CN115461065A

CN115461065A - 包含用于表达和分泌Enterocin以控制产气荚膜梭菌诱导的家畜坏死性肠炎的益生菌的组合物和相关方法

Info

Publication number: CN115461065A
Application number: CN202180011399.1A
Authority: CN
Inventors: Y·J·卡兹内西斯; K·G·克鲁齐基; D·N·西迪罗普洛斯
Original assignee: General Probiotics Co ltd
Current assignee: General Probiotics Co ltd
Priority date: 2020-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-12-09
Also published as: BR112022014917A2; US20210268034A1; WO2021154872A1

Abstract

本发明至少部分涉及用于预防或治疗产气荚膜梭菌诱导的动物坏死性肠炎的工程化抗菌益生菌及其相关方法。在一些实施方案中，包括用于治疗鸡的组合物。该组合物可以包含最初从健康鸡的小肠分离的细菌，并且可以用两种外源性多核苷酸进行基因工程化。第一外源性多核苷酸可以包含异源启动子和编码抗菌蛋白的多核苷酸。第二外源性多核苷酸可以包含异源启动子和编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质的功能是将抗菌蛋白分泌到细胞外环境。在一些实施方案中，抗菌肽可有效杀死鸡胃肠道内的产气荚膜梭菌。

Description

包含用于表达和分泌Enterocin以控制产气荚膜梭菌诱导的家畜坏死性肠炎的益生菌的组合物和相关方法

本申请于2021年1月27日以美国国家公司General Probiotics，Inc.的名义作为PCT国际专利申请提交，在所有国家指定申请人，并且美国公民Yiannis John Kaznessis、美国公民Kathryn Gayle Kruziki以及美国公民Dimitrios Nikolaos Sidiropoulos指定所有国家的发明人，并要求于2020年1月27日提交的第62/966354号美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表参考

该申请通过EFS网站以电子方式提交，并且包括以.txt格式以电子方式提交的序列列表。.txt文件包含序列表，标题为“269-0002WOU1-SEQS_ST25.txt”，创建于2021年1月27日，并且大小为38KB。.txt文件中包含的序列表是说明书的一部分，通过引用将其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及可用于例如控制家畜产气荚膜梭菌和坏死性肠炎的抗菌益生菌。本文中的实施例涉及工程化抗菌益生菌在改善动物健康和福祉中的用途。本文中的实施例涉及改进来自动物的最终产品的安全性和质量。更具体地说，一些实施例涉及从自然环境中分离的新益生菌，以及用于治疗收获前肉鸡中的产气荚膜梭菌感染的分离益生菌的基因工程化和/或筛选。

背景技术

全球肉类生产的压力

预计未来几十年，全球粮食产量将翻一番，以满足地球人口的需求，预计到2050年将达到近100亿。这一需求加上各种环境因素，包括缺水和气候不稳定，正在对全球粮食安全施加压力(FAO(联合国粮食及农业组织).2017.The future of food and agriculture:Trends and challenges.Available at http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf)。

由于人口增长和历史上的高生活水平，对动物蛋白饮食的需求大幅增加。在过去三十年中，全球对牛肉、猪肉和鸡肉的需求几乎增加了两倍，尽管出于环境原因存在减少牛肉生产的压力，但猪肉和家禽的生产预计在未来三十年将再次增加近一倍。

美国国家科学院在最近一份题为“到2030年推动粮食和农业研究的科学突破”的报告中得出结论，“今天，美国粮食和农业企业面临巨大挑战，将考验其长期可持续性、竞争力和弹性”(美国国家科学院、工程院和医学院，2018年)Science Breakthroughs toAdvance Food and Agricultural Research by 2030.Washington,DC:The NationalAcademies Press.doi:https://doi.org/10.17226/25059)。

历史上，基于科学的改进使农业能够为不断增长的人口生产粮食。几十年来，抗生素帮助生产者饲养健康的牲畜。抗生素也经常用于促进生长和提高饲料效率，即使在没有感染的情况下也是如此(White W.Medical Consequences of Antibiotic Use inAgriculture,Science,1998,279,996)。可以说，随着动物育种和生产的重大进步，抗生素促进并维持了牲畜生产力的提高。

抗生素在畜牧业生产中的应用

越来越令人担忧的是，微生物对一线抗生素的耐药性不断出现(US CDC,Antibiotic Resistance Threats in the United States,2013.Available at https:// www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf)。据估计，美国有100多万人因多重耐药感染而患病，每年有2万多人死亡。多药耐药病原体日益频繁的趋势令人不安。2017年1月，美国疾病控制中心宣布内华达州一名妇女死于一种泛耐药菌株，即对美国所有可用抗生素耐药。

耐药性出现的一个可能来源是在农场动物生产中广泛使用抗生素(US FDA,2016Summary Report on Antimicrobials Sold or Distributed for Use in Food-Producing Animals.Available at https://www.fda.gov/downloads/forindustry/ userfees/animaldruguserfeeactaduf a/ucm588085.pdf)。2015年，估计有14000吨抗生素(约占美国生产的所有抗生素的70％)用于牛、猪和家禽。

令人震惊的是，世界卫生组织列为对人类健康至关重要的抗生素类别与世界动物卫生组织列为对农业至关重要的抗生素类别之间存在大量重叠(Joint FAO/WHO/OIEExpert Meeting on Critically Important Antimicrobials,Rome,Italy,Nov 2007,http://www.who.int/foodborne_disease/resources/Report_CIA_Meeting.pdf)。例如，三类抗生素；据报道，喹诺酮类药物、第三代和第四代头孢菌素以及大环内酯类药物被用于农业，尽管它们是治疗人类某些严重感染的少数可行治疗方案之一。

家畜中使用的抗生素对抗生素耐药微生物引起的人类感染的确切贡献正在辩论中(Editorial,Safety from farm to fork,Nature Reviews Microbiology,2009,7,478)。在食品生产等复杂系统中，确实很难在动物饲料中使用抗生素与胃肠道感染之间建立因果关系，在胃肠道感染中，耐药微生物会影响人群。然而，有证据表明，耐药菌株确实通过食物传播给人类(McEwen SA,Fedorka-Cray PJ.Antimicrobial use and resistancein animals.Clin Infect Dis 2002；34:S93-S106)。

畜牧生产中的抗生素

由于这些担忧，欧盟于2006年禁止在食用动物生产中使用抗生素。美国曾试图通过类似措施，并在众议院和参议院引入了题为“医疗用抗生素保护法”(H.R.965/S.1211)的立法。该法律将导致“分阶段消除对人类健康重要的关键抗菌动物药物在动物体内的非治疗性使用”。

试图通过这项法律的努力遭到了抵制。事实上，在牲畜生产中使用抗生素有许多重要且已证明的益处。广泛禁止抗生素可能会危及全球丰富、优质、营养、安全和相对廉价的食品供应。在美国，禁止使用抗生素以及缺乏替代抗生素技术可能导致食品价格大幅上涨(Karavolias,J.Raised without antibiotics:impact on animal welfare andimplications for food policy,Translational Animal Science,2(4),2018,337–348)。这可能会削弱畜牧业对经济的巨大积极影响，估计每年将达到1250亿美元。

尽管有这些负面影响，FDA还是采取行动，减少在畜牧生产中使用具有重要医学意义的抗生素。制药公司自愿采用了FDA指南209和指南213，修订了FDA批准的标签使用条件，以取消出于生产目的使用抗菌药物。其目的是将动物服用抗生素的销售状态从非处方药改为兽医饲料指令(VFD)。

随着VFD的出现，从2017年开始，非处方抗生素停止用于动物生产。抗生素现在只由有执照的兽医为患病动物开出处方。这一步骤可有助于确保明智地使用抗生素。另一方面，农民现在面临着在没有促生长抗生素的情况下饲养健康动物的挑战。

家禽产气荚膜梭菌与坏死性肠炎

以家禽业为重点，抗生素的逐步淘汰已经导致坏死性肠炎(NE)的发生率更高。NE是肉仔鸡肠道损伤的结果，通常在存在产毒产气荚膜梭菌菌株的情况下由E.maxima引起。据信，球虫削弱了胃肠道的粘液层，使产气荚膜梭菌能够接触并破坏上皮细胞(Prescott,J.F.,The pathogenesis of necrotic enteritis in chickens:what we know and whatwe need to know:a review,Avian Pathology,45(3),2016,288-294)。

NE对肉鸡生产造成了显著的负面经济影响。急性形式的NE导致肉鸡群的死亡率增加，连续几天每天可损失1％。NE的亚临床表现为肠粘膜受损、营养吸收减少和体重增加减少。据报道，NE对全球禽业的全球经济影响每年估计为60亿美元。

家禽中的产气荚膜梭菌也是食源性传播给人类的重大风险。A型和C型产气荚膜梭菌菌株分别引起人类A型腹泻和C型坏死性肠炎。美国每年报告约100万例产气荚膜梭菌感染。

牲畜的可持续生产和福利面临风险

由于在畜牧生产中逐步淘汰抗生素，可持续性增加了另一个需要考虑的重要方面。许多病原体影响动物的健康，并导致动物生产损失。可以说，限制使用抗生素可能会导致动物因疾病而大量死亡，大量食物损失，并因此对环境产生重大负面影响。

在全球范围内，整个供应链每年损失或浪费价值7500亿美元的粮食，其中约25％的粮食在生产过程中损失。根据联合国粮食及农业组织(FAO)的研究，粮食损失和浪费约占温室气体排放量的33亿吨。

据估计，如果没有抗生素，每年需要饲养7亿只额外的禽类以满足美国的禽类需求，每年需要额外约20亿加仑水和540万吨饲料。

另一个重要方面与动物的福利有关。在没有抗生素的情况下饲养的动物更容易遭受痛苦的疾病。例如，在没有使用抗生素的情况下饲养的家禽，其眼睛被氨灼伤的可能性是普通家禽的三倍多。

发明内容

本文的实施例涉及用于治疗动物中产气荚膜梭菌和坏死性肠炎的抗菌益生菌的分离、表征、筛选、选择和/或工程化。在一些实施方案中，包括用于治疗鸡的组合物。在一些实施方案中，将该组合物在水中施用于鸡。在一些实施方案中，该组合物可以包含最初从健康鸡的小肠分离的细菌。在一些实施方案中，可以测试细菌在胃肠道环境中的存活、生长、定植和代谢活性。在一些实施方案中，可以用两个外源多核苷酸对细菌进行基因工程化。第一外源性多核苷酸可以包括异源启动子和编码抗菌蛋白的多核苷酸。第二外源性多核苷酸可以包括异源启动子和编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质的功能是将抗菌蛋白分泌到细胞外环境。在一些实施方案中，抗菌肽可有效杀死鸡胃肠道内的产气荚膜梭菌。

本摘要是对本申请的一些教导的概述，并不是对本主题的排他性或详尽的论述。更多细节见详细说明书和所附权利要求书。在阅读和理解以下详细描述并查看构成其一部分的附图时，本领域技术人员将清楚地看到其他方面，其中每一个都不具有限制意义。本文的范围由所附权利要求及其法律等价物定义。

