CN102480995A - 用于动物饲料的组分及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于目标动物的发酵液体饲料组合物，该饲料组合物是通过用产乳酸细菌发酵饲料基质来制备的，所述乳酸菌的特征在于：a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的；b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及c)在饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。还提供了生产发酵液体饲料组合物的方法。用于所述组合物和方法中的优选的产乳酸细菌是乳杆菌。

Description

用于动物饲料的组分及其用途
本发明涉及用于动物的饲料物质，涉及提供发酵的动物饲料产品、它们的制备方法及其用途。 
为了避免变质，常规的措施是将动物饲料制备成至多15％水分的干组合物。干饲料物质可以被存储延长的时段和运输而很少会或不会劣化。然而，制备干饲料的成本正逐渐增加。具体地，制备干饲料时，超过60％的能量成本被消耗在实际的干燥阶段。因此，对已知的干动物饲料的替代品存在逐渐增大的需求。 
一种这样的替代品是含水饲料或液体饲料。就此而言，含水饲料，例如饲养小鸡和其他家禽的那些饲料包含按重量计算高达30％的水。液体饲料，例如饲养猪的那些饲料包含按重量计算高达70％的水。已知一段时间内，液体饲料可能难以以有成本效益的方式进行配制、制备和存储。此外，含水饲料或液体饲料难以存储和长距离运输。具体地，湿饲料或液体动物饲料因霉菌、细菌和酵母的生长而非常易于变质，使得长期存储湿的和液体动物饲料前景困难。因此，存在解决存储和运输湿饲料和液体饲料的需求。如果能够扩大制备湿和液体动物饲料的原料的范围也是最有有利的。目前，由例如乳业、焙烤食品业、蒸馏业的副产物和残余物来制备动物用的湿饲料和液体饲料。未来具有相当大潜力的原料是生物乙醇和生物燃料生产的副产物。它们在干燥之后被掺入到食物中，干燥是非常需要能量的处理模式。如果可以发现将这些副产物配制成含水饲料或液体饲料的方式，那么这将是有益的。用于掺入到含水和液体动物饲料中的其他可能的原料来源包括来自屠宰过程的和来自鱼和肉加工的人类食品级残余物。由于不好存储、干燥或处理填埋，因而目前此材料的大部分价值丧失了。所有这些过程具有高的能量需求和不利的环境影响。 
制备湿的和液体动物饲料的一种改进是用一种或多种合适的微生 物接种饲料原料以产生所谓的“发酵饲料”。此过程与“青贮法”同义，青贮法是用于保藏饲养反刍动物用的牧草的普遍方法。选择接种物以抑制将会在饲料材料中增殖并使饲料材料变质的霉菌、酵母和腐败菌的生长。生产发酵饲料的过程可以被看作一种“生物保存”的形式。EP 0 906 952公开了用于青贮稻草的一种菌株。发现这种乳球菌属菌株在青贮新饲料时有效地抑制了酵母、梭菌、霉菌、革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌的生长。 
此外，US 2002/0054935关注适用于催肥家畜，例如牛、山羊、绵羊、猪和家禽的家畜饲料组合物。通过用一种或多种曲霉属(Aspergillus)菌株接种增加了家畜饲料的营养价值。用此方式处理的家畜饲料由纤维饲料材料、谷类作物和有机废料组成。显然，曲霉属用于改变饲料的营养成分。然而，这可能产生不利的结果，因为许多曲霉属物种产生对许多动物有害的霉菌毒素。 
US 6,403,084关注用于改善青贮饲料的发酵和好氧稳定性的混合培养物。解决了青贮饲料好氧不稳定性的问题，尤其是可能发生的酵母和霉菌的快速生长，导致青贮饲料变质。此外，应注意，青贮饲料可能因酵母的生长而变质，即使当被接种和经受良好的发酵阶段也会如此(在发酵阶段中，微生物用于发酵青贮饲料并产生乳酸，降低了pH并产生酸性条件)。耐酸的酵母被认为是发酵的青贮饲料变质的原因。作为这些问题的解决办法，US 6,403,084提供用同型发酵(homofermenting)乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和异型发酵乳酸菌布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的组合接种青贮饲料。据称前述微生物的组合能提供足够低的pH条件以保藏青贮饲料并防止因霉菌和酵母的生长引起的变质。 
WO 99/18188描述了一种用于马的饲料产品。该饲料产品包括具有定殖马肠道的能力的一种或多种乳酸杆菌属菌株。从马的胃粘膜或肠粘膜分离出所述微生物。 
GB 2,167,639公开了一种用于处理工业或农业废物，例如动物蛋 白的方法。该方法包括将废物切碎成含水团块并用蛋白水解酶处理所得到的材料以形成悬浮液，在悬浮液中获得糊状淀粉成分并向悬浮液中添加淀粉分解酶和产乳酸培养物。发酵所得到的混合物以产生单糖和乳酸。 
US 4,214,985涉及污水处理。处理包括用植物乳杆菌和碳水化合物例如乳糖接种污水污泥。发酵所得到的混合物，直至pH降至低于4.0。所产生的组合物被用作土壤补充剂。 
JP 2007082468关注提供饲料用的微生物制品。制品包括植物乳杆菌和/或枯草杆菌(Bacillus subtilis)的特异性菌株。发酵饲料可以通过向有机废物例如青贮牧草中添加微生物并发酵来产生。 
WO 89/05849描述了基于从猪的胃肠道分离出的乳酸菌在胃肠道的环境内存活并附着到目标动物的胃肠道上皮的能力来选择这些乳酸菌。所选择的具有这些性能的细菌可以被包括在人类消费的发酵乳制品中或被包括在为预防或治疗胃肠道疾病而向猪提供的兽医组合物中。 
最近，WO 2008/006382公开了同型发酵的液体动物饲料产品。正如在WO 2008/006382中论述的，使用含微生物的接种物来生产发酵动物饲料是非常困难的，通常会产生含有致病菌的发酵饲料，致病菌例如弧菌(Vibrio spp.)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。发酵饲料还可以包含多种高含量的酵母和霉菌。应注意，家畜摄取这种不合适发酵的饲料可能会引发疾病并导致死亡。WO 2008/006382指出，希望由他们自己制备发酵饲料的农场主所需要的无菌处理细菌通常是不可能实现的。此外，存在使用连续发酵工艺的惯例，其中一个批次的发酵饲料的一部分被用作随后的发酵批次的接种物。这导致有害的且不期望的微生物逐渐累积在发酵饲料中。在试图解决这些问题时，WO 2008/006382提出了制备发酵的混合饲料的方法，该方法包括：提供液体的发酵产品；提供待发酵的饲料产品；使前述产品组合；以及使用液体的发酵产品作为接种物来 发酵饲料产品。还描述了由此方法制备的发酵饲料。 
虽然有建议提供抵抗因酵母、霉菌、细菌和其他生物体的生长引起的变质的发酵饲料，但是仍存在对可以存储延长的时段并运输而不会明显变质的改善的发酵饲料的需求。 
