CN114828642A

CN114828642A - 用于消化道健康的组合物

Info

Publication number: CN114828642A
Application number: CN202080087798.1A
Authority: CN
Inventors: J·T·甘农; M·W·博斯蒂克; A·陈; R·E·杰克逊; V·V·凯利; A·D·科帕提斯; C·朗; 王琼; J·耶格; R·W·叶
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2022-07-29
Also published as: WO2021080864A3; BR112022007613A2; US20220395543A1; EP4048081A2; WO2021080864A2; CN114828642A8

Abstract

本文尤其提供了产短链脂肪酸(SCFA)微生物的组合物，以及制备和使用这些组合物来抑制动物胃肠道中病原性细菌群体并额外促进动物的一项或多项指标改善的方法，该一项或多项指标是例如增加的体重增重、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落。

Description

用于消化道健康的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月21日提交的美国临时专利申请号62/923,781的优先权，该临时专利申请的公开内容以其全文并入本文。

技术领域

本文尤其提供了可用于改善动物消化道健康和/或性能的多菌株直接饲喂微生物细菌聚生体以及制备和使用该多菌株直接饲喂微生物细菌聚生体的方法。

背景技术

在禽类等单胃动物物种中，胃肠道和肠相关的微生物区系不仅参与消化和吸收，而且还与免疫和中枢神经系统相互作用以调节健康。肠道的内部涂覆有粘稠的薄层粘液，并且数百万的细菌和其他微生物包埋在该粘液层中。当肠细菌处于平衡(即，有益细菌的数量超过有害细菌)时，可以说消化道处于健康状态。健康的微生物群为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的定殖抗力、必需营养素的生物合成和吸收以及维持健康的消化道上皮和适当控制的全身免疫的免疫刺激。在“微生态失衡”或共生遭破坏的情况下，微生物群功能可能会丧失或紊乱，导致对病原体的易感性增加、代谢特征改变或促炎信号的诱导，其可能会导致局部或全身炎症或自身免疫。因此，家禽的肠微生物群在许多疾病和障碍的发病机理中起到重要作用，这些疾病和障碍包括诸如球虫病或坏死性肠炎等消化道的多种病原性感染。

在过去的几年中，政府和消费者对动物饲料行业施加的压力越来越大，要求减少或缩减抗生素作为动物营养饲喂方案的组成部分的使用。这种压力在很大程度上是由于认识到使用此类抗生素会导致耐抗生素病原性微生物的增加。然而，这种“永不使用抗生素”的消费趋势，尤其是在家禽行业，导致了细菌性疾病(特别是坏死性肠炎)的再度出现(Poultry Science[家禽科学],第97卷,第6期,2018年6月1日,1929-1933)。坏死性肠炎是由某些产毒素的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)菌株引起的。在某些条件下，产气荚膜梭菌产生的毒素会在小肠中引起病变，并最终导致受感染的禽类的生长减缓或死亡。据此，目前公认需要能够在不使用传统上使用的抗生素的情况下减少家养动物如禽类消化道中的病原性细菌群体的产品和方法。

本文所公开的主题解决了这些需求且还提供了额外的益处。

发明内容

本文尤其提供了产短链脂肪酸(SCFA)微生物的多菌株直接饲喂微生物细菌聚生体，以及制备和使用这些聚生体来抑制动物(如禽类，例如，鸡)胃肠道中病原性细菌群体并另外促进动物的一项或多项指标改善的方法，该一项或多项指标是例如增加的体重增重、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落。

据此，在一些方面，本文提供了包含直接饲喂微生物(DFM)的饲料添加剂组合物，这些饲料添加剂组合物包含一种或多种生物学纯的人结肠厌氧棍状菌(Anaerotruncuscolihominis)细菌菌株。在一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含一种、两种、三种或四种人结肠厌氧棍状菌菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(Westerdijk Fungal Biodiversity Institute，WFDB)，保藏号为CBS146120；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W2保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146122；c)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W3保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS146123；以及d)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W4保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146121。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)的所有鉴别特征的活菌株；b)人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)的所有鉴别特征的活菌株；c)人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)的所有鉴别特征的活菌株；以及d)人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含生物学纯的a)粪球菌属物种(Coprococcus sp.)细菌菌株；b)乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)细菌菌株；以及c)假毛癣菌(Pseudoflavonifractorcapillosus)细菌菌株。在一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)细菌菌株，其具有与粪球菌属物种菌株M1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该粪球菌属物种菌株M1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146125；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株M2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株M2保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146119；c)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株M3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该乳酸发酵梭菌菌株M3保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146124；以及d)细菌菌株，其具有与假毛癣菌菌株M4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)或具有粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)的所有鉴别特征的活菌株；b)人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)的所有鉴别特征的活菌株；c)乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株；以及d)假毛癣菌菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

在其他方面，本文提供了一种包含直接饲喂微生物(DFM)的饲料添加剂组合物，该饲料添加剂组合物包含产短链脂肪酸(SCFA)细菌菌株的一种或多种生物学纯的细菌菌株和一种或多种生物学纯的产乳酸细菌菌株。在一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)生物学纯的乳酸发酵梭菌菌株；以及b)两种生物学纯的产乳酸细菌菌株。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，这两种生物学纯的产乳酸细菌菌株是唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该乳酸发酵梭菌菌株2F1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为146124；b)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株2F2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该唾液乳杆菌菌株2F2保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146126；以及c)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株2F3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该罗伊氏乳杆菌菌株2F3保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 145921。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物包含a)乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株；b)唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)或具有唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)的所有鉴别特征的活菌株；以及c)罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，a)人结肠厌氧棍状菌菌株W1的16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；b)人结肠厌氧棍状菌菌株W2的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；c)人结肠厌氧棍状菌菌株W3的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列；并且d)人结肠厌氧棍状菌菌株W4的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，a)粪球菌属物种菌株M1的16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列；b)人结肠厌氧棍状菌菌株M2的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列；c)乳酸发酵梭菌菌株M3的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列；并且d)假毛癣菌菌株M4的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，a)乳酸发酵梭菌菌株2F1的16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列；b)唾液乳杆菌菌株2F2的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列；并且c)罗伊氏乳杆菌菌株2F3的该16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物产生选自由以下组成的组的一种或多种短链脂肪酸：丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种酶。在一些实施例中，该一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，每种菌株以至少约1x10³CFU/g饲料添加剂组合物到至少约1x10⁹CFU/g饲料添加剂组合物的浓度存在。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该组合物在已摄取有效量的该直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种(Salmonella sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的至少一种病原体。

在另外的方面，本文提供了一种预混物，其包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种和至少一种矿物质和/或至少一种维生素。在仍其他方面，本文提供了一种饲料或喂养料，其包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种或本文公开的预混物中的任一种。

在另一个方面，本文提供了试剂盒，其包含a)本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种；以及b)针对向动物施用的书面说明。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含一种或多种酶。在一些实施例中，该一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

在另外的方面，本文提供了一种用于改善动物的一项或多项指标的方法，该一项或多项指标选自由以下组成的组：增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落，该方法包括向动物施用有效量的本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种、本文公开的预混物中的任一种、或本文公开的饲料或喂养料中的任一种，从而改善该动物的一项或多项指标。在一些实施例中，该饲料添加剂组合物使该动物的胃肠道的乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和/或戊酸中的一种或多种的含量增加。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该饲料添加剂组合物使动物的胃肠道的丁酸含量增加。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该病原体是产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠杆菌科、沙门菌属物种和/或大肠杆菌中的一种或多种。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该方法进一步治疗、预防坏死性肠炎或降低坏死性肠炎的发生率。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该动物是家养禽类。在一些实施例中，该家养禽类选自由鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸸鹋、鸵鸟和雉鸡组成的组。在一些实施例中，该鸡是肉鸡或蛋鸡。

在其他方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将以下组合：a)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W1保藏于CBS，保藏号为CBS 146120；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W2保藏于CBS，保藏号为CBS 146122；c)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W3保藏于CBS，保藏号为CBS 146123；以及d)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株W4保藏于CBS，保藏号为CBS 146121。在一些实施例中，a)该人结肠厌氧棍状菌菌株W1是人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)的所有鉴别特征的活菌株；b)该人结肠厌氧棍状菌菌株W2是人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS146122)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)的所有鉴别特征的活菌株；c)该人结肠厌氧棍状菌菌株W3是人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)的所有鉴别特征的活菌株；以及d)该人结肠厌氧棍状菌菌株W4是人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

在仍其他方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将以下组合：a)细菌菌株，其具有与粪球菌属物种菌株M1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该粪球菌属物种菌株M1保藏于CBS，保藏号为CBS146125；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株M2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该人结肠厌氧棍状菌菌株M2保藏于CBS，保藏号为CBS 146119；c)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株M3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该乳酸发酵梭菌菌株M3保藏于CBS，保藏号为CBS146124；以及d)细菌菌株，其具有与假毛癣菌菌株M4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。在一些实施例中，该a)粪球菌属物种菌株M1是粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)或具有粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)的所有鉴别特征的活菌株；b)该人结肠厌氧棍状菌菌株M2是人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)的所有鉴别特征的活菌株；以及c)该乳酸发酵梭菌菌株M3是乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

在仍其他方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将以下组合：a)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该乳酸发酵梭菌菌株2F1保藏于CBS，保藏号为CBS146124；b)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株2F2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该唾液乳杆菌菌株2F2保藏于CBS，保藏号为CBS 146126；以及c)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株2F3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，该罗伊氏乳杆菌菌株2F3保藏于CBS，保藏号为CBS145921。在一些实施例中，a)该乳酸发酵梭菌菌株2F1是乳酸发酵梭菌菌株W1(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株；b)该唾液乳杆菌菌株2F2是唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)或具有唾液乳杆菌菌株2F2(CBS146126)的所有鉴别特征的活菌株；并且c)该罗伊氏乳杆菌菌株2F3是罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种酶与该饲料添加剂组合物组合。在一些实施例中，该一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，将至少约1x10³CFU/g饲料添加剂组合物到至少约1x10⁹CFU/g饲料添加剂组合物组合以形成该饲料添加剂组合物。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该方法进一步包括将该饲料添加剂组合物包装。