附图说明

结合下图可以更全面地理解各个方面，其中：

图1是工程化Enterocin转录单元的示意图，包括启动子的组装DNA序列、核糖体结合位点、enterocin A和转录终止位点。

图2是分泌系统转录单元的示意图，包括Microcin V分泌系统的基因cvaA和cvaB，该图具体说明启动子的组装DNA序列、cvaA的核糖体结合位点、cvaA、cvaB的核糖体结合位点和转录终止位点。

图3是用于设计cellbot以表达抗菌肽的质粒图谱的示意图，该图具体说明了表达抗菌肽(AMP)的质粒pKG00255(SEQ ID No:13)和分泌机制。选择标志物赋予氯霉素耐药性。

图4是stab-on琼脂试验的快照，证实cellbot GP00837(General ProbioticsInc.Accession Number 00837)对四种不同的产气荚膜梭菌菌株具有抗菌活性。图4具体说明了组成性表达Enterocin A的大肠杆菌GP00837在琼脂扩散试验中对四种不同的产气荚膜梭菌菌株的活性。中间的白点是改良的GP00837。浅背景显示产气荚膜梭菌生长为白色。深色区域是产气荚膜梭菌生长抑制区，由GP00837分泌的EntA引起。

图5是产气荚膜梭菌在富氧培养基中的生长与时间的关系图，显示了含有抗菌肽Enterocin B、Hiracin JM79和Enterocin A的上清液如何抑制病原体的生长。在特定时间点(0小时、3小时、6小时、24小时)通过平板法和计数每毫升菌落形成单位(CFU)来测量生长。在产生Enterocin B、Hiracin JM79和Enterocin A(BHA)的细胞培养物上清液中测量生长。

图6A和6B是四个Cellbot随时间的增长曲线图，表明Cellbot在不同环境中的增长是可变的。根据600nm处的光密度测量生长。图6A显示了富培养基中的生长以及图6B显示了小肠粘液内容物的生长。

图7A和7B是产气荚膜梭菌生长随时间变化的曲线图，显示了抗菌肽如何在各种环境中抑制病原体。在特定时间点(0小时、3小时、6小时、24小时)通过平板法和计数每毫升菌落形成单位(CFU)来测量生长。使用来自产生Enterocin B、Hiracin JM79和Enterocin A(BHA)的cellbot培养物的上清液、或来自不含抗菌肽的cellbot培养物的上清液来测量生长。图7A显示了小肠内容物的生长。图7B显示了盲肠粘液内容物的生长。

图8是这样的图，该图证实与未经治疗的鸟类相比，经cellbot GP00837(动物研究中称为GPEC2019005)治疗的感染产气荚膜梭菌和坏死性肠炎的鸟类的死亡率较低。

具体实施方式

益生菌或直接饲喂微生物被认为是抗生素饲料添加剂的潜在替代品，以减少牲畜中病原体的携带。DFM的管理也旨在诱导更好的营养消化，并提高动物(如牛和家禽)的肉类产量。此外，这些产品被认为可以调节动物的免疫反应。

FAO将益生菌定义为“活的微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处。”过多的微生物被视为益生菌，包括乳酸杆菌、双歧杆菌、杆菌和肠球菌(FAO,Probiotics inAnimal Nutrition,http://www.fao.org/3/a-i5933e.pdf)。

美国饲料控制官员协会(AAFCO)编制了一份可作为一般认为安全的(GRAS)DFM营销的官方微生物列表。这些DFM被认为是发酵产品或酵母产品，并且FDA认为是安全的。

然而，益生菌的性能和功效并不一致。对益生菌的理解存在差距，尤其是在胃肠道的复杂环境中。特定益生菌的作用模式通常不太清楚。长期以来，竞争排斥一直被认为是一种重要的作用机制，益生菌在肠道定植并抑制病原体。抑制可只是由于资源有限，或更积极地通过抑制物质的表达和分泌而发生。更具体地说，已知益生菌产生细菌素。

细菌素是由多种细菌产生的抗菌肽(AMP)。与由多酶复合物形成的抗生素肽(如短杆菌肽、多粘菌素或糖肽)不同，细菌素是核糖体合成的，即它们的序列是基因编码的。许多细菌素的确切生物学作用仍不清楚，但人们认为细菌素在生态学中起着至关重要的作用，因为它们影响某些生长环境中微生物区系的组成，例如人和动物的胃肠道(Nissen-Meyer,Ribosomally synthesized antimicrobial peptides:their function,structure,biogenesis,and mechanism of action Arch Microbiol.1997,167(2/3),67-77和其中的参考文献)。

许多细菌素通过干扰靶菌的细胞膜完整性发挥其抗菌作用，并且它们共享几个物理化学特征。它们通常是热稳定的，体积小，通常是阳离子的，并且具有两亲性或疏水性结构。

然而，它们与通常作为哺乳动物抵抗入侵病原体的第一道防线的真核AMP有很大不同：细菌素可非常有效，并且可在皮摩尔到纳摩尔浓度下发挥作用，而真核AMP的活性通常需要微摩尔浓度。大多数细菌素的靶谱也有点窄；个别细菌素通常仅对少数物种或属具有活性。相比之下，真核AMP和传统抗生素通常不那么特异，针对多种不同的细菌。因此，在效力和特异性方面，细菌素可优于传统抗生素和真核AMP。

因此，细菌素在治疗中非常有用，在这种治疗中，要从复杂的多物种环境(如肠道)中去除特定病原体，而不会像普通抗生素那样产生副作用。

对于细菌素和抗菌肽的所有前景而言，总的来说，将这些化合物用作治疗药物存在一个关键障碍。为了治疗目的，很难口服或静脉注射AMP。作为蛋白质，它们被迅速降解，在高初始剂量下，它们可能对宿主细胞有毒。一种能够在感染部位(例如动物胃肠道内)安全输送细菌素的技术将是有利的。

本文描述了工程化抗菌益生菌的开发，简称“cellbot”，其影响家畜胃肠道中产气荚膜梭菌的生存能力。理想的结果是一种能够安全有效地减少肠道内产梭菌数量的cellbot。这可以降低坏死性肠炎的风险、发病率和死亡率，并降低牲畜生产者的生产损失风险。

虽然不希望受到理论的约束，但人们认为，只有某些特定的自然分离物可以被工程化，以定植鸡的空肠，在空肠内具有代谢活性，表达和分泌针对产气荚膜梭菌的抗菌肽，和/或降低鸡中坏死性肠炎引起的发病率和死亡率。

本文中的“有效”是指可测量且持续地降低动物胃肠道长度内的产气荚膜梭菌携带，并且因此降低坏死性肠炎的发病率和NE诱导的动物发病率和死亡率。

此处的“安全”是指以下风险最小：1)cellbot感染鸟类；2)cellbot对鸡的胃生理产生负面影响；3)cellbot破坏了鸡正常的肠道菌群；4)cellbot有毒性作用；5)cellbot具有免疫原性作用；7)cellbot不能被控制并传播到环境中。

本文介绍了满足以下主要性能标准的方法，以获得对产气荚膜梭菌的安全、治疗效果：

1.cellbot在通过胃进入胃肠道的路径中幸存

2.cellbot在病原体附近的肠道内定植

3.cellbot在肠道内具有代谢活性

4.cellbot表达并分泌抗菌蛋白

5.抗菌蛋白在肠道内是稳定的

6.抗菌蛋白优先有效地杀死病原体

7.对宿主没有不利影响。

在此，我们描述了一种迭代方法，用于满足所有主要性能标准。据我们所知，在cellbot的工程化中，使线性简化方法起作用是一个挑战。我们可以努力选择每种成分，从益生菌有机体开始，并且逐个添加合成DNA构建成分，但在动物肠道内的整体性能可能不足以达到抗菌效果。我们可以测量性能结果，但当我们更改不同的组分时，使用第一组分观察到的结果可以不可预测的方式发生变化，从而阻碍设计努力。例如，在富培养基中，通过使用强组成性启动子过度表达分泌基因，可以预测会导致分泌肽的更高滴度。当这种强促进剂用于低pH值或低营养环境时，细菌的生长可受到阻碍，严重限制了肽的表达和分泌量。

根据本文的实施例，在以下四个周期中用迭代过程替换线性开发过程：

周期1.建立可以工程化到cellbot中的有机体库。

该方法的第一周期包括以下步骤：

1.在各种实施例中，从健康动物肠道的特定区域分离细菌库，如下面的实施例1所述。在各种实施例中，肠道位置为空肠区域。在其他实施例中，肠道位置为回肠或盲肠。在一些实施例中，动物感染病原体。在一些实施例中，病原体属于梭菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、劳森氏菌属、埃希氏菌属或链球菌属。

在各种实施方案中，分离的细菌菌株为大肠杆菌。在其他实施例中，分离菌株属于芽孢杆菌属、乳杆菌属和肠球菌属。在各种实施例中，分离菌株将在给动物服用后重新定植其已分离的区域。在各种实施方案中，分离物将在动物肠道内具有代谢活性。例如，选择并设计成靶向产气荚膜梭菌的cellbot必须在空肠定植，并在空肠内具有代谢活性，因为空肠是产气荚膜梭菌定植的主要位置。

2.在各种实施例中，将使用下面实施例2中所述的实验技术来确定是否存在毒力因子。在一个实施例中，将确定不存在与禽致病性大肠杆菌(APEC)毒力相关的毒力因子。在一个实施例中，将确定不存在以下一组毒力因子：cvaC、iroN、ompTp、hlyF、etsB、iss、aerJ/iutA、ireA、papC。

在各种实施例中，将不存在抗生素耐药性标志物。在一些实施例中，使用下面实施例3中的技术，所选菌株将对以下抗生素敏感：利福平、萘啶酸、氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和大观霉素。

在各种实施例中，所有分离的细菌均采用下文实施例4中所述的指纹技术进行表征。

在各种实施例中，将使用下面实施例5中所述的方法测定分离细菌的血清型。在各种实施方案中，所选分离的大肠杆菌菌株的血清型将不属于以下类型：O26、O55、O103、O111、O121、O129abc、O145、O157和O45。

在各种实施例中，将用不具有已知毒力因子、毒素和不期望的抗性标志物的不同菌株构建文库。

周期2.设计编码DNA启动子、抗菌蛋白和分泌基因的DNA序列。

3.构建DNA序列库，如下面的实施例6所述，包括用于以下目的的DNA编码：

a.抗菌肽。在各种实施例中，将组装编码属于以下类别的抗菌肽的DNA序列：微蛋白、蛋白原、卵螺旋蛋白和肠肽。在各种实施例中，将组装DNA序列，该序列编码属于endolysin类的抗菌肽。