正如WO 2008/006382中提到的，与饲料，尤其是含水的或液体饲料材料有关的另一问题是消耗此饲料的家畜的健康和健壮状况。正如WO 2008/006382中注意到的，不好的发酵饲料可能是对消耗此饲料的动物有害的微生物的来源。更通常而言，动物易于受到由进入和定殖在动物的胃肠道内的微生物引起的多种感染的影响。EP 0 955 061解决了猪的胃肠道感染的问题，尤其是猪轮状病毒、猪冠状病毒、产肠毒素的和致肠病的大肠杆菌、梭菌、沙门氏菌、猪痢疾蛇形螺旋体(Serpulina hyodysenter iae)、结肠菌毛样螺旋体(Serpulina pilosicoli)、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、猪等孢子球虫(Isospora suis)和隐孢子菌(Cryptosporidium)菌株引发的问题。作为猪的胃肠道感染问题的解决办法，EP 0 955 061提出了以含有由免疫母鸡的蛋黄获得的上述微生物的至少一种特异性抗体为特征的口服产品。EP 0 955 061中指出，施用给猪的产乳酸细菌(lactacidogenic bacteria)可以具有益生菌作用，抑制致肠病的细菌和产肠毒素的细菌的增殖并增强动物免疫系统的活性。因此，EP 0 955 061的一个优选实施方案包括一种或多种乳酸细菌，例如肠球菌属和乳酸杆菌属。 
正如EP 0 955 061中论述的，年幼的动物特别容易受到胃肠道感染的影响，这引发疾病并导致死亡。P.Brooks等人，‘The Effect on Biological Performance and Faecal Microbiology of feeding Finishing Pigs on Liquid Diets Fermented with Lactic Acid Bacterial’，SafePork，2005，第149页描述了改善育肥猪的健康和健壮的方式。Brook s等人注意到发酵的液体饲料(FLF)已经显示出降低了猪的沙门氏菌发病率。具体地，发现发酵饲料中70mMol/kg的乳酸浓度呈现出对沙门氏菌的抑菌活性，但杀菌需要超过100 mMol/kg的更高乳酸浓度。然而，Brooks等人发现自然发酵在商用饲料装置中产生了不可预料的结果，并且提到的一项研究发现仅3％的小麦和大麦商业化发酵会在发酵24小时后产生超过75mMol/kg的乳酸。其结论是依靠存在于谷物中的固有微生物产生高浓度乳酸的发酵不能够用于商业化生产发酵饲料。Brooks等人使用特异性的LAB进行试验来检验对生物性能的影响和由发酵液体饲料食物喂养的猪的粪便微生物。结果显示，当被喂养发酵的液体饲料时，猪保持了良好的健康，且与标准饲料相比，当用FLF喂养时，并未显示出平均日体重增量的变化。此外，试验显示出虽然发酵饲料包含高浓度的乳酸菌，但是猪粪便中的LAB浓度保持不变。然而，粪便中大肠菌存在情况的分析结果表明，由FLF食物喂养的猪的大肠菌含量得到降低。这又表明改善了猪的健康且降低了感染和发病风险。其结论是选择用于发酵的LAB对实现大肠菌的减少至关重要。 
正如Brooks等人注意到的，在发酵饲料中获得特定浓度的乳酸对实现发酵饲料的有益效果是重要的。S.J.Niven等人描述了测量发酵饲料中乳酸浓度的技术，‘The Simultaneous Determination of Short Chain Fatty Acid，Monosaccharides and Ethanol in Fermented Liquid Pig Eiets’，Animal Feed Science and Technology，117(2004)，第339-345页。 
University of Plymouth土地、食品和休闲食品学院，农业和食品系的V.Demeckova于2003年7月的论文，‘Benefits of Fermented Liquid Diets for Sows and their Piglets’描述了用由植物乳杆菌发酵的液体饲料进行的试验，以测定它们对抗微生物的影响和对妊娠后期的母猪的潜在免疫影响。结果表明，乳酸杆菌属的某些菌株既是用于制备发酵液体饲料的有效接种物，也为摄取了发酵饲料后的母猪提供益生菌活性。母猪初乳内的免疫球蛋白水平明显得到增加。靠发酵饲料喂养的母猪的初乳还增强了血淋巴细胞和肠细胞的有丝分裂促进活性。这些因子又能够改善母猪和它们的仔猪对病原体攻击的抵抗。 
Drago，L.等人的‘Inhibition of in vitro growth of enteropathogen by new lactobacillus isolates of human interstinal origin’FEMS Microbiology Letters，153(1997)，第455到463页，描述了从新出生的婴幼儿的粪便中分离出乳酸杆菌属菌株的试验并检验它们在共培养物中对某些致病菌的影响。所进行的这些试验是完全体外的，虽然显示出乳酸杆菌在减少某些病原体的生长方面的有益效果，但并不涉及动物用饲料的配制。 
如果能够提供可以由多种原材料来商业化规模制造的、可以被生物保存的且排除可能有害的肠病原体的发酵液体饲料组合物，那么这将是最有利的。如果发酵的饲料能够为接受饲料的动物提供益生作用且减少或防止所述动物因感染和致病性攻击而引起的疾病，那么这将有另外的有利方面。 
本发明人现在发现这样的发酵液体饲料组合物可以使用具有某些特性的一种或多种乳酸菌来生产。 
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于目标动物的发酵液体饲料组合物，所述饲料组合物通过用产乳酸细菌发酵饲料基质发酵来制备，所述乳酸细菌的特征在于： 
a)在所述目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
还发现，根据本发明的通过由具有上面阐明的特性的产乳酸细菌对饲料基质进行发酵产生的发酵饲料相比已知饲料提供了相当多的有利方面。具体地，该饲料能够存储延长的时段且可以被运输而不会变质，发酵饲料能抗对目标动物和其他家畜可能有害的霉菌和酵母的生长且能抗对目标动物和其他家畜可能有害的细菌的侵入和定殖。此外，一旦发酵饲料被消耗后，其为动物提供有效的保护以避免因细菌引起的感染，尤其是可能引发动物严重疾病或死亡的致病菌感染。本发明的发酵饲料通过增强目标动物的上胃肠道的屏障作用来实现这种保护 作用。该有利方面在饲养新出生的动物和刚断奶的动物，以及新孵出的禽类方面是特别显著的。在大规模饲养动物，如牛、猪和家禽时，当年幼的动物离开他们的母亲(断奶的)并在不同的环境中饲养时，存在特别的攻击。断奶过程去除了由母乳提供的免疫球蛋白的支持并加快肠生态系统的变化。这又使年幼的动物易受多种可能有害的微生物的感染。年幼动物的高死亡率至少部分是因为对这种微生物感染缺乏抵抗力。本发明的发酵饲料可通过使健康有益的微生物在年幼动物的胃肠道内集群、继而对年幼动物提供保护以免受致病微生物的感染，从而减少或消除此风险。 
本发明的发酵饲料被提供给目标动物，其可以决定例如饲料组成和发酵饲料基质所使用的特定细菌的诸多因素。本发明的发酵饲料可以提供给多种动物和家畜，包括哺乳动物和家禽。目标动物的示例包括所有养殖的或饲养的哺乳动物，包括马、绵羊、山羊、猪、牛和鹿，以及为了皮毛而饲养的动物，例如貂和类似动物。目标家禽的示例包括商业化规模饲养的和养殖的所有禽类，包括鸡、鸭子、鹅、鹌鹑和火鸡，以及狩猎野禽，例如野鸡、鹧鸪以及类似禽类。发酵饲料还可以被提供给养殖的和观赏的鱼类和甲壳类动物。此外，发酵饲料还可以被提供给作为家庭宠物的动物，例如狗、猫、兔子以及类似动物。 
在一个优选的实施方案中，本发明的发酵饲料被有利于地配制用于提供给家禽，包括鸡、鹌鹑火鸡、鹅、鸭子以及类似家禽。 
在第二个优选的实施方案中，本发明的发酵饲料被有利地配制用于提供给哺乳动物，尤其是猪和反刍动物例如牛和绵羊(尤其是在刚出生阶段和反刍前阶段期间被提供)以及小肉牛，其中反刍作用可能被延迟。 