在另一个方面，本文提供了一种用于制备预混物的方法，该方法包括将本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。在一些实施例中，该方法进一步包括将该预混物包装。

本文所述的方面和实施例中的每个能够一起使用，除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除。

在整个说明书中，援引了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。出于所有目的，本文所引用的所有专利、专利申请和其他出版物的公开通过援引以其全文特此并入。

附图说明

图1A描绘了显示人结肠厌氧棍状菌在培养24小时和48小时时的短链脂肪酸(SCFA)生产的柱状图。图1B描绘了显示乳酸发酵梭菌在培养24小时和48小时时的SCFA生产的柱状图。

图2描绘了显示细菌单独培养以及共培养时的SCFA生产的柱状图。Rl＝粪球菌属物种菌株M1；Ac＝人结肠厌氧棍状菌菌株M2；Cl＝乳酸发酵梭菌菌株M3；并且Pc＝假毛癣菌菌株M4。

具体实施方式

已表明多种微生物物种在体外或体内对消化道病原体具有一定程度的功效。通常研究的生物体已将芽孢杆菌属(Bacillus)或乳杆菌属(Lactobacillus)包括在内。另一组潜在目的微生物是可以产生短链脂肪酸(SCFA)的专性厌氧菌。猜测SCFA，例如，丙酸根和丁酸根(即分别为丙酸和丁酸的共轭碱)具有许多针对消化道健康的有益特性(参见例如，AdvImmunol[免疫学进展].2014；121:91-119；Eur J Pharmacol[欧洲药理学杂志].2018年7月15日；831:52-59；Adv Nutr[营养学进展].2019年1月1日；10(增刊1):S49-S66)。

如本文更详细地描述的，发明人惊奇地发现，将特定种类的产SCFA微生物施用于动物(如家养禽类，例如，鸡)可以改善一项或多项指标的表现，该一项或多项指标包括增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染(如但不限于产气荚膜梭菌感染)和粪便中减少的病原体脱落。不受理论束缚，据信SCFA在预防肠炎症和维持肠稳态方面起重要作用。虽然许多专性厌氧菌具有产生SCFA的能力，但并非所有物种在作为饲料添加剂或作为饲料的一部分施用时都能为动物提供益处。然而，如将在实例部分中描述的，发现施用微生物的特定组合在预防和/或治疗动物消化道发病机理以及维持整体健康方面出人意料地有效。

I.定义

如本文所用，短链脂肪酸(SCFA)(也称为挥发性脂肪酸(VFA))是具有少于六个碳原子的脂肪酸。SCFA的非限制性实例包括甲酸(formic acid)(甲酸(methanoic acid))、乙酸(acetic acid)(乙酸(ethanoic acid))、丙酸(propionic acid)(丙酸(propanoicacid))、丁酸(butanoic acid)(丁酸(butyric acid))、异丁酸(2-甲基丙酸)、戊酸(valeric acid)(戊酸(pentanoic acid))和异戊酸(3-甲基丁酸)。SCFA的这个定义中还包括SCFA的共轭碱，包括但不限于甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、异丁酸根、戊酸根、和异戊酸根。

如本文所用，“微生物(microorganism或microbe)”是指细菌、真菌、病毒、原生动物、和其他微生物或微观生物体。

如本文所用，术语“直接饲喂微生物”是指供动物食用的组合物(即，作为动物饲料或作为动物饲料的组分)，该组合物包含有活力的微生物，即能够生存和繁殖的微生物。参见例如美国专利号8,420,074。直接饲喂微生物可包含本文所述的任何微生物菌株中的一种或多种(如任何1、2、3、4、5或6种或更多种)。

如本文所用，细菌“菌株”是指在生长或繁殖时遗传上保持不变的细菌。包括许多相同的细菌。

“至少一种菌株”意指单一菌株，但也指包含至少两种微生物菌株的菌株混合物。“至少两种菌株的混合物”意指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株混合物的一些实施例中，比例可以在1％至99％之间变化。当混合物包含多于两种菌株时，菌株能以基本上相等的比例或以不同的比例存在于混合物中。

出于本公开的目的，“生物学纯的菌株”意指不包含足以干扰菌株的复制或可通过正常的细菌学技术检测到的量的其他细菌菌株的菌株。当与本文所述的生物体和培养物结合使用时，“分离”不仅包括生物学纯的菌株，而且还包括除自然界中发现的那些之外生长或维持的生物体的任何培养物。在一些实施例中，菌株是菌株W1、W2、W3、W4、M1、M2、M3、M4、2F1、2F2和2F3的突变体、变体或衍生物，这些突变体、变体或衍生物也提供了与由W1、W2、W3、W4、M1、M2、M3、M4、2F1、2F2和2F3所提供的益处相当的益处。在一些实施例中，菌株是具有菌株W1、W2、W3、W4、M1、M2、M3、M4、2F1、2F2和2F3的所有鉴别特征的菌株。此外，每个单独的菌株(W1、W2、W3、W4、M1、M2、M3、M4、2F1、2F2和2F3)或这些菌株的任何组合也可以提供本文所述的一种或多种益处。还将清楚的是，添加其他微生物菌株、载剂、添加剂、酶、酵母等也将在动物中提供一种或多种益处或改善一项或多项指标，并且不会构成实质上不同的DFM。

术语“16S rRNA”或“16S核糖体RNA”意指构成原核生物核糖体小亚基的rRNA。在细菌中，该序列可用于鉴定和表征运算分类单元。

如本文所用，术语“序列同一性”或“序列相似性”意指两个多核苷酸序列(候选序列和参考序列)在候选序列的长度上是相同的(即100％序列同一性)或相似的(即在逐个核苷酸的基础上)。在将候选序列与参考序列进行比较时，如与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，候选序列可包含添加或缺失(即，空位)。用于确定序列同一性的最佳序列比对可以使用本领域已知的任何数量的公开可用的局部比对算法(如ALIGN或Megalign(DNASTAR公司))、或通过检查来进行。

如本文关于参考序列所用的术语“百分比(％)序列同一性”或“百分比(％)序列相似性”定义为在对序列进行最佳比对并在必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考多核苷酸序列中的残基相同的核苷酸残基的百分比。

如本文所用，“预防(prevent、preventing、prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或阻碍障碍或病症(如坏死性肠炎)和/或其伴随症状中的一种或多种的发生或复发，或阻止动物获得或重新获得障碍或病症或降低动物获得或重新获得障碍或病症或其伴随症状中的一种或多种的风险的方法。

如本文所用，关于特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的术语“减少”是指特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的减少。性状、特征、特性、生物过程、或现象可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于100％。

如本文所用的术语“家禽”意指为了它们的蛋、它们的肉或它们的羽毛而由人类饲养的家养禽类。这些禽最典型地是鸡雁总目(Galloanserae)的成员，特别是包括但不限于鸡、鹌鹑、鸭、鹅、鸸鹋、鸵鸟、雉鸡和火鸡的鸡形目(Galliformes)。

如本文所用，“施用(administer或administering)”意指如通过饲喂或通过灌胃将一种或多种微生物菌株、外源性饲料酶和/或菌株以及外源性饲料酶引入动物的行为。

如本文所用，“有效量”意指改善动物的一项或多项指标的DFM和/或外源性酶的数量。对动物的一项或多项指标(如但不限于增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落中的任何一项)的改善可以如本文所述的或通过本领域已知的其他方法测量。可以通过提供自由采食的含有DFM和外源性酶的饲料向动物施用有效量。DFM和外源性酶也能以一剂或多剂施用。

术语“肠健康状态”是指可能会受到例如传染原或非传染性原因(如次优配制的饮食)的影响的消化道壁结构和形态的状态。“消化道壁结构和形态”或“消化道屏障完整性”可以指但不限于其特征为绒毛缩短、隐窝延长和炎性细胞(如但不限于CD3+细胞)的浸润的上皮损伤和上皮渗透率。当使用评分系统(如由Teirlynck等人所述的评分系统(2011))评估时，与“正常”外观相比，后一损伤和炎症标志物也可以与消化道的“严重”肉眼可见的外观相关。

如本文所用，术语“饲料”在本文中与“喂养料”同义使用。饲料广义上是指用于滋养动物并用于维持动物(包括新生或年幼和发育中的动物)的正常或加速生长的液体或固体材料。该术语包括适合于动物(如例如家禽如鹌鹑、鸭、火鸡、和鸡)摄入的化合物、制剂、混合物、或组合物。在一些实施例中，饲料或饲料组合物包含基础食物组合物和一种或多种饲料添加剂或饲料添加剂组合物。如本文所用，术语“饲料添加剂”是指出于用另外的组分强化基础饲料以促进饲料摄入、治疗或预防疾病、或改变代谢的目的而包括的组分。饲料添加剂包括预混物。

如本文所提及的，“预混物”可以是由微量成分组成的组合物，这些微量成分如但不限于维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物、和其他必需成分中的一种或多种。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

如本文所用，“改善动物的一项或多项指标”是指对与动物(如家养禽类，例如，鸡)的生长和/或健康相关的测量值的改善，通过以下参数中的一项或多项来衡量：平均日增重(ADG)、总重、死亡率、饲料转化率(其包括饲料:增重和增重:饲料两者)、饲料摄入、肠健康状态、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染、和粪便中减少的病原体脱落。如本文所用的“指标的改善”或“改善的指标”是指在动物定义中指标下列出的至少一个参数的改善。

如本文所用，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加规定量的饲料量。改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物使动物体重增加指定量而所需饲喂给动物的饲料量低于该饲料不包含所述饲料添加剂组合物的情况下使动物体重增加相同量时所需的饲料量。

某些范围在本文以前面有术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。

除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。

还需注意的是，权利要求书可以经撰写而排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

仍需注意的是，如本文所用的术语“基本上由……组成(consisting essentiallyof)”是指组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总组合物的小于30％重量的总量，并且不会影响或干扰一种或多种组分的作用或活性。

进一步注意到，如本文所用的术语“包含(comprising)”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，但是包含该一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或任选的一种或多种组分。

还要注意的是，如本文所用的术语“由……组成(consisting of)”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。