在各种实施方案中，DNA序列编码以下一组抗菌肽之一：Enterocin A、EnterocinB、Enterocin P、肉杆菌素、Hiracin JM79和Plantaricin EF，如表3所述。在各种实施方案中，DNA序列编码两种不同的抗菌肽，从而产生多顺反子mRNA分子。在各种实施例中，DNA序列编码三种不同的抗菌肽，从而产生多顺反子mRNA分子。在各种实施例中，多顺反子DNA序列编码以下组中的两个或三个抗菌肽：Enterocin A、Enterocin B、Enterocin P、肉杆菌素、Hiracin JM79和Plantaricin EF。

b.DNA启动子。在各种实施例中，DNA启动子是组成型、静止状态、厌氧状态和氯化物诱导的DNA启动子。在各种实施例中，DNA启动子选自表5中所述的启动子组。

c.分泌基因。在各种实施例中，分泌基因是Microcin V分泌系统的基因。在各种实施例中，分泌基因是Microcin N分泌系统的基因。在各种实施例中，分泌基因是MicrocinC7分泌系统的基因。

d.核糖体结合位点和终止位点。在一个实施例中，核糖体结合位点为合成双顺反子设计(SEQ ID No 11)，如Mutalik所述(Mutalik VK,et al.Precise and reliable geneexpression via standard transcription and translation initiation elements.NatMethods.2013,10(4):354-360)。在一个实施例中，终止位点是合成转录终止子(SEQ ID No12)。

4.组装结合启动子、肽和分泌机制的DNA结构。在一个实施例中，组成性DNA启动子可操作地连接到RBS序列(SEQ ID No.11)和连接到终止位点(SEQ ID No 12)的编码Enterocin a的DNA序列，然后是可操作地连接到RBS序列和编码Microcin V系统分泌基因的DNA的组成性启动子，然后是终止位点序列(均包含在SEQ ID No 2中)。

通过组合单个肽、启动子和分泌机制而产生的不同DNA序列的可能实施例的数量为N＝(M个可用肽(乘以)P个可用肽启动子(乘以)R个可用的分泌机制启动子(乘以)S个不同的分泌基因集)。

通过组合两个不同的肽、启动子和分泌机制产生的不同DNA序列的可能实施例的数量为N＝((M个可用肽选择2)(乘以)P个可用肽启动子(乘以)R个可用的分泌机制启动子(乘以)S个不同的分泌基因集)。

通过组合三种不同的肽、启动子和分泌机制产生的不同DNA序列的可能实施例的数量为N＝((M个可用肽选择3)(乘以)P个可用肽启动子(乘以)R个可用的分泌机制启动子(乘以)S个不同的分泌基因集)。

5.在步骤2中选择的I个细菌分离物库中转化DNA结构。选择包含DNA质粒的cellbot。cellbot不同实施例的最大数量是分离物的数量乘以不同DNA序列的数量(C＝I(乘以)N)。在各种实施例中，分离物库中DNA构建物的转化将如下文实施例7所述进行。

周期3.进行性能测试并选择性能最佳的候选者。.

6.针对产气荚膜梭菌的筛选和排序系统。

在一个实施例中，可以使用下面的实施例8中所述的stab-on琼脂试验来测试cellbot的活性。

在一个实施例中，可以使用下面的实施例9中所述的上清液测试针对产气荚膜梭菌测试cellbot的活性。在一个实施例中，可以使用如实施例9所述的液体培养测试针对指示菌株测试cellbot的活性。在一个实施例中，指示菌株将为肠球菌属，如实施例9所示。

7.以下生物矩阵分析中生存和生长的筛选和排序系统：

a.胃内容物和低pH环境。在各种实施例中，所遵循的实验技术将是下面实施例10中描述的技术。

b.十二指肠区域的胆汁酸内容物。在各种实施例中，所遵循的实验技术将是下面的实施例11中描述的技术。

c.从动物的空肠、回肠和结肠刮取粘液层。在各种实施例中，所遵循的实验技术将是实施例12中描述的技术。

8.生物矩阵分析中代谢和抗菌活性的筛选和排序系统。在各种实施例中，将进行实验以在这些环境中生长Cellbot和产气荚膜梭菌，并测量肽对产气荚膜梭菌的活性，如下面的实施例13所述。在各种实施例中，将进行实验以在模拟肠道的环境中生长cellbot和指示菌株，并测量肽对指示菌株的活性。在一个实施例中，指示菌株可以是屎肠球菌。在一个实施例中，指示菌株可以是粪肠球菌。

9.排序系统，并选择顶尖的cellbot进入动物实验。在各种实施例中，可以如下面的实施例14所述进行cellbot的排序和选择。

周期4.进行概念验证动物实验。

在各种实施例中，将使用以下实施例15中所述的实验方案进行动物实验。

术语

如本文所用，术语“蛋白质”泛指通过肽键连接在一起的两个或多个氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”还包括包含通过二硫键连接的一种以上蛋白质的分子，或以共价或非共价方式连接在一起的蛋白质复合物，作为多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体)。因此，术语肽、寡肽、酶、亚单位和蛋白质都包含在蛋白质的定义中，并且这些术语可以互换使用。应该理解的是，这些术语并不意味着氨基酸聚合物的特定长度，也不意味着或区分蛋白质是使用重组技术、化学或酶合成生产的，还是自然产生的。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸，包括双链和单链RNA和DNA。多核苷酸可以直接从天然来源获得，也可以借助重组、酶或化学技术制备。多核苷酸在拓扑结构上可以是线性的或圆形的。例如，多核苷酸可以是载体的一部分，例如表达或克隆载体或片段。多核苷酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，例如，包括编码区和非编码区，例如调节区。

如本文所用，术语“编码区”、“编码序列”和“开放阅读框”可互换使用，并指编码蛋白质的核苷酸序列，当置于适当调控序列的控制下时，表达编码的蛋白质。编码区的边界通常由5′端的翻译起始密码子和3′端的翻译终止密码子决定。“调节序列”是一种核苷酸序列，用于调节其可操作链接的编码序列的表达。调控序列的非限制性示例包括启动子、增强子、转录起始位点、翻译起始位点、翻译停止位点和转录终止子。术语“可操作连接”是指组件的并置，使其处于允许其以预期方式运行的关系中。当调控序列以与调控序列兼容的条件下实现编码区表达的方式连接时，调控序列与编码区“可操作连接”。

如本文所用，“多顺反子mRNA”是指包含两个或多个编码区的转录产物。两个或多个编码区的表达由单个启动子控制，转录以产生多顺反子mRNA的两个或多个编码区序列称为操纵子。

如本文所用，“基因修饰的细菌”是指“通过人的手”改变的细菌。基因修饰的细菌包括引入外源多核苷酸(例如表达载体)的细菌。

如本文所用，“载体”是用作载体的核酸(例如，DNA)，用于将遗传材料(例如，工程化核酸)人工携带到细胞中，其中，例如，可以复制和/或表达核酸。载体的非限制性示例是质粒。质粒是双链的环状DNA序列，能够在宿主细胞中自动复制。质粒通常包含复制起点，允许质粒在宿主中半独立复制，也允许转基因插入。质粒可能具有更多特征，例如，包括“多克隆位点”，其包括用于插入核酸插入物的核苷酸悬置，以及插入物任一侧的多个限制性内切酶共识位点。

如本文所用，“外源性蛋白质”和“外源性多核苷酸”分别指通常或自然在微生物中未发现和/或已引入微生物中的蛋白质和多核苷酸。外源性多核苷酸可以从细胞的基因组DNA中分离(例如，它可以是载体，例如质粒)，或者外源性多核苷酸可以整合到细胞的基因组DNA中。

如本文所用，“异源”多核苷酸，例如异源启动子，是指在自然界中通常或自然地不可操作地连接到另一多核苷酸(例如编码区)的多核苷酸。如本文所用，“异源”蛋白质或“异源”氨基酸是指在氨基酸序列两侧的自然界中通常或自然不存在的氨基酸。

如本文所用，术语“变体”是指包含变体相对于参考序列的氨基酸序列中的一个或多个差异的多肽。例如，“变体”多肽可以包括相对于参考序列的一个或多个删除、添加或替换。术语“变体”并非旨在将变体多肽仅限于通过修饰编码参考序列的现有多肽或核酸分子制备的那些多肽，而是可以包括从头制备或从参考序列以外的多肽开始制备的变体多肽。

如本文所用，术语“保守变体”应指反映保守氨基酸替换的并入的序列。保守替换表在本领域是众所周知的(例如，参见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany(Eds)和下表1)。

残基	保守替换	残基	保守替换
				Ala	Ser	Leu	lle；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；lle
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	lle；Leu
lle	Leu，Val

表1：保守氨基酸替换示例

如本文所用，如果蛋白质的氨基酸序列与参考蛋白质相比具有指定数量的序列相似性和/或序列同源性，则蛋白质可以与参考蛋白质“结构相似”。因此，如果与参考蛋白质相比，蛋白质具有足够水平的氨基酸序列同源性、氨基酸序列相似性或其组合，则蛋白质可与参考蛋白质“结构相似”。

两种蛋白质的结构相似性可以通过对齐两种蛋白质的残基(例如，本文所述的候选蛋白质和任何适当的参考蛋白质)来确定，以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数量；尽管每个序列中的氨基酸必须保持正确的顺序，但为了优化相同氨基酸的数量，在进行比对时允许其中一个或两个序列中存在间隙。参考蛋白质可以是本文所述的蛋白质。候选蛋白质是与参考蛋白质进行比较的蛋白质。候选蛋白质可以例如从微生物中分离出来，或者可以使用重组技术生产，或者通过化学或酶法合成。

除非本文另有说明，否则可以使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序进行氨基酸序列的成对比较分析，如Tatiana等人所述(FEMS Microbiol Lett，174，247-250(1999))，并可在国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获得。可以使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括矩阵＝BLOSUM62；开放间隙惩罚＝11，扩展间隙惩罚＝1，间隙x_衰减＝50，期望值＝10，字号＝3，然后filter on。或者，可以使用GCG包(10.210.2，Madison Wis.)中的最佳拟合算法比较多肽。

本领域已知的术语“同源性百分比”是通过比较序列确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同源性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，由此类序列的字符串之间的匹配确定。“同源性”和“相似性”可以通过已知方法轻松计算，包括但不限于以下所述方法：ComputationalMolecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis inMolecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；and SequenceAnalysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,New York(1991)。确定同源性的首选方法旨在提供测试序列之间的最佳匹配。确定身份和相似性的方法被编入公开的计算机程序中。可以使用序列分析软件(如LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序)进行序列比对和身份百分比计算(DNASTAR Inc.,Madison,Wis.)。序列的多重比对可以使用Clustal比对方法(Higgins et al.,CABIOS.5:151(1989))和默认参数(间隙惩罚＝10，间隙长度惩罚＝10)来执行。可以选择使用Clustal方法的成对对齐的默认参数：KTUPLE 1，间隙惩罚＝3，窗口＝5和保存的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。

因此，如本文所用，在本文所述方法和组合物中有用的候选蛋白质包括与参考氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相似性。

或者，如本文所用，在本文所述方法和组合物中有用的候选蛋白质包括与参考氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同源性。

在本文方法和组合物中有用的核酸包括与参考核酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核酸序列同源性。

“适合”事件发生的条件，例如在细胞中表达外源多核苷酸以产生蛋白质或产物，或“适合”条件是不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于活动。