本发明的发酵饲料可以被提供给任何年龄的目标动物，从新出生的动物或新孵出的禽至成熟的成年动物。已经发现当发酵饲料被提供给新出生的且刚断奶的动物或新孵出的禽类时是特别有利的，其中发酵饲料提供例如这样的有利方面，如加快了年幼动物的体重增加和减少了可能有害的或致病的微生物的感染。这导致由动物排泻的有害的 或致病的微生物的减少，又增强了在同一环境中饲养的其他动物的健康以及动物和/或其产品的最终消费者的健康。 
发酵饲料由饲料基质制备，饲料基质被接种含有产乳酸细菌的培养物并进行发酵。这样接种并发酵的基质本身可以形成成品饲料。可选择地，基质一旦被发酵后就被添加到其他饲料材料中，以便为其他材料提供生物保存作用。 
饲料基质可以是在发酵条件下可以由目标动物消费的任何合适的基质。饲料基质可以由一种来源的基质组成，或可选择地可以包括基质的组合。 
合适的基质材料包括有机材料，例如植物或植物材料，如纤维植物材料，例如草；谷类和谷物，例如小麦、大麦、玉米、稻、高粱和黑麦；整个作物谷类，青贮玉米和玉米芯粉；根类作物，例如马铃薯、瑞典芜菁(swedes)、饲用甜菜、糖用甜菜以及类似物；豆类和种子，例如豆、豌豆、大豆和油菜籽(和它们的残余物)；芸苔类(brassiccas)以及类似物。另外的基质包括有机残余物，例如来自乳品操作中作为副产物或残余物产生的物质，例如乳清、凝乳和脱脂牛奶、冰淇淋、酸奶、不合格的黄油和乳酪；来自焙烤和糖果点心工业中，例如饼干食品、谷类残余物、畸形的和不合格的面包、糕饼和饼干；来自饮料工业中，例如水果果肉、葡萄果肉、咖啡和巧克力残余物；酿造和蒸馏残余物；来自烹饪用油提取物中，例如油菜籽粉、大豆粉和橄榄果肉；来自肉和鱼的屠宰和加工中；或生物燃料的生产。 
为了适于发酵，饲料基质应该包含足以支持用产乳酸细菌进行发酵的量的水。优选地，饲料基质具有按重量计算至少20％、更优选按重量计算至少30％、仍更优选按重量计算至少40％的水含量。干饲料基质对水的优选比例取决于被喂养的目标物种，其范围在1∶0.25到1∶4，更优选1∶0.4到1∶2。对小鸡来说，干饲料基质对水的一个优选比是1∶1.2，而对猪来说，一个优选比是1∶2.5。饲料基质的确切的水含量将由诸多因素决定，如饲料基质的性质和组成，所使用的产乳酸细菌和发酵饲料的最终用途和目标动物。本文中提到“含水饲料”或“液 体饲料”是指含有支持由产乳酸细菌来发酵饲料的至少最低水含量的饲料材料，因此术语“含水饲料”或“液体饲料”应该据此被理解和解释。 
饲料基质可以包含足够的水以支持由乳酸菌进行的发酵。如果不够的话，应该向饲料基质中添加水以获得发酵所要求的水。 
为了生产本发明的发酵饲料，饲料基质被接种产乳酸细菌并发酵。本发明所使用的产乳酸细菌的特征为具有下述特性： 
a)所述细菌在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)所述细菌能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集；以及 
c)所述细菌在对饲料基质进行发酵时能够在被发酵饲料中产生至少最小抑制浓度的乳酸。 
具有上述三个特性(a)至(c)的细菌可提供本发明发酵饲料的有利性能。如上所述，发酵饲料被接种所述产乳酸细菌。 
因此，在另一个方面，本发明提供了用于由饲料基质制备发酵饲料的接种物，所述接种物包含具有下述特性的产乳酸细菌的存活培养物： 
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
所述接种物可以呈任何合适的形式且具有任何合适的组成，以便包含可存活的产乳酸细菌来集群(populating)和发酵饲料基质。优选的接种物的形式是冻干的或作为液体培养物。 
接种物应该包含存活形式的且足够浓度的产乳酸细菌，该足够的浓度允许饲料基质被接种后发酵并在饲料基质中产生要求数目的存活产乳酸细菌和要求浓度的乳酸。如果呈液体形式提供，接种物中产乳酸细菌的典型数目是105至109CFU/ml，更优选约106CFU/ml，或如果呈冻干形式提供，该数目是105至109CFU/g，更优选约106CFU/g。 
例如，用于基质的合适的接种物是0.1％的含有109CFU/ml产乳酸 细菌的液体培养液培养物或0.1％的含有109CFU/g产乳酸细菌的冻干培养物。 
接种物可以在合适的载体中提供以维持存储期和且当被添加到基质中时有利于准确分散。这样的方法是本领域已知的且易于由本领域的技术人员理解。 
作为第一特征，所述产乳酸细菌应该在目标动物的胃肠道内存活和生存。许多动物的胃肠道内的条件非常苛刻而防止了许多微生物的定殖和生长。具体地，许多动物的上胃肠道是足够酸性的而防止许多微生物物种滋长和保持存活。为了提供本发明发酵饲料的有利性能，用于发酵饲料基质的产乳酸细菌应该在目标动物的上胃肠道内的主要酸性条件和十二指肠中遇到的碱性条件下是可存活的，且应该在小肠和大肠内都保持存活。此外，在预期提供给家禽的发酵饲料的情形中，产乳酸细菌还应该在嗉囊和前胃以及砂囊的主要条件下保持存活。 
胃肠道内所述细菌的存活力可以由本领域已知的方法和技术确定。具体地，可以测量由含有存活乳酸菌的食物喂养的目标动物的粪便中可存活乳酸菌的微生物数目。可选择地，可以使用泄殖腔棉拭子来测定由含有所述细菌的食物喂养的家禽的胃肠道内所述乳酸菌的数目。这样的方法是本领域已知的且易于由本领域的技术人员理解。 
作为前述方案的另外的替代方案，或除了前述方案之外，可以体外测定所述产乳酸细菌在目标动物的胃肠道内的存活力，尤其是通过测量该微生物在与目标动物的上胃肠道内主要的酸性条件类似或相同的酸性条件下的生长来测定。因而，在预期用于猪的发酵饲料的情形下，可以在合适的饲料基质中暴露于pH 2达2小时，然后缓冲到pH 6.8并暴露于胆汁盐达4小时(这代表了目标动物的胃和小肠内的条件)后，测量所述产乳酸细菌的存活力。大肠的酸度通常类似于小肠的酸度，这意味着对于在胃内较低pH的主要条件下幸存的所有微生物而言，在大肠内存活是很有可能的。类似地，家禽胃肠道内的存活力可以通过依次将合适的饲料基质中的产乳酸细菌暴露于4.4到4.5的pH(正如通常在嗉囊和前胃中遇到的)、约2.6的pH(正如在砂囊中遇 到的)以及在胆汁盐存在下6.2的pH(正如在目标禽类的小肠中遇到的)来测定。此外，盲肠内的条件不可能对在砂囊和小肠内幸存的生物体产生不利的影响。 
为了更准确地模拟目标动物的胃肠道的条件，进一步优选使用最终的发酵饲料作为微生物的生长培养基来进行下文描述的体外试验。这样，可以测定由可能改变胃肠道内条件的发酵饲料喂养的目标动物的胃肠道内产生的任何效果和/或产乳酸细菌的存活力。 
下面的实施例1详细描述了目标动物的胃肠道内产乳酸细菌的存活力的体外测定操作。 
在一个特别优选的实施方案中，本发明的发酵饲料包含产乳酸细菌，其已经应使用前述应用饲料基质作为微生物生长培养基的体外操作被证明在目标动物的胃肠道内保持存活。 
作为第二要求，本发明的发酵饲料的产乳酸细菌是聚集菌(aggregating bacteria)，即所述细菌形成聚集体。此外，或可选择地，所述细菌能够与其他微生物、尤其是对目标动物有致病性的微生物共聚集，即与其他微生物一起形成聚集体。优选地，所述产乳酸细菌既是聚集的，又是共聚集的。所述产乳酸细菌聚集和/或共聚集的能力可能通过在饲料基质中在发酵期间和之后的条件下和/或在目标动物的胃肠道内的主要条件下表现出来。优选地，所述细菌在饲料基质中和在目标动物的胃肠道内均是聚集的和/或共聚集的。 
微生物在体外聚集的能力强烈显示了它们能够附着到目标动物的肠的粘液层和肠壁的上皮细胞，且通常定殖在胃肠道。这通过从附着部位排除有害的或致病的微生物又增强了目标动物对感染的抵抗性。此外，所述产乳酸细菌优选是共聚集的细菌，即与其他微生物，尤其是有害的或致病的细菌形成共聚集体。具体地，优选所述产乳酸细菌与沙门氏属、大肠杆菌和/或梭菌属菌株共聚集。这又增强了所述有害细菌通过肠腔和从肠腔的清除。 