在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语的其他定义可在本说明书通篇出现。

II.组合物

A.菌株

直接饲喂微生物(DFM)是指在动物(例如家禽)处于应激时期(疾病、口粮变化、环境或生产挑战)时或作为日常营养方案的一部分以预防疾病和促进消化过程中的营养素利用而向动物饲喂的有益微生物。益生菌是这类饲料添加剂的另一种说法。在对照研究中已证明益生菌或DFM可以改善动物的表现。在一些实施例中，DFM包括直接饲喂的细菌和/或基于酵母的产品两者，并且在特定实施例中，包括有活力的微生物。术语“有活力的微生物”意指具有代谢活性或能够分化的微生物。

在一个实施例中，DFM可以是形成孢子的细菌并且因此术语DFM可以指由孢子组成或包含孢子(例如细菌孢子)的组合物。因此，在一个实施例中，如本文所用的术语“有活力的微生物”可以包括微生物孢子，如内生孢子或分生孢子。在另一个实施例中，根据本发明的饲料添加剂组合物中的DFM不由微生物孢子组成或不包含微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子(即，DFM不形成孢子)。

本文提供的菌株包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1、人结肠厌氧棍状菌菌株W2、人结肠厌氧棍状菌菌株W3、人结肠厌氧棍状菌菌株W4、粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、假毛癣菌菌株M4、乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3，这些菌株在本文分别也称为W1、W2、W3、W4、M1、M2、M3、M4、2F1、2F2和2F3。

人结肠厌氧棍状菌菌株W1、人结肠厌氧棍状菌菌株W2、人结肠厌氧棍状菌菌株W3、和人结肠厌氧棍状菌菌株W4于2019年10月9日保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，Uppsalalaan 8,3584 CT，荷兰乌特勒支(Utrecht,The Netherlands)，并且分别给出保藏号CBS 146120、CBS 146122、CBS 146123和CBS 146121。保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure)的规定进行的。本文提供的一种或多种菌株可以用作直接饲喂微生物(DFM)。

粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、和乳酸发酵梭菌菌株M3于2019年10月9日保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，Uppsalalaan 8,3584CT，荷兰乌特勒支(Utrecht,The Netherlands)，并且分别给出保藏号CBS 146125、CBS 146119和CBS 146124。保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行的。本文提供的一种或多种菌株可以用作直接饲喂微生物(DFM)。

乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3于2019年7月24日和2019年10月9日保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，Uppsalalaan8,3584CT，荷兰乌特勒支(Utrecht,The Netherlands)，并且分别给出保藏号CBS 146124、CBS 146126和CBS 145921。保藏是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行的。本文提供的一种或多种菌株可以用作直接饲喂微生物(DFM)。可以将多种直接饲喂微生物菌株组合成单一组合物(例如，饲料添加剂组合物或饲料)，从而形成多菌株DFM。

DFM组合物可以包括含有一种或多种(如任何约1、2、3、4、5、6、7或8种或更多种菌株)人结肠厌氧棍状菌菌株的那些。该微生物是革兰氏阳性、不形成孢子、杆状并且厌氧的细菌，来自厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)，已经观察到该微生物存在于人类粪便中(Lau等人,J Clin Pathol[临床病理学杂志].2006年7月；59(7):748-752)。

DFM组合物可以包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3和/或W4中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1(SEQ ID NO:1)、W2(SEQ ID NO:2)、W3(SEQ ID NO:3)、和/或W4(SEQ ID NO:4)中的一种或多种的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列。在一些实施例中，DFM组合物仅包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3或W4。在另一个实施例中，DFM组合物包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W2；人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W3；人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W2和W3；人结肠厌氧棍状菌菌株W2和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W3和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、和W3；人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W3、和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W2、W3、和W4；或人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3、和W4。另外，当一起培养时，一种或多种人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3和/或W4具有单独培养的人结肠厌氧棍状菌菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于所产生的短链脂肪酸的量和/或类型的变化、代谢特征的变化和/或细菌一起培养的培养基(如丁酸)的组成的变化。

本文提供的DFM组合物可以包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3和/或W4中的一种或多种(即，这些组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。

DFM组合物可以另外包括含有粪球菌属物种微生物、人结肠厌氧棍状菌微生物、乳酸发酵梭菌微生物、和/或假毛癣菌微生物中的一种或多种的那些。粪球菌属是革兰氏阳性厌氧球菌属，其已经在人类粪便菌丛中观察到。该属在生物化学上与瘤胃球菌属(Ruminococcus)密切相关，并且在系统发育上与毛螺菌属(Lachnospira)密切相关。乳酸发酵梭菌是革兰氏阳性杆状细菌，末端呈锥形，无运动性，且无孢子形成(van der Wielen等人，Int J Syst Evol Microbiol.[国际系统和进化微生物学杂志]2002年5月；52(部分3):921-5)。假毛癣菌是健康人类消化道的正常革兰氏阴性驻留细菌。在对三名健康成年人的结肠微生物群进行的一项基于16S rDNA序列的全面计数中，它平均占所有16S rDNA序列的0.008％，占其分支中序列的0.016％(Eckburg等人,Science[科学]2005年6月10日；308(5728):1635-8)。它也与人类囊肿和伤口相关，并且已知会导致新生儿败血症。

DFM组合物可以包括粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和/或假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与粪球菌属物种菌株M1(SEQ ID NO:5)、人结肠厌氧棍状菌菌株M2(SEQ ID NO:6)、乳酸发酵梭菌菌株M3(SEQ ID NO:7)和/或假毛癣菌菌株M4(SEQ IDNO:8)中的一种或多种的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列。在一些实施例中，DFM组合物仅包括粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3或假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)。在另一个实施例中，DFM组合物包括粪球菌属物种菌株M1和人结肠厌氧棍状菌菌株M2；粪球菌属物种菌株M1和乳酸发酵梭菌菌株M3；粪球菌属物种菌株M1和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；人结肠厌氧棍状菌菌株M2和乳酸发酵梭菌菌株M3；人结肠厌氧棍状菌菌株M2和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；乳酸发酵梭菌菌株M3和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；粪球菌属物种M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、和乳酸发酵梭菌菌株M3；粪球菌属物种菌株M1、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株a(如假毛癣菌菌株M4)；或粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)。另外，当一起培养时，一种或多种粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和/或假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)具有单独培养的菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于短链脂肪酸生产的量和/或类型的变化(如仅在这些微生物一起培养时才能观察到的戊酸的生产)。

本文提供的DFM组合物可以包括一种或多种粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和/或假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)(即，这些组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。

本文提供的DFM组合物可以另外包括含有乳酸发酵梭菌微生物、唾液乳杆菌微生物、和/或罗伊氏乳杆菌微生物中的一种或多种的那些。乳酸发酵梭菌是革兰氏阳性杆状细菌，末端呈锥形，无运动性，且无孢子形成(van der Wielen等人，Int J Syst EvolMicrobiol.[国际系统和进化微生物学杂志]2002年5月；52(部分3):921-5)。唾液乳杆菌是乳酸菌，其是人类和仓鼠的固有微生物群的一部分(Raftis等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学],2011年1月,77(3)954-965)。最近有越来越多的研究探索了不同唾液乳杆菌菌株的益生菌效用(Neville&O’Toole，FutureMicrobiol.[未来微生物学]2010,5:759-774)。罗伊氏乳杆菌是革兰氏阳性细菌，其天然栖息在哺乳动物和禽类的消化道中。

DFM组合物可以包括乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和/或罗伊氏乳杆菌菌株2F3中的一种或多种，或一种或多种微生物，该一种或多种微生物具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1(SEQ ID NO:9)、唾液乳杆菌菌株2F2(SEQ ID NO:10)和/或罗伊氏乳杆菌菌株2F3(SEQ ID NO:11)中的一种或多种的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列。在一些实施例中，DFM组合物仅包括乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、或罗伊氏乳杆菌菌株2F3。在另一个实施例中，DFM组合物包括乳酸发酵梭菌菌株2F1和唾液乳杆菌菌株2F2；乳酸发酵梭菌菌株2F1和罗伊氏乳杆菌菌株2F3；唾液乳杆菌菌株2F2和罗伊氏乳杆菌菌株2F3；乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3。另外，当一起培养时，一种或多种乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和/或罗伊氏乳杆菌菌株2F3具有单独培养的菌株所缺乏的一种或多种生理或代谢特性。这些特性可以包括但不限于所产生的短链脂肪酸的量和/或类型的变化(如仅在这些微生物一起培养时才能观察到的乳酸的生产)、代谢特征的变化和/或细菌一起培养的培养基的组成的变化。

本文提供的DFM组合物可以包括一种或多种乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3(即，组合物包括来自这些菌株的真正细菌)和/或衍生自这些菌株的培养(单独或共培养)的一种或多种培养上清液。

B.外源性酶

补充性酶可用作动物饲料特别是家禽和猪饲料的添加剂，作为提高营养素利用率和改善性能特征的手段。

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种DFM(如含有本文公开的任何微生物菌株的DFM)和一种或多种外源性饲料酶。在另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和一种或多种外源性饲料酶、由该多菌株DFM和一种或多种外源性饲料酶组成或基本上由其组成。在一个实施例中，外源性饲料酶包括但不限于木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶。在仍另一个实施例中，组合物包含饲料添加剂。

1.木聚糖酶

木聚糖酶是向将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶给出的名称。木聚糖酶，例如内切-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)水解木聚糖主链。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和一种或多种木聚糖酶。

在一个实施例中，木聚糖酶可以是任何可商购的木聚糖酶。合适地，木聚糖酶可以是内切-1,4-P-d-木聚糖酶(分类为E.G.3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(分类为E.G.3.2.1.37)。在一个实施例中，本公开涉及与内切木聚糖酶(例如，内切-1,4-P-d-木聚糖酶)和另一种酶组合的DFM。本文提到的所有E.C.酶分类涉及在国际生物化学与分子生物学联合会(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)命名委员会的Enzyme Nomenclature–Recommendations[酶命名法-推荐](1992)–ISBN 0-12-226164-3中提供的分类，将其并入本文

在另一个实施例中，木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(Trichodermna)、嗜热真菌属(Therinomyces)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的木聚糖酶。在仍另一个实施例中，该木聚糖酶可以是Axtra