如本文所用，“动物”包括哺乳动物类成员和Aye类成员，例如人类、鸟类、牛、山羊、绵羊、猪、马、犬和猫。

如本文所用，端点对数值范围的叙述包括包含在该范围内的所有数字(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

如本文所用，“益生菌”是“当施用足够量时，对宿主产生健康益处的活微生物”，如联合国粮食及农业组织(FAO)所定义。过多的微生物被视为益生菌，可根据本文实施例在工程化状态下使用，包括大肠杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、杆菌和肠球菌。

根据本文实施例，益生菌包括在动物胃肠道内发现的细菌。

如本文所用，“cellbot”是使用合成生物学技术修饰的益生菌，以表达和传递抗菌蛋白质/肽(包括但不限于细菌素)。本发明至少部分基于意外的发现，这些发现表明，并非所有从动物胃肠道分离的细菌都可以被改造为在动物肠道重新定植并维持蛋白质生产的代谢活性。本发明公开了用于分离细菌和测试这些分离细菌在肠道内的定植和代谢活性的方法。我们发现，只有少数益生菌菌株可以在动物肠道重新定植，并表达和分泌适当数量的抗菌肽以靶向病原菌。

虽然病原体可以在整个胃肠道中找到，但它们也优先粘附在胃肠道的不同部位。例如，Clostridia spp.优先定植于鸡小肠的空肠区。如果能够在空肠定植，并且能够代谢活跃并在空肠区域生长，则经基因修饰以靶向产气荚膜梭菌的益生菌将表现更好。如实施例所述，从鸡小肠空肠区分离的益生菌大肠杆菌只有少量可以在空肠重新定植，并在基因修饰后表达和分泌抗菌肽。

抗菌肽

如本文所用，“抗菌肽”是长度通常在约10到约100个氨基酸之间的小蛋白质，其抑制并通常杀死某些细菌。因此，抗菌肽具有抑制或杀死目标微生物的抗菌活性。

目标微生物可是属于梭状芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌。例如，梭状芽孢杆菌属包括产气荚膜梭菌和艰难梭菌。

目标微生物可以是体外或体内。例如，在一个实施方案中，目标微生物可以是存在于受试者的胃肠道或泌尿生殖系统中的微生物，并且可选地可以对受试者致病。例如，在另一个实施方案中，目标微生物可是存在于母鸡卵巢中的微生物，在蛋壳形成之前污染鸡体内的鸡蛋。

使用不同的指示菌株可以确定抗菌肽是否具有抗菌活性。指示菌株的示例包括但不限于肠球菌属和大肠杆菌属。合适指示菌株的示例包括但不限于下表2中列出的菌株。在一个实施方案中，指示菌株是肠球菌属的成员，例如粪肠球菌和屎肠球菌。测试抗菌肽活性的方法包括但不限于stab-on琼脂试验以及用于评估细菌素活性的其他方法。此类方法为本领域所知且为常规方法。

指示菌株
	Lactococcus lactis subsp lactis IL1403
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
	Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842
Enterococcus faecalis ATCC 700802
	Enterococcus faecalis ATCC 47077

表2.示例指示菌株

抗菌肽可以是天然存在的，也可以是工程化的。抗菌肽由所有种类的有机体产生，包括哺乳动物、细菌和噬菌体。抗菌肽的示例如表3所示。

表3.示例性抗菌肽

表3的来源。1.Aymerich et al.,1996,Appl Environ Microbiol.62:1676-1682；2.Cintas et al.,1997,Appl Environ Microbiol.,63:4321-4330；3.Sánchez et al.,2007,FEMS Microbiol Lett.270:227-236；4.

et al.,2012,Microb DrugResist.,18:322-332；5.Fahrner et al.,1996,Chemistry&Biology 3:543-550；5.Yoonget al.,2004,J.Bacteriol.186:4808-4812；6.Uchiyama et al.,2011,Appl EnvironMicrobiol.77:580-585；7.Son et al.,2010,J.Appl Microbiol.108:1769-1779；8.

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抗菌肽的示例还包括与表3中任何一种抗菌肽基本相同的抗菌肽。如本文所用，在蛋白质的上下文中，“基本相同”是指与本文所公开的蛋白质之一不同1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基但具有相同活性的蛋白质。例如，与抗菌肽基本相同的蛋白质在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基处不同于表3中的抗菌肽，并且具有抗菌活性。在一个实施例方案中，差异是保守替换。保守氨基酸替换定义为来自以下一类残基内的氨基酸残基交换：第1类：Ala、Gly、Ser、Thr和Pro(代表小脂肪族侧链和羟基侧链)；第2类：Cys、Ser、Thr和Tyr(代表包括-OH或-SH基团的侧链)；第3类：Glu、Asp、Asn和Gln(含羧基的侧链)：第4类：His、Arg和Lys(代表碱性侧链)；第5类：Ile、Val、Leu、Phe和Met(代表疏水侧链)；第6类：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸(代表芳香侧链)。

大多数细菌素的靶谱也很窄；个别细菌素对少数物种或属具有活性。相反，真核AMP和传统抗生素的特异性通常要低得多，针对多种不同的细菌。因此，在效力和特异性方面，细菌素可能优于传统抗生素和真核AMP。

细菌素包括I类和II类细菌素。II类细菌素的示例包括IIa亚类细菌素的成员。IIa类细菌素是小分子(通常为37至48个氨基酸)、热稳定、非翻译后修饰的蛋白质，通常带正电荷，可包含N端共有序列-Tyr-Gly-Asn-Gly-(Val/Lys)-Xaa-Cys-(SEQ ID NO:50)。IIa类细菌素的示例包括但不限于表5中所述的细菌素。II类细菌素的另一示例包括IIb亚类细菌素的成员。IIb类细菌素是异二聚体细菌素，需要两个浓度大致相等的不同分子才能表现出最佳活性。IIb类细菌素的示例包括但不限于表5中所述的细菌素。

抗菌肽的另一个示例包括内溶素。内溶素是在噬菌体感染的细菌细胞中产生的双链DNA噬菌体编码的肽聚糖水解酶，当应用于革兰氏阳性细菌时会引起快速裂解(Fenton等人，2010，Bioeng Bugs.1:9-16；Fischetti，2008，Curr Opin Microbiol.11:393-400)。

编码抗菌肽的编码序列的核苷酸序列可以基于参考标准遗传代码轻松预测。当抗菌肽将在特定微生物中表达时，可参考特定微生物的首选密码子用法产生编码抗菌肽的核苷酸序列。

编码抗菌肽的编码序列还可以包括编码分泌信号蛋白的核苷酸，使得抗菌肽和分泌信号蛋白融合并表达为单个蛋白质。分泌信号蛋白以细胞外分泌的蛋白质为靶点，通常存在于蛋白质的氨基末端。在原核微生物中有用的分泌信号蛋白在本领域已知并经常使用。已知在乳酸菌中有用的分泌信号蛋白的示例，包括乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌。有用的分泌信号蛋白的一个示例来自蛋白质Usp45(Van Asseldonk et al.,1990,Gene,95,155-160)。已探索并可能采用Usp45的几种变体(Ng and Sarkar,2012,Appl.Environ.Microbiol.,79:347-356)。此外，乳杆菌分泌标签包括但不限于Lp_3050和Lp_2145，可用于L.lactis和Lactobacilli spp.。

除了上述依赖于一般Sec分泌机制的信号肽外，许多抗菌肽还具有自己的专用分泌机制，并带有相应的分泌标签。这些标签通常与这些转运系统天然分泌的抗菌肽相关，然而，这些标签也可用于分泌非天然抗菌肽。这种分泌机制的一个例子是双甘氨酸型先导物，它已被用于从乳杆菌中分泌colicin V。在大多数microcin转运系统中，分泌系统与microcin前体的自身免疫或蛋白水解裂解有关。II类microcin基因簇通常编码专用的ABC转运体和辅助蛋白。

在本文的实施例中，基因工程细菌可以表达和分泌一种或多种AMP。在本文的各种实施例中，基因工程细菌可以表达和分泌AMP的组合，例如两种或更多不同的AMP。

启动子和σ因子

自然产生的细菌监测环境条件，并通过修改其基因的表达模式它们作出反应。基因转录是由一种RNA聚合酶(RNAP)进行的。RNAP的核心酶执行RNA聚合反应，但它不能识别DNA启动子，与之结合并启动转录。细菌中启动子识别的任务留给称为σ因子的少数蛋白质亚单位之一。每个σ因子与其同源启动子结合，并与RNAP核心酶连接，从而形成功能完整的RNAP全酶。在大肠杆菌中有七个已知的σ因子，每个因子在不同的条件下与DNA启动子结合。例如，σ70始终与其同源DNA启动子结合。σ38在固定状态下与其DNA同源启动子结合。因此，可以通过使用与在所需表达条件下占优势的σ因子相互作用的启动子来控制感兴趣基因的表达。例如，通过使用能够结合σ38而非σ70的启动子，基因表达将在稳定期而不是指数期上调。

表4列出了大肠杆菌中已知σ因子的完整列表。

σ因子	基因	调节目的
			σ<sup>19</sup>	FecI	调节铁的运输
<u>σ<sup>24</sup></u>	RpoE	胞外/极端热应激
			<u>σ<sup>28</sup></u>	RpoF	鞭毛控制
σ<sup>32</sup>	RpoH	热冲击
			<u>σ<sup>38</sup></u>	RpoS	饥饿/固定相
<u>σ<sup>54</sup></u>	RpoN	氮限制
			σ<sup>70</sup>/σ<sup>A</sup>	RpoD	“内务(Housekeeping)"或主要σ因子

表4.大肠杆菌的已知σ因子

表4的来源。Gruber TM,Gross CA(2003)."Multiple sigma subunits and thepartitioning of bacterial transcription space".Annual Review ofMicrobiology.57:441–66。

