analysis of SequenceData,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,NJ[胡玛纳出版社，新泽西州](1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press,NY[斯托克顿出版社，纽约州](1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公共可用的计算机程序中。
如本文所用，“同一性％”或“同一性百分比”或“PID”是指蛋白质序列同一性。同一性百分比可使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见，Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志]，215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用若干搜索参数，其中大部分被设置为默认值。NCBI BLAST算法找到在生物相似性方面最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic AcidsRes[核酸研究],25:3389-3402,1997；以及Schaffer等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。用于核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。用于氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。氨基酸序列同一性百分比(％)值由匹配的相同残基数目除以“参考”序列的残基总数来确定。BLAST算法将“参考”序列称为“查询”序列。
如本文所用，“同源蛋白质”或“同源植酸酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有明显相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用0.001的阈值(E值截止值)进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,LipmanDJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database searchprograms.[带空位的BLAST和PSI BLAST是新一代蛋白质数据库搜索程序]Nucleic AcidsRes[核酸研究]1997第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可对蛋白质序列进行分组。
可使用LASERGENE生物信息计算包的Megalign程序(威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司(DNASTAR Inc.,Madison,WI))、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(马里兰州贝塞斯达的Informax公司(Informax,Inc.,Bethesda,MD))或EMBOSS开放软件包(EMBL-EBI；Rice等人.,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和同一性百分比计算。可使用比对的CLUSTAL方法(诸如CLUSTALW；例如版本1.83)(Higgins和Sharp,CABIOS[生物信息学],5:151-153(1989)；Higgins等人.,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；以及Chenna等人.,Nucleic Acids Res[核酸研究]31(13):3497-500(2003)，经由欧洲生物信息学研究所获自欧洲分子生物学实验室)用默认参数来进行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白质比对的适合参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白质ENDGAP＝-1、蛋白质GAPDIST＝4并且KTUPLE＝1。在一个实施例中，快速或慢速比对使用在慢速比对情况下的默认设置。替代性地，可修改使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同样使用KTUPLE＝1，空位罚分＝10，空位延伸＝1，矩阵＝BLOSUM(例如，BLOSUM64)，窗口＝5，以及存储的顶部对角线＝5。替代性地，可使用来自
Figure BDA0003908349840000271
版本10.2.4的MAFFT比对以默认设置、评分矩阵BLOSUM62、空位开放罚分1.53和偏移值0.123来导出多序列比对。
MUSCLE程序(Robert C.Edgar.MUSCLE:multiple sequence alignment withhigh accuracy and high throughput[MUSCLE：高精度和高通量的多序列比对]Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)是多序列比对算法的另一个实例。
图2描绘了系统发生或进化树，基于氨基酸序列的相似性和差异显示了包括工程化的植酸酶多肽及其片段的各种植酸酶之间的相关性。
鉴定序列相似性的另一种方式是生成隐马尔可夫模型(HMM)。HMM是概率框架，其中观察到的数据(例如DNA或氨基酸序列)是根据由几种(隐藏)内部状态之一产生的一系列输出(或发射)建模的。HMM通常用于多重DNA序列比对的统计分析。它们可以用于鉴定基因组特征，例如ORF、插入、缺失、取代和蛋白质结构域等。HMM还可以用于鉴定同源性；例如，广泛使用的Pfam数据库(Punta等人，2012)是使用HMM鉴定的蛋白质家族的数据库。HMM比首次生产于1990年的序列比较工具的主力工具BLAST(基本局部比对搜索工具)要准确得多(Altschul等人,1990,1997)。因此，将实例4中所示的高Tm植酸酶进化枝多肽的多肽序列及其片段用于产生隐马尔可夫模型(HMM)以鉴定序列相似性。
术语“工程化的植酸酶多肽”意指多肽不是天然存在的并且具有植酸酶活性。
注意，工程化的植酸酶多肽的片段是工程化的植酸酶多肽的一部分或子序列，其能够像工程化的植酸酶多肽一样起作用，即，其保留了植酸酶活性。
术语“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括但不限于克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
如本文所用，“表达载体”意指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列可操作地连接到能够在合适的宿主中实现DNA表达的合适的控制序列上。此类控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
如本文所用，术语“表达”是指前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质)的产生。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
基因的表达涉及基因的转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。“成熟”蛋白质是指经翻译后加工的多肽；即初级翻译产物中存在的任何信号序列、原肽(prepeptide)或前肽(propeptide)已被去除的多肽。“前体”蛋白质是指mRNA翻译的初级产物；即仍然存在原肽和前肽。前肽和原肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器两者的基因组，从而导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的细胞核中或含有DNA的细胞器中，从而导致基因表达而无整合或稳定的遗传。
因此，在一个实施例中，描述了一种重组构建体，该重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，该调控序列与编码如本文所述的工程化的植酸酶多肽及其片段的核苷酸序列可操作地连接。
该重组构建体可包含在生产宿主中起作用的调控序列，该调控序列与编码本文所述的任何工程化的植酸酶多肽及其片段的核苷酸序列可操作地连接。此外，生产宿主选自由细菌、真菌、酵母、植物或藻类组成的组。优选的生产宿主是丝状真菌里氏木霉。
替代性地，使用如Chong,Curr Protoc Mol Biol.[最新分子生物学实验方法汇编]2014；108:16.30.1-16.30.11中所述的无细胞蛋白质合成是可能的。
本文还描述了一种用于生产工程化的植酸酶多肽或其片段的方法，该方法包括：
(a)用本文所述的重组构建体转化生产宿主；以及
(b)在产生工程化的植酸酶多肽或其片段的条件下培养步骤(a)的生产宿主。
任选地，可从生产宿主中回收工程化的植酸酶多肽或其片段。
在另一方面，可通过本文所公开的方法中的任一种获得含有植酸酶的培养物上清液。
在另一个实施例中，描述了编码如本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种的多核苷酸序列。
可包括在表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员所熟悉的。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境或发育调控下具有活性的启动子。在一些实施例中，由于环境因素的变化，启动子是诱导型或阻抑型的，这些环境因素包括但不限于如在本领域中已知的碳、氮或其他营养物可用性、温度、pH、渗透压、一种或多种重金属的存在、一种或多种抑制剂的浓度、压力或前述因素的组合。在一些实施例中，诱导型或阻抑型启动子可被代谢因子诱导或阻抑，诸如如在本领域中已知的某些碳来源的水平、某些能量来源的水平、某些分解代谢物的水平、或前述因素的组合。
在一个实施例中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，在一些情况下，当里氏木霉是宿主时，启动子可以是天然的里氏木霉启动子，诸如在GenBank中以登录号D86235保藏的cbh1启动子。可用于真菌表达的启动子的其他合适的非限制性实例包括cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1和xyn2、产黄青霉菌(P.chrysogenus)的阻抑型酸性磷酸酶基因(phoA)启动子(参见例如，Graessle等人,(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学],63:753-756)、葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见例如，Leuker等人,(1997),Gene[基因],192:235-240)、麦芽糖诱导型葡萄糖阻抑型MET3启动子(参见Liu等人,(2006),Eukary.Cell[细胞],5:638-649)、pKi启动子和cpc1启动子。有用启动子的其他实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见例如，Nunberg等人,(1984)Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和Boel等人.,(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会会刊]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见例如，EPA 137280Al)。
控制转录终止的DNA片段也可以衍生自优选的生产宿主细胞的各种天然基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区。
术语“生产宿主”、“生产宿主细胞”、“宿主细胞”和“宿主菌株”在本文中可互换使用，并且意指包含编码植酸酶多肽或其片段的多核苷酸的表达载体或DNA构建体的合适宿主。生产宿主的选择可选自由细菌、真菌、酵母、植物和藻类组成的组。通常，选择将取决于编码工程化的植酸酶多肽或其片段的基因及其来源。
特别地，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。在本发明的一个优选实施例中，“宿主细胞”意指由丝状真菌菌株、并且特别是木霉属(Trichoderma)物种或曲霉属(Aspergillus)物种的细胞产生的细胞和原生质体。
术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)(参见Alexopoulos,C.J.(1962),INTRODUCTORY MYCOLOGY[菌物学概论],Wiley,New York[威利，纽约州])。这些真菌的特征在于具有由几丁质、纤维素和其他复合多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长进行的，并且碳分解代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲本细胞可以是但不限于以下物种的细胞：木霉属(例如，里氏木霉(以前分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，并且目前也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉属(Penicillium)物种、腐质霉属(Humicola)物种(例如，特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea))、金孢子菌属(Chrysosporium)物种(例如，洛克维金孢子菌(C.lucknowense))、粘帚霉属(Gliocladium)物种、曲霉属物种(例如米曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉)、镰孢菌属(Fusarium)物种、脉孢菌属(Neurospora)物种、肉座菌属(Hypocrea)物种和裸孢壳属(Emericella)物种(还参见Innis等人,(1985)Sci.[科学引文索引]228:21-26)。
如本文所用，术语“木霉菌”或“木霉属物种”是指先前或目前分类为木霉属的任何真菌属。
表达盒可包括在生产宿主中，特别是微生物生产宿主的细胞中。生产宿主细胞可以是在真菌家族中发现的微生物宿主，并且在大范围的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、酵母、植物、藻类或真菌(诸如丝状真菌)中的任一种都可合适地作为表达载体的宿主。
在生产宿主细胞中包含表达盒可用于表达目的蛋白，使得其可位于细胞内、细胞外或细胞内外两者的组合。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法相比，细胞外表达使得从发酵产物中回收期望的蛋白质更容易。
将核酸转化为丝状真菌(诸如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)、灰腐质酶(H.grisea)、特异腐质霉(H.insolens)和里氏木霉)的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适程序描述于例如EP 238023中。
用于转化木霉属宿主细胞的合适程序描述于例如Steiger等人2011,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121中。将DNA摄取到宿主木霉属物种菌株中取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中使用约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了在摄取溶液中需要钙离子外，通常包括的其他化合物是缓冲系统，诸如TE缓冲液(10MmTris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS(pH 6.0)缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据信，聚乙二醇起到融合细胞膜的作用，从而允许培养基的内容物被递送到木霉属物种菌株的细胞质中，并且将质粒DNA转移到细胞核中。这种融合经常留下整合到宿主染色体中的质粒DNA的多个拷贝。
通常在转化中使用含有已以105至107/mL、优选地2×106/mL的密度经受渗透性处理的木霉属物种原生质体或细胞的悬浮液。将100μL体积的这些原生质体或细胞在适当的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中与期望的DNA混合。通常，向摄取溶液中添加高浓度的PEG。可向原生质体悬浮液中添加0.1至1倍体积的25％ PEG 4000。然而，向原生质体悬浮液中添加约0.25倍体积是优选的。也可将添加剂诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中并帮助转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞。(参见，例如美国专利号6,022,725和6,268,328，其两者通过援引并入本文)。
优选地，用载体系统构建了遗传稳定的转化体，由此编码植酸酶多肽或其片段的核酸被稳定整合到宿主菌株染色体中。然后通过已知技术纯化转化体。
将表达载体引入细胞后，在有利于在启动子序列控制下的基因表达的条件下培养转染或转化的细胞。
通常，细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养(参见例如，Pourquie,J.等人,BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION[纤维素降解的生物化学和遗传学],Aubert,J.P.等人编辑,Academic Press[学术出版社],第71-86页,1988以及IImen,M.等人,(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:1298-1306)。常见的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽提取物(YM)肉汤、卢里亚-贝尔塔尼(LuriaBertani，LB)肉汤和沙氏葡萄糖(Sabouraud Dextrose，SD)肉汤也可用于本发明。
培养条件也是标准的(例如，将培养物在大约28℃下在适当的培养基中在振荡培养或发酵罐中孵育，直到达到期望的植酸酶表达水平)。给定丝状真菌的优选培养条件是本领域已知的，并且可在科学文献中和/或从真菌的来源诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)和真菌基因种源中心(Fungal Genetics StockCenter)中找到。
在真菌生长已建立后，将细胞暴露于有效引起或允许植酸酶并且特别是如本文所定义的植酸酶表达的条件下。在植酸酶编码序列在诱导型启动子的控制下的情况中，将诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以有效诱导植酸酶表达的浓度添加到培养基中。可使用从宿主细胞分泌的工程化的植酸酶多肽或其片段作为全肉汤配制品，只需最少的生产后处理。
可使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的用过的全发酵液的制备，从而导致工程化的植酸酶多肽或其片段的表达。
术语“用过的全发酵液”在本文中被定义为包括培养基、细胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“用过的全发酵液”还涵盖已使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括残留的粗发酵材料)，以便获得植酸酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心后超滤、萃取或色谱法等。
有可能任选地从生产宿主中回收期望的蛋白质。在另一方面，通过使用本领域技术人员已知的任何方法获得含有培养物上清液的工程化的植酸酶多肽或其片段。
这些技术的实例包括但不限于亲和色谱法(Tilbeurgh等人,(1984)FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]16:215)、离子交换色谱方法(Goyal等人,(1991)Biores.Technol.[生物资源技术]36:37；Fliess等人,(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.[欧洲应用微生物学与生物技术杂志]17:314；Bhikhabhai等人,(1984)J.Appl.Biochem.[应用生物化学杂志]6:336；以及Ellouz等人,(1987)Chromatography[色谱法]396:307)，包括使用具有高分辨率能力的材料的离子交换(Medve等人,(1998)J.Chromatography A[色谱法期刊A]808:153)、疏水相互作用色谱(参见，Tomaz和Queiroz,(1999)J.Chromatography A[色谱法期刊A]865:123)；两相分配(参见，Brumbauer等人,(1999)Bioseparation[生物分离]7:287)；乙醇沉淀；反相HPLC、硅胶或阳离子交换树脂色谱法诸如DEAE、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(例如，Sephadex G-75)。期望的纯化程度将根据工程化的植酸酶多肽或其片段的用途而变化。在一些实施例中，纯化将不是必需的。
另一方面，可能需要浓缩含有工程化的植酸酶多肽或其片段的溶液以便优化回收率。使用未浓缩的溶液需要增加孵育时间以便收集经富集或纯化的酶沉淀物。使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直至获得期望的酶水平。含酶溶液的浓缩可通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。
另外，可使用例如沉淀剂(诸如金属卤化物沉淀剂)来进行期望蛋白质产物的浓缩。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。金属卤化物沉淀剂以有效沉淀工程化的植酸酶多肽或其片段的量使用。常规测试后，选择至少有效量和最佳量的金属卤化物以有效引起酶的沉淀，以及用于使回收最大化的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。通常，向浓缩的酶溶液中添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，并且通常为至少8％w/v。
沉淀酶的另一种替代方式是使用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂的添加可在添加金属卤化物沉淀剂之前、与之同时或之后进行，并且两种沉淀剂、有机化合物和金属卤化物的添加可依次或同时进行。通常，有机沉淀剂选自由以下组成的组：4-羟基苯甲酸的碱金属盐(诸如钠盐或钾盐)，和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中该烷基基团含有1至12个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为对羟基苯甲酸甲酯)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为对羟基苯甲酸丙酯)。对于进一步的描述，参见例如美国专利号5,281,526。有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件在pH、温度、浓度、沉淀剂、蛋白质浓度和孵育时间方面的高度灵活性的优点。通常，向浓缩的酶溶液中添加至少约0.01％w/v且不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂。
孵育期后，经富集或纯化的酶然后与解离的色素和其他杂质分离，并通过常规分离技术诸如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微滤、交叉流膜微滤等收集。通过用水洗涤沉淀物可获得酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水、或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤经富集或纯化的酶沉淀物。
有时从表达宿主中缺失基因是有利的，其中基因缺陷可通过表达载体治愈。在需要获得具有一种或多种灭活基因的真菌宿主细胞的情况下，可使用已知的方法(例如，公开于美国专利号5,246,853、美国专利号5,475,101和WO 92/06209中的方法)。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式(使得阻止基因表达功能性蛋白)来完成基因灭活。
来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何已被克隆的基因均可被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些实施例中，基因缺失可通过本领域已知的方法将待灭活的期望基因的形式插入质粒来完成。然后在期望基因编码区内部，在一个或多个适当的限制性酶位点处切割缺失质粒，并用选择性标记替换该基因编码序列或其部分。来自待缺失的基因的基因座的侧翼DNA序列(优选地在约0.5至2.0kb之间)保留在标记基因的任一侧。适当的缺失质粒将通常具有存在于其中的独特的限制性酶位点，使得含有缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和选择性标记基因能够作为单个线性片被去除。
根据所用的宿主细胞，可进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。在另一种情况下，这种剪切可导致获得成熟植酸酶多肽并且进一步去除N或C-末端氨基酸以产生保留酶促活性的截短形式的植酸酶。
转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化、以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可能取决于表达该蛋白质的宿主生物体。
多肽在表达后可能发生进一步的序列修饰。这包括但不限于氧化、去糖基化、糖化等。已知当与葡萄糖或其他还原糖一起孵育时，特别是在高于30℃的温度和中性或碱性pH下，糖化可影响植酸酶的活性。消除赖氨酸残基的蛋白质工程化可用于防止此类修饰。这样的实例可见于US 8,507,240中。例如，酵母表达可产生高度糖基化的多肽，从而导致分子量明显增加。另外，国际公布日期为2013年8月15日的WO2013/119470(通过援引并入本文)涉及具有增加的稳定性(据信这是由于糖基化增加)的植酸酶。
如本文所用，术语“糖基化”是指聚糖与分子例如蛋白质的附接。糖基化可以是酶促反应。附接可通过共价键形成。短语“高度糖基化的”是指分子(诸如酶)在许多位点和所有或几乎所有可用的糖基化位点(例如N-连接的糖基化位点)处被糖基化。替代性地或除此之外，短语“高度糖基化的”可指在所有或基本上所有N-连接的糖基化位点处的广泛的糖酵解分支(诸如，与特定N-连接的糖基化位点相关的糖分解部分的大小和数量)。在一些实施例中，工程化的植酸酶多肽在所有或基本上所有共有序列N-连接的糖基化位点(即NXS/T共有序列N-连接糖基化位点)处被糖基化。
如本文所用，术语“聚糖”是指多糖或寡糖，或糖缀合物(诸如糖蛋白)的碳水化合物部分。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物。它们可以是直链或支链分子。
植酸酶可具有不同程度的糖基化。已知此类糖基化可提高在储存和应用期间的稳定性。广泛的
本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段的活性可如上所讨论进行确定。
如本领域技术人员将理解的，酶是易碎的蛋白质，总是在饲料厂的恶劣环境中受到威胁。极端的温度、压力、摩擦、pH和微生物活性会降解或破坏添加到饲料中的酶。酶活性的胁迫主要在加工的调节和制粒阶段期间发生。例如，饲料在制粒之前在调节期间吸收了其大部分热能。但是，从调节器穿过丸粒模具也会加热饲料。许多因素可能会导致通过模具的温度升高，例如进料制剂、模具厚度、模具速度、模具规格(孔尺寸和形状)、初始加工温度、制粒能力等。
因此，在工业规模的饲料制粒期间的条件可以变化。酶在制粒条件下承受这些变化的能力或稳健性非常重要。本领域普通技术人员将理解，调节温度可以根据饲料厂而变化。此外，在确定进行制粒过程的条件时，需要考虑当地法律。例如，丹麦法律要求将家禽饲料的制粒设为81℃(环境食品部(
Figure BDA0003908349840000381
-og
Figure BDA0003908349840000382
)，食品局(
Figure BDA0003908349840000383
)，编号2017-32-31-00378)。
同样，较高温度的制粒条件可用于工业中以提高制粒质量(例如更好的耐久性和减少的细粉)并增加丸粒压制能力。因此，存在对稳健的植酸酶的需要，当在调节和制粒之前将其掺入饲料中时，所述稳健的植酸酶可以在高于80℃的宽温度范围内产生稳定活性的丸粒。这对于如本文所述的液体应用的植酸酶和固体应用的植酸酶都是重要的。
可能会影响饲料酶可能承受的实际压力的、超出调节温度的因素包括但不限于饲料原料、饲料厂的地理位置、所用设备、模具尺寸、制粒助剂的使用、蒸汽控制、温度控制和任何其他与商业相关的制粒条件，例如是否存在以这样的方式来修饰饲料以减少制粒压力的任何其他外源酶。
这些胁迫因素进一步由于高温或超调节(super conditioning)的趋势而变得更加复杂，这导致在制粒后以液体形式应用酶。
如果可以将稳健的酶进行工程化，以便在调节和制粒之前将其作为液体应用，会怎么样？
术语“稳健的”和“稳健性”在本文可互换地使用，并且是指本文公开的工程化的植酸酶或其片段承受工业饲料生产中调节和制粒过程中变化的能力。作为高Tm-植酸酶进化枝多肽及其片段的一部分，本文公开的工程化的植酸酶多肽及其片段是可以在调节和制粒之前以液体形式应用于饲料的稳健的酶的实例。
换句话说，当在调节和制粒之前以液体形式应用或以未配制、未涂覆、未保护的固体形式应用时，新颖的工程化的植酸酶多肽及其片段能够以未配制、未涂覆、未保护的形式在工业饲料制粒过程中承受此类变化。
术语“液体”、“液体形式”和“液体配制品”可互换地使用，并且意指在调节和制粒之前能以任何方式将酶以液体形式应用至饲料。
据信将稳健的工程化的植酸酶多肽或其片段以液体形式应用到饲料中与应用涂覆颗粒形式的此类植酸酶相比是有益的。这种涂覆颗粒是目前制造适于高温调节和制粒的植酸酶产品的商业方法。稳健的酶的液体应用的益处包括：1)动物摄取后，酶将立即开始起作用，因为酶在与饲料相互作用之前不必从涂覆颗粒中释放出来，2)酶在整个饲料中的分布得到改善，因此确保了酶向动物更一致的递送，这对进食少量饲料的幼小动物尤其重要，3)在饲料中的均匀分布使得更容易测量饲料中的酶，以及4)在稳健的植酸酶的情况下(诸如本文公开的工程化的植酸酶多肽和片段)，它可开始降解饲料中已存在的植酸盐。
换句话说，新型工程化的植酸酶多肽及其片段非常稳健，以至于在调节和制粒之前不需要特殊的涂层或制剂来将其应用于饲料，因为它们已被工程化以承受在工业饲料生产中所使用的调节和制粒的压力。因此，本文所述的新型工程化的植酸酶多肽及其片段的稳健性使得它们可以未涂覆的颗粒(granule或particle)的形式或当置于液体中时可以未涂覆和未保护的形式应用。
应当指出，工程化的植酸酶多肽及其片段可在固体载剂上廉价地配制而不特别需要保护性涂层，并且在整个调节和制粒过程中仍保持活性。当其中使用苛刻条件的某些区域需要或如果条件允许(例如在高于90℃的超调节饲料的情况下)时，以固体形式应用时提供附加热稳定性的保护性涂层对于获得制粒稳定性可能是有益的。
所公开的工程化的植酸酶多肽或其片段是使用蛋白质工程领域中已知的方法和技术的组合衍生的，该方法和技术包括系统发生分析、位点评估文库、组合文库、高通量筛选和统计分析。
在一方面，本公开涉及一种还与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少82％序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段。
本领域技术人员将理解，此类至少82％序列同一性还包括82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本领域技术人员将理解，此类至少79％序列同一性还包括79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
还可提及以下内容，因为在一些实施例中，提供了：
a)一种还与SEQ ID NO:2、3、8、10、12、18、19、24、26、27、28、30、31、32、33、和/或36的氨基酸序列具有至少81％(诸如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段。
b)一种还与SEQ ID NO:1、4、5、7、9、11、14、15、17、21、25、34、和/或35的氨基酸序列具有至少82％(诸如82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段；
c)一种还与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少83％(诸如，83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段；
d)一种工程化的植酸酶多肽或其片段，所述工程化的植酸酶多肽或其片段还与SEQ ID NO:6、22、和/或64的氨基酸序列具有至少79％(例如79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；和/或
e)一种还与SEQ ID NO:16、20、23、29、和/或37的氨基酸序列具有至少80％(诸如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段。
在进一步的方面，多肽包含工程化的植酸酶多肽的核心结构域或者是工程化的植酸酶多肽的核心结构域片段。“核心结构域片段”在本文中被定义为从多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。如本文所用，短语“核心结构域”是指涵盖维持多肽的结构和功能(诸如植酸水解)所必需的氨基酸的多肽区域。核心结构域中的氨基酸可被进一步修饰以提高在各种条件下(诸如但不限于pH)的热稳定性或催化活性。在一些非限制性实施例中，本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段的核心结构域对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14-325。在其他非限制性实施例中，核心结构域对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置13-326、12-327、11-328、10-329、9-330、8-331、7-332、6-333、5-334、4-335、3-336、2-337或1-338。在其他实施例中，核心结构域的N-末端对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25，并且核心结构域的C-末端对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、或413。
因此，本文还提供了：
f)一种工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，所述工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段与SEQ ID NO:6和/或64的氨基酸14-325具有至少78％(例如，78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置；
g)一种与SEQ ID NO:2、8、27和/或37的氨基酸14-325具有至少79％(诸如，79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置；
h)一种工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，所述工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段与SEQ ID NO:3、10、12、18、25、26、28、30、32、35、65、70和/或86的氨基酸14-325具有至少81％(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置；
i)一种工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，所述工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段与SEQ ID NO:1、4、5、7、9、11、13-17、21、22、31、33、34、36、64、66-69和/或71-84的氨基酸14-325具有至少82％(例如，82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置；
j)一种与SEQ ID NO:19、20、23和/或24的氨基酸14-325具有至少83％(诸如，83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置；和/或
k)一种与SEQ ID NO:29的氨基酸14-325具有至少84％(诸如，84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于SEQ IDNO:1的氨基酸位置。
在仍另一方面，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少82％序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段还可以具有隐马尔可夫模型(HMM)评分至少为约1200(例如至少约1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750或1800)的氨基酸序列，如表11中关于高Tm植酸酶进化枝多肽所示。
在仍其他方面，本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段可在其多肽序列内一个或多个位置处包含一个或多个特定氨基酸取代。同样地，在一些实施例中，本文提供了包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)氨基酸取代的工程化的植酸酶多肽或其片段，所述氨基酸取代选自由以下组成的组：30(L、I)、37Y、45P、89T、182R、194M、195F、202S、228Y、256H、261H、和298V，其中位置对应于SEQ ID NO:1或57的编号。
另外或此外，任何工程化的植酸酶多肽或其片段可包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个)氨基酸取代，所述氨基酸取代选自由以下组成的组：3T、6S、9Q、73I、76K、78S、118Q、123A、130V、163P、186D、187K、209A、284S、288A、289R、337V、345A、和347K，其中位置对应于SEQ ID NO:1的编号。在一些实施例中，所述工程化的植酸酶多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、和SEQ ID NO:87。
含有一个或多个氨基酸取代的工程化的植酸酶多肽或其片段与不包含所述一个或多个氨基酸取代的植酸酶多肽或其片段相比，可表现出一种或多种特性改善或增强，例如但不限于热稳定性改善(例如，热稳定性改善约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％或更多中任一项(包括介于这些值之间的所有百分比)或活性改善(例如，相比在pH 5.5处的活性，在pH 3.5处的比活性和/或活性改善)(例如，活性改善约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％或更多中任一项(包括介于这些值之间的所有百分比))。
在又其他方面，本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段可以具有一个或多个取代(例如以上公开的取代中的一个或多个)，其增加了在pH 3.5处与pH 5.5处的植酸酶的活性(例如比活性)的比率。因此，在一些实施例中，本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段在pH3.5处的活性(例如，比活性)与在pH 5.5处的活性(例如，比活性)的比率大于或等于约1.2(例如约1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高中的任一项)。
还描述了一种工程化的植酸酶多肽或其片段，使用标准进料制粒回收率测试，当在95℃在MLA中应用30秒时，所述工程化的植酸酶多肽或其片段具有至少50％的进料制粒回收率。此外，如本文所述的具有至少50％的进料制粒回收率的工程化的植酸酶多肽或其片段还可以具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少82％的序列同一性。
进料制粒回收率可以是从约50％至约100％范围内的任何值，具体地约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施例中，当在95℃作为固体应用时，所述工程化的植酸酶多肽或其片段具有至少约60％、65％、70％、75％、70％、85％、90％、95％或99％的进料制粒回收率。
本领域技术人员将理解，进料制粒回收率可以根据所用饲料的类型、所用的调节和制粒条件(例如温度和水分含量，用于确定活性的测定法等)而变化。
使用标准进料制粒测试，本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段在95℃在MLA中应用30秒时与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率为至少0.7。该比率包括约0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98和0.99。
在另一实施例中，公开了一种工程化的植酸酶多肽或其片段，相比于：a)SEQ IDNO:60；b)具有A25F和G157R取代的SEQ ID NO:60；c)SEQ ID NO:104；和/或d)SEQ ID NO:104的氨基酸22-431，所述工程化的植酸酶多肽或其片段在95℃在MLA中应用30秒时与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率为至少约3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
在另一实施例中，公开了一种工程化的植酸酶多肽或其片段，相比于：a)SEQ IDNO:60；b)具有A25F和G157R取代的SEQ ID NO:60；c)SEQ ID NO:104；和/或d)SEQ ID NO:104的氨基酸22-431，所述工程化的植酸酶多肽或其片段在95℃在MLA中应用30秒时与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率的比率为至少约3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段可以进一步包含至少约92.5℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约97℃、约98℃、约99℃、约100℃、或约101℃的Tm温度(使用实例3所述的差示扫描量热测定条件)，且结果提供于实例4中。
在另一实施例中，公开了一种工程化的植酸酶多肽或其片段，相比于：a)SEQ IDNO:60；b)具有A25F和G157R取代的SEQ ID NO:60；c)SEQ ID NO:104；和/或d)SEQ ID NO:104的氨基酸22-431，所述工程化的植酸酶多肽或其片段的Tm温度比率为至少约1.08、1.10、1.12、1.14、1.16、1.18或1.20、2.1、2.4、2.7、3.0或3.3(如通过差示扫描量热法测量的)。
在另一方面，本文公开的任何工程化的多肽或其片段在如实例4所述的那些测定条件下在pH 3.5处包含至少约100U/mg的比活性。比活性范围(U/mg，在pH 3.5下)包括但不限于约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、2000等。
在另一方面，本文公开的一些工程化的多肽或其片段在如实例4所述的那些测定条件下在pH 5.5处包含至少约100U/mg的比活性。比活性范围(U/mg，在pH 5.5下)包括但不限于约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、2000等。
在仍另一方面，本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种可在约3.0或更低的pH下以液体形式稳定。这在本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段通过动物消化道时十分相关，如下所讨论的。
在另一实施例中，描述了包含本文所述的任何工程化的植酸酶多肽或其片段的动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物。
重要的是，饲料添加剂酶(例如植酸酶)在通过动物消化道时经受非常苛刻的条件，即低pH和消化酶的存在。胃蛋白酶是单胃动物胃肠道中存在的最重要的蛋白水解消化酶之一。胃蛋白酶在酸性区域具有低特异性和高pH耐受性(pH 1.5-6.0稳定直至pH 8.0)。本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段在很大程度上耐受胃蛋白酶，而胃蛋白酶对于良好的体内性能是必需的。
包含本文所述的任何工程化的植酸酶多肽或其片段的动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物可以(i)单独使用，或(ii)与包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物组合使用，或(iii)与至少一种其他酶一起使用，或(iv)与包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物以及至少一种其他酶组合使用，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一种、进一步包含至少一种其他饲料添加剂组分，以及任选地所述工程化的植酸酶多肽或其片段以至少0.1g/吨饲料的量存在。
术语“饲料添加剂”、“饲料添加剂组分”和/或“饲料添加剂成分”在本文可互换使用。
饲料添加剂可被描述为用于动物营养的产品，目的是改善饲料质量和动物来源食物的质量，或改善动物的性能和健康，例如提供增强的饲料材料消化率。
饲料添加剂分为多种类别，诸如感官添加剂，其刺激动物的食欲，使它们自然地想更多进食。营养添加剂提供动物日粮中可能缺乏的特定营养物。畜牧学添加剂通过饲料中的添加剂来提高动物日粮的总体营养价值。
此类饲料添加剂的实例包括但不限于益生菌、精油(例如但不限于麝香草酚和/或肉桂醛)、脂肪酸、短链脂肪酸(诸如丙酸和丁酸等)、维生素、矿物质、氨基酸等。
饲料添加剂组合物或制剂还可包含至少一种选自由以下组成的组的组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
至少一种其他酶(即除了本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种之外)可包括在本文公开的饲料添加剂组合物或制剂中，其可包括但不限于木聚糖酶、淀粉酶、另一种植酸酶、β-葡聚糖酶、和/或蛋白酶。
木聚糖酶是将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶的名称。木聚糖酶，例如内切-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)水解木聚糖主链。
在一个实施例中，木聚糖酶可以是任何可商购获得的木聚糖酶。合适地，木聚糖酶可以是内切-1,4-P-d-木聚糖酶(分类为E.G.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(E.G.3.2.1.37)。在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种与木聚糖内切酶(例如内切-1,4-P-d-木聚糖酶)和另一种酶组合的组合物。本文提及的所有E.C.酶分类涉及在国际生物化学与分子生物学联合会(International Union ofBiochemistry and Molecular Biology)命名委员会的酶命名法-推荐(EnzymeNomenclature—Recommendations)(1992)-ISBN 0-12-226164-3中提供的分类，其通过援引并入本文。
在另一个实施例中，该木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(Trichodermna)、嗜热真菌属(Therinomyces)、曲霉属、腐质霉属和青霉属的木聚糖酶。在另一个实施例中，该木聚糖酶可以是Axtra
Figure BDA0003908349840000481
或Avizyme
Figure BDA0003908349840000482