或Avizyme

中的木聚糖酶，两者都是来自丹尼斯科公司(Danisco A/S)的可商购的产品。在一个实施例中，木聚糖酶可以是两种或更多种木聚糖酶的混合物。在仍另一个实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。在又另一个实施例中，木聚糖酶来自选自由以下组成的组的生物体：芽孢杆菌属、木霉属、嗜热真菌属、曲霉属、青霉属、和腐质霉属(Humicola)。在又另一个实施例中，木聚糖酶可以是表1中引用的一种或多种木聚糖酶或一种或多种商业产品。

表1：代表性的商业木聚糖酶

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和木聚糖酶。在一个实施例中，组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的木聚糖酶单位/g组合物。

在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000和大于8000的木聚糖酶单位/g组合物。

应当理解，一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃，每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物释放0.5μmol的还原糖等价物(为木糖，通过二硝基水杨酸(DNS)测定-还原糖方法)的酶量。(Bailey等人,Journal of Biotechnology[生物技术杂志],第23卷,(3),1992年5月,257-270)。

2.淀粉酶

淀粉酶是能够将淀粉水解为较短链的寡糖(例如麦芽糖)的一类酶。那么，与从原始的淀粉分子转移相比，葡萄糖部分可以更容易地从麦芽糖转移到单甘油酯或糖基单甘油酯。术语淀粉酶包括α-淀粉酶(E.G.3.2.1.1)、形成G4的淀粉酶(E.G.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.G.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。淀粉酶可以是细菌或真菌来源的，或是化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和一种或多种淀粉酶。

在一个实施例中，该淀粉酶可以是两种或更多种淀粉酶的混合物。在另一个实施例中，该淀粉酶可以是例如来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶的淀粉酶和例如来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶的淀粉酶。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是Axtra

或Avizyme

中的α-淀粉酶，两者都是来自丹尼斯科公司的可商购的产品。在又另一个实施例中，该淀粉酶可以是抗胃蛋白酶的α-淀粉酶，例如抗胃蛋白酶的木霉属(例如里氏木霉(Trichoderma reesei))α淀粉酶。在英国申请号101 1513.7(其通过援引并入本文)和PCT/IB2011/053018(其通过援引并入本文)教导了合适的抗胃蛋白酶的α-淀粉酶。

在一个实施例中，用于本发明的淀粉酶可以是表2引用的一种或多种商业产品中的一种或多种淀粉酶。

表2：代表性的商业淀粉酶

应当理解，一个淀粉酶单位(AU)是在pH 6.5和37℃，每分钟从非水溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶量。(这在本文中可被称为用于确定1AU的测定法)。

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和淀粉酶。在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM、木聚糖酶和淀粉酶。在一个实施例中，该组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的淀粉酶单位/g组合物。

在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的淀粉酶单位/g组合物。

3.蛋白酶

如本文所用的术语蛋白酶(protease)与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(E.G.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.G.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.G.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.G.3.4.X.X)。在一个实施例中，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和一种或多种蛋白酶。

碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如，美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例还包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体。

在另一个实施例中，蛋白酶可以是表3中引用的一种或多种商业产品中的一种或多种蛋白酶。

表3：代表性的商业蛋白酶

商业蛋白酶的代表性示例

在一个实施例中，蛋白酶选自由以下组成的组：枯草杆菌蛋白酶、芽孢杆菌溶素、碱性丝氨酸蛋白酶、角蛋白酶和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶。

应当理解，一个蛋白酶单位(PU)是在pH 7.5(40mM Na₂PO₄/乳酸缓冲液)和40℃，一分钟内从底物(0.6％酪蛋白溶液)释放一微克酚类化合物(表示为酪氨酸等价物)的酶量。这可被称为用于确定1PU的测定法。

在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和蛋白酶。在另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和木聚糖酶以及蛋白酶。在仍另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和淀粉酶以及蛋白酶。在又另一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和木聚糖酶、淀粉酶以及蛋白酶。

在一个实施例中，该组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的蛋白酶单位/g组合物。

在一个实施例中，该组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的蛋白酶单位/g组合物。

4.植酸酶

在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含多菌株DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)和一种或多种植酸酶。用于本发明的植酸酶可以分类为6-植酸酶(分类为E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(分类为E.C.3.1.3.8)。在一个实施例中，用于本发明的植酸酶可以是下表4中的一种或多种商业产品中的一种或多种植酸酶：

表4：代表性的商业植酸酶

在一个实施例中，植酸酶是柠檬酸杆菌属(Citrobacter)植酸酶，该柠檬酸杆菌属植酸酶衍生自例如弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，优选地，例如如在WO 2006/038062(通过援引并入本文)和WO 2006/038128(通过援引并入本文)中公开的弗氏柠檬酸杆菌NCIMB 41247及其变体，如在WO 2004/085638中公开的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)YH-15，如在WO 2006/037328(通过援引并入本文)公开的布氏柠檬酸杆菌ATCC51113，以及例如如在WO 2007/112739(通过援引并入本文)和WO 2011/117396(通过援引并入本文)中公开的其变体；无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)，优选地，如在WO 2006037327(通过援引并入本文)中公开的无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC 25405或丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌ATCC 25407；吉伦氏柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii)，优选地，如在WO 2006037327(通过援引并入本文)中公开的吉伦氏柠檬酸杆菌DSM 13694；或中间柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedius)、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、啮齿类柠檬酸杆菌(Citrobacter murliniae)、鼠类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)、沃克曼氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)；柠檬酸杆菌物种多肽或其变体。

在一些实施例中，该植酸酶是以丹尼斯科公司Phyzyme XP^TM的名称销售的大肠杆菌植酸酶。替代性地，植酸酶可以是布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶，例如乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)植酸酶，例如，在WO 2006/043178、WO 2008/097619、WO 2009/129489、WO 2008/092901、PCT/US 2009/41011或PCT/IB 2010/051804中教导的植酸酶，所有这些文献通过援引并入本文。

在一个实施例中，植酸酶可以是来自哈夫尼亚菌属(Hafnia)(例如来自蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei))的植酸酶，如US 2008263688中教导的一种或多种植酸酶，将该文献通过援引并入本文。在一个实施例中，植酸酶可以是来自曲霉属(例如来自米曲霉(Apergillus orzyae))的植酸酶。在一个实施例中，植酸酶可以是来自青霉属(例如来自绳状青霉(Penicillium funiculosum))的植酸酶。

优选地，植酸酶按以下范围存在于喂养料中：约200FTU/kg至约1000FTU/kg饲料、更优选地约300FTU/kg饲料至约750FTU/kg饲料、更优选地约400FTU/kg饲料至约500FTU/kg饲料。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于喂养料中：多于约200FTU/kg饲料、合适地多于约300FTU/kg饲料、合适地多于约400FTU/kg饲料。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于喂养料中：少于约1000FTU/kg饲料、合适地少于约750FTU/kg饲料。优选地，植酸酶按以下范围的量存在于饲料添加剂组合物中：约40FTU/g至约40,000FTU/g组合物、更优选地约80FTU/g组合物至约20,000FTU/g组合物、以及甚至更优选地约100FTU/g组合物至约10,000FTU/g组合物、以及甚至更优选地约200FTU/g组合物至约10,000FTU/g组合物。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于饲料添加剂组合物中：多于约40FTU/g组合物、合适地多于约60FTU/g组合物、合适地多于约100FTU/g组合物、合适地多于约150FTU/g组合物、合适地多于约200FTU/g组合物。在一个实施例中，植酸酶按以下量存在于饲料添加剂组合物中：少于约40,000FTU/g组合物、合适地少于约20,000FTU/g组合物、合适地少于约15,000FTU/g组合物、合适地少于约10,000FTU/g组合物。

应当理解，如本文所用，1FTU(植酸酶单位)定义为在ISO 2009植酸酶测定法(用于确定植酸酶活性的标准测定法)中定义的反应条件下，在一分钟内从底物释放1μmol无机正磷酸盐所需的酶量，并且1FTU可在国际标准ISO/DIS 30024:1-17,2009中找到。在一个实施例中，使用上述E.C.分类法将酶分类，并且当以本文教导的用于确定1FTU的测定法测试时，E.C.分类法对具有该活性的酶进行命名。

C.DFM配制品

在一个实施例中，可以将DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)以及任选地外源性酶配制为液体、干粉或颗粒。在一个实施例中，可以将这些DFM和外源性酶配制为单一混合物。在另一个实施例中，可以将这些DFM和外源性酶配制为单独的混合物。在仍另一个实施例中，DFM和外源性酶的单独的混合物可以同时或不同时施用。在仍另一个实施例中，DFM和外源性酶的单独的混合物可以同时或依序施用。在又另一个实施例中，可以施用包含DFM的第一混合物，随后施用包含外源性酶的第二混合物。在仍另一个实施例中，可以施用包含外源性酶的第一混合物，随后施用包含DFM的第二混合物。

干粉或颗粒可通过本领域的技术人员已知的方式，例如在顶喷式流化床包覆器中、在Wurster型底喷式流化床中或者通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、锅式涂层或在微成分混合器中进行制备。

在另一个实施例中，可以对DFM和/或一种或多种酶进行涂覆，例如封装。合适地，可以将DFM和酶配制在相同的涂层内或封装在相同的胶囊内。替代性地，可将一种或多种酶配制在相同的涂层内或封装在相同的胶囊内，同时可将DFM配制在与这些酶分离的涂层中。

在一些实施例中，如在DFM能够产生内生孢子的情况下，可以提供没有任何涂层的DFM。在此类情况下，可以将DFM内生孢子简单地与一种或多种酶混合。在后一种情况下，可以对酶进行涂覆，例如封装，例如可以对所有酶中的一种或多种进行涂覆，例如封装。可以将这些酶封装为(即包含一种或多种、两种或多种、三种或更多种或全部)酶的混合物，或者可以将它们单独封装(例如作为单一的酶)。在一个优选的实施例中，可以将所有酶涂覆(例如封装)在一起。在一个实施例中，涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。

在另一个实施例中，可以将这些DFM和外源性饲料酶与饲料混合或在饮用水中施用。在一个实施例中，用于纳入到水中的剂量范围为约1×10³CFU/动物/天至约1×10¹⁰CFU/动物/天，例如，约1×10⁷CFU/动物/天。