大肠杆菌的σ因子如上所示。然而，应了解，每种细菌可具有不同的σ因子。

本文使用的启动子包括但不限于高、中、低表达组成型启动子、对应激、营养限制、变化pH值、变化渗透压作出反应的启动子以及在静止状态下激活的启动子。

表5列出示例启动子列表。

表5.大肠杆菌DNA启动子示例

表5的来源:1.http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Ecoli/Constitutive；2.Piraner DI,et al.Tunable thermal bioswitches for in vivocontrol of microbial therapeutics,Nat Chem Biol.2017Jan；13(1):75-80；3.SuhyunK,et al.Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transferbetween Bacteria in the Mammalian Gut,ACS Synth.Biol.2018,7,9,2270-2281；4.Schlegel S,et al.Isolating E.coli strains for recombinant proteinproduction,Cell Mol Life Sci.2017Mar；74(5):891-908；5.Kammerer W,etal.Functional dissection of E.coli promoters:information in the transcribedregion is involved in late steps of the overall process,EMBO J.1986Nov；5(11):2995–3000；6.Courbet A,et al.Detection of pathological biomarkers in humanclinical samples via amplifying genetic switches and logic gates,Sci TranslMed.2015May 27；7(289):289ra83；7.Royo JL,et al.In vivo gene regulation inSalmonella spp.by a salicylate-dependent control circuit,Nat Methods.2007Nov；4(11):937-42；8.Tucker DL,et al.Gene Expression Profiling of the pH Responsein E.coli,J.Bacteriol.183:6551-6558；9.Boulanger A,et al.MultistressRegulation in E.coli:Expression of osmB Involves Two Independent PromotersResponding either toσS or to the RcsCDB His-Asp Phosphorelay,J Bacteriol.2005May；187(9):3282-6；10.Sanders JW,et al.A chloride-inducible gene expressioncassette and its use in induced lysis of Lactococcus lactis.Appl EnvironMicrobiol.1997 Dec；63(12):4877-82.；11.Gutierrez C,et al.Osmotic induction ofgene osmC expression in E.coliK12,J Mol Biol.1991 Aug 20；220(4):959-73.；12.Boysen A,et al.Translational Regulation of Gene Expression by anAnaerobically Induced Small Non-coding RNA in E.coli,J Biol Chem.2010 Apr 2；285(14):10690-702；13.Kang Y,et al.Genome-Wide Expression Analysis Indicatesthat FNR of E.coli K-12 Regulates a Large Number of Genes of UnknownFunction,J Bacteriol.2005 Feb；187(3):1135–1160；14.Nasr R,et al.Constructionof a Synthetically Engineered nirB Promoter for Expression of RecombinantProtein in E.coli,Jundishapur J Microbiol.2014 Jul；7(7):e15942.；15.ChiuchioloMJ,et al.Growth-Phase-Dependent Expression of the Cyclopeptide AntibioticMicrocin J25,J Bacteriol.2001 Mar；183(5):1755–1764.；16.Shimada T,etal.Classification and Strength Measurement of Stationary-Phase Promoters byUse of a Newly Developed Promoter Cloning Vector,J Bacteriol.2004 Nov；186(21):7112-22；17.Hurme R,et al.A proteinaceous gene regulatory thermometer inSalmonella.Cell.1997 Jul 11；90(1):55-64.；18.Valdez-Cruz NA,et al.Productionof recombinant proteins in E.coli by the heat inducible expression systembased on the phage lambda pL and/or pR promoters,Microb Cell Fact.2010 Mar19；9:18.；19.Dobson R,et al.Characterization of a rationally engineered nitricoxide,nitrate and nitrite biosensor linked to a hybrid bacterial mammalianpromoter,available online:https://doi.org/10.6084/m9.figshare.1103248.v1；20.Kottula JW,et al.Programmable bacteria detect and record an environmentalsignal in the mammalian gut,PNAS April 1,2014 111(13)4838-4843；21.Prindle A,et al.A sensing array of radically coupled genetic‘biopixels’.Nature.2011；481:39–44.；22.Jayaraman P,et al.Repurposing a Two-Component System-BasedBiosensor for the Killing of Vibrio cholerae.ACS Synth Biol.2017 Jul 21；6(7):1403-1415。

在各种实施方案中，组成型启动子J23100-109(SEQ ID NO:3-5)在胃肠道营养丰富的环境中表现最好-它们在基因表达强度上的差异也被用作以最佳比例生产抗菌肽、成熟因子和分泌机制的方法。

在各种实施方案中，FNR启动子(SEQ ID NO:6)在胃肠道最厌氧的环境中起组成性控制的作用，因为它起源于大肠杆菌中有氧代谢和无氧代谢之间的开关系统，即FNR调节子。

在各种实施方案中，GadA/B启动子(SEQ ID NO:7-8)对pH敏感，这使得它们对胃肠道的高酸性成分有用。

在本文各种实施方案中，可以使用RPO启动子。在本文各种实施方案中，可以使用厌氧诱导启动子。在本文各种实施方案中，可以使用氯化物诱导启动子。在本文的各种实施例中，可以使用固定相启动子。

在各种实施方案中，启动子osmB(SEQ ID NO:9)是应激反应型rpoS启动子，用于高盐/离子含量(渗透胁迫)的营养不良环境。

组合物

在实施方案中，包括用于治疗动物的组合物。该组合物可包含从动物肠道分离的细菌，并包含外源性多核苷酸，该多核苷酸包含第一异源启动子和编码抗菌蛋白的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸可操作地连接所述第一异源启动子。在各种实施方案中，组合物的多核苷酸还可以包含第二异源启动子和编码合适分泌基因的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸可操作地连接所述第二异源启动子。

在一些实施方案中，该细菌可包括以ATCC登记号PTA-126596保藏的大肠杆菌菌株GP00700。在一些实施方案中，该组合物还可以包含医药上可接受的载体。在一些实施方案中，该细菌可包括大肠杆菌菌株GP00695。

在一些实施方案中，抗菌肽对产气荚膜梭菌具有溶菌或抑菌活性。在一些实施方案中，所述治疗的动物是鸡。在一些实施方案中，细菌从健康鸡的空肠中分离。在一些实施方案中，细菌使感染产气荚膜梭菌的鸡的胃肠道重新定植。在一些实施方案中，细菌在鸡的胃肠道内具有代谢活性。

在一些实施方案中，选择所述第一异源启动子和所述第二异源启动子以响应从σ70(RpoD)、σ19(FecI)、σ24(RpoE)、σ28(RpoF)、σ32(RpoH)、σ38(RpoS)和σ54(RpoN)组成的组中选择的不同σ因子。

在一些实施方案中，权利要求2-10中任一项所述的组合物，其中选择所述第一异源启动子和所述第二异源启动子以响应在动物胃肠道中发现的不同外源性环境条件，该外源性环境条件由营养成分、氧含量、pH值和胆汁浓度中的一个或多个定义。

在一些实施方案中，所述第一异源启动子和所述第二异源启动子中的至少一种选自组成启动子、外源诱导启动子、pH诱导启动子、渗透压诱导启动子、厌氧诱导启动子、饥饿诱导启动子、温度诱导启动子、炎症诱导启动子和群体感应启动子。

在一些实施方案中，基因工程化细菌是益生菌。在一些实施方案中，基因工程化细菌选自芽孢杆菌、拟杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌。在一些实施方案中，基因工程化细菌是不属于血清型O26、O55、O103、O111、O121、O129abc、O145、O157和O45的大肠杆菌菌株。在一些实施方案中，基因工程化细菌是不编码志贺毒素的大肠杆菌菌株。在一些实施方案中，基因工程化细菌是不编码以下毒力基因cvaC、iroN、ompTp、hlyF、etsB、iss、aerJ/iutA、ireA、papC的大肠杆菌菌株。在一些实施方案中，基因工程化细菌是对以下抗生素敏感的大肠杆菌菌株：利福平、萘啶酸、氯霉素、氨苄西林、卡那霉素和大观霉素。

在一些实施方案中，抗菌蛋白选自：肠霉素A、肠霉素B、肠霉素P、肉杆菌素、车前霉素EF和Hiracin JM79、或它们的保守变体。

在一些实施方案中，编码所述抗菌蛋白的异源启动子和多核苷酸位于所述细菌的染色体上。在一些实施方案中，编码所述抗菌蛋白的异源启动子和多核苷酸位于所述细菌中的质粒上。

在一些实施方案中，所述细菌从健康动物的肠道中分离。

在一些实施方案中，编码抗菌蛋白的外源性多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少70、80、85、90、95、98、99或100％序列同源性。

在一些实施方案中，本文包括医药上可接受的组合物。该组合物可以包括任何上述组合物。在一些实施方案中，组合物配制为口服施用。在一些实施方案中，组合物配制成引入动物的供水中。在一些实施方案中，组合物配制成引入动物的饲料供应中。

在一些实施方案中，包括用于治疗动物的组合物。所述组合物可包含从动物肠道分离并用质粒转染的细菌，所述质粒包含外源性多核苷酸，所述多核苷酸包含第一异源启动子和编码抗菌蛋白的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸可操作地连接所述第一异源启动子。

在实施方案中，质粒可包括与SEQ ID NO:13至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％序列同源性，或序列同源程度在上述任一范围内。

SEQ ID No:13包括77-111处的启动子J23100(SEQ ID No.5)；在77-500位表达Enterocin A的构建物的DNA序列(SEQ ID No.1其本身包括SEQ ID No.5和SEQ ID No.12)；372-500位合成转录终止子(SEQ ID No.12)的DNA序列；以及在513-4144位分泌EnterocinA(SEQ ID No.2)的构建物的DNA序列。

本文实施方案可特异性包括从动物肠道分离的细菌，包含外源性多核苷酸，包含SEQ ID No.1(或可用于表达Enterocin A的多核苷酸，包括与SEQ ID NO:1的至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％序列同源性，或在上述任一范围内的序列同源性程度)，并包含SEQ ID No.2(或用于表达Enterocin A分泌成分的多核苷酸，包括与SEQ ID NO:2至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％序列同源性，或序列同源程度在上述任一范围内)。

本文实施方案可特异性包括根据ATCC登记号PTA-126596保藏的肠道细菌大肠杆菌菌株GP00700，该细菌进一步包含外源性多核苷酸(或可用于表达Enterocin A的多核苷酸，包括与SEQ ID No.1至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％的序列同源性，或在上述任一范围内的序列同源性程度)和与SEQ ID No.2(或用于表达Enterocin A分泌成分的多核苷酸，包括与SEQ ID NO:2至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％序列同源性，或序列同源程度在上述任一范围内)。

本文实施方案可特异性包括多核苷酸，包含SEQ ID No.1(或可用于表达Enterocin A的多核苷酸，包括与SEQ ID NO:1至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％的序列同源性，或在上述任一范围内的序列同源性程度)和包含SEQ ID No.2(或用于表达Enterocin A分泌成分的多核苷酸，包括与SEQ ID NO:2至少约70、80、85、90、92、95、98、99或100％序列同源性，或序列同源程度在上述任一范围内)。

在一些实施方案中，本文公开一种用于预防、减轻或治疗由产气荚膜梭菌引起的动物坏死性肠炎的方法。该方法可以包括识别需要该方法的动物的步骤。该方法可以包括向需要的动物施用有效量的组合物(例如任何上述组合物)的步骤。在一些实施方案中，动物是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人、狗、猫或猪。在一些实施方案中，动物是禽类。在一些实施方案中，所述禽类是鸡、火鸡或鸭子。在一些实施方案中，动物是鱼。

在一些实施方案中，本文公开一种恢复由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎动物体重增加率的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括向需要的动物施用有效量的组合物(例如任何上述组合物)的步骤。在一些实施方案中，动物是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是猪。在一些实施方案中，哺乳动物是禽类。在一些实施方案中，所述禽类是鸡、火鸡或鸭子。

应当注意，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，提及含有“细菌”的组合物包括含有一种以上细菌的组合物。还应注意，术语“或”通常在其意义上使用，包括“和/或”，除非内容另有明确规定。

还应注意，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，“工程化”一词描述了被构造或配置为执行特定任务或采用特定配置的系统、装置或其他结构。短语“工程化”可以与其他类似短语互换使用，例如排列和配置、构造和排列、构造、制造和布置等。

对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，可以按任何可行顺序执行这些步骤。并且，视情况而定，可以同时执行两个或多个步骤的任何组合。