可通过本领域已知的体外方法和技术，如上述Drago.L.等人描述的方法测定产乳酸细菌聚集的能力。具体地，可以在合适的液体生长 培养基中，正如Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养液(市售)中培养所述细菌。细菌聚集体可以被确认为在液体培养基中形成的颗粒或微粒，通常在重力的作用下集中在培养物容器的底部并留下澄清的上清液。 
类似地，可通过按照与形成聚集体类似的方式制备所述产乳酸细菌与一种或多种目标细菌的共培养物来测定该产乳酸细菌与其他细菌共聚集的能力，观察到类似谷粒的颗粒，其倾向于在培养物中沉降，留下澄清的上清液。 
虽然用肉眼就可以观察到细菌培养物中聚集体和共聚集体的形成，正如上面描述的，但是通过使用显微镜技术，包括扫描电子显微镜(SEM)，可以获得关于该微生物的聚集能力的另外的且更详细的信息。 
下面的实施例2描述了聚集的和共聚集的乳酸细菌的确认操作。 
作为第三特征，本发明的发酵饲料的产乳酸细菌能够在发酵饲料中产生至少最小乳酸抑制浓度。关于本发明的发酵饲料，术语“最小乳酸抑制浓度”是指在30℃下、由含有按重量计算2％葡萄糖的MRS培养液组成的生长培养基中发酵时能够在24小时内产生至少150mMol乳酸的产乳酸细菌。已经发现，能够在前述试验中产生此最小浓度乳酸的产乳酸细菌在制备发酵饲料和为供给饲料的目标动物提供显著健康益处方面是特别有利的。 
可以使用本领域已知的方法测定培养基中的乳酸浓度，该方法如Niven，S.J.等人的方法，‘The simultaneous determination of short chain fatty acid monosacharides and ethanol in fermented liquid pig diets’Animal Feed Science and Technology，117(2004)，(3-4)，第339-345页。 
下面的实施例3描述了确认能够产生至少最小乳酸抑制浓度的产乳酸细菌的操作。 
更优选地，所述产乳酸细菌能够在前述操作和试验条件下产生至少200mMol的乳酸，仍更优选至少250mMol的乳酸。在前述试验条件下产生至少300mMol、更优选至少350mMol的乳酸浓度也可以被 有利地应用。 
一般而言，优选发酵饲料中有较高的乳酸浓度，并且因此优选发酵饲料有较低的pH值。因此，优选地，发酵饲料的pH值是4.5或更低，更优选4.0或更低，仍更优选3.5。pH的下限且因而乳酸浓度的上限将至少部分由目标动物及其进食发酵饲料的能力和意愿所确定。随着pH进一步降低，目标动物可以拒绝进食该饲料。 
制备本发明的发酵饲料所使用的产乳酸细菌可以是同型发酵的或异型发酵的。异型发酵的细菌作为它们的代谢产物产生乳酸，以及其他有机酸，例如乙酸、丙酸和丁酸。然而，已经发现，存在显著量的这些其他酸代谢产物可能不利地影响供给目标动物的发酵饲料的味道和/或降低饲料的营养价值。相比之下，同型发酵的产乳酸细菌是代谢饲料基质以产生乳酸作为唯一酸代谢产物的细菌。因此，优选地，存在于发酵饲料中的产乳酸细菌是同型发酵的。 
此外，用于本发明的发酵饲料的产乳酸细菌优选对目标动物中常见的病原体是拮抗的。例如，在预期提供给家禽的发酵饲料的情形中，优选产乳酸细菌对沙门氏属、梭菌属和大肠杆菌中的一个或多个菌株具有拮抗活性。 
下面的实施例4描述了测定产乳酸细菌的拮抗活性的操作。 
此外，用于本发明的发酵饲料的产乳酸细菌优选能够附着到目标动物的胃肠道的上皮细胞。用于测定细菌按此方式进行附着的体外方法是本领域已知的。 
下面的实施例5描述了测定产乳酸细菌附着到目标动物上皮细胞的能力的操作。 
用于本发明的发酵饲料的合适产乳酸细菌是天然存在的且可以按照本领域的已知技术从合适的来源分离。用于本发明的产乳酸细菌的合适来源包括动物和禽类的胃肠道，包括但不限于发酵饲料所涉及的目标动物或禽类的胃肠道。产乳酸细菌的其他来源包括谷类谷物、基质内的自发发酵以及动物的乳头和其他部位。产乳酸细菌的分离可以使用本领域已知的技术进行。 
同样可以使用本领域已知的技术确认产乳酸细菌。例如，可以使用革兰氏染色液和过氧化氢酶试验确认乳酸杆菌属，其中乳酸杆菌属是革兰氏阳性的和过氧化氢酶阴性的杆状菌。 
在另外的方面，本发明提供了一种用于制备发酵饲料组合物的方法，该方法包括用产乳酸细菌发酵饲料基质，所述产乳酸细菌的特征在于： 
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集的细菌；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
本发明的发酵饲料可以按照任何合适的方式制备。通常，通过用含有存活形式的产乳酸细菌的接种物接种饲料基质并在合适的条件下发酵饲料基质来制备所述发酵饲料。用于在接种产乳酸细菌后发酵饲料基质的技术是本领域已知的。 
发酵的饲料组合物包含水。如果使用干的饲料基质，那么向基质中添加水。发酵的饲料组合物优选每1重量份饲料基质(基于干物质)包含1到10重量份的水，更优选1到5重量份的水。一个优选的实施方案包括1∶1到1∶3，更优选1∶1到1∶2，尤其是1∶1到1∶1.5重量比的饲料基质和水。 
可以在适合于产乳酸细菌培养的任何温度下进行饲料基质的发酵。发酵的最佳温度取决于所使用的细菌菌株。通常，基质饲料在15℃到45℃，更优选30℃到35℃的温度下发酵。 
将饲料基质发酵持续足够的时间段以允许产乳酸细菌产生150mMol/l，更优选至少200mMol/l、仍更优选至少250mMol/l的至少最小乳酸浓度的乳酸。典型的发酵时间是8到72小时，更优选8到24小时。 
可以通过测量饲料组合物的pH来监测发酵饲料中乳酸的产生，其中，随着发酵工艺期间产生乳酸，饲料组合物的pH将降低。在由产乳酸细菌发酵后的饲料组合物的pH优选是4.5或更低，更优选4.0或更 低。 
如上所述，具有低pH的饲料可能对目标动物是不合口味的。具有较高浓度的乳酸和pH低于3.5的发酵饲料可以有利地与其他材料组合以产生最终的食物，只要维持乳酸最小抑制浓度即可。 
可以按照需要向饲料基质中添加产乳酸细菌的生长所必需的营养物和其他组分。这样的营养物和组分将是本领域已知的。 
发酵饲料基质以在饲料组合物中产生有益于目标动物的浓度的产乳酸细菌。具体地，在发酵结束后存在于饲料组合物中的乳酸菌应该有足够存活数量以定殖目标动物的胃肠道并在其内形成活的菌落。优选地，发酵饲料中产乳酸细菌的浓度是至少106CFU/ml，更优选107至1010CFU/ml，仍更优选109至1010CFU/ml。 
本发明的饲料组合物和方法可以使用任何合适的产乳酸细菌，条件是该细菌对目标动物不是有害的。优选的产乳酸细菌包括乳杆菌属菌株和/或小球菌属(Pediococcus)菌株，特别优选乳酸杆菌属菌株。乳杆菌属菌株的特别优选的微生物包括植物乳杆菌菌株和唾液乳杆菌菌株。 
已经进行了广泛的工作来分离在制备根据本发明的发酵饲料方面具有特定有利方面的一系列乳杆菌属菌株。通过前面描述的方法并使用下面描述的详细方法来分离菌株。每一株分离出的菌株呈现出上述(a)到(c)的全部三种性能，使得它们特别适合用于制备根据本发明的饲料组合物。每一株分离出的菌株已于2009年2月11日保藏在国家工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection ofIndustrial and Marine bacterial Ltd.，Aberdeen，Scotland，以下为“NCIMB”)中且给出了下面所示的NCIMB登录号。这些保藏是根据国际承认用于专利保护目的的微生物保藏的布达佩斯条约进行的并且满足了其要求。 