D.饲料添加剂组合物

在一个实施例中，本文提供了饲料添加剂组合物，其包含一种或多种DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选地一种或多种外源性饲料酶。在一个实施例中，能以任何合适的方式配制饲料添加剂组合物，以确保配制品包含有活力的DFM和任选地活性酶。

在一个实施例中，饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其可替代物的形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、胚珠剂、药丸、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。

在另一个实施例中，该饲料添加剂组合物能以固体形式使用。在一个实施例中，该固体形式是丸粒形式。固体形式的饲料添加剂组合物还可以含有以下中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。

用于制备这些形式的营养上可接受的载剂的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。

在一个实施例中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO 2007/044968(称为TPT颗粒)或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述(这些文献各自通过援引并入本文)。

在一个实施例中，可以将饲料添加剂组合物配制成包含以下的颗粒饲料组合物：包含一种或多种DFM(如本文公开的任何多菌株DFM组合物)以及任选地一种或多种外源性饲料酶和至少一个涂层的活性剂。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留活性。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留选自由以下组成的组的活性水平：50％-60％活性、60％-70％活性、70％-80％活性、80％-85％活性、85％-90％活性、和90％-95％活性。

在另一个实施例中，颗粒可以含有一个涂层。涂层可包含构成颗粒的至少55％w/w的水分水合材料。在另一个实施例中，颗粒可以含有两个涂层。这两个涂层可为水分水合涂层和防潮层涂层。在一些实施例中，该水分水合涂层可为颗粒的25％w/w至60％w/w并且该防潮层涂层可为颗粒的2％w/w至15％w/w。该水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且该防潮层涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

在又另一个实施例中，颗粒可使用饲料制丸方法产生并且该饲料预处理方法可在70℃与95℃之间(如在85℃与95℃之间)进行长达若干分钟。在另一个实施例中，该颗粒可使用蒸汽加热制丸方法产生，该方法可在85℃与95℃之间进行长达若干分钟。

在一个实施例中，该颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮层涂层并且水分水合材料可为无机盐。该水分水合涂层可在该颗粒的25％与45％w/w之间并且该防潮层涂层可在该颗粒的2％至20％w/w之间。

在一个实施例中，活性剂在选自以下中的一种或多种条件后保留活性：(a)饲料制丸方法；(b)蒸汽加热饲料预处理方法；(c)储存；(d)作为未制丸混合物中的成分储存；和(e)作为包含至少一种选自以下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱、和导致酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。

在一些实施例中，可以使用稀释剂(如淀粉粉末、石灰石等)对DFM(例如DFM内生孢子)进行稀释。在一个实施例中，DFM和酶可以处于适合食用的液体配制品中，优选地，此类液体食用品包含以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。在另一个实施例中，可以通过将一种或多种酶施加(例如喷涂)于载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举例而言，该预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一个实施例中，DFM和外源性饲料酶可用至少一种生理上可接受的载剂配制，该载剂选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

在另一个实施例中，该饲料添加剂组合物可以作为水性悬浮液和/或酏剂递送。可将该饲料添加剂组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(如水、丙二醇和甘油)进行组合，以及它们的组合。

E.喂养料

在另一个实施例中，本文提供了含有本文公开的任何多菌株DFM组合物的饲料添加剂组合物，其可用作饲料或用于制备饲料。饲料可以是溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。当用作饲料或用于制备饲料(如功能性饲料)时，该饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载剂、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。

在一个实施例中，将本文公开的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。在一个实施例中，该饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可以将本文公开的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分、或复合饲料的预混物混合，或将其混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。

在一个实施例中，秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属(brassicas)、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自天然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树-干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。用于复合饲料的主要成分是饲料谷物，这些饲料谷物包括玉米、大豆、高粱、燕麦、和大麦。

如本文所提及的“预混物”可以是由微量成分构成的组合物，这些微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

在一个实施例中，如本文公开的喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及其组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(Distillers Dried GrainSoluble)(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；获得自以下来源的蛋白：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；获得自植物和动物来源的油和脂肪；以及矿物质和维生素。

在又另一个实施例中，喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦，大麦，黑麦，燕麦，来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白来源也可视为高纤维：获得自来源如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的蛋白。

在仍另一个实施例中，该饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、干椰肉、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新割的草和其他饲用植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；寡糖；糖渍饲用植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

在一个实施例中，将本文公开的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。替代性地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。在另一个实施例中，使饲料添加剂组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。在仍另一个实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物可以与受控量的DFM和任选地酶一起应用、散布、涂覆和/或浸渍于产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。

在又另一个实施例中，DFM和任选的酶可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。

在一个实施例中，将DFM和任选的酶同时应用于喂养料。在又另一个实施例中，将DFM和任选的酶在被递送至喂养料或喂养料的原始成分之前混合。

在一个实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物中的DFM能以合适的浓度添加，包括但不限于在最终饲料产品中提供约2×10³CFU至约2×10¹¹CFU、约2×10⁶至约1×10¹⁰、和约3.75×10⁷CFU至约1×10¹⁰CFU的日剂量的浓度。

III.方法

A.用于改善动物的性能指标的方法

本文进一步提供了用于提高动物的性能指标的方法。在另一个实施例中，本公开涉及提高禽类的性能指标的方法。在仍另一个实施例中，本公开涉及提高家禽(其包括但不限于肉鸡、鸡和火鸡)的性能指标的方法。

在又另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物施用包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选地外源性饲料酶的组合物。在仍另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物施用有效量的包含DFM和任选的外源性饲料酶的组合物以提高该动物的性能。该有效量能以一剂或多剂向动物施用。在一个实施例中，该动物是家禽。在仍另一个实施例中，该动物是肉鸡。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选地外源性饲料酶的组合物以增加平均日饲料摄入量。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，该平均日饲料摄入量增加约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加平均日增重。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，该平均日增重增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以提高总增重。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，总增重增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加饲料转化率，该饲料转化率可以通过饲料:增重或增重:饲料来衡量。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，饲料转化率增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加饲料效率。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，饲料效率增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以降低死亡率。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，死亡率降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以降低饲料转化率(FCR)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，FCR降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以增加消化道屏障完整性。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，消化道屏障完整性增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。“消化道屏障完整性”可以指但不限于其特征为绒毛缩短、隐窝延长和炎性细胞(如但不限于CD3+细胞)的浸润的上皮损伤和上皮渗透率。当使用评分系统(如由Teirlynck等人所述的评分系统(2011))评估时，与“正常”外观相比，后一损伤和炎症标志物也可以与消化道的“严重”肉眼可见的外观相关。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以减少或防止病原体感染(如但不限于产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌、沙门菌属物种、和/或大肠杆菌的感染)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，病原体感染减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在另一个实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如家养禽类，例如，鸡)施用有效量的包含DFM(如本文公开的任何多菌株DFM)和任选的外源性饲料酶的组合物以减少或防止粪便中的病原体脱落(如但不限于产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌、沙门菌属物种、和/或大肠杆菌的脱落)。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种多菌株DFM组合物的动物，粪便中的病原体脱落减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。

在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的DFM组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株DFM：人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W1的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1(SEQ ID NO:1)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W2的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W2(SEQ ID NO:2)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W3的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W3(SEQ ID NO:3)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；和/或人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W4的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W4(SEQ IDNO:4)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物。在另一个实施例中，DFM组合物包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W2；人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W3；人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W2和W3；人结肠厌氧棍状菌菌株W2和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W3和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、和W3；人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W3、和W4；人结肠厌氧棍状菌菌株W2、W3、和W4；或人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3、和W4。在一些实施例中，将该一种或多种人结肠厌氧棍状菌菌株以至少1×10⁴CFU/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种人结肠厌氧棍状菌菌株以约1×10⁵CFU/g饲料至约1×10¹⁰CFU/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种人结肠厌氧棍状菌菌株以约1×10⁵CFU/禽类/天或约1×10⁸CFU/禽类/天来饲喂。

在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的DFM组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株DFM：粪球菌属物种菌株M1(CBS146125)、或具有粪球菌属物种菌株M1的所有鉴别特征的菌株、或具有与粪球菌属物种菌株M1(SEQ ID NO:5)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株M2的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株M2(SEQ ID NO:6)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS146124)、或具有乳酸发酵梭菌菌株M3的所有鉴别特征的菌株、或具有与乳酸发酵梭菌菌株M3(SEQ ID NO:7)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；和/或假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)、或具有与假毛癣菌菌株M4(SEQ IDNO:8)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物。在一些实施例中，DFM组合物仅包括粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3或假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)。在另一个实施例中，DFM组合物包括粪球菌属物种菌株M1和人结肠厌氧棍状菌菌株M2；粪球菌属物种菌株M1和乳酸发酵梭菌菌株M3；粪球菌属物种菌株M1和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；人结肠厌氧棍状菌菌株M2和乳酸发酵梭菌菌株M3；人结肠厌氧棍状菌菌株M2和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；乳酸发酵梭菌菌株M3和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；粪球菌属物种M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、和乳酸发酵梭菌菌株M3；粪球菌属物种菌株M1、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)；人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株M4；或粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)。在一些实施例中，将该一种或多种M1、M2、M3和/或M4菌株以至少1×10⁴CFU/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种M1、M2、M3和/或M4菌株以约1×10⁵CFU/g饲料至约1×10¹⁰CFU/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种M1、M2、M3和/或M4菌株以约1×10⁵CFU/禽类/天或约1×10⁸CFU/禽类/天来饲喂。