本文所描述的实施例不应与本发明的其余部分分离，因此，可以基于熟练读者的一般知识和理解与其他特征或实施例结合。

本说明书中的所有出版物和专利申请均表示本发明所属领域的普通技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请通过引用明确和单独表示的程度相同。

参考以下示例可以更好地理解各个方面。这些示例旨在代表特定实施例，但不旨在限制本文实施例的整体范围。

实施例

在此，我们描述了本发明在将抗菌肽Enterocin A输送到动物肠道中的应用。

Enterocin A是一种具有抗Clostridia spp活性的抑菌肽。本发明的应用导致鸡空肠中的产气荚膜梭菌计数较低。

在本文的实施方案中，从健康鸡的肠道中分离出新的大肠杆菌菌株。本文的实施方案包括天然大肠杆菌分离物GP00492-551、GP00666-811(General Probiotics Inc.登录号00492-00551和00666-00811)。

在本文的实施方案中，分离的大肠杆菌菌株的特征在于毒力因子、抗生素敏感性和DNA指纹特征。

在本文的实施方案中，选定的大肠杆菌分离物被设计用于表达和分泌EnterocinA。

Enterocin A表达载体包括各种大肠杆菌益生菌，其所有部分的表达依赖于重组表达系统。

本文的实施方案包括基因工程化大肠杆菌分离物GP00492-551和GP00666-811。

在本文的实施方案中，用于表达Enterocin A的重组构建体中的DNA启动子选自表5中所示的启动子，包括但不限于以下组：组成型(SEQ ID NO:3-5)、FNR(SEQ ID NO:6)、固定相(SEQ ID NO:10)、GadA/B(SEQ ID NOS:7-8)和OsmB(SEQ ID NO:9)。

在本文的实施方案中，在模拟胃肠道环境的试验中测试工程化大肠杆菌。在本文的实施方案中，对工程化大肠杆菌进行排序、筛选和选择以用于动物实验。

在本文的实施方案中，将选定的大肠杆菌施用给动物，证明大肠杆菌诱导的坏死性肠炎减少。

实施例1.来自鸡肠道的大肠杆菌分离物

在本例中，我们描述了从健康鸡的空肠中分离出大肠杆菌库，并将这些分离物用作cellbot候选物。

在分离之前，从禽类中切除健康鸡的肠道，并在-20℃下冷冻。在分离当天，肠道在～37℃下解冻。然后将小肠展开，并从十二指肠近端开始分成五个约12”长的部分。然后将含有无菌水的清洗瓶插入每个节段的近端，并用于冲洗每个节段的管腔内容物。然后用无菌手术剪刀纵向切开肠段，用无菌剃须刀片将粘液层与肠壁分离。然后将粘液储存在无菌1.5mL微量离心管中。

为了从粘液中分离大肠杆菌，将100微升的粘液直接接种在直径150mm的MacConkey琼脂平板(Remel)上。将2mL溶酶原肉汤(Miller)添加到剩余的粘液中(约500微升至1mL粘液)，并在37℃下培养2小时，以帮助大肠杆菌的回收。

然后将样品在3000rcf下离心2分钟，并将50微升的颗粒接种在另一MacConkey琼脂平板上。必要时，在电镀前进行10倍和100倍稀释，以获得单个菌落。培养皿在37℃下培养过夜(约20小时)。保存在MacConkey琼脂上表现出乳糖发酵大肠杆菌形态的菌落，以供进一步评估。

为了进一步验证MacConkey板上的菌落确实是大肠杆菌，使用与大肠杆菌染色体中gadA和gadB启动子区域结合的引物进行了两次独立的菌落聚合酶链反应(PCR)。PCR使用GoTaq Green Mastermix进行，参数如下所示。引物、退火温度和预期带尺寸如表6所示。

使用大肠杆菌Nissle 1917和另一经验证的大肠杆菌分离物作为阳性对照。检测到一个或两个具有预期条带大小的PCR表明大肠杆菌具有阳性特性。来自每只鸟每一段的五个阳性菌株在溶酶原肉汤中培养过夜，并在-80℃下保存为冷冻库。

PCR条件：初始变性：95℃ 2分钟。重复30x：95℃ 1分钟，45℃ 1分钟。72℃ 30秒。最终延期：5分钟

表6.用于验证大肠杆菌鉴定的引物

实施例2.毒力标志物鉴定

在这个例子中，我们描述了确保分离的候选细胞不包含某些毒力因子。

以下基因已被鉴定与禽致病性大肠杆菌(APEC)毒力相关：cvaC,iroN,ompTp,hlyF,etsB,iss,aerJ/iutA,ireA,papC(Logue CM,et al.Comparative analysis ofphylogenetic assignment of human and avian ExPEC and fecal commensalEscherichia coli using the(previous and revised)clermont phylogenetic typingmethods and its impact on avian pathogenic Escherichia coli(APEC)classification.Front.Microbiol.8,2017)。

使用菌落PCR筛选分离株是否存在这些基因。使用表7中列出的引物对每种基因进行PCR。引物序列从Logue等人2017年获得。使用GoTaq Green Mastermix进行PCR，参数如下所示。已知含有或缺乏每个相关基因的对照菌株包括在所有PCR中。表现出预期DNA长度的PCR产物的菌株被认为是毒力基因阳性。一般来说，优先选择不具有上述任何毒力因子的菌株。注意，毒力基因的存在并不一定表明菌株的致病性。然而，与非致病性大肠杆菌相比，这些基因在APEC菌株中富集(Johnson TJ,et al.Identification of minimal predictorsof avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostictool.J.Clin.Microbiol.2008,46,3987–3996)。

PCR条件：初始变性：95℃ 2分钟。重复30x：95℃ 1分钟，见表7中的退火温度，1分钟，72℃ 1分钟。最终延期：5分钟。

表7.用于毒力因子筛选的引物

实施例3.抗生素耐药性筛查

在本例中，我们描述了候选细胞对各类抗生素的敏感性特征。

检测以下抗生素的耐药性：利福平(100ug/mL)、萘啶酸(20ug/mL)、氯霉素(20ug/mL)、氨苄西林(100ug/mL)、卡那霉素(50ug/mL)和大观霉素(100ug/mL)。大肠杆菌分离物在溶酶原肉汤(LB)琼脂上去除，并在37℃下过夜生长。第二天，将来自LB板的大肠杆菌接种在含有上述浓度抗生素的LB琼脂生长板上。板在37℃下培养过夜。根据产生的大肠杆菌斑的密度，生长被记录为阳性、阴性或轻微。无抗生素耐药性的菌株优先用于进一步研究。

实施例4.大肠杆菌分离物指纹图谱

在本例中，我们描述了大肠杆菌分离物库的指纹识别。.

DNA指纹被用来描述分离物的特征，并确保分离物事实上是彼此唯一的。在相同鸟内分离不同菌株时，这一点尤为重要。DNA指纹分析使用单个引物，随机但可重复地结合整个物种基因组。当使用这些引物对菌株进行PCR时，它会生成一组独特的产物条带，可用于区分菌株(Dombek PE,et al.Use of repetitive DNA sequences and the PCR todifferentiate Escherichia coli isolates from human and animal sources.Appl.Environ.Microbiol.2000,66,2572–2577)。BOX A1R引物(5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’)用于在大肠杆菌分离物中区分。³使用GoTaq Green Master Mix(Promega)在以下PCR条件下进行PCR：初始变性：95℃ 2分钟。重复30x：95℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 8分钟。最终延长：8分钟。

实施例5.大肠杆菌分离株的血清分型

对所有分离的大肠杆菌进行了以下血清型测试：O26、O55、O103、O111、O121、O128abc、O145、O157、O45。这些血清型包括美国肉类行业监测的“六大”大肠杆菌血清型。这些血清型和O157是食品中最常见的大肠杆菌血清型。它们产生志贺毒素，可导致人类严重的肠道感染。

使用Statens Serum Institut(SSI)的O45单抗血清(产品编号85042)和O Pool1EPEC&VTEC/STEC(产品编号48229)测试上述血清型。

益生菌在脑心灌注(BHI)培养基中培养过夜。第二天，将培养物(连同缺乏BHI阴性对照细胞)在121℃下高压灭菌两小时，以去除可能的K胶囊和交叉反应。然后让培养物在室温下静置1小时。然后将80微升抗血清与80微升高压灭菌培养物和对照品在无菌圆底96孔板中结合。然后将平板密封在拉链袋中，并在50℃下培养过夜。

显示凝集的培养物被视为血清型阳性。包括阳性对照(ex.E.coli O157 H7 EDL#933用于O Pool 1)，并发现其凝集。此外，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)而不是O抗血清来测试自凝集。在PBS中表现出凝集的培养物无法检测血清型，因此被排除为候选培养物。

实施例6.组装一组用于表达和分泌Enterocin A的DNA序列

为了产生修饰的GP菌株，用质粒pKG00255转化大肠杆菌。工程化菌株表达Enterocin A，并利用Microcin V分泌基因(cvaA和cvaB)分泌肽。该遗传构建物包含来自安德森启动子集合(J23100-J23119)的启动子以及来自当时天然大肠杆菌microcin V基因簇的启动子。具体来说，J23100用作控制Enterocin A表达的启动子，天然分泌系统启动子用作控制Microcin V分泌基因表达的启动子。这些成分被整合到高拷贝数质粒中，该质粒包含大肠杆菌复制的pMB1来源。

图1是工程化Enterocin转录单元的示意图，包括启动子的组装DNA序列、核糖体结合位点、enterocin a和转录终止位点。图2是分泌系统转录单元的示意图，包括Microcin V分泌系统的基因cvaA和cvaB，该图具体说明了启动子的组装DNA序列、cvaA的核糖体结合位点、cvaA的核糖体结合位点和转录终止位点。图3是用于工程化cellbot以表达抗菌肽的质粒图谱的示意图，该图具体说明了表达抗菌肽(AMP)的质粒pKG00255(SEQ ID No:13)和分泌机制。选择标志物赋予氯霉素耐药性。

实施例7.DNA在Cellbot变体中的转化

DNA构建物首先在标准克隆菌株(例如大肠杆菌JM109和大肠杆菌MC1061 F)中生成。然后分离构建物，验证序列，并将其转化为所需的传递宿主。使用标准方法将从家禽肠道分离的大肠杆菌制成电兼容，包括天然大肠杆菌分离株GP00492-551和GP00666-811。

简言之，将100mL溶酶原肉汤(LB)接种400微升的大肠杆菌过夜培养物，然后在37℃下搅拌培养，直到培养物达到约0.4的OD600。通过在4000xg下离心10分钟将细胞制成颗粒，并在冰冷的去离子水中洗涤三次。最后的颗粒在400微升冰凉的10％甘油去离子水中重新悬浮。

为了进行转化，将50微升的电兼容细胞在冰上解冻，然后与50-200纳克的载体混合。大肠杆菌在2400V、25uF、200欧姆的0.2um间隙试管中转化。然后将转化体在37℃的400微升SOC培养基中培养1小时，并接种在含有适当选择性抗生素的LB琼脂上。