因此，在另一个方面，本发明提供了下述微生物的生物上纯的培养物： 
植物乳杆菌，菌株编号C28，保藏号NCIMB 41605； 
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS3，保藏号NCIMB 41606； 
植物乳杆菌，菌株编号MS18，保藏号NCIMB 41607； 
植物乳杆菌，菌株编号VD23，保藏号NCIMB 41608； 
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS6，保藏号NCIMB 41609；和 
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS16，保藏号NCIMB 41610。
上述菌株已于2009年2月11日保藏在国家工业与海洋细菌菌种保藏中心(NCIMB) 
在另一个方面，本发明提供了用于制备发酵饲料的组合物，所述组合物包括前述微生物中的一种或多种和合适的载体。 
更一般而言，已发现向目标动物施用具有下述特性的产乳酸细菌通常对目标动物的健康和健壮是有利的： 
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
因此，在另一个方面，本发明提供了一种用于改善目标动物的总体健康的方法，该方法包括向所述动物施用具有下述特性的产乳酸细菌： 
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
所述微生物可以通过给动物提供水的方式进行施用，如作为单次剂量或通过含所述微生物的水连续供给。可选择地，所述微生物可以通过提供给目标动物的饲料进行施用，更优选通过前述发酵饲料的方式进行施用。 
用于通常施用至目标动物的优选的产乳酸细菌是如上描述的。 
所述产乳酸细菌优选作为存活的微生物施用至目标动物，优选以至少106CFU/ml的浓度，更优选至少107CFU/ml，仍更优选至少109CFU/ml的浓度。如果通过水施用至目标动物，那么最少的微生物数目优选是至少106CFU/ml。如果通过发酵饲料施用，那么最少的产乳酸细菌数目优选是至少108CFU/ml，更优选不超过1010CFU/ml。 
已经发现，以此方式为目标动物提供产乳酸细菌加快了动物体重增加的速率并改善了动物的总体健康状况，尤其增强了动物对因可能有害的微生物引发的感染的抵抗性。这降低了目标动物将有害菌排泄到它们的环境中的水平，继而又降低了目标动物周围其他动物的感染率。已经发现当所述产乳酸细菌提供给非常年幼的或未成熟的动物时，这些有利方面是特别显著的。 
另外，本发明提供了具有下述特征的产乳酸细菌的生物学纯培养物： 
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
用于向目标动物提供乳酸菌的组合物包括前述具有特性(a)到(c)的产乳酸细菌的活培养物和合适的载体。 
将通过下面的具体实施例且通过参考附图来阐释本发明，其中： 
图1是测定目标动物的胃肠道内产乳酸细菌的存活力的优选体外方法的示意图； 
图2是测定产乳酸细菌的聚集和共聚集能力的优选方法的示意图示；和 
图3是用于测定产乳酸细菌的拮抗水平的优选方法的示意图。 
使用按照下述方式确定来源、分离并确认的产乳酸细菌来进行下面的实施例中描述的试验： 
对三只小鸡(Hubbard繁殖系；9周龄和2日龄)随意饲喂市售的有机生长剂定量食谱、牧草和三叶草。人工屠宰小鸡并切下每只鸡的整个胃肠道。无菌除去盲肠、空肠、回肠和嗉囊的内容物。此外，通过用载玻片刮来从小肠和嗉囊取下上皮细胞。用10ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS，如Oxoid，England)稀释所有样品并平板接种在Man-Rogosa-Sharpe(MRS)和Rogosa琼脂中(两种都来自如Oxoid，England)。采用划线分离法从混合的细菌培养物中获得纯的培养物。 这样分离出的纯的培养物在MRS琼脂平板上第二次培养并在含有5％体积二氧化碳的气氛下在厌氧瓶中温育72小时。 
在MRS琼脂(用于乳杆菌菌株和片球菌菌株的分离培养基)和Rogosa琼脂(用于乳杆菌菌株的分离培养基)上分离出总共111种产乳酸细菌。 
利用革兰氏染色液和过氧化氢酶测试证明分离物是产乳酸细菌。通过使用API CHL试剂盒(如，BioMereux，UK)由不同的碳水化合物代谢作用进一步鉴定革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的分离物。 
对这样分离出的且确认的产乳酸细菌使用实施例1至3的操作进行分析以鉴定满足下述要求的细菌： 
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的； 
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及 
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。 
此外，根据实施例4中描述的操作测定分离出的产乳酸细菌对抗主要致病菌的拮抗活性。此外，使用实施例5中描述的操作测定细菌附着到上皮细胞的能力。 
实施例
实施例1
测定产乳酸细菌在目标动物的胃肠道内的存活力
使用图1中概述的下述操作测定产乳酸细菌菌株在小鸡的胃肠道内的存活力： 
将每株产乳酸细菌菌株喷雾到市售的粒状家禽生长剂饲料上(如，Mole Valley Farmers，Devon，UK)。在细菌喷雾之前，通过辐射(25kGy，Co60)对饲料进行灭菌。粒状饲料的组成如下： 
表I 
Figure BPA00001476428500181
Figure BPA00001476428500191
向烧瓶中添加已接种饲料的样品，添加蒸馏水进行稀释并在水浴中加热至41.4℃，该温度表示小鸡胃肠道内的温度。通过添加HCl(水溶液；1M)来连续调节饲料组合物的样品的pH，以将烧瓶内的pH调节至对应于家禽消化道内的连续阶段中存在的pH：pH 4.4到4.5，对应于嗉囊和前胃；pH 2.6，对应于砂囊；以及pH 6.2，对应于小肠。在每一个pH下温育样品的时间对应于进行消化物通过胃肠道的相应部分所耗费的时间：嗉囊和前胃45分钟；砂囊90分钟；以及小肠90分钟。 
在整个温育期间定期向每一个样品中添加HCl(水溶液；1M)，以便将pH保持在合适的水平并抵消饲料组分的通常的缓冲作用。 
在温育中的每一个阶段，在即将调节pH之前取出烧瓶中溶液的样品(1ml)，用无菌胨水(9ml)稀释并制备10倍系列稀释液。使用无菌技术将100μl的每一种稀释液涂布在MRS琼脂上并在37℃下将平板温育24小时，之后对平板进行计数。以通过模拟胃肠道后存活的生物体的百分数计算微生物的存活力。 
实施例2
聚集的和共聚集的乳酸菌的测定
使用图2中阐释的下述操作测定乳酸菌菌株聚集并与其他细菌形成共聚集体的能力： 
将产乳酸细菌在37℃、在5％vol二氧化碳的气氛下，在MRS培养 液(ex Oxoid)中生长过夜。之后，以10000倍重力离心培养物10分钟并用无菌蒸馏水洗涤三次。这样洗涤的材料在pH 6.0下以109CFU/m l的浓度重悬浮在相同体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并在室温下温育。 