在仍另一个实施例中，施用给动物(如家养禽类，例如，鸡)的DFM组合物(如饲料或饲料添加剂组合物)是包含以下中的一种或多种的多菌株DFM：乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS146124)、或具有乳酸发酵梭菌菌株2F1的所有鉴别特征的菌株、或具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1(SEQ ID NO:9)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)、或具有唾液乳杆菌菌株2F2的所有鉴别特征的菌株、或具有与唾液乳杆菌菌株2F2(SEQ ID NO:10)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；和/或罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)、或具有罗伊氏乳杆菌菌株2F3的所有鉴别特征的菌株、或具有与罗伊氏乳杆菌菌株2F3(SEQ IDNO:11)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物。在一些实施例中，罗伊氏乳杆菌菌株2F3产生罗伊氏菌素(3-羟基丙醛)。在其他实施例中，罗伊氏乳杆菌菌株2F3不产生罗伊氏菌素(3-羟基丙醛)。在一些实施例中，DFM组合物仅包括乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、或罗伊氏乳杆菌菌株2F3。在另一个实施例中，DFM组合物包括乳酸发酵梭菌菌株2F1和唾液乳杆菌菌株2F2；乳酸发酵梭菌菌株2F1和罗伊氏乳杆菌菌株2F3；唾液乳杆菌菌株2F2和罗伊氏乳杆菌菌株2F3；或乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3。在一些实施例中，将该一种或多种2F1、2F2和/或2F3菌株以至少1×10⁴CFU/动物/天的速率施用于动物。对于家禽，根据一个非限制性实施例，可以将该一种或多种2F1、2F2和/或2F3菌株以约1×10⁵CFU/g饲料至约1×10¹⁰CFU/g饲料来饲喂。在至少一些实施例中，将该一种或多种2F1、2F2和/或2F3菌株以约1×10⁵CFU/禽类/天或约1×10⁸CFU/禽类/天来饲喂。

本文提供的DFM组合物可以例如作为含有菌株的培养液、含有菌株的上清液或培养液的细菌产物来施用。将包含本文提供的DFM和任选的外源性饲料酶的组合物施用于动物可以提高动物的性能。在一个实施例中，将本文提供的DFM施用于动物可以增加平均日饲料摄入量(ADFI)、平均日增重(ADG)或饲料效率(增重:饲料；G:F)(统称为“性能指标”)。可以改善这些性能指标中的一项或多于一项。

能以多种方式中的一种向动物施用包含DFM和外源性饲料酶的组合物。例如，该组合物可以作为兽药以固体形式施用，可以分布在赋形剂中，优选地水，并直接饲喂给动物，能以干燥的形式与饲料材料物理上混合，也可以将该组合物形成为溶液，然后喷洒到饲料材料上。向动物施用本文公开的组合物的方法被认为在技术人员的技能范围内。

当与饲料材料组合使用时，该饲料材料可以包括玉米、大豆粉、副产品像干酒糟及可溶物(DDGS)、以及维生素/矿物质补充剂。也可以使用其他饲料材料。

因此，在至少一些实施例中，通过补充旨在用于动物的饲料，向动物施用有效量的包含DFM和任选的外源性饲料酶的组合物。如本文所用，“补充”是指将有效量的本文提供的细菌直接掺入旨在用于动物的饲料中的行为。因此，动物在饲喂时摄取本文提供的细菌。

B.用于制备饲料添加剂组合物的方法

本文还提供了用于制备饲料添加剂组合物的方法，这些方法包括将本文公开的两种或更多种DFM组合。在一些实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种、3种或4种中的任一者)组合：人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W1的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1(SEQ ID NO:1)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W2的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W2(SEQ ID NO:2)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W3的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W3(SEQ ID NO:3)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；和/或人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W4的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W4(SEQ ID NO:4)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物。在另一个实施例中，将人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W2组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W3组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W1和W4组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W2和W3组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W2和W4组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W3和W4组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2和W3组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W3和W4组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株W2、W3和W4组合；或将人结肠厌氧棍状菌菌株W1、W2、W3和W4组合。

在又另外的实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种、3种或4种中的任一者)组合：粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)、或具有粪球菌属物种菌株M1的所有鉴别特征的菌株、或具有与粪球菌属物种菌株M1(SEQ ID NO:5)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)、或具有人结肠厌氧棍状菌菌株M2的所有鉴别特征的菌株、或具有与人结肠厌氧棍状菌菌株M2(SEQ ID NO:6)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS146124)、或具有乳酸发酵梭菌菌株M3的所有鉴别特征的菌株、或具有与乳酸发酵梭菌菌株M3(SEQ ID NO:7)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；和/或具有假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)的所有鉴别特征的菌株、或具有与假毛癣菌菌株M4(SEQ ID NO:8)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物。在另一个实施例中，将粪球菌属物种菌株M1和人结肠厌氧棍状菌菌株M2组合；将粪球菌属物种菌株M1和乳酸发酵梭菌菌株M3组合；将粪球菌属物种菌株M1和假毛癣菌菌株M4组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株M2和乳酸发酵梭菌菌株M3组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株M2和假毛癣菌菌株M4组合；将乳酸发酵梭菌菌株M3和假毛癣菌菌株M4组合；将粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、和乳酸发酵梭菌菌株M3组合；将粪球菌属物种菌株M1、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株M4组合；将人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株M4组合；或将粪球菌属物种菌株M1、人结肠厌氧棍状菌菌株M2、乳酸发酵梭菌菌株M3、和假毛癣菌菌株M4组合。

在另外的实施例中，该方法包括将以下中的两种或更多种(如2种或3种中的任一者)组合：乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)、或具有乳酸发酵梭菌菌株2F1的所有鉴别特征的菌株、或具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1(SEQ ID NO:9)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)、或具有唾液乳杆菌菌株2F2的所有鉴别特征的菌株、或具有与唾液乳杆菌菌株2F2(SEQ ID NO:10)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物；和/或罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)、或具有罗伊氏乳杆菌菌株2F3的所有鉴别特征的菌株、或具有与罗伊氏乳杆菌菌株2F3(SEQ ID NO:11)的16S核糖体RNA序列呈现出至少约97.0％序列相似性(如约97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、或100％序列相似性中的任一者)的16S核糖体RNA序列的微生物。在另一个实施例中，将乳酸发酵梭菌菌株2F1和唾液乳杆菌菌株2F2组合；将乳酸发酵梭菌菌株2F1和罗伊氏乳杆菌菌株2F3组合；将唾液乳杆菌菌株2F2和罗伊氏乳杆菌菌株2F3组合；或将乳酸发酵梭菌菌株2F1、唾液乳杆菌菌株2F2、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3组合。

另外，用于制备饲料添加剂组合物的方法可以进一步包括将饲料添加剂组合物与本文公开的外源性酶中的一种或多种(例如，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶或β-葡聚糖酶中的一种或多种)组合。该方法可以另外包括包装所述饲料添加剂组合物用于储存或运输的另外的步骤。

IV.试剂盒

本文进一步提供了试剂盒，其含有本文公开的一种或多种DFM(如一种或多种多菌株DFM)。这些试剂盒可以包括本文提供的菌株(这些菌株包括人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)、人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)、人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS146123)、人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)、粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)、人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)、乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)、假毛癣菌菌株(如假毛癣菌菌株M4)、乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)、唾液乳杆菌菌株2F2(CBS146126)、和罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921))中的一种或多种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11种中的任一者)连同用于正确储存、维护以及用于向动物施用以改善一项或多项性能指标的使用说明。在一个实施例中，该试剂盒可以包括菌株W1、W2、W3和/或W4。在另一个实施例中，该试剂盒可以包括菌株M1、M2、M3和/或M4。在另外的实施例中，该试剂盒可以包括菌株2F1、2F2、和/或2F3。这些试剂盒可以另外包括本文公开的外源性酶中的一种或多种(例如，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶或β-葡聚糖酶中的一种或多种)。

通过参照以下实例可以进一步理解本发明，这些实例是为了说明而提供的，而不是为了限制。

实例

实例1：方法和测定

在以下实例中，为了易于阅读，使用如下所阐述的各种方法和测定法。与下面提供的方案的任何偏差均在相关部分中指出。

从鸡肠道中分离厌氧微生物：为了分离严格的厌氧菌，将现场解剖的GIT样品尽快转移到厌氧运输介质中。一旦肠样品抵达实验室，就开始菌株分离。在厌氧室内使用无菌技术对盲肠、回肠、空肠或十二指肠样品进行解剖。弃去消化物并使用环将粘膜结合的材料刮除。然后将该材料转移到无菌培养基或缓冲液中并进行连续稀释。使用铺板珠将范围从10^-1至10^-6的连续稀释液铺板到各种培养基类型的皮氏培养皿或全能板(omni plate)上。然后将这些板在厌氧条件下孵育直到菌落变得可见。对于专性厌氧菌，使用脑心浸液(BHI)培养基。

一旦在琼脂板上可见菌落，就在厌氧室中将菌落挑取到96深孔板中的液体培养基中。一些板最初被挑取到少量液体培养基(即200μl)中，然后在1-4天后添加培养基至800μl以促进生长。对于同一个板，可以在多个时间点进行菌落挑取。例如，在第2天挑取大菌落，然后在第5天挑取非常小的菌落或新菌落。

短链脂肪酸生产的样品制备与分析：通过GC方法评估细菌培养物的上清液中的短链脂肪酸(SCFA)生产。将细胞培养物在4℃以4100RPM离心，并且通过0.2um过滤器多孔板过滤单元(颇尔公司(Pall Corporation)，产品ID 8119)过滤去除300μl的上清液。将150μl过滤后的上清液添加到150μl的0.5％H₃PO₄溶液中，并且通过0.2μm过滤板再次过滤。将140μl制备的上清液样品转移到具有体积插入物的GC小瓶中进行GC-FID分析。

在FFAP柱上进行SCFA的GC分离先前已有报告(Zhao等人2005)。对GC仪器方法进行了改进，从而将样品运行时间减少到大约8分钟。使用配备有FID检测器的安捷伦(Agilent)7890A GC系统进行SCFA色谱分析。使用具有游离脂肪酸相的融合的二氧化硅毛细管柱(安捷伦P/N 122-3232DB-FFAP，30m x 0.25mm直径，0.25μm膜厚)。将氦气用作载体气体。为了延长分析时间，对GC仪器方法进行了优化。入口温度为250℃，其中入口压力为22.192psi。该方法在1.8mL/min载体气体流速的恒流下运行。初始烘箱温度为100℃，维持0.3min，以17.5℃/min升高至240℃，其中在最终240℃温度时没有保持时间。使用这些参数的平均气体速度>42cm/sec。FID的温度为300℃。仪器参数使运行时间缩短至大约8分钟。将GC级标准用于外部校准。