实施例8.Stab-on琼脂检测cellbot对C.perf.的抗菌活性

为了测试修饰的cellbot的活性，将50-150微升C.perf.过夜培养物铺在带有琼脂板的脑心输液(BHI)上以生成坪(lawn)。将修饰的GP00837菌落拭去，然后插入琼脂中，并在37℃厌氧培养过夜。图4显示了该测定的结果。中间的白点是修饰的GP00837。浅背景表明C.perf.生长为白色。深色区域是C.perf.生长抑制区，由GP00837分泌的EntA引起。该实施例表明，在高营养琼脂的琼脂扩散试验中，含有pKG00255的工程化大肠杆菌对C.perf.菌株表现出高活性。

实施例9.cellbot对指示菌株抗菌活性的上清液测定和液体培养物测定

为了进行这些检测，将待比较的cellbot菌落接种在生长培养基中。培养物在37℃的有氧环境(摇动)中培养24小时。在24小时后，将培养物在13,000x g下离心1分钟，使细胞形成颗粒。然后将上清液转移到新管中，并在100℃下煮沸灭菌10分钟。

然后通过连续稀释每个上清液并测试稀释液抑制指示菌株或已知对肽敏感的菌株的能力来比较上清液的肽浓度。这基本上估计了每个上清液的最小抑制浓度(MIC)。MIC最低的上清液效力最强。

在本实验中，粪肠球菌8E9(EF)被用作指示菌株，而不是C.perf.，因为其生长强劲。这使得生产菌株之间的定量比较更加可靠。通过证明EF和C.perf.对所述cellbot的易感性之间的线性相关，这些结果被证明可翻译为C.perf.。

为了测定MIC，将指示菌株在富培养基中生长过夜。第二天，在富培养基中稀释指示菌株，得到约10E3-10E4 CFU/mL。将30微升益生菌上清液装入无菌96孔板的前两排。将30微升磷酸盐缓冲盐水(PBS)装入其余行中。从第2行到第8行进行2次连续稀释。然后将270微升稀释的指示菌株培养物添加到每个孔中。这提供一系列8倍稀释的上清液，浓度为10％v/v至0.08％v/v。

盖上指示板，并在37℃静态培养24小时。在第二天，记录每种测试上清液的最后一次稀释，显示没有生长。然后使用这些数据比较每个上清液的效价。

表8显示了在富培养基(溶酶原肉汤)中生长的12种不同益生菌的活性，其中包含三种不同的结构(共36种益生菌菌株)。Cellbot活性显示为能够抑制指示菌株的上清液的最低体积分数的倒数。例如，含有高组成启动子的益生菌GP00835的1％体积比上清液足以抑制病原体生长。取倒数只是为了使数据更直观，因此值越高表示活动水平越高。

表8.比较Enterocin产生的上清液最小抑制活性

图5显示了在营养丰富的培养基(含2％牛肉提取物的巯基乙酸盐)中，产Enterocin A、EnterocinB和Hiracin JM79的益生菌上清液在高营养条件下与未经处理时的C.perf.生长曲线。该实例表明，经高营养启动子工程化的益生菌分泌的肽抑制C.perf.在营养丰富的培养基中的生长。

采用上清液菌落计数法获得这些数据。在本试验中，将10微升的C.perf.过夜培养物接种到900微升的巯基乙酸盐+2％的牛肉提取物中。然后将100微升来自不产生肽的益生菌(对照)或产生三种肽的同一菌株的上清液(Enterocin A、Enterocin B和Hiracin JM79(BHA))添加到培养物中。然后在37℃的厌氧条件下孵育培养物。

在0小时、3小时、6小时和24小时采集每种培养物的10微升样品，并以6个10倍的稀释液连续稀释。稀释液被镀在选择性琼脂上(用100微克/毫升利福平和30微克/毫升萘啶酸进行脑-心输注)。板在37℃厌氧条件下培养过夜和C.perf.菌落计数。根据菌落数，在每个时间点测定每毫升培养物中C.perf.的菌落形成单位(CFU)。

实施例10.胃状环境中cellbot的测试和筛选

为了完好无损地运送到感染部位，cellbot在胃的酸性条件下存活是有益的。因此，使用体外生存试验测试cellbot对胃内容物的敏感性。在这些试验中，从健康鸡的胃中取出内容物，并与水(约1:1比率)混合。然后在3500rcf下将混合物离心1分钟，以去除大固体。测量每个实验的pH值(pH～2)。然后用每毫升～10⁷CFU的益生菌接种胃内容物。然后将培养物在37℃下厌氧培养45分钟。该时间被选为鸡胃中停留时间的保守估计值。

在0小时和45分钟时，通过选择性琼脂(BHI或LB+150微克/毫升利福平)上的稀释平板计数益生菌。平板在37℃下培养过夜，并在两个时间点测定CFU/mL。然后根据以下公式计算每个菌株的存活率：

存活率＝(孵育后CFU/mL)/(孵育前CFU/mL)

表9显示了30种不同益生菌的存活率。对存活率特别低(例如<0.2)的益生菌进行了重新测试。

表9.益生菌在鸡胃内容物中的存活

除了测试胃内容物中的存活率外，还测试了在pH值调整为2的M9最低培养基中的存活率。这是为了在没有任何其他可变生物成分的情况下测试pH值对细胞的影响。表10显示了11种不同菌株在胃内容物和M9中与HCl孵育24小时后的存活率。注意，尽管两种培养基中的pH值均约为2，但在用HCl调节的M9中，分离物似乎更为敏感。

表10.益生菌在胃内容物或M9(pH＝2)中24小时后的存活率

实施例11.胆汁酸内容物中cellbot的测试和筛选

为了完好无损地运送到感染部位，cellbot也能通过十二指肠胆汁存活是有益的。因此，使用体外存活试验测试了cellbot对鸡胆汁的敏感性。在这些试验中，从健康鸡的十二指肠中取出内容物，在3500rcf下离心1分钟，以除去大块固体。然后，十二指肠内容物接种～10⁷CFU/mL的每种益生菌。然后将培养物在37℃下厌氧培养2小时。选择该时间作为鸡十二指肠内停留时间的保守估计值。

通过在选择性琼脂(BHI或LB+150微克/毫升利福平)上稀释平板在0小时和2小时计数益生菌。平板在37℃下培养过夜，并在两个时间点测定CFU/mL。然后根据以下公式计算每个菌株的存活率：

存活率＝(孵育后CFU/mL)/(孵育前CFU/mL)

表11显示30种不同益生菌的存活率。对存活率特别低的益生菌(例如<0.2，灰色显示)进行了重新测试。

表11.益生菌在鸡胆汁中的存活

实施例12.空肠样环境中cellbot的生长和稳定性

为了使cellbot有效，它们最好在感染部位的家禽肠道内具有代谢活性。在NE中，C.perf的增殖主要发生在小肠的粘膜层。因此，需要选择能够在SI粘液层中增殖、指示代谢活性的传递菌株。为了测试这个参数，从空肠和回肠分离出SI粘液。然后将粘液在M9最小培养基中稀释10倍，并无菌过滤以生成biomatrix生长培养基。可以使用从ceca分离的粘液进行类似的检测。

为了进行测定，首先在溶酶原肉汤(LB)中过夜培养益生菌。然后将2.5微升过夜培养物添加到250微升无菌96孔板中的biomatrix生长培养基中。然后在37℃下在读板器中搅拌培养板。根据600nm处的光密度，连续监测生长20小时。

图6显示了四种不同肠道分离物在富培养基(LB)和10倍稀释的SI粘液中的生长曲线。注意，与其他三种菌株相比，GP00105在SI粘液中生长较差，但在富培养基中生长不好。这表明这种特殊菌株可在动物肠道内表现出次优代谢活性。

实施例13.生物基质分析中的抗菌活性

人们普遍认为C.perf.在鸡小肠的粘膜层中增殖。因此，在该粘液层中发现的条件下，益生菌对C.perf.具有活性是可取的。类似于实施例8中的上清液活性测定，用于验证肽在感染部位可用的营养物中具有活性。

在这些试验中，从家禽研究设施中宰杀的健康鸡中分离出肠道。然后将肠道分为主要组成部分-十二指肠、回肠、空肠和盲肠。然后用无菌去离子水冲洗每个部分，以去除管腔内容物。然后使用无菌剃须刀片纵向切割切片，轻轻刮取粘液层并保存在无菌瓶中。

图7显示了在稀释的小肠和盲肠粘液中进行的上清液抑制试验。在本试验中，如上所述，从健康鸡的回肠和空肠(用于小肠)或盲肠中获取粘液。用M9最低培养基将粘液稀释1:10，然后过滤消毒。将10微升C.perf.过夜培养物接种到900微升稀释粘液中。然后将100微升来自不产生肽的益生菌(对照)或产生三种肽的同一菌株的上清液(Enterocin A、Enterocin B和Hiracin JM79(BHA))添加到培养物中。然后在37℃厌氧条件下孵育培养物。

在0小时、3小时、6小时和24小时采集每种培养物的10微升样品，并以6个10倍的稀释液连续稀释。稀释液被镀在选择性琼脂上(用100微克/毫升利福平和30微克/毫升萘啶酸进行脑-心输注)。板在37℃厌氧条件下培养过夜，计数C.perf.的菌落数。根据菌落数，在每个时间点测定每毫升培养物中C.perf.的菌落形成单位(CFU)。

基于图中的结果，似乎这些肽在小肠和盲肠粘膜层中的营养成分中都很活跃，但程度不同。

实施例14.cellbot的等级排序和筛选

对于前面示例中描述的每个筛选实验，采用方案对大肠杆菌分离株进行排序。例如，在实施例12中描述了程序用于评估在模拟鸡空肠粘液的环境中分离物的生长。在不同的时间点记录OD600测量值，并对分离株进行相应的排序。在表12中，根据40小时处的OD600测量结果对10种菌株进行了排序。

序号	菌株	OD600 40hr	等级
				1	GP000694	0.24	3
2	GP000695	0.1	7
				3	GP000696	0.11	6
4	GP000699	0.21	5
				5	GP000700	0.25	2
6	GP000701	0.08	9
				7	GP000706	0.26	1
8	GP000809	0.05	10
				9	GP000810	0.1	8
10	GP000811	0.24	4

表12.根据分离物在鸡空肠粘液环境中的生长情况对分离物进行示例等级排序(实施例12)。

在表13中，根据在stab-on琼脂平板实验中测量的光环直径对大肠杆菌工程化菌株进行评级，如实施例8所述。

序号	菌株	光环直径(mm)	等级
				1	GP000816	18	4
2	GP000817	17	6
				3	GP000818	12.5	13
4	GP000819	14	12
				5	GP000820	16.5	9
6	GP000821	15.5	11
				7	GP000822	0	15
8	GP000823	17	6
				9	GP000824	18	4
10	GP000825	16	10

表13.根据通过stab-on琼脂测试测得的抗菌活性对Cellbot进行示例等级排序(实施例8)