中的木聚糖酶，两者都是可从丹尼斯科公司(Danisco A/S)商购获得的产品。在一个实施例中，木聚糖酶可以是两种或更多种木聚糖酶的混合物。在另一个实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。
在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段和木聚糖酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的木聚糖酶单位/g组合物。
在一个实施例中，所述组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000和大于8000的木聚糖酶单位/g组合物。
应当理解，一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物中释放0.5μmol还原糖当量(通过二硝基水杨酸(DNS)测定-还原糖方法以木糖计)的酶的量。(Bailey等人,Journal of Biotechnology[生物技术杂志],第23卷,(3),1992年5月,257-270)。
淀粉酶是一类能够将淀粉水解为较短链的寡糖(诸如麦芽糖)的酶。然后与从原始的淀粉分子转移相比，葡萄糖部分可更容易地从麦芽糖转移到单甘油酯或糖基单甘油酯。术语淀粉酶包括α-淀粉酶(E.G.3.2.1.1)、G4形成淀粉酶(E.G.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.G.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。淀粉酶可以是细菌或真菌来源的，或是化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
在一个实施例中，淀粉酶可以是两种或更多种淀粉酶的混合物。在另一个实施例中，淀粉酶可以是来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的淀粉酶(例如α-淀粉酶)和来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的淀粉酶(例如α-淀粉酶)。在一个实施例中，α-淀粉酶可以是Axtra
Figure BDA0003908349840000491
或Avizyme
Figure BDA0003908349840000492
中的α-淀粉酶，两者都是可从丹尼斯科公司商购获得的产品。在另一个实施例中，淀粉酶可以是抗胃蛋白酶α-淀粉酶，诸如抗胃蛋白酶木霉属(诸如里氏木霉)α淀粉酶。在英国申请号101 1513.7(其通过援引并入本文)和PCT/IB2011/053018(其通过援引并入本文)中传授了一种合适的抗胃蛋白酶α-淀粉酶。
应当理解，一个淀粉酶单位(AU)是在pH 6.5和37℃下，每分钟从非水溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶量(这在本文中可以称为确定1AU的测定法)。
在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段和淀粉酶的组合物。在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段、木聚糖酶和淀粉酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的淀粉酶单位/g组合物。
在一个实施例中，所述组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的淀粉酶单位/g组合物。
如本文所用，术语蛋白酶(protease)与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(E.G.3.4.21.62)或杆菌蛋白酶(E.G.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.G.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.G.3.4.X.X)。在一个实施例中，蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。
经化学修饰或蛋白质工程化的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。例如，碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在一个实施例中，本文提供了包含本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种和一种或多种蛋白酶的组合物。
碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如，美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和镰孢菌属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例还包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体。
在一个实施例中，蛋白酶选自由以下组成的组：枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶。
应当理解，一个蛋白酶单位(PU)是在pH 7.5(40mM Na2PO4/乳酸缓冲液)和40℃下在一分钟内从底物(0.6％酪蛋白溶液)中释放一微克酚类化合物(以酪氨酸当量表示)的酶的量。这可被称为用于确定1PU的测定。
在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段和蛋白酶的组合物。在另一实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段以及木聚糖酶和蛋白酶的组合物。在仍另一实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段以及淀粉酶和蛋白酶的组合物。在又另一实施例中，本公开涉及包含本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段以及木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。
在一个实施例中，所述组合物包含约10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的蛋白酶单位/g组合物。
在一个实施例中，所述组合物包含约500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的蛋白酶单位/g组合物。
至少一种直接饲喂微生物(DFM)可包含至少一种有活力的微生物，诸如有活力的细菌菌株或有活力的酵母或有活力的真菌。优选地，DFM包含至少一种有活力的细菌。
有可能DFM可以是形成孢子的细菌菌株，因此术语DFM可由孢子构成或含有孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所用，术语“有活力的微生物”可包括微生物孢子，诸如内生孢子或分生孢子。替代性地，本文所述的饲料添加剂组合物中的DFM可不由微生物孢子构成或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。
微生物可以是天然存在的微生物，或者其也可以是转化的微生物。
如本文所述的DFM可包含来自一种或多种以下属的微生物：乳杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属、梭菌属和巨球菌属(Megasphaera)以及它们的组合。
优选地，DFM包含一种或多种选自以下芽孢杆菌属物种的细菌菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
如本文所用，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属继续经历分类学上的重组。因此，该属旨在包括已被重新分类的物种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”)或多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(现在被命名为“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的生物体。在压力环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，尽管该特性也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在另一方面，DFM可进一步与以下乳球菌属物种组合：乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)以及它们的组合。
DFM可进一步与以下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳杆菌(Lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、以及它们的任何组合。
在另一方面，DFM可进一步与以下双歧杆菌属物种组合：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、以及它们的任何组合。
可提及以下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivariusssp.Salivarius)、丙酸杆菌物种以及它们的组合。
本文所述的包含一种或多种细菌菌株的直接饲喂微生物可以是同一类型(属、种和菌株)，或者可包含属、种和/或菌株的混合物。
替代性地，DFM可与WO 2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中包含的微生物组合，并且总结如下：枯草芽孢杆菌菌株2084登录号NRRLB-50013、枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104、和枯草芽孢杆菌菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507(来自Enviva
Figure BDA0003908349840000541
(以前称为
Figure BDA0003908349840000542
)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自
Figure BDA0003908349840000543
)；枯草芽孢杆菌菌株PB6(来自
Figure BDA0003908349840000544
)；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌NCIMB 10415(SF68)(来自
Figure BDA0003908349840000545
)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自
Figure BDA0003908349840000546
和
Figure BDA0003908349840000547
)；地衣芽孢杆菌(来自
Figure BDA0003908349840000548
)；肠球菌和片球菌(来自Poultry
Figure BDA0003908349840000549
)；乳杆菌、双歧杆菌和/或肠球菌(来自
Figure BDA00039083498400005410
)；枯草芽孢杆菌菌株QST 713(来自
Figure BDA00039083498400005411
)；解淀粉芽孢杆菌CECT-5940(来自
Figure BDA00039083498400005412
和
Figure BDA00039083498400005413
Plus)；屎肠球菌(Enterococcusfaecium)SF68(来自
Figure BDA00039083498400005414
)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自
Figure BDA00039083498400005415
)；乳酸菌7屎肠球菌(来自
Figure BDA00039083498400005416
)；芽孢杆菌菌株(来自
Figure BDA00039083498400005417
)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(来自Yea-
Figure BDA00039083498400005418
)；肠球菌(来自Biomin
Figure BDA0003908349840000551
)；乳酸片球菌、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(来自Biomin
Figure BDA0003908349840000552
)；香肠乳杆菌(来自
Figure BDA0003908349840000553
)；肠球菌(来自Oralin
Figure BDA0003908349840000554
)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM1103(来自Probios-pioneer
Figure BDA0003908349840000555
)；鼠李糖乳杆菌和香肠乳杆菌(来自
Figure BDA0003908349840000556
)；枯草芽孢杆菌(来自
Figure BDA0003908349840000557
)；肠球菌(来自
Figure BDA0003908349840000558
)；酿酒酵母(来自LevucellSB
Figure BDA0003908349840000559
)；酿酒酵母(来自Levucell SC 0&
Figure BDA00039083498400005510
ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自
Figure BDA00039083498400005511
(以前为
Figure BDA00039083498400005512
))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自
Figure BDA00039083498400005513
SC47)；丁酸梭菌(来自Miya-
Figure BDA00039083498400005514
)；肠球菌(来自Fecinor和Fecinor
Figure BDA00039083498400005515
)；酿酒酵母NCYC R-625(来自
Figure BDA00039083498400005516
)；酿酒酵母(来自
Figure BDA00039083498400005517
)；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自
Figure BDA00039083498400005518
)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自PepSoyGen-
Figure BDA00039083498400005519
)；蜡样芽孢杆菌(来自
Figure BDA00039083498400005520
)；蜡样芽孢杆菌东洋变体(Bacillus cereus var.toyoi)NCIMB40112/CNCMI-1012(来自
Figure BDA00039083498400005521
)，或其他DFM，诸如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自
Figure BDA00039083498400005522
YC)和枯草芽孢杆菌(来自
Figure BDA00039083498400005523
)。
DFM可与
Figure BDA00039083498400005524
PRO组合，后者可从丹尼斯科公司商购获得。Enviva
Figure BDA00039083498400005525
是芽孢杆菌菌株2084登录号NRRL B-50013、芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104和芽孢杆菌菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469 B中所传授的-通过援引并入本文)。
也可将本文所述的DFM与来自以下属的酵母组合：酵母属(Saccharomyces)物种。
优选地，本文所述的DFM包含通常被认为是安全(GRAS)并且优选地经GRAS批准的微生物。
本领域普通技术人员将很容易意识到来自本文所述属内的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。
在一些实施例中，重要的是DFM是热耐受的，即耐热的。当饲料被制粒时尤其如此。因此，在另一个实施例中，DFM可以是耐热微生物，诸如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。
在其他方面，可能希望DFM包含产生孢子的细菌，诸如芽孢杆菌纲，例如芽孢杆菌属物种。当生长条件不利时，芽孢杆菌纲能够形成稳定的内生孢子，并且对热、pH、水分和消毒剂具有很强的抗性。
本文所述的DFM可减少或防止致病性微生物(如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属(Salmonella)物种和/或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种)的肠道建立。换句话说，DFM可以是抗致病性的。如本文所用，术语“抗致病性”意指DFM抵抗病原体的作用(负面作用)。
如上所述，DFM可以是任何合适的DFM。例如，以下测定“DFM测定”可用于确定微生物作为DFM的适合性。如本文所用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的解释。为了避免疑问，根据本文所传授的“DFM测定”选择作为抑制性菌株(或抗致病性DFM)的DFM是根据本公开使用的适合的DFM，即在根据本公开的饲料添加剂组合物中使用的DFM。
每个管接种有来自代表性簇的代表性病原体(例如，细菌)。
将来自需氧或厌氧生长的潜在DFM的上清液添加到接种管中(不添加上清液的对照除外)并孵育。孵育后，测量对照管和上清液处理管中每种病原体的光密度(OD)。
然后可将与对照(不含有任何上清液)相比产生较低OD的(潜在DFM)菌株的集落分类为抑制性菌株(或抗致病性DFM)。因此，如本文所用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的解释。
优选地，在这种DFM测定中使用的代表性病原体可以是以下的一种(或多种)：梭菌属，诸如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌(Clostridium difficile)，和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个优选的实施例中，该测定用以下中的一种或多种进行：产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌和/或大肠杆菌，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌。更优选地产气荚膜梭菌。
抗致病性DFM包括以下细菌中的一种或多种并在WO 2013029013中有所描述：
枯草芽孢杆菌菌株3BP5登录号NRRL B-50510、
解淀粉芽孢杆菌菌株918 ATCC登录号NRRL B-50508和
解淀粉芽孢杆菌菌株1013 ATCC登录号NRRL B-50509。
DFM可被制备成培养物和载剂(如果使用的话)，并可被添加到带式或桨式混合器中并混合约15分钟，尽管时间可增加或减少。将这些组分共混，使得得到培养物和载剂的均匀混合物。最终产物优选地为干燥、可流动的粉末。然后可将包含一种或多种细菌菌株的DFM添加到动物饲料或饲料预混物中，添加到动物的水中，或以本领域已知的其他方式施用(优选地与本文所述的酶同时)。
在DFM混合物中包含的单个菌株的比例可从1％至99％并且优选地从25％至75％变化。
动物饲料中DFM的合适剂量可在约1×103CFU/g饲料至约1×1010CFU/g饲料、合适地在约1×104CFU/g饲料至约1×108CFU/g饲料之间、合适地在约7.5×104CFU/g饲料至约1×107CFU/g饲料之间的范围内。
在另一方面，喂养料中DFM的剂量超过约1×103CFU/g饲料、合适地超过约1×104CFU/g饲料，合适地超过约5×104CFU/g饲料、或合适地超过约1×105CFU/g饲料。
饲料添加剂组合物中DFM的剂量从约1x103CFU/g组合物至约1x1013CFU/g组合物，优选1x105CFU/g组合物至约1x1013CFU/g组合物，更优选在约1x106CFU/g组合物至约1x1012CFU/g组合物之间，并且最优选在约3.75x107CFU/g组合物至约1x1011CFU/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约1×105CFU/g组合物、优选地大于约1×106CFU/g组合物并且最优选地大于约3.75×107CFU/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约2×105CFU/g组合物、合适地大于约2×106CFU/g组合物、合适地大于约3.75×107CFU/g组合物。
在仍另一方面，公开了颗粒状饲料添加剂组合物，用于在动物饲料中使用，所述动物饲料包含如本文所述的具有植酸酶活性的至少一种多肽，单独的或与至少一种直接饲喂微生物组合、或与至少一种其他酶组合、或与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合使用，其中所述饲料添加剂组合物包含的可以是任何形式，例如颗粒状颗粒。此类颗粒状颗粒可通过选自由以下组成的组的方法产生：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷雾涂层、喷雾干燥、冷冻干燥、制粒、喷雾冷却、涡流盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
此外，颗粒状饲料添加剂组合物的颗粒可具有大于50微米并且小于2000微米的平均直径。
本领域技术人员将理解动物饲料可包括用于家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的植物材料，诸如玉米、小麦、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵、或这些植物材料或植物蛋白来源中的任一种的混合物。预期动物性能参数，诸如生长、饲料摄入量和饲料效率，以及改善的均匀性、降低的动物棚舍中的氨浓度和因此改善的动物福利和健康状况都将得到改善。
因此，公开了一种用于提高动物饲料的营养价值的方法，其中可将如本文所述的工程化的植酸酶或其片段中的任一种添加到动物饲料中。
如本文所用的短语“有效量”是指单独地或与一种或多种其他活性剂(诸如但不限于一种或多种另外的酶、一种或多种DFM、一种或多种精油等)组合赋予动物在一个或多个指标上改善的性能所需的活性剂(诸如植酸酶，例如本文公开的工程化的植酸酶多肽中的任一种)的量。
如本文所用，术语“动物性能”可通过任何指标诸如但不限于饲料效率和/或动物的增重、和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中营养物的消化率(例如，氨基酸消化率或磷消化率)和/或饲料中可消化能量或代谢能、和/或通过氮保留和/或通过动物避免疾病负面作用的能力或通过受试对象的免疫应答来确定。
动物性能特性可包括但不限于：体重；增重；质量；体脂百分比；身高；体脂分布；生长；生长速率；蛋大小；蛋重量；蛋质量；产蛋率；矿物质吸收；矿物质排泄、矿物质保留；骨密度；骨强度；饲料转化率(FCR)；平均每日饲料摄入量(ADFI)；平均日增重(ADG)；铜、钠、磷、氮和钙中的任何一种或多种的保留和/或分泌；氨基酸保留或吸收；矿化、骨矿化屠体产量和屠体品质。
“在一个或多个指标上改善的动物性能”意指与不包含本文所述的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用包含所述饲料添加剂组合物的饲料，受试对象中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中营养物或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎负面作用的能力改善和/或免疫应答改善。
优选地，所谓“改善的动物性能”意指饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低。如本文所用，术语“饲料效率”是指在一段时间内给动物随意饲喂或饲喂指定量的食物时出现的动物增重的量。如本文所用的“指标的改善”或“改善的指标”是指在动物定义的指标下列出的至少一个参数的改善。
所谓“饲料效率增加”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量的增重增加。
如本文所用，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加指定量的饲料量。
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致饲喂给动物以使动物体重增加指定量所需的饲料量与在饲料不包含所述饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量所需的饲料量相比较低。
性能参数的改善可相对于其中所用饲料不包含植酸酶的对照。
术语胫骨灰分是指骨矿化的量化方法。该参数给出了磷是缺乏(例如，在磷缺乏阴性对照日粮中含量应低)还是足够(例如，植酸酶处理中的含量与满足肉鸡磷需求的阳性对照日粮相当)的指示
术语“磷缺乏日粮”是指其中磷水平不足以满足动物营养需求的日粮，例如，配制的饲料中磷水平远低于国家研究委员会(NRC)或肉鸡饲养者所推荐的水平。动物饲料中的矿物质水平低于最佳生长所需的水平。如果日粮中缺乏磷，钙也不会被动物吸收。Ca过多可导致磷(P)消化率变差，并造成不溶性矿物-植酸盐复合物的形成。P和Ca两者的缺乏可导致骨骼完整性降低，生长低于正常水平，并最终导致体重减轻。
术语“矿化”或“矿化”涵盖矿物质沉积或矿物质的释放。矿物质可从动物体内沉积或释放。矿物质可从饲料中释放。矿物质可包括动物日粮中必需的任何矿物质，并且可包括钙、铜、钠、磷、铁和氮。在一个优选的实施例中，本发明的工程化的植酸酶多肽或其片段在食物或饲料中的使用导致钙在动物体内(特别是在骨中)的沉积增加。
如本文所用的营养物消化率意指营养物从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的分数。营养物消化率可被测量为施用给受试对象的营养物与受试对象粪便中排出的营养物之间的差异，或者施用给受试对象的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养物之间的差异。
如本文所用，营养物消化率可如下测量：通过在一段时间内营养物的摄入量与通过排泄物完全收集而得出的营养物的排出量之间的差异；或者使用不被动物吸收的惰性标记，并允许研究人员计算在整个胃肠道或胃肠道的区段中消失的营养物的量。此类惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为在饲料中营养物的百分比，或表示为可消化营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。
如本文所用的营养物消化率涵盖磷消化率、淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。可消化磷(P)可被定义为回肠可消化P，其为总P摄入量中动物在回肠末端吸收的比例，或粪便可消化P，其为总P摄入量中粪便中未排泄的比例。
如本文所用的术语“存活率”意指存活的受试对象数量。术语“改善的存活率”是“降低的死亡率”的另一种说法。
如本文所用的术语“屠体产量”意指在商业或实验性宰杀过程之后以活体重量的比例计的屠体量。术语屠体意指已被宰杀用于食用并去除头部、内脏、四肢部分和羽毛或皮肤的动物躯体。如本文所用，术语肉产量意指以活体重的比例计的可食用肉量，或以活体重的比例计的指定肉块量。
术语“屠体品质”和“肉品质”可互换使用，并且是指组成品质(肥瘦比率)以及适口性因素，诸如觉外观、气味、坚实度、多汁性、嫩度和风味。例如，生产没有“木质胸肉(woodybreast)”的家禽。在美国，小部分鸡肉中的肌肉异常导致出现木质胸肉的品质问题，这种状况导致鸡胸肉难以接触，并且经常颜色苍白且质地较差。木质胸肉不会给人们带来任何健康或食品安全隐患，并且鸡本身的健康也不会受到负面影响。
“增重增加”是指与饲喂不含饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物体重增加。
在本发明的上下文中，术语“宠物食品”旨在理解为表示用于家养动物的食品，所述家养动物诸如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、毛丝鼠、花枝鼠(fancy rat)、豚鼠；禽类宠物，诸如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行类宠物，如龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，诸如热带鱼和青蛙。
术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“喂养料”和“秣料(fodder)”可互换使用，并且可包含选自下组的一种或多种饲料材料，该组包含：a)谷类，诸如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物，诸如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，诸如玉米麸质粉、含可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米的含可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、粗小麦粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦皮、棕榈仁和柑橘渣；c)从来源诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。
如本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段或包含此类工程化的植酸酶多肽或其片段的饲料添加剂组合物可以用作饲料或用于制备饲料。
因此，描述了用于在动物饲料中使用的干燥的酶组合物，所述干燥的酶组合物包含本文所述的任何工程化的植酸酶多肽或其片段。
还描述了用于在动物饲料中使用的液体酶组合物，所述液体酶组合物包含如本文所述的任何工程化的植酸酶多肽或其片段。
术语“饲料添加剂组合物”和“酶组合物”在本文中可互换地使用。
取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或呈半固体形式。
在一个优选的实施例中，将本文所述的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。
如本文所用的，“饲料组分”意指饲料的全部或部分。饲料的部分可意指喂养料的一种成分或饲料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。
在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。可以将所述饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。
秣料涵盖已经切下的植物。此外，秣料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合口粮，并且还包括发芽谷物和豆类。
合适地，如本文所提及的预混物可以是由微量成分诸如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分构成的组合物。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
如本文所用，术语“接触”是指将工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种(或包含工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种的组合物)间接或直接应用于产品(例如饲料)。可使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品，通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用，将饲料添加剂组合物喷雾到产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的配制品中。在一个实施例中，将本发明的饲料添加剂组合物优选地与产品(例如喂养料)混合。替代性地，饲料添加剂组合物可包含在喂养料的乳液或原始成分中。对于一些应用而言，重要的是组合物在待被影响/处理的产品表面上可用或可用于待被影响/处理的产品表面。这允许组合物赋予性能益处。
在一些方面，任何工程化的植酸酶多肽或其片段可以用于食品或饲料的预处理。例如,将具有10％-300％的水分的饲料混合并与所述工程化的植酸酶多肽或其片段在5℃-80℃(优选地在25℃-50℃，更优选地在30℃-45℃之间)孵育，其中在有氧条件下孵育1分钟至72小时或在厌氧条件下孵育1天至2个月。经预处理的材料可以直接饲喂给动物(所谓的液体饲喂)。经预处理的材料也可以在升高的温度(60℃-120℃)下蒸汽压成丸粒。所述工程化的植酸酶多肽或其片段可以通过真空喷涂机(vacuum coater)浸渍到饲料或食品材料中。
可将本文所述的任何工程化的植酸酶多肽或其片段(或包含此类工程化的植酸酶多肽或其片段的组合物)和受控量的所述酶用以散布、涂覆和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。
在另一方面，可将饲料添加剂组合物均化以产生粉末。粉末可与本领域已知的其他组分混合。粉末或包含粉末的混合物可被强制通过模具，并将所得的线料切割成合适的不同长度的丸粒。
任选地，制粒步骤可包括在形成丸粒之前的蒸汽处理或调节阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器例如具有蒸汽注入的混合器中。将混合物在调节器中加热达到指定温度，诸如60℃-100℃，典型温度将是70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可从几秒到几分钟不等。应当理解，本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种(或包含工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种的组合物)适合于添加到任何适当的饲料材料中。
在其他实施例中，可将颗粒引入饲料制粒过程中，其中饲料预处理过程可在70℃至95℃之间诸如在85℃与95℃之间进行长达几分钟。
在一些实施例中，基于纯酶蛋白，工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种可以1ppb(十亿分率)至10％(w/w)的范围存在于饲料中。在一些实施例中，工程化的植酸酶多肽或其片段以1-100ppm(百万分率)的范围存在于喂养料中。优选剂量可以是每吨饲料产品或饲料组合物1-20g工程化的植酸酶多肽或其片段，或在最终饲料产品中1-20ppm工程化的植酸酶多肽或其片段的最终剂量。
优选地，饲料中存在的工程化的植酸酶多肽或其片段应为至少约50-10,000FTU/kg，相当于大约0.1至20mg工程化的植酸酶多肽或其片段的蛋白质/kg。
范围可包括但不限于以上讨论的下限和上限的任何组合。
包含本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种和组合物的制剂和/或配制品可以任何合适的方式制备，以确保制剂包含活性植酸酶。此类制剂可以是液体、干粉或颗粒，其可以是未涂层/未保护的，或者可涉及使用热防护涂层，这取决于加工条件。如上所述，工程化的植酸酶多肽及其片段可在固体载剂上廉价地配制而不特别需要保护性涂层，并且在整个调节和制粒过程中仍保持活性。当其中使用苛刻条件的某些区域需要或如果条件允许(例如在高于90℃的超调节饲料的情况下)时，以固体形式应用时提供附加热稳定性的保护性涂层对于获得制粒稳定性可能是有益的。
本文所述的饲料添加剂组合物可被配制成干粉或颗粒，如WO 2007/044968(称为TPT颗粒)或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述(所述文献各自通过援引并入本文)。
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可被配制成用于饲料组合物的颗粒，所述颗粒包含：核心；活性剂(例如，植酸酶，诸如本文公开的工程化的植酸酶多肽中的任一种)；和至少一个涂层，在经历选自以下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制粒过程，b)蒸汽加热饲料预处理过程，c)储存，d)作为未制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
关于颗粒，至少一个涂层可包含占颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包含两个涂层。这两个涂层可以是水分水合涂层和防潮层涂层。在一些实施例中，水分水合涂层可占颗粒的25％w/w至60％w/w，并且防潮层涂层可占颗粒的2％w/w至15％w/w。水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且防潮层涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
在其他实施例中，可将颗粒引入饲料制粒过程中，其中饲料预处理过程可在70℃至95℃之间诸如在85℃与95℃之间进行长达几分钟。
饲料添加剂组合物可被配制成用于动物饲料的颗粒，该颗粒包含：核心；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒过程之后，颗粒的活性剂保持至少80％活性；防潮层涂层；和占该颗粒至少25％w/w的水分水合涂层，该颗粒在蒸汽加热制粒过程之前具有小于0.5的水分活度。
颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮层涂层并且该水分水合材料可是无机盐。水分水合涂层可占颗粒的25％至45％w/w并且防潮层涂层可占颗粒的2％至10％w/w。
替代性地，该组合物处于适合于消费的液体制剂中，优选地，此类液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨糖醇和/或甘油。
此外，可通过将酶应用(例如喷雾)到载剂底物(诸如磨碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可被配制成预混物。仅举例而言，预混物可包含一种或多种饲料组分，诸如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施例中，将直接饲喂微生物(“DFM”)和/或工程化的植酸酶多肽或其片段与至少一种生理学上可接受的载剂一起配制，该载剂选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
可用于制造含有本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或片段的动物饲料丸粒的载剂优选地选自允许转化形成类似于常规饲料丸粒的限定形状的饲料液体或固体载剂。在一些非限制性实施例中，可以使用以下两类液体或固体载剂：(i)在溶剂或分散剂介质中使用的载剂；以及(ii)能够被熔化的载剂。
在溶剂或分散剂介质中使用的第一种类型的载剂包括：水胶体类，优选纤维素的水溶性衍生物，更优选羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟甲基纤维素；天然或合成多糖类，优选阿拉伯树胶、黄蓍胶、角叉菜胶、糊精、淀粉、黄原胶和藻酸盐；糖；糖蜜和啤酒糟；木质素磺酸盐；谷物粉或海藻粉；可结晶无机化合物，优选石灰、石膏、硅酸钠、碳酸钙和二氧化硅；明胶；鞣酸蛋白(tanned protein)；天然或合成多元酸的多价阳离子盐；以及通过干性油和填料的组合获得的干性油和乳香脂。
一些载剂与交联剂一起使用。优选的交联剂包括用于蛋白质的醛，以及用于藻酸盐、黄原胶、糖蜜、啤酒糟的二价或三价金属的盐或氧化物，以及本领域技术人员已知的适用于粘合剂的其他硬化剂或固化剂。
能够被熔化的第二类型的载剂包括：脂肪酸和醇；氢化植物和动物脂肪；甘油酯类；石腊；天然和合成蜡；以及合成聚合物，优选聚乙二醇和聚乙酸乙烯酯。在所有粘合剂中，最优选的是糖蜜、啤酒糟、脂肪酸、氢化植物或动物脂肪、石膏和石蜡。
以下是可用于制造含有本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或片段的动物饲料丸粒的可掺入待成形为丸粒的混合物中的治疗剂或营养剂的非限制性实例：矿物添加剂，诸如磷、硫、镁、锌、铜、钴、钠、钾、氯、铁、钙、碘、钼、硒、镍和钒；维生素诸如维生素A、B、D和E；产生能量的食物，诸如葡萄糖、长链脂肪酸和挥发性脂肪酸；酵母；生长因子；酶(诸如本文公开的任何酶)；DFM(诸如本文公开的任何DFM)；肽，诸如特别是生长激素；以及食品辅料诸如碳酸氢钠、山梨醇、丙二醇、甜菜碱和丙酸钠。
可用于制造含有本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或片段的动物饲料丸粒并且可掺入待成形为丸粒的混合物中的治疗剂或营养剂的其他非限制性实例包括：必需氨基酸、其盐、其衍生物及其类似物，优选甲硫氨酸和赖氨酸；维生素；以及药用活性成分或组分，诸如抗生素。
在一些实施例中，甲硫氨酸用作用于制造含有本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或片段的动物饲料丸粒并且可掺入待成形为丸粒的混合物中的治疗剂或营养剂。甲硫氨酸可以是甲硫氨酸补充制剂，其包含至少一种另外的饲料原料，诸如L-甲硫氨酸。另外的实例是其中甲硫氨酸是DLM(即DL-甲硫氨酸)或HMTBA(即2-羟基-4-(甲硫基)丁酸)。甲硫氨酸可以呈L-甲硫氨酸的形式，诸如呈合成的甲硫氨酸源的形式。它可以是L-甲硫氨酸的所有其盐形式、其类似物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸或所有其盐形式)、衍生物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸异丙酯或任何其他酯)或其混合物。喂食所述甲硫氨酸的剂量和天数如上给出，并且对于所有实施例也适用于改善肉质。特别地，甲硫氨酸以屠宰前每天每kg体重0.1-1g的剂量使用，诸如0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或甚至1g总甲硫氨酸。在另一方面，甲硫氨酸以高于推荐日剂量0.3％-0.6％的剂量使用。
应当指出，工程化的植酸酶多肽及其片段中的任一种可用于谷物应用中，例如用于非食品/饲料应用(例如乙醇生产)中的谷物加工。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种工程化的植酸酶多肽或其包含植酸酶活性的片段，所述植酸酶多肽或其片段与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少82％的序列同一性。
2.如实施例1所述的工程化的植酸酶多肽或其片段，其中所述工程化的植酸酶多肽或其片段的氨基酸序列具有至少约1200的隐马尔科夫模型(HMM)评分，如表11中关于高Tm植酸酶进化枝多肽或其片段所示。
3.一种工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，所述工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置14-325具有至少78％的序列同一性。
4.一种工程化的植酸酶多肽或其片段(例如，如实施例1、2或3所述的那些)，使用如实例5中所述的标准进料制粒回收率测试，在95℃在MLA中应用30秒时，所述工程化的植酸酶多肽或其片段具有至少约50％的进料制粒回收率。
5.如实施例1或2所述的工程化的植酸酶多肽或其片段，其中使用如实例5中所述的标准进料制粒回收率测试，在95℃在MLA中应用30秒时，所述植酸酶多肽或其片段具有至少约50％的进料制粒回收率。
6.一种工程化的植酸酶多肽或其片段(例如，如实施例1、2、3、4或5所述的那些)，使用如实例5中所述的标准进料制粒测试，所述工程化的植酸酶多肽或其片段在95℃在MLA中应用30秒时与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率为至少约0.7。
7.如实施例1、2、3、4、5或6所述的工程化的植酸酶多肽或其片段，使用如实例5中所述的标准进料制粒测试，所述工程化的植酸酶多肽或其片段在95℃在MLA中应用30秒时与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率为至少约0.7。
8.如实施例1、2、3、4、5、6或7所述的工程化的植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段在使用实例3中所述的差示扫描量热分析测定条件下包含至少约92.5℃的Tm温度。
9.如实施例1、2、3、4、5、6、7、或8所述的工程化的植酸酶多肽或其片段，其中所述多肽或其片段在实例3中所述的测定条件下在pH3.5处包含至少约100U/mg的比活性。
10.一种动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，所述动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物包含如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的工程化的植酸酶多肽或其片段，其中所述工程化的植酸酶多肽或其片段可以(i)单独使用，或(ii)与包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物组合使用，或(iii)与至少一种其他酶一起使用，或(iv)与包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物以及至少一种其他酶组合使用，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一种、进一步包含至少一种其他饲料添加剂组分，以及任选地所述工程化的植酸酶多肽或其片段以至少约0.1g/吨饲料的量存在。
11.一种重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列可操作地连接到编码如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9所述的工程化的植酸酶多肽或其片段的核苷酸序列上。
12.如实施例11所述的重组构建体，其中所述生产宿主选自由以下组成的组：细菌、真菌、酵母、植物和藻类。
13.一种用于生产工程化的植酸酶多肽或其片段的方法，所述方法包括：
(a)用如实施例11所述的重组构建体转化生产宿主；以及
(b)在产生工程化的植酸酶多肽或其片段的条件下培养步骤(a)的生产宿主。
14.如实施例13所述的方法，其中从所述生产宿主中任选地回收所述工程化的植酸酶多肽或其片段。
15.一种含有植酸酶的培养物上清液，所述含有植酸酶的培养物上清液通过如实施例13或14所述的方法获得。
16.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的工程化的植酸酶多肽或其片段。
17.一种用于在动物饲料中使用的干燥的酶组合物，所述干燥的酶组合物包含如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的工程化的植酸酶多肽或其片段或其片段。
18.如实施例17所述的干燥的酶组合物，其中干燥的酶组合物是颗粒状饲料添加剂组合物。
19.一种用于在动物饲料中使用的液体酶组合物，所述液体酶组合物包含如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的工程化的植酸酶多肽或其片段。
20.一种用于改善动物饲料的营养价值的方法，其中将如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的工程化的植酸酶或其片段添加到动物饲料中。
21.一种用于在一个或多个指标方面改善动物性能的方法，所述方法包括向动物施用有效量的如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的工程化的植酸酶多肽或如实施例10或11所述的动物饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物。
实例
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],2D版,John Wiley and Sons,NewYork[约翰威利父子出版公司，纽约州](1994)，以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial,N.Y.[哈珀永久出版社，纽约州](1991)为技术人员提供了本公开中所用的许多术语的通用词典。
本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解的是，这些实例虽然指示了某些实施例，但仅以举例说明的方式给出。从以上讨论和实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的基本特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种改变和修改以适应各种用途和条件。