当聚集细胞形成清晰可见的、砂粒样颗粒并且受重力作用于2小时内沉降至管的底部时，确定发生了自聚集。 
此外，通过下面的操作测定所述产乳酸细菌与其他细菌共聚集的能力： 
将产乳酸细菌在37℃、含有5％vol二氧化碳的气氛下在MRS培养液中生长24小时。将沙门氏菌和大肠杆菌在37℃、含有5％vol二氧化碳的气氛下在营养物中生长24小时。此外，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)在37℃、厌氧性条件下在梭菌培养液中生长24小时。第二天，以10000倍重力离心每一种培养物10分钟并用无菌蒸馏水洗涤三次。将致病培养物以109CFU/ml的浓度(pH 6.0)重新悬浮在相同初始体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并在10％vol新制备的滤器过滤除菌的产乳酸细菌上清液培养物的存在下，共1ml液体体积，在室温下温育。由聚集细胞形成的清晰可见的、砂粒样颗粒受重力作用沉降到容器底部、在2小时内留下澄清的上清液时，共聚集被认为是阳性的。 
以类似的方式测试了所述产乳酸细菌与其他可能致病的微生物的共聚集并使用电子扫描显微镜进行证实。 
实施例3
测定能够产生至少最小抑制性乳酸浓度的产乳酸细菌
使用下面的操作测定产乳酸细菌菌株产生至少最小抑制浓度的乳酸的能力： 
将产乳酸细菌菌株在30℃下在MRS培养液中生长24小时。用0.1ml的24小时培养液培养物接种10ml等分试样的新的MRS培养液并在30℃下温育。在12、24和48小时后采集1.0ml的子样品按照Niven等人的高效液相色谱分析乳酸。标准的MRS培养液包含2％的葡萄糖作 为碳水化合物来源，得到220mMol/L的最大乳酸产量。 
实施例4
测定产乳酸细菌的拮抗活性
使用图3中阐释的下述操作测定产乳酸细菌菌株针对于致病微生物的拮抗活性： 
将所述产乳酸细菌在厌氧性条件下，在37℃的温度下在MRS培养液(如，Oxoid CM0359)中生长24小时。在此时期结束时，使用无菌棉拭子将细菌样品点样到MRS琼脂板(如，Oxoid)上并再次在厌氧性条件下，在37℃下温育另外24小时，以允许形成菌落。将含有五株致病菌：肠炎沙门氏菌(Salmonella enteric Enteritidis)(3株菌株)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enteric Typhimurium)(1株菌株)和大肠杆菌(1株菌株)且每一株含有约107CFU/ml的营养物琼脂倾倒在琼脂板上且在37℃的温度下温育平板另外24小时。将含有约107CFU/ml的产气荚膜梭菌(1株菌株)的营养物琼脂倾倒在第二块平板上并在39℃的厌氧性条件下温育另外48小时。 
在温育期结束时，目视检查平板中围绕乳酸杆菌斑点的抑制区域并记录抑制区域的半径。可以通过测量围绕产乳酸细菌斑点的抑制区域的半径来作为获得受试产乳酸细菌针对目标病原体的拮抗活性的量度。1到2cm的半径表明高水平的拮抗活性。 
实施例5
测定产乳酸细菌对上皮细胞的附着
使用下面的操作进行试验以测定产乳酸细菌菌株附着到有机养殖的小鸡的上皮细胞的能力。 
人工屠宰小鸡并且通过用显微镜载玻片刮上皮来刮取回肠上皮细胞。将这样取下的细胞悬浮在PBS中并检验以确保它们不含任何附着的细菌。利用血球细胞计数器测定细胞数目。 
将所选择的乳酸杆菌在MRS培养液中培养过夜以得到109CFU/ml的细菌数目，将其重新悬浮在PBS中以得到108CFU/ml的细胞密度。将100μl的乳杆菌悬浮液添加到400μl的上皮细胞悬浮液中，将 混合物在37℃下温育30分钟同时摇动。使用相差显微镜，通过对附着到从所得悬浮液随机选择的上皮细胞的细菌细胞的数目进行计数观察乳杆菌细胞到上皮细胞的附着。 
实施例6
进行试验以测定用产乳酸的微生物唾液乳杆菌的菌株处理小鸡的益处，所述唾液乳杆菌菌株呈现出下述特征：a)在小鸡的胃肠道内是可存活的(按照实施例1概括的内容所测定的)；b)聚集和与下述病原体中的至少一种共聚集：沙门氏菌、大肠杆菌或梭菌(按照实施例2概括的内容所测定的)；以及c)产生至少最小抑制浓度的乳酸(按照实施例3概括的内容所测得的)。此外，使用实施例4中提供的方法测得所述微生物对沙门氏菌、梭菌和大肠杆菌菌株是拮抗的。使用实施例5中提供的操作，还测得所述产乳酸细菌高度附着到小鸡的上皮细胞。 
所使用的唾液乳杆菌菌株是上面提到的菌株C28。 
在整个试验中，禽类被喂以干净的水和市售饲料(Saracen ChickCrumbs，如J&W Attlee，Dorking，England)。饲料具有14.0wt％的水含量，表II提供了基于干物质的组成。 
表II饲料组成 
Figure BPA00001476428500221
102只不含特异性病原体的小鸡被随机分成6组，每组17只，每组按照下述处理： 
组I：小鸡被喂以干净的水和根据表I的饲料。 
组II：小鸡在1日龄时通过口腔管饲含有浓度为107cfu/ml的唾液乳杆菌的含水培养基进行处理。之后，小鸡组I进行喂养。 
组III：小鸡从1日龄起被喂以含107cfu/ml的唾液乳杆菌的水和根据表I的饲料。 
组IV：小鸡从7日龄起被喂以含107cfu/ml的唾液乳杆菌的水和根据表I的饲料。 
组V：小鸡从1日龄起被喂以干净的水和发酵的湿醪。发酵的湿醪是通过用唾液乳杆菌接种表I的饲料和水的混合物(饲料与水的比为1∶1.2)并在30℃下发酵24小时来获得约109cfu/ml的微生物浓度。在用唾液乳杆菌发酵之前，饲料具有5.94的平均pH，而在发酵之后，具有4.42的平均pH。 
组VI：小鸡从7日龄起被喂以干净的水和发酵的湿醪。发酵的湿醪是通过用唾液乳杆菌接种表I的饲料和水的混合物(饲料与水的比为1∶1.2)并在30℃下发酵24小时来获得约109cfu/ml的微生物浓度。在用唾液乳杆菌发酵之前，饲料具有5.94的平均pH，而在发酵之后，具有4.39的平均pH。 
被禽类消耗的饲料的重量
此实验进行6周。作为禽类健康的第一标示，监测每一组中的禽类所消耗的饲料的重量。表2提供了在此试验的第3周到6周期间，每一组中的禽类的平均日饲料消耗量。 
表2.禽类的平均日饲料消耗量(g/禽类/天，基于干饲料) 
Figure BPA00001476428500231
Figure BPA00001476428500241
正如表2所显示的，提供发酵饲料的组V和组VI中的禽类比其他组中的禽类消耗明显更高量的饲料，这表明组V和组VI中的禽类有更高的总体健康水平。一般而言，无论是通过水，还是通过发酵饲料提供了产乳酸细菌的禽类比对照组I消耗了更大量的饲料。 
禽类的体重增加
除了消耗的饲料量外，测量了每一组中的禽类的平均体重增加量。表3显示了试验中第3周到第5周禽类的平均日体重增加量。 
表3.平均日体重增加量(g/禽类/天) 
Figure BPA00001476428500251
如表3所示，用唾液乳杆菌处理的禽类的平均日体重增加量通常高于未受处理的禽类的平均日体重增加量。具体地，提供了产乳酸细菌的所有禽类的初始重量增加量显著高于对照组I的初始重量增量。此外，被喂以发酵饲料的组V和组VI中禽类呈现出明显高的重量增加量，尤其是在试验的第65周中。 
禽类的沙门氏菌排泄和感染
在试验开始时，对来自每一组中禽类的随机样品经泄殖腔棉拭子擦拭并且分析它们的粪便成分以证实未受沙门氏菌属菌株的感染。 