通过16S测序和netB qPCR分析小肠粘膜区域的微生物组成：为了对小肠的微生物组成进行评估，通过16S测序对小肠粘膜区域的鸡拭子进行了分析。将鸡的胃肠道(GIT)去除并分成四个部分：十二指肠、空肠、回肠和盲肠。对每个部分进行挤压以去除消化物内容物，然后纵向切割以暴露内表面。使用FLOQSwab(加利福尼亚州穆列塔市Copan Mfgr公司(Copan Mfgr,Murrieta,CA))对每个部分的内表面进行擦拭。将拭子直接添加到96孔凯杰公司(Qiagen)MagAttract PowerSoil试剂盒(德国希尔登凯杰公司(Qiagen,Hilden,Germany))的孔中。根据制造商的说明，使用KingFisher Flex自动化平台对拭子进行细菌DNA分离处理。然后分离的宏基因组DNA可用于NGS样品制备。

将从鸡GIT拭子中纯化的宏基因组DNA制备用于16S群落测序，如下所示：通过将20μl分子生物学级水以0.1-10ng/μl添加到5μl纯化的DNA中，以1:5稀释DNA。然后将2μl稀释的DNA与25ul不含UNG的ABI Universal TaqMan反应混合物(ABI Universal TaqManReaction mix)(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)#4326614)、0.1μl 100uM的每种PCR引物和24.8μl分子生物学级水一起添加到PCR反应中，总体积为50ul。使用的PCR引物是Illumina-V4-515F-RJ：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA和Illumina-V4-806R-RJ：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反应为：95℃10min，然后95℃15秒+55℃30秒+72℃持续2min的35个循环。根据制造商的说明，使用安捷伦Bravo自动机器人工作站，使用Ampure XP磁珠(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)A63881)对扩增反应进行纯化。然后在第二个PCR反应中使用IlluminaXT索引引物(Illumina XT Index Primers)(Illumina XT v2.0#FC-131-2001-2004)在与上述相同的条件下进行15个循环来对2μl的每个扩增子池进行索引化。然后将索引化的扩增子汇集并在安捷伦Bravo自动机器人工作站上使用AmPure XP磁珠进行纯化。根据制造商的说明，使用Kapa Illumina文库定量试剂盒(Kapa Illumina Library QuantificationKit)(KAPA#KK4835)对汇集的、索引化的扩增子进行定量。将纯化、定量、索引化的池与15％Illumina PhiX(Illumina FC-110-3001)一起加载到Illumina MiSeq上，终浓度为8pM。将测序运行2x250个配对末端循环。

对来自Illumina Miseq测序的16S扩增子数据进行了分析。配对末端读段首先由Flash合并(Mogoc等人,Bioinformatics.[生物信息学]2011；27:2957-63)。从合并的读段中去除正向和反向引物，并通过RDP初始处理工具(RDP Initial Process tool)(Fish等人,Front Microbiol.[微生物前沿]2013；4:291)将总体质量得分低于20的读段舍弃。由于源自鸡线粒体的读段长度短于200bp，该步骤还将这些读段去除。在下一步骤中，通过RDP分类器将读段分配给细菌和古菌分类法(Wang等人,Appl Environ Microbiol.[应用与环境微生物学]73(16):5261-5267)。将通过以上质量处理步骤的读段通过CD-HIT以98％聚类(Li和Godzik,Bioinformatics[生物信息学],2006；22:1658-9)，以获得运算分类单元(OTU)。将来自每个OTU的代表性序列通过RDP双序列比对工具(Fish等人,FrontMicrobiol.[微生物前沿]2013；4:291)针对经过审查的16S参考数据库分配给最近的物种，该参考数据库主要包含来自模式菌株和公共基因组的16S基因。样品中OTU的相对丰度是分配给该OTU的读段的分数。如果OTU与参考数据库中的某一物种具有至少98％的同一性，则将该OTU分配给该物种。将小肠中的聚生体中物种的平均丰度计算为来自每种处理的DUO、JEJ和ILL样品的该物种的平均相对丰度。

还使用qPCR对netB基因的相同DNA制剂进行了定量。NetB是产气荚膜梭菌的重要毒力因子。使用1.5μl DNA连同10μl TaqMan Universal Master Mix、0.2μl 100uM正向和反向引物、0.05μl TaqMan探针和9.55μl分子生物学级水运行每个测定。qPCR反应条件如下：在ABI Quant Studio qPCR仪器上，95℃10min+以下的40个循环：95℃15秒+60℃60秒。使用来自netB阳性产气荚膜梭菌的基因组DNA对样品数据进行定量。所用的引物和探针序列在下表5中。

表5：qPCR引物和探针

实例2：来自肉鸡的专性厌氧细菌的短链脂肪酸生产

基于实例1所述的方法，鉴定出多种产生SCFA的专性厌氧菌，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。表6列出了从鸡肠道分离的细菌的非限制性实例的丁酸和丙酸的生产。它们大多数产生丁酸作为主要的SCFA(图1A)。另一方面，一种菌株——乳酸发酵梭菌M3产生丙酸作为主要的SCFA(图1B)。

表6：某些专性厌氧菌的短链脂肪酸生产(mM)

为了评估产SCFA微生物之间的潜在相互作用，将四种产SCFA微生物混合在BHI培养基中进行共培养。如表6所列，这四种生物体为粪球菌属物种M1、人结肠厌氧棍状菌M2、乳酸发酵梭菌M3、和假毛癣菌M4。分析上清液中SCFA的含量。如表7中所示，来自共培养物的丙酸的量与单个培养物中测量的乳酸发酵梭菌产生的量成比例。然而，共培养物中丁酸生产的量高于任何单个菌株产生的量，这表明存在累加作用。对于戊酸生产，在单独培养的任何单个菌株中均未检测到戊酸。另一方面，共培养物产生了戊酸，这表明存在协同作用(图2)。已证明戊酸具有降低坏死性肠炎的发生率的功效(Poult Sci.[家禽科学]2018年7月1日；97(7):2303-2311)。

表7：按单个培养物和混合培养物比较SCFA特征。

实例3：通过动物研究评估产SCFA细菌对坏死性肠炎的预防

已广泛使用针对肉鸡的激发致病模型(Front Microbiol.[微生物前沿]2016,7:1416；J Anim Sci Biotechnol.[动物科学与生物技术杂志]2018,9:25；Poult Sci.[家禽科学]2018年11月18日)。在该实验中，将鸡在第9天首先用活的1x艾美虫病疫苗(

球虫病疫苗，内布拉斯加州林肯Huvepharma公司(Huvepharma,Inc.,Lincoln,NE 68528)进行激发。实验组和对照组各有十七(17)只禽类。将疫苗用水稀释，并且每只鸡口服接受1ml。在第11天，每只鸡口服接受1ml的病原体混合物。病原体混合物由从患病组织中分离出的五种产气荚膜梭菌菌株组成。基于基因组分析，所有菌株均含有netB和Tpel基因。这些菌株在熟肉培养基(西格玛公司(Sigma))中单独生长过夜，并将新鲜培养物在手套箱中以等体积混合以制成混合物。将混合物在同一天使用以诱导坏死性肠炎。

使用这种疾病模型，对DFM候选物针对产气荚膜梭菌感染的功效进行了评估。对于厌氧细菌，使DFM候选物在厌氧条件下在BHI培养基中生长，并将新鲜培养物在手套箱内以等体积混合，以制成用于动物试验的指定聚生体。在手套箱内，在厌氧条件下，将每种聚生体的混合细胞悬浮液等分到血清瓶中。将血清瓶在80℃储存并在使用前解冻。从第1天开始，每天通过灌胃给每只鸡饲喂DFM聚生体。在第15天，收集鸡肠用于组织病理学分析，并将粘膜样品用于DNA分离，如实例1所述。

DFM聚生体及其菌株组成列于表8。对于第一动物试验，聚生体K和N由不产生SCFA的厌氧微生物组成。只有聚生体M由可以产生SCFA的菌株组成。对于鸡的对照组，没有使用DFM候选物。对于第二动物试验，所有的聚生体都由可以产生SCFA的微生物组成。

表8：用于动物试验的聚生体及其菌株组成的列表

如实例1所述，使用来自第15天的样品基于16S分析的产气荚膜梭菌丰度总结在表9中。聚生体K和N包括不同的厌氧细菌(表8)。这些微生物不产生SCFA。基于16S分析，饲喂了这两种聚生体的鸡与疾病模型组中的鸡显示出相似的产气荚膜梭菌丰度。netB基因的qPCR分析结果显示相似的趋势。这表明这两种DFM聚生体在动物试验中没有显示出对病原体扩张的功效。与这一观察结果一致，组织病理学分析显示这些样品中存在坏死性肠炎。另一方面，聚生体M中产气荚膜梭菌的丰度远远更低。该聚生体由产生SCFA的四种不同的厌氧菌株组成，如实例2所述。有趣的是，如实例2所示，当这四种菌株混合为共培养物时，与单独培养这些菌株时相比，SCFA谱不同。组织病理学显示没有坏死性肠炎的迹象。这表明聚生体M在预防产气荚膜梭菌感染方面具有功效。

为了进一步研究从鸡身上分离出的其他产SCFA的微生物是否对降低坏死性肠炎的发生率有相似的作用，设计并且在另一个动物试验中使用了聚生体2A、Z和W(表8；试验2)。基于16S分析和netB qPCR(表9)，聚生体2A和Z在小肠中显示出高丰度的产气荚膜梭菌。组织病理学分析显示坏死性肠炎恰好与疾病模型相似。这一结果表明，这两种产SCFA聚生体没有影响。另一方面，发现新的聚生体W针对病原体有效。该聚生体由来自人结肠厌氧棍状菌物种的分离株组成。

表9：动物试验的结果

1-CP丰度＝16S CP序列读段/总16S序列读段(实例1)

2-netB qPCR＝qPCR netB拷贝数/qPCR总16S

实例4：产SCFA微生物与乳杆菌属(Lactobacillus)物种的组合

为了研究产SCFA微生物与其他不产生SCFA的潜在DFM候选物的组合，用聚生体2F进行了另一项动物试验(表10)。聚生体2F由来自聚生体M(表6)的SCFA生产者乳酸发酵梭菌M3和两种不同的乳杆菌属分离株组成。