实例1
植酸酶分子的产生
使用本领域已知的分子生物学技术进行DNA操作以产生植酸酶基因。使用真菌表达宿主里氏木霉(Trichoderma reseei，T.reesei)的优选密码子合成对应于各种植酸酶编码序列的多核苷酸片段，并使用PCR技术将其随机重新组装。将来自里氏木霉(SEQ ID NO:63)的pep1天冬氨酸蛋白酶的、被pep1内含子人工中断的信号序列引入每个植酸酶基因序列的N-末端(5'末端)。根据供应商的建议，使用
Figure BDA0003908349840000711
BP重组技术将所述基因引入pDonor221载体(英杰公司(Invitrogen)，美国)。将所得的进入质粒与目的载体pTTTpyr2重组，得到最终的表达载体。除了pyrG基因被pyr2基因代替外，pTTTpyr2类似于之前描述的pTTTpyrG载体(PCT公布WO 2011/063308)。载体pTTTpyr2含有里氏木霉cbhI启动子和终止子区域、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS选择标记、里氏木霉pyr2选择标记和来自里氏木霉的端粒序列(用于复制)。这些质粒在大肠杆菌TOP10细胞(英杰公司(Invitrogen)，美国)中增殖，并纯化DNA并进行序列验证。
所有真菌操作(包括高通量转化、接种、发酵和收获)均在96孔微量滴定板(MTP)中进行。使用聚乙二醇(PEG)-原生质体方法将质粒转化到合适的里氏木霉宿主菌株中。简言之，用200μL 25％ PEG溶液处理总体积为50μL、含有约0.5-2μg DNA和5x106原生质体的转化混合物，然后用等体积的1.2M山梨糖醇/10mM Tris/10mM CaCl2(pH 7.5)溶液稀释。然后使原生质体在含有山梨糖醇的液体生长培养基中再生以维持渗透压。将100μl的转化混合物转移至96孔MTP(含有补充有山梨糖醇(0.30M–0.84M)的300μl基本培养基)中。使板在摇床孵育器中于28℃、80％湿度下生长3天，直到形成真菌菌丝体。如有必要，将20μL生长的培养物转移到含有10mM乙酰胺的新鲜基本培养基中以增强选择压力，并再生长2天。
为了表达植酸酶蛋白，按如下培养转化的里氏木霉菌株：在96孔MTP中将20μl液体培养物用于接种400μl生产培养基(9g/L酪蛋白氨基酸、10g/L(NH4)2SO4、4.5g/L KH2PO4、1g/L MgSO4*7H2O、1g/L CaCl2*2H2O、33g/L PIPPS缓冲液(pH 5.5)、0.25％里氏木霉微量元素(100％：175g/L柠檬酸(无水)、200g/L FeSO4*7H2O、16g/L ZnSO4*7H2O、3.2g/L CuSO4*5H2O、1.4g/L MnSO4*H2O、0.8g/L H3BO3)。在如上所述的相同生长条件下，将MTP在摇床孵育器中孵育。发酵5天后，通过使用亲水性PVDF膜离心来过滤培养物，以获得澄清的上清液用于分析重组植酸酶。
实例2
植酸酶的制备与表征
蛋白质纯化和标准化
如上所述培养编码重组植酸酶的里氏木霉菌株，并使用澄清的上清液纯化植酸酶。将过滤的培养物上清液用洗涤缓冲液(25mM乙酸钠，pH 5.5)稀释5倍，并加载到MTP滤板(密理博公司(Millipore)Multiscreen Solvinert深孔滤板96孔MTP，0.45uM亲水性膜，#MDRLN0410)中的用纯化水平衡的阳离子交换树脂(来自美国拜沃股份有限公司(Bio-Works)的WorkBeads 40S)上。将MTP放置在离心机中，在1分钟的离心(100x g)期间丢弃流出物。在1分钟的离心(100x g)期间，使用洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，0.5M NaCl，pH 5.5)洗脱植酸酶蛋白样品。在96孔UV MTP(柯仕达(Costar)，3635)中，用乙酸钠缓冲液(25mM乙酸钠，0.5M NaCl，pH 5.5)将蛋白质纯化步骤中的样品稀释5倍至最终体积为100μl。在280nm处测量样品的吸光度，并根据植酸酶蛋白的标准曲线计算蛋白质浓度，并且已知浓度范围为0-1750ppm。基于确定的蛋白质浓度，将来自纯化的所有样品在96孔MTP中在缓冲液(100mM乙酸钠，0.5M NaCl pH 5.5)中稀释至150ppm的目标值，并储存在5℃，直至用于下文所述的测定中。
通过反相HPLC(RP-HPLC)确定每个样品中的植酸酶蛋白浓度。将标准化的样品加载到安捷伦1260HPLC上的安捷伦(Agilent)Zorbax300柱(SB-C3 2.1x 50mm)上。根据表2应用溶剂A(在水中的0.1v/v％TFA)和溶剂B(在乙腈中的0.07％ TFA)的梯度。样品注射体积为10μl，柱温为60℃，并且流速为1mL/min。在220nm处测量洗脱液的吸光度，并使用ChemStation软件(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))进行整合。根据植酸酶蛋白的标准曲线确定植酸酶样品的蛋白质浓度，并且已知浓度范围为0-350ppm。
Figure BDA0003908349840000731
如下进行样品(植酸酶PHY-11895、PHY-11932和PHY-12663，以及商业产品QuantumBlue 5G和Natuphos E 10000G的提取物(实例5中所述的提取方法))的纯化。将样品在PD10柱(用缓冲液(10-30mM乙酸钠，pH 5.5)预平衡)上进行缓冲液交换，随后使用疏水相互作用色谱HIC纯化。根据样品，使用以下HIC柱之一(苯基HP XK26或HiTrap苯基HP或苯基15，HR5/5)。将HIC柱在加载缓冲液(20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，含有1.0-1.3M硫酸铵)中进行预平衡。使用在pH 5.5的10mM乙酸钠中的硫酸铵的线性梯度来洗脱结合的植酸酶蛋白。使用Sephadex G25 M、XK50/35或PD10柱(用缓冲液(10-30mM乙酸钠，pH 5.5)预平衡)对从HIC柱收集的级分进行缓冲液交换。据估计，所有纯化的植酸酶样品(植酸酶PHY-11895、PHY-11932和PHY-12663以及商业产品Quantum Blue 5G和Natuphos E 10000G的提取物)的最终纯度均超过95％。通过分光光度法测量280nm处的吸光度并使用计算的消光系数来确定最终纯化的样品中的蛋白质浓度。对于所述两种商业产品(Quantum Blue 5G和Natuphos E10000G)，使用了两个紧密相关的公共植酸酶序列(SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:60)的计算的消光系数。使用
Figure BDA0003908349840000741
软件10.2.4版本计算摩尔消光系数。
实例3
植酸酶的体外测定
以下测定用于测量高Tm-植酸酶进化枝多肽及其片段以及可商购的植酸酶的各种特性。
参考植酸酶活性(FTU)
通过参考植酸酶活性方法(FTU)测定植酸酶样品的活性。使用以下改良的ISO30024程序：“Animal feeding stuffs-Determination of phytase activity”[动物饲料—植酸酶活性的测定]：为了分析做准备，将液体植酸酶样品在测定缓冲液(250mM乙酸钠，1mM CaCl2和0.01％Tween-20，pH 5.5)中稀释，以在随后的FTU植酸酶测定中获得在磷酸盐标准曲线的线性范围内的测量。对于固体样品，称取1.0g样品并在100mL测定缓冲液中通过在磁力搅拌器上混合20分钟而萃取。过滤(玻璃纤维过滤器，GA-55，研华公司(Advantec))后收集上清液并进一步稀释至约0.04FTU/mL。按照以下程序进行样品的分析：将1mL稀释的植酸酶样品与2mL的7.5mM IP6底物溶液(来自稻的植酸钠，上海AZ进出口公司(Shanghai AZ Import and Export)，浙江东方植酸有限公司(Zhejiang Orient PhyticAcid Co.Ltd)#Z0201301181)在测定缓冲液中混合，并在水浴中在37℃孵育60min。用2mL酸性钼酸盐/钒酸盐试剂终止反应，在415nm处用分光光度法对无机磷酸盐的含量进行定量。通过从植酸酶样品的吸光度中减去缓冲液空白的吸光度来校正结果。从干燥的磷酸氢钾中生成磷酸盐的标准曲线，并用于计算每个样品释放的磷酸盐量。一个FTU定义为每分钟产生1微摩尔磷酸盐的植酸酶的量。
在pH 3.5或5.5处对IP6底物的比活性
使用IP6底物溶液(来自稻的植酸钠，上海AZ进出口公司(Shanghai AZ Importand Export)，浙江东方植酸有限公司(Zhejiang Orient Phytic Acid Co.Ltd)#Z0201301181)测定植酸酶的植酸酶活性。为了在pH 5.5处进行评估，在分析前使用384MTP中的100mM乙酸钠缓冲液、0.025％Tween-20和0.05mM CaCl2(pH 5.5)将浓度为150ppm的植酸酶样品连续稀释至最终浓度为0.18ppm。向384MTP的每个孔中添加在100mM乙酸钠、0.025％ Tween 20和0.05mM CaCl2(pH 5.5)中的47μL的IP6底物(0.20mM)，并添加3μL稀释的植酸酶样品至最终体积为50μL。
为了评估pH 3.5处的活性，在分析前将浓度为150ppm的植酸酶样品连续稀释至在384MTP中的100mM乙酸钠缓冲液、0.025％ Tween-20和0.05mM CaCl2(pH 5.5)中最终浓度为0.11ppm。向384MTP的每个孔中添加在100mM甘氨酸、0.025％ Tween-20和0.05mM CaCl2(pH3.3)中的47μL的IP6底物(0.20mM)，并添加3μL稀释的植酸酶样品至最终体积为50μL。
在具有连续搅拌(1400rpm)的iEMS摇床(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))中，将MPT反应板在25℃孵育10分钟，并通过添加45μL的Pi Blue终止试剂(PiBlueTM磷酸盐测定试剂盒，POPB-DP，生物测定系统公司(BioAsay Systems)，美国)终止反应。将板混合并密封，然后在iEMS摇床(650rpm)中于25℃孵育30分钟以显色。孵育后，通过在酶标仪(Spectramax，分子仪器公司(Molecular Device))上测量620nm处的吸光度来确定颜色形成。基于植酸酶蛋白的拟合标准曲线计算每个植酸酶样品对IP6底物的活性，并且已知浓度和活性的范围为0-350ppm，取三个重复的平均值。随后，使用pH 3.5或5.5处的活性除以通过RP-HPLC确定的样品中植酸酶的蛋白质浓度(如实例2中所述)，计算出每种植酸酶样品中以微摩尔磷酸盐/mg/min计的比活性。
对于表3B和表21中所述的植酸酶变体，按此处所述进行样品制备和活性分析。在缓冲液(100mM乙酸钠，0.5M NaCl pH 5.5)中将纯化的蛋白(实例2)的等分试样稀释至100ppm的目标浓度，然后使用100mM乙酸钠缓冲液、0.025％ Tween-20和0.05mM CaCl2(pH5.5)进行连续稀释至0.1ppm的最终浓度。随后如实例3中所述的确定pH 5.5和3.5处的活性，除了用96孔MTP代替384孔MTP(将在100mM乙酸钠、0.025％ Tween 20和0.05mM CaCl2(pH 5.5)中的70μL的IP6底物(0.20mM)与10μL等分的稀释的酶反应；使用170μL的Pi Blue试剂终止反应)。
通过DSC确定熔融温度(Tm)
使用MicroCalTMVP-毛细管DSC系统(通用电气医疗公司(GE Healthcare))进行差示扫描量热法(DSC)测量。DSC是表征蛋白质和其他生物分子的稳定性的强大分析工具。它测量溶液中热诱导结构转变的焓(ΔH)和温度(Tm)。制备了在100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中稀释至最终浓度为0.4mg/mL的植酸酶蛋白样品。将400μL这些蛋白样品以及含有相同量的无蛋白缓冲液的参考样品添加到96孔板中。将板置于温度受控的保持在10℃的自动进样器隔室中。以每分钟2℃的扫描速率从20℃到120℃扫描蛋白质样品和参考。将熔融温度(Tm)确定为从折叠状态到未折叠状态的转变的最大峰处的温度。Tm的最大变化为±0.2℃。ORIGIN软件包(微量热公司(MicroCal)，通用电气医疗公司(GE Healthcare))用于基线减法和Tm值的计算。
实例4
植酸酶的比活性和热稳定性评估
使用实例3中所述的方法，评估使用实例1和实例2中所述的方法产生的高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段的样品在pH 3.5和5.5处的植酸酶比活性和热稳定性。研究中包括商业植酸酶产品Quantum
Figure BDA0003908349840000761
(AB Vista公司)和
Figure BDA0003908349840000772
10000E(巴斯夫营养公司(BASF Nutrition))。选择这两种产品是因为它们是可商购的最固有的热稳定产品。表3A和3B提供了在pH 3.5和pH 5.5处以微摩尔磷酸盐/mg/min计的比活性的结果，以及通过DSC测量的以℃计的热稳定性(Tm)，其中ND表示值未确定。结果表明，所有高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段均显示出远高于商业产品的Tm值。这些高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段在pH 5.5处显示出与商业产品的比活性相当或比其更高的比活性。在pH 3.5处，高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段的比活性均高于商业产品。在制粒条件下，尤其是在MLA中或以固体制剂应用时，较高的热稳定性是非常有益的。在单胃动物消化道中存在的酸性条件下，在酸性pH下较高的比活性可能是非常有益的。
Figure BDA0003908349840000771
Figure BDA0003908349840000781
ND表示值未确定
Figure BDA0003908349840000791
Figure BDA0003908349840000801
进行了高分辨率质谱(MS)以确认高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段的氨基酸序列：PHY-13594、PHY-11895、PHY-12663、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885、PHY-13936、PHY-14004、PHY-14256和PHY-14277(SEQ ID NO:1、8、11、17、22、26、27、28、30、31)。MS分析确认了SEQ ID NO:1、8、11、17、22、26、27、28、30、31的预测的C-末端。此外，MS分析显示SEQ IDNO:1、8、11、17、22、26、27、28、30、31的N-末端的截短。最常观察到的N-末端氨基酸对应于相对于预测的成熟序列的位置4，但在位置2、3、5、6、7、9、10处也观察到了截短。
实例5
植酸酶的制粒稳定性研究
高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段的进料制粒回收率测试是在技术学院(Technological Institute)(南斯滕纳鲁普(Sdr.Stenderup)，丹麦)制粒设备中进行的。应注意，进料制粒回收率取决于若干因素，包括：具体的饲料基质、调节和制粒条件、用于测定活性的测定法等。
测量了植酸酶PHY-11895、PHY-11932、PHY-12663、PHY-13594、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885、PHY-13936、PHY-14256、PHY-14277以及参考商业酶
Figure BDA0003908349840000802
Blue 5G(AB Vista)和
Figure BDA0003908349840000803
E10000G(巴斯夫营养公司(BASF Nutrition))的进料制粒回收率。通过使用100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)从粉末产品Quantum Blue 5G和Natuphos E10000G中提取植酸酶来获得参考商业植酸酶样品的液体样品。使用实例3中所述的参考植酸酶活性测定法(FTU)测量液体植酸酶样品的活性，并相应地给予至饲料中。根据以下程序，将PHY-11895、PHY-11932、PHY-12663、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885的液体样品应用到全谷物小麦载剂上，制成用于制粒稳定性研究的固体样品。将磨碎的全谷物小麦被转移到装有锯齿状刀片的切割搅拌器(coupe mixer)中。在混合的同时，将液体植酸酶样品(最多40％vol/w)添加到磨碎的全谷物小麦粉中。将液体植酸酶样品和磨碎的全谷物小麦粉的混合物放在托盘上，并在烘箱中于40℃干燥8-10小时。干燥后，使用Bühler研磨机(型号MLT 204)研磨固体植酸酶产品，并将辊隙设置为0。将参考商业产品样品Quantum Blue5G以固体(原样)给予至饲料中进行比较。使用参考植酸酶活性测定(FTU)进行了固体植酸酶产物的分析，并将产物相应地给予至饲料中。
饲料组合物是玉米/大豆饮食，其包含：62.5％的玉米、31％的大豆粉、4.4％的大豆油、1.2％的石灰石、0.5％的VIT/MIN(Farmix Leghennen预混物)和0.4％氯化钠。饲料的水分含量为约12％-14％(w/w)。在水平带式搅拌器中，在室温(22℃-24℃)下，将120kg至200kg之间的上述预混合的饲料与液体(MLA)或固体植酸酶样品混合10分钟，以达到饲料中最终植酸酶浓度为5FTU/g。添加到饲料中的液体植酸酶样品的量在0.2％至0.5％(w/w)之间。
混合后，将含有植酸酶的饲料样品在KAHL级联搅拌器中在60℃、80℃、85℃、90℃或95℃调节30秒，然后压成丸粒。如本文所用的，术语“调节”意指混合饲料/酶混合物并用蒸汽处理以达到60℃、80℃、85℃、90℃或95℃的目标温度持续30秒保持时间。通过调节3个蒸汽阀来手动控制调节温度，将2atm压力下的蒸汽从所述蒸汽阀导入饲料/酶混合物中。在调节器的出口处将温度维持在目标温度+/-0.3℃。这种蒸汽调节通常在60-95℃的调节温度下使饲料的水含量增加2-5.5重量％。在调节步骤后，立即将饲料/酶混合物在装配有
Figure BDA0003908349840000811
模具和7.5kW马达的Simon Heesen压丸机中形成丸粒。调节进料螺杆速度以达到约300kg/小时的生产率，并且将辊速度设定为500rpm。所述系统可以在达到目标调节温度以预热制粒模具后运行约8分钟。随后收集5-7.5kg的压成丸粒的饲料样品，并立即在具有多孔底的冷却箱中冷却，伴随1500m3空气/h的环境空气流15分钟。在冷却期间，丸粒的水含量下降到与蒸汽调节之前含有植酸酶的饲料混合物(醪液饲料)相当的水平。根据ISO_6497_2002，使用分样器缩小样品的尺寸，并按如下来确定植酸酶的回收率。
使用Retch实验室研磨机(装有0.75mm筛的ZM 200型)研磨含有植酸酶的饲料样品(醪液饲料和丸粒两者)，然后使用以下方法对植酸酶活性进行分析，所述方法是对ISO30024程序：“Animal feeding stuffs-Determination of phytase activity”[动物饲料—植酸酶活性的测定]的改良。
为了从饲料样品中提取植酸酶，将20.0g(+/-0.05g)的研磨的醪液和压成丸粒的饲料与100mL提取缓冲液(250mM乙酸钠，1mM CaCl2、0.01％ Tween-20，pH 5.5)在旋转搅拌器上在室温混合20分钟。过滤后收集上清液(玻璃纤维过滤器，购自研华公司(Advantec)的GA-55)。将上清液在提取缓冲液中进一步稀释，以在以下FTU植酸酶测定(0.04FTU/mL)中获得在磷酸盐标准曲线的线性范围内的测量。
将1mL稀释的植酸酶稀释样品与2mL的7.5mM IP6(来自稻的植酸钠，上海AZ进出口公司(Shanghai AZ Import and Export)，浙江东方植酸有限公司(Zhejiang OrientPhytic Acid Co.Ltd)#Z0201301181)底物溶液在提取缓冲液中混合，并在水浴中在37℃孵育60min。用2mL酸性钼酸盐/钒酸盐试剂终止反应，在415nm处用分光光度法对无机磷酸盐的释放进行定量。通过减去相应时间为零的样品(在37℃未孵育60min的样品)的吸光度来校正结果。从干燥的磷酸氢钾中生成磷酸盐的标准曲线，并用于计算每个样品释放的磷酸盐量。一个单位(FTU)定义为每分钟产生1微摩尔磷酸盐的植酸酶的量。使用下式计算进料制粒回收率百分比：(丸粒的植酸酶活性(FTU/g)除以醪液饲料的植酸酶活性(FTU/g))*100。
表4列出了在表3中示出的在温度60℃、80℃、85℃、90℃和95℃应用于MLA的植酸酶的进料制粒回收率百分比。对于应用于MLA中的所有测试的高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段，在95℃的制粒回收率为至少50％。为了进行比较，提取的商业参考植酸酶QuantumBlue和Natuphos E 10000在相同条件下的进料回收率低得多，分别为15％和25％。这些数据说明了高Tm-植酸酶进化枝多肽及其片段的高稳健性。
在60℃，对于测试的所有高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段，当应用于MLA中时的进料制粒回收率在71％至85％之间。起初似乎是矛盾的，即当60℃调节温度比稳健的植酸酶的Tm低多于30℃时，本文公开的稳健的植酸酶在60℃调节并随后压成丸粒时损失15％至29％的活性。这表明，最初的损失与调节器中的热失活无关，这进一步得到以下事实的确证：当温度升高到80℃时，仅存在有限的额外损失。不受理论的束缚，据信并且对于其他酶(植酸酶和木聚糖酶；试验报告875：丹麦农业与食品委员会(Danish Agriculture&FoodCouncil)，专利申请WO 2014120638和Novus Insight，第3期，2015)已经描述，可能存在难以在调节和制粒后从饲料提取/回收的一部分植酸酶和木聚糖酶。但是，据信(再次不受理论的束缚)，这种不可回收级分中至少有一部分仍在动物中具有生物活性—换句话说，所述不可回收级分可能不会由于热胁迫而被不可逆地灭活。相反，据信(再次不受理论的束缚)不可回收的级分以不能在体外提取的方式结合在饲料中。替代性地，据信(再次不受理论的束缚)，实际上即使提取了所有植酸酶蛋白，但是由于调节和制粒，当在体外测定中测量时植酸酶的活性明显降低。不受理论的束缚，据信与干燥和/或涂覆形式相比在MLA中应用植酸酶将增加植酸酶的这种不可回收的但具有生物活性形式的量，这是由于与饲料的直接物理相互作用。
因此，评估MLA中所应用的植酸酶的热稳健性的合适方式不是比较调节和制粒之前和之后饲料中的可回收活性，而是比较在低(例如80℃)和高(95℃)的调节温度下进行调节和制粒后植酸酶活性的回收率，所述调节温度是在商业相关的调节温度范围内。
Figure BDA0003908349840000841
ND表示值未确定
表5显示了在95℃在MLA中应用30秒时与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率。对于在MLA中应用的高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段，在95℃与在80℃在MLA中应用30秒相比的进料制粒回收率的比率在0.72至0.98之间。提取的商业参考植酸酶Natuphos E 10000的相应数值是0.32。数据表明，本文公开的高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段对商业相关温度范围内的调节温度变化具有高度稳健性。
Figure BDA0003908349840000842
Figure BDA0003908349840000851
*比率结果以95℃过程与85℃过程(而不是80℃)相比给出。
ND表示值未确定
表6显示了当以固体应用时，植酸酶PHY-11895、PHY-11932、PHY-12663、PHY-13637、PHY-13789、PHY-13885和Quantum Blue 5G在95℃的进料制粒回收率。当以固体应用到磨碎的全谷物小麦载剂上时，所有高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段在95℃的进料制粒回收率至少为64％。在相同条件下测试时，商业粉末产品Quantum Blue 5G的回收率为58％。
Figure BDA0003908349840000852
Figure BDA0003908349840000861
实例6
植酸酶的体内评估
PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895的性能评估
在肉鸡中评估植酸酶PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895的体内性能。所述研究在德克萨斯农工大学(Texas A&M universit)进行。测试了八种膳食处理：配制为能满足肉鸡营养需求的阳性对照饮食(PC)、配制缺乏可消化磷(比PC低0.16％点)和钙(比PC低0.19％点)的阴性对照(NC)、以及补充有PHY-12663、PHY-11932或PHY-11895植酸酶(剂量为500和1000FTU/kg)的NC。表7提供了本研究中使用的计算和分析的营养值的膳食组合物。
Figure BDA0003908349840000862
Figure BDA0003908349840000871
Figure BDA0003908349840000881
将磨碎的稻壳被用作植酸酶载剂。
为一天大的Cobb 500雄性肉鸡分配膳食处理中，每个包含10个重复的栏，每栏30只小鸡。饮食以醪液形式的玉米、大豆粉和米糠为基础。在第21天，每个重复的栏取五只鸡，并收集胫骨以确定无脂肪的胫骨灰分。根据3阶段饲喂程序(前期(starter)第0-10天、中期(grower)第11-21天和后期(finisher)第22-42天)配制饮食。在42天的研究中饮食和水可随意摄取。
使用ANOVA分析数据，使用Tukey HSD测试分离处理平均值，P<0.05被认为是显著的。计算了以下性能参数：0-42天研究期中的ADG(日平均增重)、ADFI(日平均采食量)和FCR(饲料转化率)。表8显示了在0-42日龄期间饲喂补充了不同剂量的不同植酸酶的饮食的肉鸡的生长性能结果和在21日龄测量的胫骨灰分。与PC相比，NC饮食中磷(P)和钙(Ca)的减少与ADG、ADFI和胫骨灰分含量较低以及FCR较高相关。与NC饮食相比，所有测试的植酸酶PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895改善了肉鸡的ADG、ADFI、胫骨灰分和FCR。平均而言，与NC饮食相比，当剂量为500和1000FTU/kg的饲料时，用PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895植酸酶处理使ADG分别改善12％和14％，ADFI分别改善8％和10％，FCR分别改善3.3％和3.7％，胫骨灰分分别改善9％和9.7％。此外，在所有参数上，所有植酸酶与饲喂PC饮食的那些相比有更好表现或无显著不同的表现。这些数据表明，高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段(PHY-12663、PHY-11932和PHY-11895)能够显著改善肉鸡骨骼生长和性能。
Figure BDA0003908349840000882
Figure BDA0003908349840000891
a、b、c：列中的不同上标表示显著差异，P<0.05
FCR是已校正的死亡率
PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的性能评估。
在AH药物公司(AH Pharma)(希伯伦，马里兰州，美国)的肉鸡中评估了PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的体内性能。测试了十种处理，包括配制为能满足肉鸡营养需求的阳性对照饮食(PC)、以及阴性对照饮食(NC)。配制NC饮食，其中缺乏可消化的磷(不含无机磷酸盐，比PC低0.24％点)、钙(比PC低0.19％点)、可消化AA(对于Lys、Met+Cys、Thr分别比PC低0.04％、0.03％和0.03％)和ME(比PC低69kcal/kg)。
在NC饮食中以500或1000FTU/kg饲料的两种剂量分别测试了PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的性能。雄性肉鸡(Ross 308)从0至5日龄饲喂相同的前期前(pre-starter)饮食，并在6至15日龄期间接受测试饮食。将膳食处理随机分配为九个笼/处理，每个笼中有8只鸡。饮食以玉蜀黍、小麦、大豆粉、菜籽粉和米糠为基础(饮食成分示于表9)。
Figure BDA0003908349840000901
Figure BDA0003908349840000911
ND意指值未确定
*ME：代谢能
在第6和15天记录体重和采食量。在最后4天期间，每天收集排泄物，称重并将一个笼中的排泄物合并。根据AOAC官方方法965.17，将每个笼的合并的排泄物用于磷(P)保留量的测量。在第15天，收集每笼六只鸡的右胫骨，并将其用于胫骨灰分的测量。
使用ANOVA分析数据，使用Tukey HSD测试分离处理平均值。P<0.05被认为是统计学上的显著差异。表10显示了对PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885的性能的影响。在15日龄时测量胫骨灰分，并在11-15日龄的肉鸡中测量磷保留量。与NC相比，所有测试的植酸酶PHY-13789、PHY-13637、PHY-14004和PHY-13885改善了肉鸡的ADG、ADFI、胫骨灰分和磷保留量。
Figure BDA0003908349840000912
Figure BDA0003908349840000921
a、b、c等：列中的不同上标表示显著差异，P<0.05
当剂量为500和1000FTU/kg时，与NC相比，植酸酶PHY-13789使ADG分别改善5.4％和8.4％，FCR分别改善3.4％和5.1％，胫骨灰分分别改善4.6％和8.8％，磷保留量分别改善15.3％和35.4％。当剂量为500和1000FTU/kg时，与NC相比，植酸酶PHY-13637使ADG分别改善6.1％和8.6％，FCR分别改善3.8％和5.7％，胫骨灰分分别改善6.3％和9.6％，磷保留量分别改善17.7％和35.8％。当剂量为500和1000FTU/kg时，与NC相比，植酸酶PHY-14004使ADG分别改善4.5％和7.5％，FCR分别改善3.3％和5％，胫骨灰分分别改善6.5％和10.1％，磷保留量分别改善19.3％和36.4％。当剂量为500和1000FTU/kg时，与NC相比，植酸酶PHY-13885使ADG分别改善5.6％和7.8％，FCR分别改善3.6％和5.4％，胫骨灰分分别改善5.5％和9.8％，磷保留量分别改善17.7％和36.9％。平均而言，与NC相比，高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段使ADG分别改善5.4％和8.1％，使FCR分别改善3.5％和5.3％，使胫骨灰分分别改善5.7％和9.6％，并且使磷保留量分别改善17.5％和36.1％。尽管该试验中NC的营养素大量减少(无机磷的总去除和Ca、可消化AA和ME的减少)，但在所有剂量下测试的所有植酸酶在ADG、ADFI和FCR上的表现均与PC无显著差异。除了500FTU/kg的PHY-13789和PHY-13885外，所有植酸酶均具有与PC相似的胫骨灰分含量。与PC相比，在所有植酸酶处理中磷保留量(以P摄入的百分比计)均得到改善。胫骨灰分和磷保留量结果确认这些植酸酶可有效释放磷。
两项试验的结果表明，测试的所有高Tm植酸酶进化枝多肽及其片段都在动物性能方面提供了很大的改善。
实例7
植酸酶的新颖进化枝的鉴定
将实例3中所示的高Tm-植酸酶进化枝多肽的多肽序列及其片段用于产生隐马尔可夫模型(HMM)以鉴定序列相似性。将MUSCLE版本3.8.31(MUSCLE:multiple sequencealignment with high accuracy and high throughput.[MUSCLE：高精度和高通量多序列比对]R.C Edgar(20014)Nucleic Acid Res[核酸研究]32:1792)使用默认参数用于序列比对。随后，将HMM构建器软件(builder software)HMMER版本3.1b1(可从http://hmmer.org/获得)用于从多重序列比对中生成HMM。仅使用了两个参数：先验概率(Priors)＝无，以及权重＝无。使用如下命令：/usr/bin/hmmbuild--pnone--wnone Variants_for_filing_draft_5.hmm Variants_for_filing_draft_5.fsa，其中wnone＝没有相对权重(所有序列都分配有统一的权重)，而pnone＝不使用任何先验概率，并且参数是频率。所有概率参数都存储为负自然对数概率，其精度在小数点右边五位四舍五入。例如，将概率存储为0:25log0:25＝1:38629。将零概率的特殊情况存储为*符号。图1(栏A至1BB)显示了高Tm植酸酶进化枝植酸酶的多肽序列的每个位置的HMM概率评分。HMM的综合评分(COMP)以粗体显示在图1A的顶部3栏。每个氨基酸的位置(P)和共有序列(C)在P/C下的第1列中显示。共有序列高Tm植酸酶进化枝植酸酶多肽序列由图1所示的HMM产生，并列为SEQ ID NO:64。
然后，将HMM用于为约7000个独特的植酸酶的全局集合生成HMM序列评分，其中包括公共数据库和专利中可获得的植酸酶序列。比较了各种序列的等级和序列评分与热稳定性的相关性(Tunfold，以及通过DSC测量的Tm)(数据未显示)。基于此分析，新颖的高Tm植酸酶进化枝多肽均具有大于1200的HMM序列评分，如表11中关于表3A和3B列出的植酸酶所示。
Figure BDA0003908349840000941
Figure BDA0003908349840000951
Figure BDA0003908349840000961
表11中列出的高Tm植酸酶进化枝酶：[PHY-13594(SEQ ID NO:1)；PHY-10931(SEQID NO:2)；PHY-10957(SEQ ID NO:3)；PHY-11569(SEQ ID NO:4)；PHY-11658(SEQ ID NO:5)；PHY-11673(SEQ ID NO:6)；PHY-11680(SEQ ID NO:7)；PHY-11895(SEQ ID NO:8)；PHY-11932(SEQ ID NO:9)；PHY-12058(SEQ ID NO:10)；PHY-12663(SEQ ID NO:11)；PHY-12784(SEQ ID NO:12)；PHY-13177(SEQ ID NO:13)；PHY-13371(SEQ ID NO:14)；PHY-13460(SEQID NO:15)；PHY-13513(SEQ ID NO:16)；PHY-13637(SEQ ID NO:17)；PHY-13705(SEQ IDNO:18)；PHY-13713(SEQ ID NO:19)；PHY-13747(SEQ ID NO:20)；PHY-13779(SEQ ID NO:21)；PHY-13789(SEQ ID NO:22)；PHY-13798(SEQ ID NO:23)；PHY-13868(SEQ ID NO:24)；PHY-13883(SEQ ID NO:25)；PHY-13885(SEQ ID NO:26)；PHY-13936(SEQ ID NO:27)；PHY-14004(SEQ ID NO:28)；PHY-14215(SEQ ID NO:29)；PHY-14256(SEQ ID NO:30)；PHY-14277(SEQ ID NO:31)；PHY-14473(SEQ ID NO:32)；PHY-14614(SEQ ID NO:33)；PHY-14804(SEQID NO:34)；PHY-14945(SEQ ID NO:35)；PHY-15459(SEQ ID NO:36)；PHY-16513(SEQ IDNO:37)]；PHY-16812(SEQ ID NO:64)；PHY-17403(SEQ ID NO:65)；PHY-17336(SEQ ID NO:66)；PHY-17225(SEQ ID NO:67)；PHY-17186(SEQ ID NO:68)；PHY-17195(SEQ ID NO:69)；PHY-17124(SEQ ID NO:70)；PHY-17189(SEQ ID NO:71)；PHY-17218(SEQ ID NO:72)；PHY-17219(SEQ ID NO:73)；PHY-17204(SEQ ID NO:74)；PHY-17215(SEQ ID NO:75)；PHY-17201(SEQ ID NO:76)；PHY-17205(SEQ ID NO:77)；PHY-17224(SEQ ID NO:78)；PHY-17200(SEQID NO:79)；PHY-17198(SEQ ID NO:80)；PHY-17199(SEQ ID NO:81)；PHY-17214(SEQ IDNO:82)；PHY-17197(SEQ ID NO:83)；PHY-17228(SEQ ID NO:84)；PHY-17229(SEQ ID NO:85)；PHY-17152(SEQ ID NO:86)；和PHY-17206(SEQ ID NO:87)与公共公开的微生物植酸酶：[诺氏布丘氏菌WP 064555343.1(SEQ ID NO:38)；布氏柠檬酸杆菌AAS45884.1(SEQ IDNO:39)；柯克斯体科细菌RDH40465.1(SEQ ID NO:40)；肠杆菌科WP 094337278.1(SEQ IDNO:41)；大肠杆菌WP001297112(SEQ ID NO:42)；蜂房哈夫尼菌WP 072307456.1(SEQ IDNO:43)；Rouxiella badensis WP 084912871.1(SEQ ID NO:44)；沙雷氏菌属物种WP009636981.1(SEQ ID NO:45)；阿氏耶尔森氏菌WP004701026.1(SEQ ID NO:46)；弗氏耶尔森氏菌WP 050140790.1(SEQ ID NO:47)；克氏耶尔森氏菌WP 004392102.1(SEQ ID NO:48)；莫氏耶尔森氏菌WP 049646723.1(SEQ ID NO:49)；罗氏耶尔森氏菌WP050539947.1(SEQ ID NO:50)；EP3222714-0003APPM植酸酶(SEQ ID NO:51)；US8101391-0002(SEQ IDNO:52)；US8101391-0004(SEQ ID NO:53)；US8101391-0035(SEQ ID NO:54)；US8101391-0049(SEQ ID NO:55)；US8143046-0001(SEQ ID NO:56)；US8143046-0003(SEQ ID NO:57)；US8460656-0002(SEQ ID NO:58)；US8557555-0013(SEQ ID NO:59)；US8557555-0024(SEQID NO:60)；US20160083700-0003(SEQ ID NO:61)；WO 2010034835-0002(SEQ ID NO:62)]的预测的成熟序列的多重序列比对是在
Figure BDA0003908349840000982
版本10.2.4中使用MAFFT比对进行。基于此MAFFT序列比对，使用
Figure BDA0003908349840000983
版本10.2.4中的Geneious Tree Builder生成了显示序列关系的系统发生树，其如图2所示。
实例8
鸡中植酸酶的体内评估
本实施例评估了与营养充足、未补充植酸酶的饮食相比，当被添加到Ca和P降低的基础饮食中时，基因工程化的里氏木霉的菌株产生的代表性生物合成细菌6-植酸酶对肉鸡胫骨灰分和P的回肠消化率(AID P)的效用。此外，还观察了采食量、生长性能和饲料转化率。
材料和方法
实验和对照饮食：配制了基于玉米和大豆粉的阳性对照(PC)饮食，以满足在前期(第1–21天)和后期(第22至42天)阶段期间鸡的营养要求(P和Ca充足)[National ResearchCouncil[国家研究理事会]，Nutrient Requirements of Poultry[家禽的营养需求]第9版修订版，Natl Acad Press,[国家科学院出版社]华盛顿特区[DC]；1994]。配制阴性对照(NC)饮食，其中钙(Ca)和可用磷(P)在前期阶段分别降低2.0g/kg和1.9g/kg，并且在后期阶段饮食中分别降低2.0g/kg和1.8g/kg。参见表12。所有前期饮食中都含有二氧化钛(添加量为4g/kg)作为难消化的标记。阴性对照饮食作为独立的饮食进行测试，或补充有250、500或1000FTU/kg的由里氏木霉基因工程化的菌株产生的生物合成细菌6-植酸酶。饮食以醪液形式可供鸡随意摄取。
Figure BDA0003908349840000981
Figure BDA0003908349840000991
Figure BDA0003908349840001001
鸡、鸡舍和实验设计：孵化当天，从商业孵化场获得了混合性别的Cobb 500肉仔鸡(雄性50％，雌性50％)，所述肉仔鸡已在孵化场通过饮用水接种了针对传染性支气管炎和新城疫的疫苗。第11-14天也通过饮用水施用了针对传染性法氏囊病的疫苗。基于初始体重(BW)将鸡分配到落地栏中，使每栏含有大约相等体重的鸡。总共1176只鸡被分配到49个栏中，每栏24只鸡；NC是9栏，并且其他所有处理是10栏，每栏含有50％雄性和50％雌性，采用完全随机化设计。栏位于环境受控的肉鸡舍中，光照方案为LD 18:6，初始温度为35℃，在第28天降至24℃。
采样和测量：分析了所有饮食的代表性子样品的干物质(DM)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(CF)、灰分、P、钾(K)、镁(Mg)、钙、钠(Na)、植酸盐和植酸酶。
在第1、21和42天以栏为基础测量体重和采食量(FI)，并用于计算BW、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和死亡率校正的饲料转化率(FCR)。每天检查并记录死亡率。
在第21天和第42天，每栏分别随机选择4只鸡(2只雄性，2只雌性，在采样点确定性别)和6只鸡(3只雄性和3只雌性)，用CO2气体处死并收集它们左胫骨并合并(根据栏)以测定脱脂的胫骨灰分。在第21天从安乐死的鸡中收集回肠消化物，按每栏进行合并，并在Labconco FreeZone 12+脱水机(Labconco，堪萨斯城，密苏里州)上冷冻。对干燥的饲料和消化物样品中P和Ca含量进行了分析，以便使用二氧化钛作为惰性标记来计算营养素消化率。
化学分析：针对所有分析，将样品以一式两份进行分析。根据以下方法分析饲料和回肠食糜中的营养物：粗蛋白，NEN-EN-ISO 16634[NEN-ISO 6492,en.Animal feedstuffs-Determination of fat content.[动物饲料-脂肪含量的测定]InternationalOrganization for Standardization,Switzerland[瑞士国际标准化组织]；1999]；粗脂肪，NEN-ISO 6492[NEN-ISO 6865,en.Animal feeding stuffs--Determination of crudefibre content--Method with intermediate filtration.[动物饲料-粗纤维含量的测定-中间过滤方法]International Organization for Standardization,Switzerland[瑞士国际标准化组织]；2000]；粗纤维，NEN-ISO 6865[NEN-EN-ISO 16634,en.AnimalFeeding Stuff-Determination of Nitrogen Content using Dumas combustion.[动物饲料-使用杜马斯燃烧法测定氮含量]International Organization forStandardization,Switzerland[瑞士国际标准化组织]；2008]。根据方法AOAC 2011.14[AOAC国际方法2011.14:Calcium,Copper,Iron,Magnesium,Manganese,Potassium,Phosphorus,Sodium,and Zinc in Fortified Food Products.[强化食品中的钙、铜、铁、镁、锰、钾、磷、钠和锌]Official Methods of Analysis of AOAC International[AOAC国际官方分析方法]；2011]，通过微波消解和电感耦合等离子体发射光谱法(OES)分析饲料中的磷、Ca、镁、钾和钠以及食糜中的P和Ca。饮食中的植酸磷(PP[肌醇六磷酸(IP6)])浓度和饮食中的植酸酶活性是由杜邦实验室(DuPont Laboratories)(丹麦布拉布兰)使用Yu等人[Yu,S,Cowieson,A,Gilbert,C,Plumstead,P,Dalsgaard,S.Interactions of phytateand myo-inositol phosphate esters(IP1-5)including IP5 isomers with dietaryprotein and iron and inhibition of pepsin.[植酸盐和肌醇磷酸酯(IP1-5)(包括IP5异构体)与膳食蛋白和铁的相互作用以及对胃蛋白酶的抑制作用]J Anim Sci[动物科学]2012；90:1824-1832]所述的方法确定的。一个植酸酶单位(FTU)定义为在pH 5.5和37℃下每分钟从植酸钠底物中释放1μmol的无机正磷酸盐的酶的量[AOAC国际方法2000.12:Phytase activity in feed:Colorimetric enzymatic method.[饲料中的植酸酶活性：比色酶法]Official Methods of Analysis of AOAC International.[AOAC国际官方分析方法]第17版；Association of Official Analytical Chemists,Arlington,VA[弗吉尼亚州阿灵顿市官方分析化学家协会]；2000]。
使用以下所述方法测量胫骨灰分：去除腓骨、肌肉和结缔组织，并将骨骼在100℃干燥至少12小时，然后在乙醚中脱脂7-8小时并风干。将脱脂的胫骨再次在100℃干燥至少12小时，然后在600℃的陶瓷坩埚中灰化24小时。
计算：基于第0-21天、第22-42天和第0-42天的总BWG和总采食量(根据死亡率权重校正)计算饲料转化率(FCR)。ADG和AFDI都是通过校正死亡率来计算的，例如通过每个阶段的总采食量计算ADFI然后除以总的饲喂天数。由死亡率校正的ADFI除以死亡率校正的FCR来计算死亡率校正的ADG。
P和Ca的表观回肠消化率(AID，％)是使用二氧化钛作为惰性标记、基于以下公式计算的：
AID＝1-[(Tid/Tii)×(Ni/Nd)]
其中Tid是饮食中的钛浓度，Tii是回肠消化物中的钛浓度，Ni是回肠消化物中营养素(P或Ca)的浓度，以及Nd是饮食中营养素的浓度。所有分析值均表示为克/千克干物质。
统计分析：数据以栏为实验单位报告。使用JMP 14.0的Fit Model平台(SAS研究所有限公司(SAS Institute Inc.)，凯里，北卡罗来纳州，1989-2019)通过方差分析(ANOVA)来分析数据，以研究随机化设计中处理的效果。通过Tukey的诚实显著性差异(HonestSignificant Difference)测试实现平均值分离。使用正交多项式分析了随着植酸酶剂量增加的线性和二次响应。差异在P<0.05时被认为具有统计学意义；P<0.10被认为是一种趋势。
结果
饮食分析：最终饮食中分析的植酸酶活性确认了目标剂量水平(表13)。基础(对照)饮食中CP的分析值在计算值的10％以内。NC饮食中达到的P含量的减少与目标减少量非常相符；基于分析值，前期饮食中的总磷含量降低了1.8g/kg，后期饮食中的总磷含量降低了2.3g/kg。
Figure BDA0003908349840001031
*所述值是制作一批NC基础饮食时NC和NC+植酸酶处理的平均值。
PC、NC、NC+250FTU/kg、NC+500FTU/kg、和NC+1,000FTU/kg的分析的植酸酶活性(FTU/kg)分别在前期阶段为43、24、282、480、882，以及在后期阶段为<50、<50、253、594、1110。饮食中的植酸酶活性由丹麦布拉布兰的杜邦饲料技术服务公司(DuPont FeedTechnical Service)分析。
营养素消化率：相对于PC饮食，饲喂NC饮食的鸡中P的AID没有明显降低(表14)。在500FTU/kg或更高的剂量水平下，植酸酶补充相对于NC增加了AID P；并且在1000FTU/kg下，植酸酶相对于PC改善了P的AID(P<0.05)。当给予500FTU/kg或更高时，植酸酶改善饮食中的回肠可消化P(以g/kg基础表示)(在500FTU/kg时相对于NC为+1.39g/kg，并且在1000FTU/kg时相对于NC为+1.76g/kg；P<0.05)。在这些剂量水平下，以g/kg表示的可消化P在所述饮食中与PC饮食中相当。Ca的AID不受膳食处理的影响，但随着植酸酶剂量从0增加到1000FTU/kg而呈线性增加(P<0.10)。
Figure BDA0003908349840001041
1基因修饰的微生物里氏木霉产生的生物合成细菌6-植酸酶。
2植酸酶剂量从0(NC)增加到1,000FTU/kg导致AID P的线性和二次增加(P<0.05)，而Ca几乎呈显著线性增加(P＝0.052)
a、b、c：一行中具有不同上标字母的最小二乘方平均值不同(P<0.05，Tukey测试)。
胫骨灰分：膳食处理对胫骨灰分的影响非常显著(P<0.001)，并列于表15中。与PC相比，显示饲喂NC饮食的鸡在第21天和42天时胫骨灰分降低(分别为-6.7和-4.1个百分点；P<0.05)。与NC相比，在所有三个剂量水平下，植酸酶补充改善了在第21天和第42天采样的胫骨灰分(P<0.05)；所有植酸酶处理中的胫骨灰分均与PC相当。
Figure BDA0003908349840001051
1所有性能数据均已根据死亡率进行校正