为了测定唾液乳杆菌处理在预防禽类受其他微生物感染方面的效果，按照下面的操作用沙门氏菌属菌株攻击每一组中的所有禽类： 
在15日龄时，使用给药导管(dosing catheter)施用含有106cfu/ml的沙门氏菌鼠微生物对所有禽类通过口腔管饲定量服用鼠伤寒沙门氏菌。所使用的沙门氏菌生物体是抗萘啶酸衍生物(SL1344 nalr，如Vaterinary Laboratories Agency(VLA)，Weybridge，UK)。在即将给与沙门氏菌之前，以类似的方式对禽类施以碳酸氢钠溶液，以便立即中和禽类的嗉囊中的酸度。这样，去除了由嗉囊内的酸施加在禽类上肠道内的屏障，允许所引入的沙门氏菌进入下肠环境。 
在即将攻击之前且在攻击4周时间段后至少每周两次地，从禽类取泄殖腔棉拭子。测定了擦拭材料中鼠伤寒沙门氏菌的含量。此外，对每一组测定禽类幼仔的沙门氏菌含量。对每一组来说，测定发现不排泄沙门氏菌的禽类的百分比。结果提供在表IV中。 
表IV沙门氏菌排泄
Figure BPA00001476428500261
从表IV中可以看出，一般而言，向禽类施用产乳酸细菌显著减少了禽类向它们的环境中排泄沙门氏菌的趋势。提供了发酵饲料的禽类即组V和VI中沙门氏菌的减少是特别显著的。 
此外，在整个试验持续时间内，发现在所有时候，由禽类呈现的沙门氏菌排泄是一致的，且在喂以发酵饲料的组内即组V和VI是明显较低的。 
为了测定每一组中禽类的感染水平，进行了禽类的鼠伤寒沙门氏菌感染的两次死亡后评估，一次是在4周龄，一次是在6周龄。所使用的方法如下： 
禽类通过颈脱位法被无痛致死。无菌切下它们的肝、脾、回肠和盲肠并置于无菌PBS中。将这样收集的每一种组织的样品称重、匀浆化并在PBS(0.1M；pH 7.2)中经受10倍连续稀释。通过将稀释液滴平板接种到用萘啶酸(15μg/ml)补充的BGA上来测定每一种匀浆物中鼠伤寒沙门氏菌的存活数目。将1.0ml的残余匀浆物添加到10ml的亚硒酸盐富集的培养液中，在37℃下温育24小时，之后转种到用萘啶酸补充的BGA上。通过平板接种到MRS琼脂上并在37℃下在厌氧性瓶中温育48小时来测定细菌的存活数目。 
第一次和第二次死亡后试验的结果分别提供在表V和VI中。 
表V第一次死亡后试验的鼠伤寒沙门氏菌的数目
Figure BPA00001476428500271
表VI第二次死亡后试验的鼠伤寒沙门氏菌的数目
Figure BPA00001476428500272
Nd＝未检测到 
从表V和VI可以看出，一般而言，向禽类提供产乳酸细菌显著减少了禽类中鼠伤寒沙门氏菌的计数。鼠伤寒沙门氏菌数目的减少在喂以发酵饲料的组V和组VI禽类中是最显著的。 
禽类的唾液乳杆菌定殖
对在上述试验中无痛致死的禽类来说，还使用上面概括的一般操作测定了禽的盲肠和回肠中唾液乳杆菌的数目，以便测定该产乳酸细菌定殖禽的胃肠道内的效率。结果描述在表VII中。 
表VII禽的胃肠道内的唾液乳杆菌
Figure BPA00001476428500281
如表VII所示，向禽类供给在水中的和饲料中的产乳酸细菌显著增加了该细菌对胃肠道的定殖程度。提供给组V和VI中的禽类的发酵饲料在提高禽类胃肠道内产乳酸细菌的浓度方面是特别有效的。 
一般而言，发酵饲料在减少沙门氏菌对禽类的定殖方面是特别有效的。这在生产人类用的食物方面具有显著的有利方面，其中食品制造商首要关注的是消除含有病原体的食品，例如从动物食品和它们的产品中消除沙门氏菌。出人意料地发现了通过给仅7日龄，而非1日龄的禽类提供发酵饲料，实现了抗沙门氏菌定殖的改善。 

Claims (39)

1.一种用于目标动物的发酵液体饲料组合物，所述饲料组合物通过用产乳酸细菌发酵饲料基质来制备，所述乳酸细菌的特征在于：
a)在所述目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的；
b)是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；以及
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。
2.权利要求1的发酵液体饲料组合物，其中所述目标动物是家禽或哺乳动物。
3.权利要求2的发酵液体饲料组合物，其中所述目标动物是鸡或猪。
4.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述基质是植物或植物材料，或有机残余物。
5.权利要求4的发酵液体饲料组合物，其中所述植物或植物材料是植物或植物材料，其是草；谷类和谷物，例如小麦、大麦、玉米、稻、高粱和黑麦；根类作物，例如马铃薯、瑞典芜菁、饲用甜菜、糖用甜菜以及类似物；豆类和种子，例如豆、豌豆、大豆、油菜籽；芸苔类以及类似物。
6.权利要求4的发酵液体饲料组合物，其中所述有机残余物包括来自乳品操作中的副产物或残余物，例如乳清、凝乳、脱脂牛奶、冰淇淋、酸奶、黄油和乳酪；来自焙烤和糖果点心工业中的副产物或残余物，来自饮料工业中的副产物或残余物；来自酿造和蒸馏中的副产物或残余物；来自烹饪用油的提取中的副产物或残余物；来自肉和鱼屠宰和加工中的副产物或残余物；或生物燃料的生产中的副产物或残余物。
7.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述饲料基质具有按重量计算至少20％、更优选按重量计算至少30％、仍更优选按重量计算至少40％的水含量。
8.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中干饲料基质与水的比是1∶0.25到1∶4，更优选1∶0.4到1∶2.5。
9.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌在对应于所述目标动物的所述胃肠道内多个位置的多种pH条件下是可存活的。
10.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌在模拟所述目标动物的所述胃肠道内条件的体外试验中被证明是可存活的。
11.权利要求10的发酵液体饲料组合物，其中所述体外试验使用所述饲料基质作为所述产乳酸细菌的生长培养基。
12.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌是共聚集的。
13.权利要求12的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌与对所述目标动物有害的或致病的细菌是共聚集的。
14.权利要求13的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌与沙门氏菌、大肠杆菌和/或梭菌菌株是共聚集的。
15.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌在30℃下、由MRS培养液和按重量计算2％的葡萄糖组成的生长培养基中发酵时，能够在48小时内产生至少200mMol的乳酸。
16.权利要求15的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌在所述条件下产生至少250mMol的乳酸，更优选至少275mMol的乳酸。
17.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其具有4.5或更低的pH，优选4.0或更低的pH，更优选3.5的pH。
18.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌是同型发酵的。