表10：用于试验的组合的SCFA生产者和乳杆菌属聚生体以及菌株组成

如表11所示，与其中未使用DFM候选物的模型相比，基于16S分析和netB PCR定量两者，向动物饲喂聚生体大大减少了CP计数。另外，在用2F聚生体治疗的鸡的小肠中未检测到坏死性肠炎。结果表明，SCFA生产者和2F聚生体中存在的乳杆菌属物种的组合具有预防CP感染的功效。

表11：动物试验的结果

序列

人结肠厌氧棍状菌菌株W1 16S rRNA

人结肠厌氧棍状菌菌株W2 16S rRNA

人结肠厌氧棍状菌菌株W3 16S rRNA

人结肠厌氧棍状菌菌株W4 16S rRNA

粪球菌属物种菌株M1 16S rRNA

人结肠厌氧棍状菌菌株M2 16S rRNA

乳酸发酵梭菌菌株M3 16S rRNA

假毛癣菌菌株M4 16S rRNA

乳酸发酵梭菌菌株2F1 16S rRNA

唾液乳杆菌菌株2F2 16S rRNA

罗伊氏乳杆菌菌株2F3 16S rRNA

Claims

1.一种包含直接饲喂微生物(DFM)的饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含一种或多种生物学纯的人结肠厌氧棍状菌(Anaerotruncus colihominis)细菌菌株。

2.如权利要求1所述的饲料添加剂组合物，其包含四种人结肠厌氧棍状菌菌株。

3.如权利要求1或权利要求2所述的饲料添加剂组合物，其包含a)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146120；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W2保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146122；c)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W3保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146123；以及d)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W4保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146121。

4.如权利要求1-3中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物包含a)人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)的所有鉴别特征的活菌株；b)人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)的所有鉴别特征的活菌株；c)人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)的所有鉴别特征的活菌株；以及d)人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

5.如权利要求1所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含生物学纯的a)粪球菌属物种(Coprococcus sp.)细菌菌株；b)乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)细菌菌株；以及c)假毛癣菌(Pseudoflavonifractor capillosus)细菌菌株。

6.如权利要求5所述的饲料添加剂组合物，其包含a)细菌菌株，其具有与粪球菌属物种菌株M1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述粪球菌属物种菌株M1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146125；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株M2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株M2保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146119；c)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株M3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述乳酸发酵梭菌菌株M3保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146124；以及d)细菌菌株，其具有与假毛癣菌菌株M4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。

7.如权利要求5或6所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物包含a)粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)或具有粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)的所有鉴别特征的活菌株；b)人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)的所有鉴别特征的活菌株；c)乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株；以及d)假毛癣菌菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

8.一种包含直接饲喂微生物(DFM)的饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含产短链脂肪酸(SCFA)细菌菌株的一种或多种生物学纯的细菌菌株和一种或多种生物学纯的产乳酸细菌菌株。

9.如权利要求8所述的饲料添加剂组合物，其包含a)生物学纯的乳酸发酵梭菌菌株；以及b)两种生物学纯的产乳酸细菌菌株。

10.如权利要求8或权利要求9所述的饲料添加剂组合物，其中所述两种生物学纯的产乳酸细菌菌株是唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

11.如权利要求8-10中任一项所述的饲料添加剂组合物，其包含a)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述乳酸发酵梭菌菌株2F1保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为146124；b)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株2F2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述唾液乳杆菌菌株2F2保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS 146126；以及c)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株2F3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株2F3保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(WFDB)，保藏号为CBS145921。

12.如权利要求8-11中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物包含a)乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株；b)唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)或具有唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)的所有鉴别特征的活菌株；以及c)罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

13.如权利要求3或权利要求4所述的饲料添加剂组合物，其中a)人结肠厌氧棍状菌菌株W1的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；b)人结肠厌氧棍状菌菌株W2的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；c)人结肠厌氧棍状菌菌株W3的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列；并且d)人结肠厌氧棍状菌菌株W4的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

14.如权利要求6或权利要求7所述的饲料添加剂组合物，其中a)粪球菌属物种菌株M1的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列；b)人结肠厌氧棍状菌菌株M2的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列；c)乳酸发酵梭菌菌株M3的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列；并且d)假毛癣菌菌株M4的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

15.如权利要求11或权利要求12所述的饲料添加剂组合物，其中a)乳酸发酵梭菌菌株2F1的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列；b)唾液乳杆菌菌株2F2的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列；并且c)罗伊氏乳杆菌菌株2F3的所述16S核糖体RNA序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列。

16.如权利要求1-15中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物产生选自由以下组成的组的一种或多种短链脂肪酸：丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸和戊酸。

17.如权利要求1-16中任一项所述的饲料添加剂组合物，其进一步包含一种或多种酶。

18.如权利要求17所述的饲料添加剂组合物，其中所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

19.如权利要求1-18中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中每种菌株以至少约1x10³CFU/g饲料添加剂组合物到至少约1x 10⁹CFU/g饲料添加剂组合物的浓度存在。

20.如权利要求1-19中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物在已摄取有效量的所述直接饲喂微生物组合物的禽类的胃肠道中抑制选自禽病原性沙门菌属物种(Salmonella sp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的至少一种病原体。

21.一种预混物，其包含如权利要求1-20中任一项所述的饲料添加剂组合物和至少一种矿物质和/或至少一种维生素。

22.一种饲料，其包含如权利要求1-20中任一项所述的饲料添加剂组合物或如权利要求21所述的预混物。

23.一种试剂盒，其包含a)如权利要求1-20中任一项所述的饲料添加剂组合物；以及b)针对向动物施用的书面说明。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种酶。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

26.一种用于改善动物的一项或多项指标的方法，所述一项或多项指标选自由以下组成的组：增加的体重增重、肠健康状态、降低的饲料转化率(FCR)、改善的消化道屏障完整性、降低的死亡率、减少的病原体感染和粪便中减少的病原体脱落，所述方法包括向所述动物施用有效量的如权利要求1-20中任一项所述的饲料添加剂组合物、如权利要求21所述的预混物、或如权利要求22所述的饲料，从而改善所述动物的所述一项或多项指标。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述饲料添加剂组合物使所述动物的胃肠道的乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和/或戊酸中的一种或多种的含量增加。

28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述饲料添加剂组合物使所述动物的胃肠道的丁酸含量增加。

29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述病原体是产气荚膜梭菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠杆菌科、沙门菌属物种和/或大肠杆菌中的一种或多种。

30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步治疗、预防坏死性肠炎或降低坏死性肠炎的发生率。

31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述动物是家养禽类。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述家养禽类选自由鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸸鹋、鸵鸟和雉鸡组成的组。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述鸡是肉鸡或蛋鸡。

34.一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括将以下组合：a)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W1保藏于CBS，保藏号为CBS 146120；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W2保藏于CBS，保藏号为CBS146122；c)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W3保藏于CBS，保藏号为CBS 146123；以及d)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株W4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株W4保藏于CBS，保藏号为CBS 146121。

35.如权利要求34所述的方法，其中a)所述人结肠厌氧棍状菌菌株W1是人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W1(CBS 146120)的所有鉴别特征的活菌株；b)所述人结肠厌氧棍状菌菌株W2是人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W2(CBS 146122)的所有鉴别特征的活菌株；c)所述人结肠厌氧棍状菌菌株W3是人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W3(CBS 146123)的所有鉴别特征的活菌株；以及d)所述人结肠厌氧棍状菌菌株W4是人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株W4(CBS 146121)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

36.一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括将以下组合：a)细菌菌株，其具有与粪球菌属物种菌株M1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述粪球菌属物种菌株M1保藏于CBS，保藏号为CBS 146125；b)细菌菌株，其具有与人结肠厌氧棍状菌菌株M2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述人结肠厌氧棍状菌菌株M2保藏于CBS，保藏号为CBS 146119；c)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株M3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述乳酸发酵梭菌菌株M3保藏于CBS，保藏号为CBS 146124；以及d)细菌菌株，其具有与假毛癣菌菌株M4的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述a)粪球菌属物种菌株M1是粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)或具有粪球菌属物种菌株M1(CBS 146125)的所有鉴别特征的活菌株；b)所述人结肠厌氧棍状菌菌株M2是人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)或具有人结肠厌氧棍状菌菌株M2(CBS 146119)的所有鉴别特征的活菌株；以及c)所述乳酸发酵梭菌菌株M3是乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株M3(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

38.一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括将以下组合：a)细菌菌株，其具有与乳酸发酵梭菌菌株2F1的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述乳酸发酵梭菌菌株2F1保藏于CBS，保藏号为CBS 146124；b)细菌菌株，其具有与唾液乳杆菌菌株2F2的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述唾液乳杆菌菌株2F2保藏于CBS，保藏号为CBS 146126；以及c)细菌菌株，其具有与罗伊氏乳杆菌菌株2F3的16S核糖体RNA序列呈现出至少97.0％序列相似性的16S核糖体RNA序列，所述罗伊氏乳杆菌菌株2F3保藏于CBS，保藏号为CBS 145921。

39.如权利要求34所述的方法，其中a)所述乳酸发酵梭菌菌株2F1是乳酸发酵梭菌菌株W1(CBS 146124)或具有乳酸发酵梭菌菌株2F1(CBS 146124)的所有鉴别特征的活菌株；b)所述唾液乳杆菌菌株2F2是唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)或具有唾液乳杆菌菌株2F2(CBS 146126)的所有鉴别特征的活菌株；并且c)所述罗伊氏乳杆菌菌株2F3是罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)或具有罗伊氏乳杆菌菌株2F3(CBS 145921)的所有鉴别特征的活菌株，这些菌株(i)是单独的；或(ii)与衍生自这些菌株中的每一种的培养上清液组合。

40.如权利要求34-39中任一项所述的方法，其进一步包括将一种或多种酶与所述饲料添加剂组合物组合。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

42.如权利要求34-41中任一项所述的方法，其中将至少约1x10³CFU/g饲料添加剂组合物到至少约1x10⁹CFU/g饲料添加剂组合物组合以形成所述饲料添加剂组合物。

43.如权利要求34-42中任一项所述的方法，其进一步包括将所述饲料添加剂组合物包装。

44.一种用于制备预混物的方法，所述方法包括将如权利要求1-20中任一项所述的饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。

45.如权利要求44所述的方法，其进一步包括将所述预混物包装。