2植酸酶剂量从0(NC)增加到1,000FTU/kg导致所有测量的参数的线性和二次增加(P<0.05)
3基因修饰的微生物里氏木霉产生的生物合成细菌6-植酸酶。
a、b、c：一行中具有不同上标字母的最小二乘方平均值不同(P<0.05，Tukey测试)。
采食量和生长性能：表15还列出了膳食处理对采食量、体重和饲料转化率的影响。处理影响了所有生长阶段期间的所有应答测量(前期、后期、整个时期(overall)；在所有情况下P<0.01)。没有观察到死亡率的显著差异(数据未显示)。
与PC相比，饲喂NC饮食的鸡显示在第21天和第42天的BW下降，在后期阶段和整个时期的期间FCR增加，在所有阶段期间的ADG和ADFI下降(P<0.05)。
以任何剂量水平补充实验植酸酶都使鸡克服NC饮食中的P缺乏症，并且在所有阶段期间都具有改善的ADFI、BW和ADG和FCR(P<0.05)，使得它们在所有阶段期间与PC相当，无论植酸酶剂量如何。剂量水平为1,000FTU/kg的实验植酸酶使鸡在第42天的平均BW为2.74kg，并且平均总体FCR为1.626(相对于PC中的1.661)。
总之，这项研究表明，将实验变体植酸酶添加到配制的饲料(其中来自MCP的无机磷降低1.8至1.9g/kg)中并以250和1000FTU/kg之间的剂量水平施用，所述实验变体植酸酶有效地维持生长性能、胫骨灰分和回肠P消化率，相当于营养充足的饮食。1000FTU/kg时有最大的有益效果。基于观察到的可消化磷的增加，估计来自磷酸一钙的磷替代值在500和1000FTU/kg时分别为1.64和2.07克/千克饮食(等于1.39和1.76g/kg的来自MCP的可消化P)。
实例9
猪的植酸酶的体内评估
这项研究的目的是评估与添加来自MCP的无机P相比，在用其中未添加无机磷酸盐的基于玉米-大豆粉的饮食饲喂的断奶仔猪中，补充有代表性实验性生物合成细菌6-植酸酶的膳食对骨灰分和矿化以及生长性能的功效。出于比较目的，所述研究中包括现有的商业植酸酶。第二个目标是确定在测试环境中植酸酶的可消化P当量值。
材料和方法
实验和对照饮食：配制了基于玉米和SBM的阳性对照(PC)饮食，以满足体重10至25kg的仔猪的营养要求(NRC，2012)，所述饮食中含有2.9g/kg的可消化P和7.0g/kg的Ca(表16)。配制不含无机磷酸盐(1.1g/kg可消化P)且Ca降低(5.0g/kg)的阴性对照(NC)饮食。NC作为独立的饮食进行测试，并且还补充有500或1,000FTU/kg商业植酸酶饮食，250、500或1,000FTU/kg实验植酸酶或添加了3种水平的MCP(+0.7、+1.4和+1.8g/kg来自MCP的可消化磷)，相当于1.8、2.5和2.9g/kg的可消化P含量(后者构成PC饮食)。这总共产生了9种膳食处理。在补充有MCP的饮食中添加额外的石灰石，以将Ca与P的比例维持在1.2至1.3的范围内(表16)。商业植酸酶是来自在里氏木霉中表达的布丘氏菌属物种的微生物6-植酸酶(
Figure BDA0003908349840001072
PHY，杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition and Biosciences))，在本文中称为PhyB。实验植酸酶是生物合成的细菌植酸酶，本文称为PhyX。PhyX由用真菌(里氏木霉)生产菌株发酵而产生，所述菌株表达通过祖先重建而组装的共有序列细菌植酸酶基因的生物合成变体，且对布丘氏菌属物种(杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition andBiosciences))的序列有偏差。饮食以醪液形式可供仔猪随意摄取，并且水可自由获取，
Figure BDA0003908349840001071
Figure BDA0003908349840001081
Figure BDA0003908349840001091
1抗氧化剂，含有BHT、没食子酸丙酯和柠檬酸。
2每千克饮食补充：铁(来自FeSO4·H2O)，120mg；碘(来自Ca(IO3)2)0.75mg；钴(来自2CoCO3·3Co(OH)2·H2O)，0.6mg；铜(来自CuSO4·5H2O)，6mg；锰(来自MnO)60mg；锌(来自ZnO)100mg；硒(E8)(来自Na2SeO3)0.37mg；维生素A，10000UI；维生素D3，2000UI；维生素E(α生育酚)，25mg；维生素B1，1.5mg；维生素B2，3.5mg；维生素B6，2.4mg；维生素B12，20μg；维生素K3，1.5mg；泛酸钙14mg；烟酸，20mg；叶酸，0.5mg；生物素，50μg。
3将测试产品与小麦载剂混合以达到目标剂量，对照处理仅接受载剂而没有测试产品
4SID＝标准化回肠消化率。
猪、猪舍和实验设计：实验程序符合欧洲指令2010/63/EU和西班牙有关研究中动物护理和使用的准则(B.O.E.编号252，皇室法令(Real Decreto)2010/2005)。在断奶时获得混合性别(50％雄性，50％雌性)的总共162头杂交Pietrain x(大白猪x长白猪)21日龄仔猪(初始体重(BW)6±1kg)，并喂饲普通的前期前适应饮食直至42日龄(～10-11kg BW)。然后采用完全随机分组设计根据体重和性别对仔猪进行分组，并分配到围栏，每个围栏2头猪，每种处理9个围栏。对从42日龄到70日龄的猪施用测试饮食。在环境受控的动物房中将栏安排在一起，其中温度最初保持在30℃，然后每周降低1℃。
采样和测量：分析了所有饮食的代表性子样品的干物质(DM)、有机物质(OM)、粗蛋白(CP)、醚提取物(EE)、灰分、矿物质、植酸盐和植酸酶。
在实验开始之前，分别对猪称重，然后在第14和28天再次称重，以计算平均日增重(ADG)。在第14天和第28天评估饲料的消失，并用于计算平均日采食量(ADFI)。饲料转化率(FCR)由ADFI和ADG计算得出。
在试验的第28天，通过静脉内过量的戊巴比妥钠对每栏的一只仔猪安乐死，并切下前腿和后腿右脚，以确定掌骨/跖骨灰分和矿化(Ca和P)。将脚储存在-20℃直至分析。
化学分析：所有样品均一式两份进行分析。根据AOAC(2000a)方法分析了饲料中的干物质、灰分、CP和醚提取物(分别为925.09、942.05、968.06和920.39)。通过Dumas程序通过氮FP-528分析仪(莱科公司(Leco corp.)，圣约瑟夫，密苏里州，美国)确定氮含量。以DM和灰分之间的差计算有机物质(OM)。根据Engelen等人(1994)对饲料中的外源植酸酶活性进行了分析。一个植酸酶单位(FTU)定义为在5.5的标准pH和37℃的温度下从0.0051mol/L植酸钠中每分钟释放1mmol无机磷酸盐的植酸酶的量(AOAC，2000b)。
分别在来自右前脚和右后脚的掌骨III/IV和跖骨III/IV上确定骨灰分。提取后，首先使用配备有2kN测力传感器的型号为2519-106的Instron测试系统(美国马萨诸塞州诺伍德市(Norwood,MA,US))在3点机械测试中表征骨的完整性。将生物力学参数如外在刚度、极限力、位移和失效功用于表征骨的完整性(Turner,2006)。然后，将骨用于确定其在103℃的烘箱中4h的DM含量，然后在200℃烘干箱中燃烧3h，然后放入550℃的马弗炉中72h并且确定其灰分含量。然后使用杵和研钵研磨掌骨获得灰分，然后将所述灰分送至SCT实验室(莱里达大学(University of Lérida)，西班牙)，用于在硫酸消化后通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS；安捷伦科技公司(Agilent Technologies)型号7700X)确定矿物质(Ca、P、Mg)。还通过SCT实验室的ICP-MS在灰分样品上分析了饲料中的矿物质组成(Ti、Ca、P、Mg、Fe、Zn和Cu)(Pacquette和Thompson，2018)。
统计分析：除骨灰分和骨强度以猪为实验单位外，数据均以栏为实验单位。使用JMP 14.0的Fit Model平台(SAS研究所有限公司(SAS Institute Inc.)，凯里，北卡罗来纳州，1989-2019)通过方差分析(ANOVA)来分析数据，以研究随机化设计中处理的效果。通过Tukey的诚实显著性差异(Honest Significant Difference)测试实现平均值分离。此外，还使用因子“植酸酶”(PhyG与PhyB)和剂量(500和1000)进行了双因素方差分析，以比较两种剂量水平(500和1000FTU/kg)下的两种植酸酶。使用正交多项式分析了随着植酸酶剂量增加的线性和二次响应。此外，根据增加来自MCP的可消化P(例如NC、NC+0.7、NC+1.4、和NC+1.8g/kg来自MCP的可消化P)的添加对掌骨灰分、ADG和FCR进行线性回归。通过在给定的植酸酶剂量下应用Y值计算可消化P当量，并计算相应的X值。差异被认为是显著的，P<0.05；P<0.10被认为是一种趋势。
结果
饮食分析：饮食中营养成分的分析值列于表17。NC饮食中的植酸酶活性≤50FTU/kg，表明不存在植酸酶交叉污染。补充植酸酶的饮食中的活性在目标值的10％以内，除了处理NC+PhyX 250和NC+PhyX 500中活性相对于目标剂量分别为-20％和+27％。含有添加的来自MCP的P的NC饮食中分析的P含量接近于基于预期的MCP添加水平的预期值。
表17：实验饮食的分析的营养价值
Figure BDA0003908349840001121
1代表性生物合成细菌6-植酸酶。
2来自在里氏木霉中表达的布丘氏菌属物种的微生物6-植酸酶(
Figure BDA0003908349840001122
PHY，杜邦动物营养公司(DuPont Animal Nutrition))。
3根据AFZ-INRA表(Sauvant等人，2002)，可代谢能和净能分别计算为总能量和可消化能量的0.79和0.58。
4饮食中的植酸酶活性由丹麦布拉布兰的杜邦实验室(DuPont Laboratories)分析。
骨灰分矿物质和骨强度：在70日龄时(实验第28天)，相对于PC，用基础NC饮食饲喂的仔猪的掌骨灰分、Ca和P含量降低(P<0.05；表18)。与NC相比，补充两种植酸酶以及在所有剂量水平下均改善了骨灰分和骨P含量(％)(P<0.05)。在500和1000FTU/kg下，掌骨灰分和骨P含量与PC相当。将PhyX的剂量从0(NC)增加到1,000FTU/kg，导致在第28天掌骨灰分的线性和二次增加(P<0.05)。植酸酶补充不会影响掌骨Ca含量。随着饮食中MCP-P水平的升高，掌骨灰分和P含量呈线性响应(P<0.05)。跖骨灰分含量显示与掌骨灰分的响应相同。
表18：增加两种植酸酶剂量或无机P含量对70日龄仔猪的跖骨和掌骨灰分及矿化(％干物质基础)和掌骨强度的影响
Figure BDA0003908349840001131
1实验生物合成细菌6-植酸酶
2来自在里氏木霉中表达的布丘氏菌属物种的商业微生物6-植酸酶(
Figure BDA0003908349840001132
PHY，杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition and Biosciences))。
膳食处理对掌骨生物力学参数的影响见表18。与所有其他处理相比，NC的极限力(N)较低(P<0.05)。与NC相比，所有剂量水平下的所有植酸酶处理均改善了极限力。相对于PC，两种植酸酶在1000FTU/kg下维持相同的极限力。与每kg饮食含有额外1.8g来自MCP的可消化P的PC相比，两种植酸酶在500FTU和1000FTU下均相对于NC改善了刚度(mPa)，并且在1000FTU/kg下维持刚度(mPa)和破坏功(J)。在比较两种植酸酶的两种剂量水平时，与500FTU/kg的植酸酶相比，1000FTU/kg的植酸酶显示出更高的骨灰分、极限力(N)、刚度(mPa)和破坏功(J)(P<0.05)。在植酸酶来源和剂量水平之间未发现相互作用。
生长性能：膳食处理对生长性能的影响见表19。除了在第0–14天期间的ADFI(趋势，P＝0.08)外，在饲喂PC饲料的仔猪中，与饲喂NC饮食相比所有生长性能响应测量均受损(ADG和ADFI降低；FCR升高)(P<0.05)。
在实验的第一阶段(第0–14天)期间，1,000FTU/kg的PhyX和PhyB相对于NC产生更大的ADG和降低的FCR(P<0.05)，并且相当于含有添加的1.8g/kg来自MCP的P的PC。
在实验的第二阶段(第15至28天)期间，PhyX在250FTU/kg或更高下相对于NC改善了ADG，并且在500FTU/kg或更高下相对于NC改善了FCR(P<0.05)。在两种剂量水平下，相对于NC，PhyB还改善了ADG和FCR(P<0.05)。在500FTU/kg或更高时，两种植酸酶均产生与含有添加的1.8g/kg来自MCP的P的PC相当的ADG和FCR值。
表19：增加两种植酸酶或无机P含量对断奶仔猪(42至70日龄)性能的影响。
NC+来自MCP的可消化P(g/kg)
Figure BDA0003908349840001151
1代表性生物合成细菌6-植酸酶
2来自在里氏木霉中表达的布丘氏菌属物种的商业6-植酸酶(
Figure BDA0003908349840001152
PHY，杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition and Biosciences))。
3将PhyX的剂量从0(NC)增加到1,000FTU/kg，导致整个阶段(第0-28天)的ADG和FCR的线性和二次增加(P<0.05)。
a、b：一行中具有不同上标字母的最小二乘方平均值不同(P<0.05，Tukey测试)。
在整个阶段(第0–28天)期间，所有剂量的两种植酸酶相对于NC均改善了ADG，且500FTU/kg或以上的两种植酸酶相对于NC均改善了FCR(P<0.05)。在500FTU/kg或更高时，任一种植酸酶均产生与含有添加的1.8g/kg来自MCP的P的PC相当的ADG和FCR值。此外，PhyX剂量从0增加到1,000FTU/kg导致整个阶段期间ADG的线性和二次增加，以及FCR的降低(P<0.05)。随着饮食中MCP-P水平的升高，ADG和FCR呈线性响应(P<0.05)。比较两种植酸酶的两种剂量水平，FCR在1000FTU/kg相比在500FTU/kg更低(1.59相比1.66，P<0.05)。在1000FTU/kg相比500FTU/kg下，观察到ADG有增加的趋势(635相比590，P＝0.08)，采食量未发现差异(数据未显示)。在植酸酶来源和剂量水平之间未发现相互作用。
无机P当量：基于骨灰分、ADG和FCR作为响应参数，使用对增加来自MCP的可消化P的观察的响应作为参考来计算PhyX和PhyB的膳食可消化P当量值(g/kg饮食)。对增加来自MCP的可消化P的响应是线性且针对所有三种响应测量呈阳性(P<0.001；表20)。无论使用何种响应参数，计算的可消化P当量值均随着植酸酶剂量的增加而增加，并且最高为1,000FTU/kg(表20)。在此剂量水平下，PhyX相比PhyB的可消化P当量值更高(响应参数的平均值分别为1.83g/kg和1.66g/kg)，ADG最高，而骨灰分最低(作为响应参数)。
表20：骨灰分、ADG、FCR对增加来自MCP的可消化的响应的线性回归分析1,2
Figure BDA0003908349840001161
1线性回归是通过增加添加的来自MCP的可消化P(例如，NC、NC+0.7、NC+1.4和NC+1.8g/kg来自MCP的可消化P)相对掌骨灰分、ADG和FCR进行的，具有方程Y＝a+bX，其中Y是响应参数，且X是增加添加的来自MCP的可消化P。
2R2基于处理平均值的回归。通过在给定的植酸酶剂量下应用响应参数(Y，例如骨灰分)值计算可消化的P当量并计算相应的MCP-P替代(X)值。
总之，这项研究表明，以500或1,000FTU/kg的剂量水平将实验植酸酶(PhyX)添加到其中未添加无机P的基于玉米-大豆粉的饲料中时，所述实验植酸酶有效维持仔猪掌骨灰分、骨P含量和生长性能，相当于营养充足的饮食(含2.9g/kg可消化P，其中1.8g/kg来自MCP的可消化P)。剂量水平为1,000FTU/kg时，响应最大，据估计在此剂量水平下，以含有稻和米糠的基于玉米-SBM的饮食喂养的断奶仔猪中，实验植酸酶可替代饮食中估计的1.83g/kg可消化磷。
实例10
嵌合的高Tm植酸酶进化枝多肽的设计和评估
设计了一系列嵌合多肽，以评估实例4中所述的高Tm植酸酶进化枝多肽(PHY-13594、PHY-13789和PHY-13885)的N-末端和/或C-末端的交换/替换区域的贡献。出于本研究的目的，N-末端定义为根据SEQ ID NO:1的残基1-13，核心区域定义为根据SEQ ID NO:1的残基14-325，而C-末端定义为根据SEQ ID NO:1的残基326至实例7中所述的每个多肽的末端。使用实施例1中所述的方法产生蛋白质，并使用实例3中所述的方法，将澄清的培养物上清液样品用于通过DSC测量热稳定性以及在pH 3.5和pH 5.5处的植酸酶活性。使用PHY-13594、PHY-13789、和PHY-13885植酸酶进行比较，产生含有在如下中发现的HAP植酸酶的N-末端区域的嵌合分子的影响：布丘氏菌属物种(布丘氏菌NCIMB 41248，SEQ ID NO:88)、布氏柠檬酸杆菌(C.brakii)(布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)AAS45884，SEQ ID NO:89)、和杀鱼爱德华菌(E.piscicida)(迟钝爱德华菌YP007628727，杀鱼爱德华菌WP_015461291.1，SEQ ID NO:90)。同样，使用PHY-13594、PHY-13789、和PHY-13885进行比较，产生含有在如下中发现的HAP植酸酶的C-末端区域的嵌合分子的影响：蜂房哈夫尼菌(蜂房哈夫尼菌WO 2010034835-0002，SEQ ID NO:94)、莫氏耶尔森氏菌(莫氏耶尔森氏菌WP032813045，SEQ ID NO:95)和布丘氏菌属物种(布丘氏菌NCIMB 41248，SEQ ID NO:96)。所使用的植酸酶核心区域如下：PHY-13594为SEQ ID NO:100，PHY-13789为SEQ ID NO:101，PHY-13885为SEQ ID NO:102。表21描述了所测试的各种嵌合构建体，并提供了热稳定性、在pH 3.5处的比活性以及在pH 3.5与pH 5.5处的比活性的比率的结果。如表21所示，所评估的三个高Tm植酸酶的N-末端或C-末端的修饰导致具有非常相似的热稳定性的酶，表明用于维持这些高Tm植酸酶的热稳定性的结构决定簇位于核心区域的氨基酸序列内。当使用实例2中所述的测定进行测试时，表21中所述的所有高Tm植酸酶进化枝多肽也显示出大于100FTU/mg。
Figure BDA0003908349840001181
Figure BDA0003908349840001191
用于说明，图3描绘了代表性高Tm进化枝植酸酶的三维结构，其使用公布的紧密相关的蜂房哈夫尼菌6-植酸酶(PDB入口代码：4ARO，植酸酶与肌醇六烷基硫酸盐复合)公布的晶体结构建模并显示为条带图。使用MOE(v2013.08，化学计算集团公司(ChemicalComputing Group Inc.))构建模型，并使用PyMol软件程序(1.8.4.2版，薛定谔有限责任公司(Schrodinger，LLC))将其可视化。黑色表示“核心”结构域，浅灰色调是在本文显示的实验中已替换/交换的N和C末端区域。该模型与Ariza等人使用蜂房哈夫尼菌6-植酸酶的晶体结构提出的基于结构的多重序列比对(Degradation of Phytate by the 6-Phytase fromHafnia alvei:A Combined Structural and Solution Study[来自蜂房哈夫尼菌的6-植酸酶降解植酸盐：组合结构和溶液研究],PLOS[公共科学图书馆],8:1-13)一致。
                         序列表
<110>  杜邦营养生物科学有限公司
<120>  饲料组合物
<130>  NB41804-WO-PCT
<160>  104
<170>  PatentIn 3.5版
<210>  1
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13594
<400>  1
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  2
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-10931
<400>  2
Ser Glu Thr Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Thr Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Glu Leu Ser Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu His Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  3
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-10957
<400>  3
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Trp Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Lys Glu Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Thr Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Val Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  4
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-11569
<400>  4
Ser Glu Thr Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Met Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Thr Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Leu Asn Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Val Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  5
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-11658
<400>  5
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Trp Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Gly Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Met Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Arg Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Val Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  6
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-11673
<400>  6
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Glu Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Thr Gly Leu Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Asp Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Lys Leu Ser Ile Gly Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Val Thr Phe Thr Val
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  7
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-11680
<400>  7
Ser Glu Thr Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Thr Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Asp His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ser Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Ile Ile Thr Asp Asp Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Lys Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  8
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-11895
<400>  8
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Trp Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Lys Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Glu Leu Ser Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Thr Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  9
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-11932
<400>  9
Ser Glu Thr Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Ala Glu Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Met Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Asp His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ser Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Met Pro Ser Lys Leu Asn Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  10
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-12058
<400>  10
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Thr Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ser Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Ala Gln His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  11
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-12663
<400>  11
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Trp Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Lys Asn Ile Lys Val Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Thr Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Asp Glu Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Arg Trp Arg Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  12
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-12784
<400>  12
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Lys Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Pro Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Met Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Thr Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Thr Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Val Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  13
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13177
<400>  13
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Lys Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Met Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Ala Gln His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Arg Trp Arg Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  14
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13371
<400>  14
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Gly Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asn Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ala Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  15
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13460
<400>  15
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Ala Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Val His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asn Lys Ser Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Met Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Met Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  16
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13513
<400>  16
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Gly Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  17
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13637
<400>  17
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln His His Ser Gly Asp Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Val Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  18
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13705
<400>  18
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Arg Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Arg Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  19
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13713
<400>  19
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Ala Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile His Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Met Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  20
<211>  412
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13747
<400>  20
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Arg His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Met Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Glu Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Met Gln Thr Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile
                405                 410
<210>  21
<211>  412
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13779
<400>  21
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro His Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Glu Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile
                405                 410
<210>  22
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13789
<400>  22
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  23
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13798
<400>  23
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Ala Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asn Ile Ser Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Met Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  24
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13868
<400>  24
Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Ser Gln Thr Tyr Glu
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Gly Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Arg His Ser Gly Asp Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Glu Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  25
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13883
<400>  25
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asn Ile Ser Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
His Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  26
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13885
<400>  26
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  27
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-13936
<400>  27
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Ala Ile
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Glu Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  28
<211>  412
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14004
<400>  28
Ala Glu Glu Ala Asn Gly Met Lys Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu Ser
1               5                   10                  15
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg Asp
            20                  25                  30
Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr Ile
        35                  40                  45
Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr Arg
    50                  55                  60
Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg Lys
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Asp Leu Thr
            100                 105                 110
Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln Ala
    130                 135                 140
Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys Ser
                165                 170                 175
Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala Asn
            180                 185                 190
Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val Gln
        195                 200                 205
Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe Leu
    210                 215                 220
Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile His
225                 230                 235                 240
Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln Phe
                245                 250                 255
Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr Pro
            260                 265                 270
Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala Arg
        275                 280                 285
Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala Gly
    290                 295                 300
His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Thr Trp
305                 310                 315                 320
Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val His
            340                 345                 350
Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu Thr
        355                 360                 365
Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys Asp
    370                 375                 380
Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg Leu
385                 390                 395                 400
Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  29
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14215
<400>  29
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ile His His Gln Gln Asn Ile Thr Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Arg His Ser Gly Asp Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Ser Gln Trp Lys Ser Leu Leu Asn Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asn Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Arg Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Glu Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  30
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14256
<400>  30
Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Tyr Gln Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Gln Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  31
<211>  412
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14277
<400>  31
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Arg His Ser Gly Asp Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile
                405                 410
<210>  32
<211>  412
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14473
<400>  32
Ala Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu Ser
1               5                   10                  15
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg Asp
            20                  25                  30
Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr Ile
        35                  40                  45
Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr Arg
    50                  55                  60
Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg Lys
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Ala Ile Thr
            100                 105                 110
Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln Ala
    130                 135                 140
Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys Ser
                165                 170                 175
Pro Tyr Cys Arg His Gln Ser Gly Asp Lys Thr Cys Asp Phe Ala Asn
            180                 185                 190
Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val Gln
        195                 200                 205
Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe Leu
    210                 215                 220
Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile His
225                 230                 235                 240
Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln Phe