19.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌对所述目标动物内常见的一种或多种病原体是拮抗的。
20.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述发酵饲料中所述产乳酸细菌的浓度是至少106CFU/ml，更优选107至1010CFU/ml。
21.根据任一前述权利要求的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌包括乳杆菌属(Lactobacillus)菌株和/或小球菌属(Padiococcus)菌株。
22.权利要求21的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌包含选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)中的乳杆菌属菌株。
23.权利要求22的发酵液体饲料组合物，其中所述产乳酸细菌选自下述中的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株编号C28，保藏号NCIMB 41605；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS3，保藏号NCIMB 41606；
植物乳杆菌，菌株编号MS18，保藏号NCIMB 41607；
植物乳杆菌，菌株编号VD23，保藏号NCIMB 41608；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS6，保藏号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS16，保藏号NCIMB 41610。
24.一种用于由饲料基质制备发酵饲料的接种物，所述接种物包含具有下述特性的产乳酸细菌的活培养物：
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的；
b)是聚集菌和/或与一种或多种病原体共聚集；以及
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。
25.权利要求24的接种物，其中所述接种物中产乳酸细菌的浓度是105至109CFU/ml，更优选约106CFU/ml。
26.权利要求24或25的接种物，其中所述产乳酸细菌包含乳杆菌属菌株和/或小球菌属菌株。
27.权利要求26的接种物，其中所述产乳酸细菌包含选自植物乳杆菌和唾液乳杆菌中的乳杆菌属菌株。
28.权利要求27的接种物，其中所述产乳酸细菌选自下述中的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株编号C28，保藏号NCIMB 41605；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS3，保藏号NCIMB 41606；
植物乳杆菌，菌株编号MS18，保藏号NCIMB 41607；
植物乳杆菌，菌株编号VD23，保藏号NCIMB 41608；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS6，保藏号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS16，保藏号NCIMB 41610。
29.一种用于制备发酵饲料组合物的方法，所述方法包括用产乳酸细菌发酵饲料基质，所述产乳酸细菌的特征在于：
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的；
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。
30.权利要求29的方法，其中所述产乳酸细菌包括乳杆菌属菌株和/或小球菌属菌株。
31.权利要求30的方法，其中所述产乳酸细菌包括选自植物乳杆菌和唾液乳杆菌中的乳杆菌属菌株。
32.权利要求31的方法，其中所述产乳酸细菌选自下述中的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株编号C28，保藏号NCIMB 41605；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS3，保藏号NCIMB 41606；
植物乳杆菌，菌株编号MS18，保藏号NCIMB 41607；
植物乳杆菌，菌株编号VD23，保藏号NCIMB 41608；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS6，保藏号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS16，保藏号NCIMB 41610。
33.下述微生物中的一种或多种的生物学纯培养物：
植物乳杆菌，菌株编号C28，保藏号NCIMB 41605；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS3，保藏号NCIMB 41606；
植物乳杆菌，菌株编号MS18，保藏号NCIMB 41607；
植物乳杆菌，菌株编号VD23，保藏号NCIMB 41608；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS6，保藏号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS16，保藏号NCIMB 41610。
34.权利要求33的产乳酸细菌用于制备发酵液体饲料组合物的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述发酵组合物用于家禽或哺乳动物。
36.一种用于制备发酵液体饲料组合物的组合物，其中包含如权利要求33所述的产乳酸细菌中的一种或多种和合适的载体。
37.一种用于改善目标动物的总体健康的方法，所述方法包括向所述动物施用具有下述特性的产乳酸细菌：
a)在目标动物的胃肠道内的主要条件下是可存活的；
b)是聚集菌和/或可与一种或多种病原体共聚集；以及
c)在所述饲料基质中发酵时能够以乳酸的至少最小抑制浓度的量产生乳酸。
38.权利要求37的方法，其中所述产乳酸细菌通过提供给所述动物的水和/或通过动物饲料进行施用。
39.权利要求37或38的方法，其中所述产乳酸细菌选自下述中的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株编号C28，保藏号NCIMB 41605；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS3，保藏号NCIMB 41606；
植物乳杆菌，菌株编号MS18，保藏号NCIMB 41607；
植物乳杆菌，菌株编号VD23，保藏号NCIMB 41608；
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS6，保藏号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株编号MS16，保藏号NCIMB 41610。
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