                245                 250                 255
Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr Pro
            260                 265                 270
Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu Ser
        275                 280                 285
Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala Gly
    290                 295                 300
His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr Trp
305                 310                 315                 320
Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val Lys
            340                 345                 350
Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu Thr
        355                 360                 365
Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys Asp
    370                 375                 380
Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg Leu
385                 390                 395                 400
Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  33
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14614
<400>  33
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gly Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asn Ile Thr Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  34
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14804
<400>  34
Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Glu Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  35
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-14945
<400>  35
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Glu Arg Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Ala Ile
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  36
<211>  412
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-15459
<400>  36
Ala Glu Pro Gln Asn Gly Met Lys Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu Ser
1               5                   10                  15
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg Asp
            20                  25                  30
Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr Ile
        35                  40                  45
Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr Arg
    50                  55                  60
Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro Arg
65                  70                  75                  80
Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg Lys
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Pro Leu Thr
            100                 105                 110
Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Met Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Lys Gly Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln Ala
    130                 135                 140
Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Asp His Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Leu Asn Phe Pro Ala Ser
                165                 170                 175
Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala Gln
            180                 185                 190
Met Met Pro Ser Lys Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val Gln
        195                 200                 205
Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe Leu
    210                 215                 220
Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile His
225                 230                 235                 240
Ser Glu Gln Glu Trp Asn Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr Phe
                245                 250                 255
Asp Leu Met Tyr Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr Pro
            260                 265                 270
Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala Arg
        275                 280                 285
Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Arg Ile Leu Phe Leu Ala Gly
    290                 295                 300
His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp Trp
305                 310                 315                 320
Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val His
            340                 345                 350
Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu Thr
        355                 360                 365
Leu Gln Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Ser Cys Asp
    370                 375                 380
Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Lys Leu
385                 390                 395                 400
Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  37
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  PHY-16513
<400>  37
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Met Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Asn Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Met Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Gly Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Asp His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Leu Asn Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Thr Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Asn Glu Ser Gln Trp Lys Ser Leu Leu Asn Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asn Leu Met His Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Asn Glu Pro Ala Gly Thr Val Pro Leu Lys Ile Pro Ser Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Val
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Ile Pro
                405                 410
<210>  38
<211>  413
<212>  PRT
<213>  诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）
<400>  38
Ser Glu Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Glu Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Glu Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Ala Pro Asn Ser Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Gly Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asn Leu Glu Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Glu Lys Asn Gln Ile Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Thr Pro Ile Asp Asn Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Pro Ser Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ala Asn
                165                 170                 175
Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Val Asp Lys Ser Cys Asp Leu Gly
            180                 185                 190
Gln Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Gln Glu Asn Gly Asn Lys Ile
        195                 200                 205
Thr Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Lys Ala Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Ala Leu Leu Lys Leu His Asn Thr Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ala Thr Ala
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ser Gly Met Leu Asn Ile Ser
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ala Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu His Ala Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Ser Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Pro Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln
                405                 410
<210>  39
<211>  413
<212>  PRT
<213>  布氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）
<400>  39
His Ala Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln
    50                  55                  60
Arg Leu Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro
65                  70                  75                  80
Ser Pro Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile
            100                 105                 110
Gln Val His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn
        115                 120                 125
Pro Val Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Lys Val Lys Asn
    130                 135                 140
Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln
                165                 170                 175
Ser Glu Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro
            180                 185                 190
Glu Ala Leu Pro Ser Glu Phe Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu
        195                 200                 205
Pro Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu
    210                 215                 220
Gln Glu Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly
225                 230                 235                 240
Glu Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp
                245                 250                 255
Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu
            260                 265                 270
Leu Asp Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn
        275                 280                 285
Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His
    290                 295                 300
Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Lys Trp Ser
305                 310                 315                 320
Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe
                325                 330                 335
Glu Lys Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser
            340                 345                 350
Phe Val Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser
        355                 360                 365
Leu Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu
    370                 375                 380
Glu Lys Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu
385                 390                 395                 400
Ile Lys Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu
                405                 410
<210>  40
<211>  415
<212>  PRT
<213>  柯克斯体科（Coxiellaceae）细菌
<400>  40
Val Val Ala Lys Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Gln Gln Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Ile Lys His Ser Lys Leu Leu Asn
            20                  25                  30
Glu Ile Thr Pro Ser Ser Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Pro Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Lys Leu Leu Met Thr Leu Met Gly Glu Phe Tyr
    50                  55                  60
Gly Asp Tyr Phe Arg Asn Lys Gly Leu Leu Ala Glu His Gly Cys Pro
65                  70                  75                  80
Ala Asn Gly Thr Val Tyr Val Gln Thr Asp Val Asp Gln Arg Thr Ile
                85                  90                  95
Leu Ser Gly Trp Ala Leu Leu Ser Gly Met Thr Pro His Cys Arg Phe
            100                 105                 110
Lys Ile His His Gln Glu Asn Leu Lys Arg Ile Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Glu Ala Gly Ile Cys Glu Leu Asn Lys Glu Lys Ala Leu Asn
    130                 135                 140
Ala Ile Glu Glu Arg Leu Gly Ala Pro Leu Gln Thr Leu Ser Lys Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Ser Pro Leu Ala Gln Met Ser Lys Ile Leu Lys Phe Asp Arg
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Glu Lys Met His Lys Met Gln Lys Ser Cys Asp Phe
            180                 185                 190
Ala Thr Phe Leu Ser Asn Lys Ile Tyr Ile Asn Asn Lys Gly Thr Ile
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Gly Pro Val Ser Leu Ser Ser Thr Phe Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Gln Asn Ser Gln Gly Met Pro Asp Val Ala Trp His Arg Leu
225                 230                 235                 240
Lys Gly Glu Ala Asn Trp Glu Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Phe Tyr Ile Ser Arg His Glu Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Glu Glu Ile Gly Gly Ala Leu Thr His Gln Met Lys Gln
        275                 280                 285
Gln Arg Ile Phe Ser Thr Leu Pro Leu Ser Ala His Asn Arg Val Leu
    290                 295                 300
Phe Leu Val Gly His Asp Val Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu
305                 310                 315                 320
Gly Leu Asn Trp Gln Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Lys Met Asp Asp His Lys His
            340                 345                 350
Tyr Ile Ser Ile Lys Met Phe Tyr Gln Thr Met Val Gln Leu Arg Asn
        355                 360                 365
Lys Gln Lys Met Asp Leu Trp Leu Asn Pro Ala Gly Met Leu Ser Ile
    370                 375                 380
Pro Gly Cys Asp Asn Met Gly Lys Asp Lys Leu Cys Arg Leu Glu Lys
385                 390                 395                 400
Phe Gln Lys Lys Leu Gln Gln Ala Ile Glu Pro Ile Cys Arg Ile
                405                 410                 415
<210>  41
<211>  411
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  肠杆菌科（Enterobacteriaceae）WP 094337278.1
<400>  41
Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp
            20                  25                  30
Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu
        35                  40                  45
Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg
    50                  55                  60
Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln
65                  70                  75                  80
Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr
            100                 105                 110
Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala
    130                 135                 140
Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg
145                 150                 155                 160
Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser
                165                 170                 175
Asn Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr
            180                 185                 190
Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu
        195                 200                 205
Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu
    210                 215                 220
Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp
225                 230                 235                 240
Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr
                245                 250                 255
Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu
            260                 265                 270
Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln
        275                 280                 285
Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His
    290                 295                 300
Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr
305                 310                 315                 320
Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe
                325                 330                 335
Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser
            340                 345                 350
Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser
        355                 360                 365
Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu
    370                 375                 380
Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile
385                 390                 395                 400
Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
                405                 410
<210>  42
<211>  411
<212>  PRT
<213>  大肠杆菌（Escherichia coli）
<400>  42
Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp
            20                  25                  30
Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu
        35                  40                  45
Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg
    50                  55                  60
Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln
65                  70                  75                  80
Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr
            100                 105                 110
Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala
    130                 135                 140
Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg
145                 150                 155                 160
Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser
                165                 170                 175
Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr
            180                 185                 190
Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu
        195                 200                 205
Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu
    210                 215                 220
Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp
225                 230                 235                 240
Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr
                245                 250                 255
Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu
            260                 265                 270
Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln
        275                 280                 285
Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His
    290                 295                 300
Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr
305                 310                 315                 320
Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe
                325                 330                 335
Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser
            340                 345                 350
Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser
        355                 360                 365
Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu
    370                 375                 380
Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile
385                 390                 395                 400
Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
                405                 410
<210>  43
<211>  411
<212>  PRT
<213>  蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）
<400>  43
Ser Glu Thr Val Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Thr Phe Gln Gln Leu Gly Ile Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys His Leu
            100                 105                 110
Ser Ile His His Gln Gln Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Val Cys Ser Met Glu Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Gln Gln Ala Gly Met Pro Ile Ala Gln Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Ala Leu Ala Leu Met Ser Arg Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Ala Tyr Cys Gln Gln His Ser Ala Asp Gln Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Ala Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asp Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu His Ala Gln Gly Met Pro Asn Ala Ala Trp Gly Lys Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Asp Trp Asn Ala Leu Leu Ala Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Ser Ala Ile Asn Ser Gln Thr Gly Thr
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Glu Leu Ser Ala Asp Asn Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Leu Ser
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Trp Ser Asp Lys Ala Gly Lys Lys Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Gln Met Met Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Asp Glu Pro Ala Gly Ser Val Ala Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Gln Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Ala Lys Gln Asn Glu Leu Ala Glu Cys Gln
                405                 410
<210>  44
<211>  418
<212>  PRT
<213>  Rouxiella badensis
<400>  44
Asp Ala Pro Ala Thr Gln Asn Leu Gln Leu Gln Gln Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Gln Thr Lys Lys Met Glu
            20                  25                  30
Gln Val Ala Ala Lys Asp Trp Pro Val Trp Pro Val Lys Phe Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Thr Leu Met Gly Gly Tyr Tyr
    50                  55                  60
Gly Glu Tyr Phe Arg Lys Glu Gly Leu Ile Ser Asp Lys Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Ala Asn Gly Ala Ile Phe Gly Trp Gly Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Leu Thr Thr Gln Ala Leu Leu Asn Gly Ile Ala Pro Gly Cys His Leu
            100                 105                 110
Asp Ala His Phe Gln Asn Asp Leu Lys Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Ala Leu Lys Ala Lys Val Cys Lys Leu Asp Glu Lys Thr Ala Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Ile Glu Gln Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Ala Leu Asp Lys Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Gln Leu Gln Leu Met Ser Asn Val Leu Asp Tyr Pro His
                165                 170                 175
Ser Ala Tyr Cys Gln Lys Met Gln Lys Lys Gly Gln Gln Cys Glu Leu
            180                 185                 190
Gly Ile Asn Met Pro Ser Ser Val Lys Val Lys Val Lys Val Lys Glu
        195                 200                 205
Asn Gly Thr Asp Ala Ser Leu Lys Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr
    210                 215                 220
Leu Ala Glu Ile Phe Leu Leu Gln Asp Ala Gln Gly Met Thr Asp Pro
225                 230                 235                 240
Ala Trp Gly Asn Ile Lys Asp Gln Lys Thr Trp Gln Gly Leu Met Ala
                245                 250                 255
Leu His Asn Leu Gln Phe Ser Leu Met Ser Gly Thr Pro Tyr Leu Ala
            260                 265                 270
Lys Ser Asn Gly Thr Pro Ile Leu Gln Ala Ile Asp Ser Ala Leu Gly
        275                 280                 285
Ala Pro Glu Lys Pro Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Pro Thr Gly Asn Lys
    290                 295                 300
Leu Leu Ile Leu Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Glu Asn Val Ala Gly
305                 310                 315                 320
Ala Leu Gly Leu Asn Trp Ser Leu Asp Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro
                325                 330                 335
Pro Ala Gly Ala Leu Val Phe Glu Arg Trp Gln Ser Arg Thr Ser His
            340                 345                 350
Gln Gln Tyr Ile Ser Leu Lys Met Val Tyr Gln Thr Arg Asp Gln Met
        355                 360                 365
Arg Ser Gln Gln Val Leu Thr Leu Asn Asn Pro Pro Ser Ser Ile Ala
    370                 375                 380
Ile Thr Leu Pro Gly Cys Glu Asn Ile Gly Pro Asn Lys Leu Cys Ala
385                 390                 395                 400
Ile Lys Thr Phe His Gln Val Met Thr Lys Ala Gln Leu Pro Gln Cys
                405                 410                 415
Lys Ile
<210>  45
<211>  414
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  沙雷氏菌属物种（Serratia sp.）WP 009636981.1
<400>  45
Val Ile Pro Ala Pro Gln Asp Leu Gln Leu Gln Gln Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Lys Glu Met Lys
            20                  25                  30
Asp Leu Ala Gly Gln Asp Trp Pro Lys Trp Pro Val Lys Pro Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Gln Gln Leu Val Ser Leu Met Gly Thr Tyr Tyr
    50                  55                  60
Gly Asp Tyr Phe Lys Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Glu Gln Cys Pro
65                  70                  75                  80
Gly Asp Ser Glu Val Phe Gly Trp Gly Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Leu Thr Thr Gln Thr Leu Leu Ser Ala Ile Ala Pro His Cys His Val
            100                 105                 110
Met Ala Lys Asn Gln Ala Asp Leu Lys Lys Pro Asp Pro Val Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Thr Leu Asp Lys Ala Thr Ala Ile Lys
    130                 135                 140
Ala Ile Asp Lys Glu Ala Gly Gly Ser Leu Asp Ala Leu Asp Gln Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Ala Pro Gln Leu Lys Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Tyr Pro Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Tyr Cys Gln Gln Met Lys Gln Thr Gly Gln Thr Cys Ser Ala
            180                 185                 190
Val Ile Asp Ile Pro Ser Ser Ile Lys Met Lys Lys Lys Gly Thr Glu
        195                 200                 205
Ala Thr Leu Glu Gly Gly Ile Gly Met Ser Ser Thr Phe Ala Glu Asn
    210                 215                 220
Phe Leu Leu Glu Asp Ala Gln Gly Met Gln Asp Val Ala Trp Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ile Lys Asp Gln Lys Thr Trp Gln Ala Leu Leu Glu Leu His Asn Leu
                245                 250                 255
Gln Phe Arg Leu Met Ser Gly Thr Pro Tyr Ile Ala Lys Ser Asn Gly
            260                 265                 270
Thr Pro Val Leu Gln Val Ile Asp Asn Ala Phe Gly Ala Ala Ala Pro
        275                 280                 285
Ala Ser Ser Gly Phe Ser Leu Pro Ser Gly Asn Lys Val Leu Ile Leu
    290                 295                 300
Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Glu Asn Val Ala Gly Ala Leu Gly Leu
305                 310                 315                 320
Asp Trp Thr Leu Thr Asp Gln Pro Asp His Thr Pro Pro Ala Gly Ala
                325                 330                 335
Leu Met Phe Glu Arg Trp Gln Asp Lys Thr Thr His Gln Gln Tyr Ile
            340                 345                 350
Ser Leu Arg Met Val Tyr Gln Thr Gln Asp Gln Met Arg Thr Gln His
        355                 360                 365
Lys Leu Thr Leu Lys His Pro Pro Met Thr Val Ala Leu Ser Ile Pro
    370                 375                 380
Gly Cys Glu Asn Ile Gly Asp Asn Lys Leu Cys Ala Ile Gly Thr Phe
385                 390                 395                 400
His Gln Val Ile Glu Lys Ala Gln Leu Pro Gln Cys Lys Ile
                405                 410
<210>  46
<211>  412
<212>  PRT
<213>  阿氏耶尔森氏菌（Yersinia aldovae）
<400>  46
Gln Pro Ala Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu Ser Arg His
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln Leu Met Asn Asp Val Thr
            20                  25                  30
Pro Asp Lys Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Ala Gly Tyr Leu Thr Pro
        35                  40                  45
Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Met Gly Gln Phe Tyr Gly Asp Tyr
    50                  55                  60
Phe Arg Ser Lys Gly Leu Leu Leu Ala Gly Cys Pro Ala Glu Gly Val
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Ala Gln Ala Asp Ile Asp Gln Arg Thr Arg Leu Thr Gly Gln
                85                  90                  95
Ala Phe Leu Asp Gly Val Ala Pro Asp Cys Gly Leu Lys Val His Tyr
            100                 105                 110
Gln Ala Asp Leu Lys Lys Thr Asp Pro Leu Phe His Pro Val Glu Ala
        115                 120                 125
Gly Val Cys Lys Leu Asp Ala Val Gln Thr Gln Lys Ala Val Glu Glu
    130                 135                 140
His Leu Gly Gly Pro Leu Ser Ser Leu Gly Glu Arg Tyr Thr Lys Pro
145                 150                 155                 160
Phe Ala Gln Met Gly Glu Val Leu Asn Phe Ala Lys Ser Pro Tyr Cys
                165                 170                 175
Lys Thr Arg Gln Gln Asn Asp Lys Thr Cys Asp Phe Ala His Phe Ala
            180                 185                 190
Ala Asn Glu Ile Lys Val Asn Lys Glu Gly Ser Lys Val Ser Leu Asn
        195                 200                 205
Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu Ile Phe Leu Leu Gln
    210                 215                 220
Asn Ala Gln Asn Met Pro Asn Val Ala Trp Asn Arg Leu Ser Gly Thr
225                 230                 235                 240
Glu Asn Trp Ala Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Val Gln Phe Asp Leu
                245                 250                 255
Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr Pro Leu Leu
            260                 265                 270
Gln Gln Ile Asp Ala Ala Leu Thr Leu Gln Pro Asp Ala Leu Gly Gln
        275                 280                 285
Thr Leu Pro Leu Ser Pro Gln Ser Arg Val Leu Phe Ile Gly Gly His
    290                 295                 300
Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Ala Ser Trp Gln
305                 310                 315                 320
Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly Leu Val Phe
                325                 330                 335
Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Arg Tyr Val Ala Val Lys
            340                 345                 350
Met Phe Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Lys Ala Glu Met Leu Asp
        355                 360                 365
Leu Lys Asn Asn Pro Ala Gly Met Ile Ser Val Ala Val Glu Gly Cys
    370                 375                 380
Glu Asn Ser Gly Asp Asp Lys Leu Cys Gln Leu Asp Thr Phe Gln Lys
385                 390                 395                 400
Lys Val Ala Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys His Ile
                405                 410
<210>  47
<211>  415
<212>  PRT
<213>  弗氏耶尔森氏菌（Yersinia frederiksenii）
<400>  47
Val Val Ala Pro Pro Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln Leu Met Asn
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asp Lys Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Ala Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Ala Glu Leu Val Thr Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Gly Asp Tyr Phe Arg His Gln Gly Leu Leu Pro Met Gly Cys Pro Ala
65                  70                  75                  80
Asp Gly Ala Ile Tyr Ala Gln Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg Leu
                85                  90                  95
Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile Ala Pro Gly Cys Gly Leu Thr
            100                 105                 110
Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Ile Asp Pro Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Glu Ala Gly Val Cys Gln Leu Asp Ser Thr Gln Thr His Lys Ala
    130                 135                 140
Val Glu Glu Arg Leu Gly Gly Pro Leu Asn Thr Leu Ser Gln Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe Ser Thr Ser
                165                 170                 175
Pro Tyr Cys Gln Ser Leu Gln Gln Thr Gly Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Thr Phe Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Asn Lys Ala Gly Thr Lys Val
        195                 200                 205
Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ala Met Pro Asp Val Ala Trp His Arg Leu
225                 230                 235                 240
Asn Gly Ala Glu Asn Trp Ala Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Val Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Gln Ile Glu Thr Ala Leu Leu Leu Gln Arg Asp Ala
        275                 280                 285
Gln Gly Gln Lys Leu Pro Leu Ser Pro Gln Thr Lys Val Leu Phe Leu
    290                 295                 300
Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Ala
305                 310                 315                 320
Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly
                325                 330                 335
Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Arg Tyr Val
            340                 345                 350
Ala Val Lys Met Phe Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Arg Ala Glu
        355                 360                 365
Lys Leu Asp Leu Lys Asn Asn Pro Ala Gly Ile Val Pro Ile Thr Val
    370                 375                 380
Glu Glu Cys Glu Asn Thr Gly Asp Asn Lys Leu Cys Gln Leu Glu Thr
385                 390                 395                 400
Phe Gln Lys Lys Val Ala Lys Met Ile Glu Pro Ala Cys His Ile
                405                 410                 415
<210>  48
<211>  415
<212>  PRT
<213>  克氏耶尔森氏菌（Yersinia kristensenii）
<400>  48
Leu Ala Ala Gln Ser Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln Leu Met Asn
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asp Lys Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Ala Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gly Leu Val Thr Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Gly Asp Tyr Phe Arg Ser Tyr Gly Leu Leu Pro Ala Gly Cys Pro Ala
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ser Ile Tyr Val Gln Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg Leu
                85                  90                  95
Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile Ala Pro Asp Cys Gly Leu Lys
            100                 105                 110
Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Ile Asp Pro Leu Phe His Thr
        115                 120                 125
Val Glu Ala Gly Val Cys Lys Leu Asp Pro Glu Lys Thr His Gln Ala
    130                 135                 140
Val Glu Lys Arg Leu Gly Gly Pro Leu Asn Glu Leu Ser Gln Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Lys Pro Phe Ala Leu Met Gly Glu Val Leu Asn Phe Ser Ala Ser
                165                 170                 175
Pro Tyr Cys Asn Ser Leu Gln Gln Lys Gly Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Thr Phe Ala Ala Asn Glu Ile Glu Val Asn Lys Glu Gly Thr Lys Val
        195                 200                 205
Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ala Met Pro Asp Val Ala Trp Asn Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Gly Glu Glu Asn Trp Ile Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Gln Ile Asp Thr Ala Leu Val Leu Gln Arg Asp Ala
        275                 280                 285
Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Pro Gln Thr Lys Leu Leu Phe Leu
    290                 295                 300
Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Ala
305                 310                 315                 320
Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly
                325                 330                 335
Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Arg Tyr Val
            340                 345                 350
Ala Val Lys Met Phe Tyr Gln Thr Met Glu Gln Leu Arg Asn Ala Asp
        355                 360                 365
Lys Leu Asp Leu Lys Asn Asn Pro Ala Arg Ile Val Pro Ile Ala Ile
    370                 375                 380
Glu Gly Cys Glu Asn Glu Gly Asp Asn Lys Leu Cys Gln Leu Glu Thr
385                 390                 395                 400
Phe Gln Lys Lys Val Ala Gln Val Ile Glu Pro Thr Cys His Ile
                405                 410                 415
<210>  49
<211>  415
<212>  PRT
<213>  莫氏耶尔森氏菌（Yersinia mollaretii）
<400>  49
Val Ala Ala Pro Ala Ala Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln Leu Met Asn
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asp Lys Trp Pro Gln Trp Pro Val Gln Ala Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Gly Asp Tyr Phe Arg Ser Gln Gly Leu Leu Pro Thr Gly Cys Pro Ala
65                  70                  75                  80
Asp Gly Thr Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ile Asp Gln Arg Thr Arg Leu
                85                  90                  95
Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile Ala Pro Gly Cys Asp Leu Lys
            100                 105                 110
Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Val Asp Pro Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Glu Ala Gly Val Cys Gln Leu Asp Ser Ala Gln Thr His Gln Ala
    130                 135                 140
Ile Glu Ala Arg Leu Gly Ala Pro Leu Ser Glu Leu Ser Gln Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe Ala Ala Ser
                165                 170                 175
Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Gln Gln Gln Gly Lys Ser Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Thr Phe Ala Ala Asn Glu Val Lys Val Asn Gln Gln Gly Thr Lys Val
        195                 200                 205
Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Gln Asn Ser Gln Gly Met Pro Asp Val Ala Trp His Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ala Glu Asn Trp Val Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Gln Ile Met Thr Ala Leu Val Leu Gln Arg Lys Gly
        275                 280                 285
Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Glu Gln Thr Lys Leu Leu Phe Leu
    290                 295                 300
Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Ala
305                 310                 315                 320
Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly
                325                 330                 335
Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Gln Tyr Val
            340                 345                 350
Ala Val Lys Met Phe Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn Ser Glu
        355                 360                 365
Lys Leu Asp Leu Lys Ser His Pro Ala Gly Ile Val Pro Ile Glu Ile
    370                 375                 380
Glu Ser Cys Glu Asn Ile Gly Thr Asp Lys Leu Cys Gln Leu Asp Thr
385                 390                 395                 400
Phe Gln Lys Arg Val Ala Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys His Ile
                405                 410                 415
<210>  50
<211>  415
<212>  PRT
<213>  罗氏耶尔森氏菌（Yersinia rohdei）
<400>  50
Val Ile Thr Ala Pro Ala Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln Leu Met Asn
            20                  25                  30
Glu Val Thr Pro Asp Lys Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Ala Gly Tyr
        35                  40                  45
Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Leu Gly Ala Phe Tyr
    50                  55                  60
Gly Glu Tyr Phe Arg Ser Gln Gly Leu Leu Pro Ala Gly Cys Pro Pro
65                  70                  75                  80
Glu Gly Thr Val Tyr Ala Gln Ala Asp Ile Asp Gln Arg Thr Arg Leu
                85                  90                  95
Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Val Ala Pro Gly Cys Gly Leu Glu
            100                 105                 110
Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Thr Asp Pro Leu Phe His Pro
        115                 120                 125
Val Glu Ala Gly Val Cys Lys Val Asp Leu Ala Gln Thr Arg Gln Ala
    130                 135                 140
Val Glu Gln Arg Leu Gly Gly Pro Leu Thr Thr Leu Ser Gln Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Val Leu Asn Phe Ala Glu Ser
                165                 170                 175
Pro Phe Cys Lys Ser Leu Gln Gln Lys Gly Lys Thr Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Thr Phe Ala Ala Asn Glu Ile Asp Val Asn Lys Asp Gly Thr Lys Ile
        195                 200                 205
Ser Leu Thr Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ala Met Pro Asp Val Ala Trp His Arg Leu
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ala Glu Asn Trp Val Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Gln Ile Asn Thr Ala Leu Val Leu Gln Arg Asp Ala
        275                 280                 285
Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Pro Gln Thr Lys Val Leu Phe Leu
    290                 295                 300
Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Ala
305                 310                 315                 320
Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly
                325                 330                 335
Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln His Pro Asp Asn His Gln Arg Tyr Val
            340                 345                 350
Ala Val Lys Met Phe Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn Val Glu
        355                 360                 365
Lys Leu Asn Leu Thr Thr Asn Pro Ala Gly Ile Ile Pro Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Gly Cys Glu Asn Met Gly Asp Asp Lys Leu Cys Gln Leu Glu Thr
385                 390                 395                 400
Phe Glu Lys Lys Ile Ala Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys His Ile
                405                 410                 415
<210>  51
<211>  410
<212>  PRT
<213>  大肠杆菌（Escherichia coli）
<400>  51
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1               5                   10                  15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
            20                  25                  30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
        35                  40                  45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln
    50                  55                  60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65                  70                  75                  80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
                85                  90                  95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
            100                 105                 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
        115                 120                 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
    130                 135                 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
                165                 170                 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
            180                 185                 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
        195                 200                 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
    210                 215                 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225                 230                 235                 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
                245                 250                 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
            260                 265                 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
        275                 280                 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
    290                 295                 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305                 310                 315                 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
                325                 330                 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
            340                 345                 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
        355                 360                 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
    370                 375                 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385                 390                 395                 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
                405                 410
<210>  52
<211>  413
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  US8101391-0002
<400>  52
Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Glu Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Gly Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asn Leu Glu Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Thr Cys Ser Met Asp Lys Thr Arg Leu Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Thr Pro Ile Glu Asn Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Pro Ser Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser Thr
                165                 170                 175
Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu Ala
            180                 185                 190
Gln Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Lys Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Asp Trp Ala Glu Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asp Pro Asn Ala Thr Ala
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ser Gly Met Leu Asn Met Arg
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Ile Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ala Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ala Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Pro Thr Phe Lys Arg
385                 390                 395                 400
Val Val Ser Gln Ser Glu Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln
                405                 410
<210>  53
<211>  413
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  US8101391-0004
<400>  53
Ser Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Ile Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Ser Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Lys Phe Gln Gln Lys Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Gly Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asn Leu Glu Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Thr Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Met Pro Ile Glu Asn Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Pro Ser Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser Thr
                165                 170                 175
Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu Ala
            180                 185                 190
Gln Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Thr Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Ala His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Ser Asn Ala Leu Glu Pro Lys Ala Asp Val
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Ser Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Asn Met Arg
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Ile Ser Val
            340                 345                 350
Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ala Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Asn Glu Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  54
<211>  413
<212>  PRT
<213>  亚氏火球菌（Pyrococcus yayanosi）
<400>  54
Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys His Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asp Ile Lys Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Thr Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Thr Pro Ile Asp Asn Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Pro Phe Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser Lys
                165                 170                 175
Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu Gly
            180                 185                 190
Leu Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Val Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Asn Met Arg
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ser Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Asn Gln Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln
                405                 410
<210>  55
<211>  411
<212>  PRT
<213>  变形肥杆菌（Obesumbacterium proteus）
<400>  55
Ser Glu Thr Glu Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Ala Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Lys Phe Gln Gln Leu Gly Ile Leu Ser Lys Gly Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys His Leu
            100                 105                 110
Ser Ile His His Gln Gln Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Val Cys Thr Met Glu Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Gln Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Gln Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Ala Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Cys Gln Gln His Ser Ala Asp Gln Thr Cys Asp Leu Ala
            180                 185                 190
Gln Ala Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Asp Ala Ala Trp Gly Lys Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Asp Trp Asn Ala Leu Leu Thr Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Ser Ala Ile Asn Ser Gln Pro Ser Ser
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Glu Leu Ser Ala Asp Asn Lys Ile Leu Phe Pro Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Phe Gly Met Ser
305                 310                 315                 320
Trp Ala Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Trp Ser Asp Lys Thr Gly Lys Lys Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Gln Met Met Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Asp Lys Pro Ala Gly Ser Val Ala Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Ala Lys Gln Asn Glu Leu Val Glu Cys Gln
                405                 410
<210>  56
<211>  413
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  US8143046-0001
<400>  56
Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys His Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asp Ile Lys Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Thr Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Thr Pro Ile Asp Asn Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Pro Phe Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser Thr
                165                 170                 175
Ser Ala Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu Gly
            180                 185                 190
Leu Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Val Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ala Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Asn Met Arg
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ser Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Asn Gln Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln
                405                 410
<210>  57
<211>  413
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  US8143046-0003US8143046-0003
<400>  57
Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Thr Asp Val Ala Gln Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Gly Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asn Leu Glu Lys Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln Thr Pro Ile Asp Asn Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Pro Ser Leu Ala Leu Met Asn Thr Thr Leu Asn Phe Ser Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Trp Cys Gln Lys His Ser Ala Asp Lys Ser Cys Asp Leu Gly
            180                 185                 190
Leu Ser Met Pro Ser Lys Leu Ser Ile Lys Asp Asn Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Ser Leu Asp Gly Ala Ile Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Gln Ala Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Ala Leu Leu Leu Lys Leu His Asn Val Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Asn Met Arg
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Leu Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Ser Met Val Tyr Gln Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ser Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Asn Gln Pro Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asn Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Val Val Ser Gln Ser Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln
                405                 410
<210>  58
<211>  411
<212>  PRT
<213>  布氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）
<400>  58
Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg
1               5                   10                  15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val
            20                  25                  30
Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr
        35                  40                  45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu
    50                  55                  60
Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro
65                  70                  75                  80
Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
                85                  90                  95
Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val
            100                 105                 110
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val
        115                 120                 125
Lys Met Gly Lys Cys Ser Phe Asn Thr Leu Gln Val Lys Asn Ala Ile
    130                 135                 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Asn Ile Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Tyr Gln
145                 150                 155                 160
Ser Ser Phe Arg Thr Leu Glu Asn Val Leu Asn Phe Ser Gln Ser Glu
                165                 170                 175
Thr Cys Lys Thr Thr Glu Lys Ser Thr Lys Cys Thr Leu Pro Glu Ala
            180                 185                 190
Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Thr Pro Asp Asn Val Ser Leu Pro Gly
        195                 200                 205
Ala Trp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln Glu
    210                 215                 220
Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu Lys
225                 230                 235                 240
Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp
            260                 265                 270
Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg Tyr
        275                 280                 285
Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp Thr
    290                 295                 300
Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu Pro
305                 310                 315                 320
Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu Lys
                325                 330                 335
Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe Val
            340                 345                 350
Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu Glu
        355                 360                 365
Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu Lys
    370                 375                 380
Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile Lys
385                 390                 395                 400
Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu
                405                 410
<210>  59
<211>  413
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  US8557555-0013
<400>  59
Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asn Val Thr Pro His Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Glu Arg Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Ala Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ile His His Gln Gln Asn Ile Gln Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Ser Gln Ala His Ala
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Thr Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Ala Ser Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Asn Ile Gly Lys Leu Cys Asp Phe Ser
            180                 185                 190
Gln Ala Met Pro Ser Arg Leu Ala Ile Asn Asp Asp Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu His Ala Gln Gly Met Pro Lys Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Thr Glu Gln Gln Trp Asp Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Ala His Ala Leu Gly Ser Asn Ile Ala Ser
        275                 280                 285
Arg Pro Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ser Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Trp Val Asp Asn Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Asn Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu His Asp Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Gln His Pro Ala Gly Ser Val Arg Leu Asn Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Ser Asp Gln Thr Pro Asp Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Ser Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn His Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  60
<211>  414
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  US8557555-0024
<400>  60
Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro His Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Glu Arg Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Ala Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ile His His Gln Gln Asn Ile Thr Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asn Lys Ser Gln Thr Tyr Glu
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Gly Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Asn Ile Gly Lys Leu Cys Asp Phe Ser
            180                 185                 190
Gln Ala Met Pro Ser Arg Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Gly Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Asn Glu Ser Gln Trp Lys Ser Leu Leu Asn Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asn Leu Met His Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Ala Ile Ser Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asn
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Gln Tyr Val Ala
            340                 345                 350
Val Lys Met Ile Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn Ser Glu Lys
        355                 360                 365
Leu Asp Leu Lys Ser Asn Pro Ala Gly Ile Val Pro Ile Glu Ile Glu
    370                 375                 380
Gly Cys Glu Asn Ile Gly Thr Asp Lys Leu Cys Gln Leu Asp Thr Phe
385                 390                 395                 400
Gln Lys Arg Val Ala Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys Gln Ile
                405                 410
<210>  61
<211>  411
<212>  PRT
<213>  大肠杆菌（E. coli）K12
<400>  61
Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp
            20                  25                  30
Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu
        35                  40                  45
Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg
    50                  55                  60
Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Glu Gly Cys Pro Gln
65                  70                  75                  80
Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr
            100                 105                 110
Val His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Arg Arg Ala
    130                 135                 140
Ile Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Arg His Tyr
145                 150                 155                 160
Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser
                165                 170                 175
Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr
            180                 185                 190
Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asp Val Ser Leu
        195                 200                 205
Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu
    210                 215                 220
Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp
225                 230                 235                 240
Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Val Phe Asp
                245                 250                 255
Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu
            260                 265                 270
Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln
        275                 280                 285
Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His
    290                 295                 300
Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr
305                 310                 315                 320
Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe
                325                 330                 335
Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser
            340                 345                 350
Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser
        355                 360                 365
Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu
    370                 375                 380
Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile
385                 390                 395                 400
Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
                405                 410
<210>  62
<211>  413
<212>  PRT
<213>  未知序列
<220>
<223>  WO2010034835-0001
<400>  62
Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Glu Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro His Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Glu Arg Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Ala Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ile His His Gln Gln Asn Thr Gln Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Ser Gln Val His Ala
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Thr Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln Arg
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Ala Ser Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Asn Ile Gly Lys Leu Cys Asp Phe Ser
            180                 185                 190
Gln Ala Met Pro Ser Arg Leu Ala Ile Asn Asp Asp Gly Asn Lys Val
        195                 200                 205
Ala Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ala Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu His Ala Gln Gly Met Pro Lys Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Thr Glu Gln Gln Trp Asn Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Ala His Ala Leu Gly Ser Asn Ile Thr Ser
        275                 280                 285
Arg Pro Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ser Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Arg Trp Val Asp Asn Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Asn Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu His Asp Gln Ala Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Gln His Pro Ala Gly Ser Val Arg Leu Asn Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Ser Asp Gln Thr Pro Asp Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Ser Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Ser His Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  63
<211>  20
<212>  PRT
<213>  里氏木霉（T. reesei）
<400>  63
Met Gln Thr Phe Gly Ala Phe Leu Val Ser Phe Leu Ala Ala Ser Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Ala
            20
<210>  64
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  64
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Ala
        275                 280                 285
Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  65
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  65
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Val Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Met Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Arg Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  66
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  66
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Val Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Ser Gly Asp Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala His
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  67
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  67
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  68
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  68
Ser Glu Thr Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  69
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  69
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  70
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  70
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  71
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  71
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Asp Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  72
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  72
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Ala
        275                 280                 285
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    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  73
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  73
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Ala Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  74
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  74
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr Gln Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  75
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  75
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  76
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  76
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Val Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  77
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  77
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  78
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  78
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Ser Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  79
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  79
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  80
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  80
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  81
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  81
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Ala Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  82
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  82
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Lys Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  83
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  83
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
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Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Gln Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  84
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  84
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
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Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
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Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Arg Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  85
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  85
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  86
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  86
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Arg Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Gln
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Gln Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn Thr Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Thr
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  87
<211>  413
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  87
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Leu Met Arg
            20                  25                  30
Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro Leu Gly Tyr
        35                  40                  45
Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly Gly Phe Tyr
    50                  55                  60
Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp Asn Cys Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln Arg Thr Arg
                85                  90                  95
Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu Cys Asp Leu
            100                 105                 110
Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Ala Asp Pro Leu Phe His
        115                 120                 125
Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln
    130                 135                 140
Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu Asn Gln His
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn Phe Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys Asp Phe Ala
            180                 185                 190
Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly Asn Glu Val
        195                 200                 205
Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Glu Ile Phe
    210                 215                 220
Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp Gly Asn Ile
225                 230                 235                 240
His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His Asn Ala Tyr
                245                 250                 255
Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly Thr
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu Phe Leu Ala
    290                 295                 300
Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu Gly Met Asp
305                 310                 315                 320
Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Leu Phe Glu Leu Trp Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val
            340                 345                 350
Lys Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu
        355                 360                 365
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys
    370                 375                 380
Asp Asp Gln Thr Ala Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg
385                 390                 395                 400
Leu Val Asn Gln Val Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                405                 410
<210>  88
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  88
Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val
1               5                   10
<210>  89
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  89
His Ala Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val
1               5                   10
<210>  90
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  90
Ser Ala Ala Glu Pro Ala Val Arg His Leu Glu Arg Val
1               5                   10
<210>  91
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  91
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala
1               5                   10
<210>  92
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  92
Ser Glu Ala Ala Pro Ala Gly Tyr His Leu Gln Lys Ala
1               5                   10
<210>  93
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  93
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Gly Tyr His Leu Asp Lys Ala
1               5                   10
<210>  94
<211>  88
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  94
Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Val Phe Glu Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Asp Asn Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ser Val Asn Met Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Thr Leu Ala Gln Leu His Asp Gln Ala Pro Leu Thr Leu Gln His Pro
        35                  40                  45
Ala Gly Ser Val Arg Leu Asn Ile Pro Gly Cys Ser Asp Gln Thr Pro
    50                  55                  60
Asp Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Ser Arg Leu Val Ser His Ser
65                  70                  75                  80
Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                85
<210>  95
<211>  89
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  95
Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp
1               5                   10                  15
Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Gln Tyr Val Ala Val Lys Met Phe Tyr
            20                  25                  30
Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn Ser Glu Lys Leu Asp Leu Lys Ser
        35                  40                  45
His Pro Ala Gly Ile Val Pro Ile Glu Ile Glu Gly Cys Glu Asn Ile
    50                  55                  60
Gly Thr Asp Lys Leu Cys Gln Leu Asp Thr Phe Gln Lys Arg Val Ala
65                  70                  75                  80
Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys His Ile
                85
<210>  96
<211>  88
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  96
Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Val Phe Glu Arg Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Lys Ser Gly Lys Gln Tyr Val Ser Val Ser Met Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Thr Leu Glu Gln Leu Arg Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Asn Gln Pro
        35                  40                  45
Ala Gly Ser Val Gln Leu Lys Ile Pro Gly Cys Asn Asp Gln Thr Ala
    50                  55                  60
Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Thr Arg Val Val Ser Gln Ser
65                  70                  75                  80
Val Glu Pro Gly Cys Gln Leu Gln
                85
<210>  97
<211>  88
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  97
Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Leu Phe Glu Leu Trp
1               5                   10                  15
Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val Lys Met Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Gln Thr Pro Leu Thr Leu Lys Glu Pro
        35                  40                  45
Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys Asp Asp Gln Thr Ala
    50                  55                  60
Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg Leu Val Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                85
<210>  98
<211>  88
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  98
Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Leu Phe Glu Leu Trp
1               5                   10                  15
Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val Lys Met Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu Thr Leu Lys Glu Pro
        35                  40                  45
Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys Asp Asp Gln Thr Ala
    50                  55                  60
Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg Leu Val Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                85
<210>  99
<211>  88
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  99
Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala Leu Leu Phe Glu Leu Trp
1               5                   10                  15
Ser Asp Lys Asp Gly Thr Gln Tyr Val Ser Val Lys Met Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Thr Leu Ala Gln Leu Arg Asn Met Thr Pro Leu Thr Leu Lys Glu Pro
        35                  40                  45
Ala Gly Ser Val Pro Leu Lys Ile Pro Gly Cys Asp Asp Gln Thr Ala
    50                  55                  60
Glu Gly Tyr Cys Pro Leu Asp Thr Phe Thr Arg Leu Val Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro
                85
<210>  100
<211>  312
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  100
Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Met Arg Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly
        35                  40                  45
Gly Phe Tyr Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Ser Cys Pro Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln
65                  70                  75                  80
Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu
                85                  90                  95
Cys Asp Leu Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro
            100                 105                 110
Leu Phe His Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln
        115                 120                 125
Val Gln Gln Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu
    130                 135                 140
Asn Gln His Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn
145                 150                 155                 160
Phe Pro Lys Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys
                165                 170                 175
Asp Phe Ala Asn Ala Phe Pro Ser Lys Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly
            180                 185                 190
Asn Glu Val Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala
        195                 200                 205
Glu Ile Phe Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp
    210                 215                 220
Gly Asn Ile His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His
                245                 250                 255
Asn Gly Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn
            260                 265                 270
Thr Thr Glu Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu
        275                 280                 285
Phe Leu Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu
    290                 295                 300
Gly Met Thr Trp Thr Leu Pro Gly
305                 310
<210>  101
<211>  312
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  101
Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln
1               5                   10                  15
Leu Met Arg Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Lys Leu Met Gly
        35                  40                  45
Gly Phe Tyr Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Asn Cys Pro Thr Pro Asp Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln
65                  70                  75                  80
Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu
                85                  90                  95
Cys Asp Leu Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro
            100                 105                 110
Leu Phe His Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln
        115                 120                 125
Val Gln Gln Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu
    130                 135                 140
Asn Gln His Tyr Arg Ala Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn
145                 150                 155                 160
Phe Pro Lys Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Gln Pro Cys
                165                 170                 175
Asp Phe Ala Gln Met Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly
            180                 185                 190
Asn Glu Val Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala
        195                 200                 205
Glu Ile Phe Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp
    210                 215                 220
Gly Asn Ile His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Ala Tyr Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His
                245                 250                 255
Asn Gly Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Pro Asn
            260                 265                 270
Ala Thr Glu Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu
        275                 280                 285
Phe Leu Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu
    290                 295                 300
Gly Met Asp Trp Thr Leu Pro Gly
305                 310
<210>  102
<211>  312
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  102
Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln
1               5                   10                  15
Leu Met Arg Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly
        35                  40                  45
Gly Phe Tyr Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Arg Cys Pro Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln
65                  70                  75                  80
Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu
                85                  90                  95
Cys Asp Leu Thr Ile His His Gln Asn Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro
            100                 105                 110
Leu Phe His Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln
        115                 120                 125
Val Gln Gln Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu
    130                 135                 140
Asn Gln His Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn
145                 150                 155                 160
Phe Pro Lys Ser Pro Tyr Cys Arg Gln His Ser Val Glu Gln Pro Cys
                165                 170                 175
Asp Phe Ala Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly
            180                 185                 190
Asn Glu Val Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala
        195                 200                 205
Glu Ile Phe Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp
    210                 215                 220
Gly Asn Ile His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His
                245                 250                 255
Gln Gly Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn
            260                 265                 270
Thr Thr Glu Ser Lys Leu Pro Asp Ile Ser Pro Ser Val Lys Ile Leu
        275                 280                 285
Phe Leu Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu
    290                 295                 300
Gly Met Thr Trp Thr Leu Pro Gly
305                 310
<210>  103
<211>  312
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  103
Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln
1               5                   10                  15
Leu Met Arg Asp Val Thr Pro Tyr Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Val Ser Leu Met Gly
        35                  40                  45
Gly Phe Tyr Arg Gln Tyr Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Arg Cys Pro Thr Ala Asn Asp Val Tyr Val Trp Thr Asp Val Asn Gln
65                  70                  75                  80
Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Glu
                85                  90                  95
Cys Asp Leu Thr Ile His His Gln Ser Asp Ile Lys Gln Val Asp Pro
            100                 105                 110
Leu Phe His Pro Leu Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln
        115                 120                 125
Val Gln Gln Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Met Pro Ile Asp Lys Leu
    130                 135                 140
Asn Gln His Tyr Arg Pro Glu Leu Ala Leu Met Ser Asn Val Leu Asn
145                 150                 155                 160
Phe Pro Lys Ser Pro Tyr Cys Gln Arg His Ser Gly Glu Lys Pro Cys
                165                 170                 175
Asp Phe Ala Asn Ala Phe Pro Ser Tyr Leu Asn Ile Ser Asp Asp Gly
            180                 185                 190
Asn Glu Val Gln Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala
        195                 200                 205
Glu Ile Phe Leu Leu Glu Tyr Ala Gln Gly Met Pro Val Val Ala Trp
    210                 215                 220
Gly Asn Ile His Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asp Leu Leu Lys Leu His
225                 230                 235                 240
Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Glu Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His
                245                 250                 255
Asn Gly Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ile Val Asn Ala Leu Asn Ser Asn
            260                 265                 270
Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Val Lys Ile Leu
        275                 280                 285
Phe Leu Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu
    290                 295                 300
Gly Met Thr Trp Thr Leu Pro Gly
305                 310
<210>  104
<211>  431
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  人工序列
<400>  104
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Thr Ser Ala Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val
            20                  25                  30
Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln
        35                  40                  45
Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Leu Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly
65                  70                  75                  80
His Tyr Trp Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys
                85                  90                  95
Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu
            100                 105                 110
Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp
        115                 120                 125
Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro
    130                 135                 140
Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn
145                 150                 155                 160
Val Thr Asp Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe
                165                 170                 175
Thr Gly His Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn
            180                 185                 190
Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp
    210                 215                 220
Cys Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu
225                 230                 235                 240
Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly
                245                 250                 255
Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn
            260                 265                 270
Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg
        275                 280                 285
Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro
    290                 295                 300
Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe
305                 310                 315                 320
Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu
                325                 330                 335
Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly
            340                 345                 350
Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp
        355                 360                 365
Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys
    370                 375                 380
Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu
385                 390                 395                 400
Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly
                405                 410                 415
Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
            420                 425                 430

Claims (43)

1.一种动物饲料丸粒或预混物，其包含：
(a)工程化的植酸酶多肽或其包含植酸酶活性的片段，所述植酸酶多肽或其片段与SEQID NO：1所示的氨基酸序列具有至少82％的序列同一性；以及
(b)液体或固体载剂。
2.如权利要求1所述的丸粒，其中所述载剂包含水、甘油、甘油酯、乙二醇、1，2-丙二醇或1，3-丙二醇中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的丸粒，其中所述载剂是选自由藻酸盐、明胶、纤维素衍生物、多糖、糖蜜和啤酒糟组成的组的一种或多种水胶体。
4.如权利要求1所述的丸粒，其中所述载剂是以下中的一种或多种：糖蜜、原糖蜜、啤酒糟、液体发酵副产物、液体玉米浆、液体小麦酒糟、液体玉米酒糟、液体大麦酒糟、谷物酒糟、液体玉米麸质粉、来自乙醇加工的液体副产物、来自谷物加工的液体副产物、来自麸质生产的液体副产物。
5.如权利要求1所述的丸粒，其中所述载剂能够被熔化。
6.如权利要求5所述的丸粒，其中所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种载剂：动物油或脂肪、植物油或脂肪、甘油三酯、游离脂肪酸、动物蜡、蜂蜡、羊毛脂、贝壳蜡、虫白蜡、植物蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、杨梅蜡、甘蔗蜡、矿物蜡、合成蜡、天然和合成树脂以及它们的混合物。
7.如权利要求6所述的丸粒，其中所述脂肪酸是选自由以下组成的组的一种或多种：中链脂肪酸(MCFA)、月桂酸、C8+C10混合物、丁酸、乳酸、丙酸、甲酸和琥珀酸。
8.如权利要求6所述的丸粒，其中所述脂肪是动物脂肪或油和/或植物脂肪或油。
9.如权利要求8所述的丸粒，其中所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：低芥酸菜籽油、棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、大豆油、葵花油、红花油、椰子油、棕榈油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和菜籽油。
10.如权利要求8所述的丸粒，其中所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：完全硬化的棕榈油、完全硬化的菜籽油、完全硬化的棉籽油和完全硬化的大豆油。
11.如权利要求9或权利要求10所述的丸粒，其中所述植物脂肪或油是棕榈油或完全硬化的棕榈油。
12.如权利要求1所述的丸粒，其中所述液体载剂是液体乳清、液体脱乳糖乳清、液体酸乳清、液体奶、来自工业清洁的液体奶、液体加工奶中的一种或多种。
13.如权利要求2-12中任一项所述的丸粒，其中所述载剂是卵磷脂、卵磷脂甘油混合物或卵磷脂脂肪酸混合物中的一种或多种。
14.如权利要求1所述的丸粒，其中所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种化合物：赖氨酸、赖氨酸硫酸盐、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
15.如权利要求1所述的丸粒，其中所述载剂是甲硫氨酸。
16.如权利要求15所述的丸粒，其中甲硫氨酸呈L-甲硫氨酸的形式，或呈合成的甲硫氨酸源的形式，诸如OLM(即DL-甲硫氨酸)或所有其盐15形式、其类似物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸或所有其盐形式)、其衍生物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸异丙酯或任何其他酯)或其混合物。
17.如权利要求2-16中任一项所述的丸粒，其中所述载剂是蛋白质的水解产物。
18.如权利要求2-17中任一项所述的丸粒，其中所述载剂是液体载剂。
19.如权利要求2-17中任一项所述的丸粒，其中所述载剂是固体载剂。
20.如权利要求1-19中任一项所述的丸粒，其进一步包含维生素和/或矿物质。
21.如权利要求1-20中任一项所述的丸粒，其中所述工程化的植酸酶多肽或其片段呈颗粒形式。
22.一种用于生产动物饲料丸粒或预混物的方法，其包括组合(a)工程化的植酸酶多肽或其包含植酸酶活性的片段，所述植酸酶多肽或其片段与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少82％的序列同一性；以及(b)液体或固体载剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述载剂包含水、甘油、甘油酯、乙二醇、1，2-丙二醇或1，3-丙二醇中的一种或多种。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述载剂是选自由藻酸盐、明胶、纤维素衍生物、多糖、糖蜜和啤酒糟组成的组的一种或多种水胶体。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述载剂是以下中的一种或多种：糖蜜、原糖蜜、啤酒糟、液体发酵副产物、液体玉米浆、液体小麦酒糟、液体玉米酒糟、液体大麦酒糟、谷物酒糟、液体玉米麸质粉、来自乙醇加工的液体副产物、来自谷物加工的液体副产物、来自麸质生产的液体副产物。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述载剂能够被熔化。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种载剂：动物油或脂肪、植物油或脂肪、甘油三酯、游离脂肪酸、动物蜡、蜂蜡、羊毛脂、贝壳蜡、虫白蜡、植物蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、杨梅蜡、甘蔗蜡、矿物蜡、合成蜡、天然和合成树脂以及它们的混合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述脂肪酸是选自由以下组成的组的一种或多种：中链脂肪酸(MCFA)、月桂酸、C8+C10混合物、丁酸、乳酸、丙酸、甲酸和琥珀酸。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述脂肪是动物脂肪或油和/或植物脂肪或油。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：低芥酸菜籽油、棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、大豆油、葵花油、红花油、椰子油、棕榈油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和菜籽油。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述植物脂肪或油选自由以下组成的组：完全硬化的棕榈油、完全硬化的菜籽油、完全硬化的棉籽油和完全硬化的大豆油。
32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述植物脂肪或油是棕榈油或完全硬化的棕榈油。
33.如权利要求22所述的方法，其中所述液体载剂是液体乳清、液体脱乳糖乳清、液体酸乳清、液体奶、来自工业清洁的液体奶、液体加工奶中的一种或多种。
34.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中所述载剂是卵磷脂、卵磷脂甘油混合物或卵磷脂脂肪酸混合物中的一种或多种。
35.如权利要求22所述的方法，其中所述载剂是选自由以下组成的组的一种或多种化合物：赖氨酸、赖氨酸硫酸盐、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
36.如权利要求22所述的方法，其中所述载剂是甲硫氨酸。
37.如权利要求36所述的方法，其中甲硫氨酸呈L-甲硫氨酸的形式，或呈合成的甲硫氨酸源的形式，诸如OLM(即DL-甲硫氨酸)或所有其盐15形式、其类似物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸或所有其盐形式)、其衍生物(例如2-羟基-4-甲硫基丁酸异丙酯或任何其他酯)或其混合物。
38.如权利要求21-37中任一项所述的方法，其中所述载剂是蛋白质的水解产物。
39.如权利要求21-38中任一项所述的方法，其中所述载剂是液体载剂。
40.如权利要求21-38中任一项所述的方法，其中所述载剂是固体载剂。
41.如权利要求21-40中任一项所述的方法，其进一步包括组合维生素和/或矿物质。
42.如权利要求21-41中任一项所述的方法，其中所述工程化的植酸酶多肽或其片段呈颗粒形式。
43.如权利要求21-42中任一项所述的方法，其进一步包括(c)将所述植酸酶和载剂的组合制粒。
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