等级是针对360个经过工程化和测试的系统编制的。计算等级的线性组合，并确定了新的全局等级顺序。

排名前五位的候选物GP00824、GP00834、GP00632、GP00839和GP00837被重命名为GPEC2019001(或T5)、GPEC2019002(或T6)、GPEC2019003(或T7)、GPEC2019004(或T8)和GPEC2019005(或T9)。这五个Cellbot是为概念验证动物实验而准备的，如实施例14所述。

实施例14.概念验证动物实验

在本实施例中，我们描述了为评估工程大肠杆菌分离株的有效性和安全性而进行的动物实验，这些分离株已按实施例1-13所述进行了测试和筛选。

进行动物实验，以测试五种工程化益生菌E.coli在电池笼饲养22天的肉鸡中通过0-21天的水给药时，对控制由C.perf诱导的坏死性肠炎引起的总病变分数和死亡率的有效性和安全性。

本研究利用商业孵化场的540只单性商业肉鸡。每个笼子被视为一个实验单元。研究开始于研究第0天(禽类抵达)。共有九个(n＝9)治疗组(两个阴性对照组、一个阳性对照组、五个激发的供试品组和一个未激发的供试品组)，如表14所示。

每个治疗组有6个重复。每个复制品包含10只禽。每个治疗组有60只禽。治疗组为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8和T9。

在研究第0天，11只明显健康的小鸡被纳入每个笼子。在研究第7天，每个笼子被校正为每个笼子正好有10只小鸡。

除T1和T3治疗组外，所有其他治疗组从第一天(第0天)饮用水到研究的最后一天(第21天)使用各自的供试品服药。

除T1和T2组外，所有其他治疗组在第14天通过口服灌胃给予E.maxima(10,000个孢子化卵囊/毫升/只)+E.acervulina(无限制)的混合物。

除T1和T2组外，所有其他治疗组均在第17天和第18天通过灌胃以2-9x10⁸cfu/mL/只的速率给药C.perf.菌株#16。

在第17-22天期间，对所有死亡者进行尸检。

表14.动物实验中各组的描述(实施例14)。益生菌大肠杆菌菌株#1、#2、#3、#4和#5分别为GP00824、GP00834、GP00632、GP00839和GP00837。“仅最佳构建物系统”指全局等级最高的GP00824。

本研究的死亡率结果如下：

·T1和T2组没有观察到死亡。

·未经治疗的挑战对照组T3的死亡率为32.8％。

·阳性对照组T4也没有死亡率。

·T5构建物系统(GPEC2019001)的死亡率最高，为42.6％。

·T6(GPEC2019002)导致的死亡率为14.8％(P<0.05)。

·T7和T8在死亡率方面没有表现出统计学上的显著改善。

·T9(GPEC2019005)导致的死亡率为11.3％(P<0.05)。

T9(GPEC2019005或GP00837)是一种在体内表现良好的cellbot，证明了基于益生菌的技术可以对由C.perf.诱导的坏死性肠炎引起的肉鸡死亡率产生深远影响。CellbotGP00837(GPEC2019005)是使用ATCC登记号PTA-126596下保存的大肠杆菌菌株GP00700形成的。这表明GP00837(GPEC2019005)是一种非常有用的大肠杆菌菌株，用于创建用于治疗动物，特别是鸡的Cellbot。

出乎意料的是，在360种工程化cellbot中，五种cellbot中只有两种降低鸡坏死性肠炎引起的死亡率。

我们没有观察到对食用益生菌的禽类有任何不利影响，从而确定了在规定给药方案下给鸡施用Cellbot的安全性。

图8显示，与未经治疗的禽类相比，经cellbot GP00837(动物研究中称为GPEC2019005)治疗的感染C.perf.和坏死性肠炎的禽类的死亡率较低。

本文描述的实施例并不旨在穷举或将本发明限制为以下详细描述中公开的精确形式。相反，选择和描述实施例是为了使本领域的其他技术人员能够理解和理解这些原理和实践。因此，已经参考各种特定和优选实施例和技术描述了各个方面。然而，应当理解，在保持本文的精神和范围的同时，可以进行许多变化和修改。

序列表

<110> 普通益生菌股份有限公司

<120> 包含用于表达和分泌肠道菌素以控制产气荚膜梭菌诱导的家畜坏死性肠炎

<130> PDSD 269.0002WOU1

<150> US 62/966,354

<151> 2020-01-27

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 表达Enterocin A构建体的DNA序列（DNA sequence of construct to expressEnterocin A）

<400> 1

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagctactt acataacaac agcaacaact 60

aaggaggttt tcaatgcgca ctctgactct gaatgaatta gattctgttt ctggtggtac 120

cactcatagc ggtaagtatt acggaaatgg agtttactgt accaaaaata aatgcaccgt 180

tgattgggct aaagcgacaa cttgtatcgc tggtatgtct atcggcgggt tcttaggggg 240

tgccattcca ggcaaatgct aagcttggtc gaagctcaga ggatcgtaca ggcttccagg 300

catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 360

tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt cgggtgggcc tttctgcgtt 420

tata 424

<210> 2

<211> 3632

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 2

cctgataact ctcctatgtt gtatgtttat atgattttcc ttgaaacata taatgcaaat 60

tttcgattta ttttccatca ttaatccaga taaacaacaa actaatagta tgcaaggaga 120

cattatttgt ttcgccatga tgctttagaa aacagaaaaa tgaagtggca gggacgggca 180

atattacttc ccggaatacc actgtggtta atcatgctgg gaagcattgt gtttattacg 240

gcatttctga tgttcattat tgttggtacc tatagccgcc gtgttaatgt cagtggtgag 300

gtcacaacct ggccaagagc tgtcaatata tattcaggtg tacagggatt tgttgtcagg 360

cagtttgttc atgaagggca gttgataaaa aaaggggatc ctgtttatct gattgacatc 420

agtaaaagta cacgcaatgg tattgtcact gataatcatc gccgggatat agaaaaccag 480

ctggttcgtg tggacaacat tatttcccgt ctggaagaaa gtaaaaaaat aacgctagat 540

accctggaaa aacaacgtct gcaatacaca gatgcgttcc gtcgctcatc agacattata 600

cagcgtgcag aggaagggat aaaaataatg aaaaataata tggagaatta cagatactat 660

cagtcaaaag gactgattaa taaagatcaa ttaactaacc aagttgcatt atattatcaa 720

caacaaaaca accttctcag tctgagcgga caaaatgaac aaaatgccct gcagataacc 780

actctggaga gtcagattca gactcaggca gcagattttg ataatcgtat ctatcagatg 840

gaactgcaac gactcgaatt gcagaaagaa ctggttaaca ctgatgtgga aggcgaaatc 900

attatccggg cgttgtctga cgggaaagtt gactccctga gtgtcactgt agggcaaatg 960

gtcaataccg gagacagcct tctgcaggtt attcctgaga acattgaaaa ctattatctt 1020

attctctggg tcccgaatga tgctgttcct tatatttcgg ctggtgacaa agtgaatatt 1080

cgttatgaag ccttcccctc agaaaaattt gggcagttct ctgctacggt taaaactata 1140

tccaggactc ctgcgtcaac acaggaaatg ttgacctata agggagcacc tcaaaatacg 1200

ccgggtgcct ctgttccctg gtataaagtc attgcgacgc ctgaaaagca gataatcagg 1260

tatgacgaaa aatacctccc tctggaaaat ggaatgaaag ccgaaagtac actatttctg 1320

gaaaaaaggc gtatttacca gtggatgctt tctcctttct atgacatgaa acacagtgca 1380

acaggaccga tcaatgacta acaggaattt cagacaaatt ataaatctgc ttgatttgcg 1440

ctggcaacgt cgtgttccgg ttattcatca gacggagacc gctgaatgtg gactggcctg 1500

cctagcaatg atatgcggtc attttggtaa gaatattgac ctgatatatc ttcgccggaa 1560

gtttaatctc tctgcccgtg gagcaaccct tgcaggaatc aatggaatag cggagcaact 1620

ggggatggcc acccgggctc tttcactgga gttggatgaa cttcgagtcc tcaaaacgcc 1680

gtgtattctc cactgggatt tcagtcactt cgtcgttctg gtcagcgtaa agcgtaaccg 1740

ttatgtactg catgatccgg ccaggggcat aagatatatc agccgggagg aaatgagccg 1800

atattttaca ggcgttgcac ttgaggtctg gcccggaagt gaattccagt cggaaaccct 1860

gcagacccgc ataagtcttc gttcactgat taacagtatt tacggtatta aaagaacgct 1920

ggcgaaaatt ttctgtctgt cagttgtaat tgaagcaatc aatctgctaa tgccggtggg 1980

gacacagctg gttatggatc atgctattcc tgcgggggac agagggctac tgacgctaat 2040

ttctgctgct cttatgtttt ttatattact caaagctgca acgagtacgc tgcgcgcatg 2100

gtcttcactg gttatgagca cgctcatcaa tgtacagtgg cagtcggggc tgttcgatca 2160

tcttctcaga ctaccgctgg cgttttttga acgccgaaaa ttaggtgata tccagtcacg 2220

ttttgactcc cttgacacat tgagggccac atttaccacc agtgtgatcg ggttcataat 2280

ggacagcatt atggttgtcg gtgtttgtgt gatgatgctg ttatacggag gatatctcac 2340

ctggatagtt ctctgcttta ccacaattta catttttatt cgactggtga catacggcaa 2400

ttaccgacag atatcagaag aatgtcttgt cagggaggcc cgtgccgcct cctattttat 2460

ggaaacatta tatggtattg ccacggtaaa aatccagggg atggtcggaa ttcggggggc 2520

acactggctt aatatgaaaa tagatgcgat aaattcgggt attaagctaa ccaggatgga 2580

tttgctcttc ggaggaataa atacctttgt taccgcctgt gatcagattg taattttatg 2640

gctgggagca ggccttgtga tcgataatca gatgacaata ggaatgtttg tagcgtttag 2700

ttcttttcgt gggcagtttt cggaaagagt tgcctctctg accagttttc ttcttcagct 2760

aagaataatg agtctgcaca atgagcgcat tgcagatatt gcattacatg aaaaggagga 2820

aaagaaacct gaaattgaaa tcgttgctga tatggggcca atatccctgg aaaccaatgg 2880

tttaagctat cgttatgaca gtcagtcagc accgatattc agtgctctga gtttatctgt 2940

agctccgggg gaaagtgtgg ctataactgg tgcttccggt gcgggaaaaa ccacattaat 3000

gaaagtacta tgtggactat ttgaacctga tagcgggagg gtactgataa atggtataga 3060

tatacgccaa attggaataa ataattatca ccggatgata gcctgtgtta tgcaggatga 3120

ccggctattt tcaggctcaa ttcgtgaaaa tatctgtggt tttgcagagg aaatggatga 3180

agagtggatg gtagaatgtg ccagagcaag tcatattcat gatgttataa tgaatatgcc 3240

aatgggatat gaaacattaa taggtgaact tggggaaggt ctttctggcg gtcaaaaaca 3300

gcgtatattt attgcacgag ccttataccg gaaaccagga atattattta tggatgaggc 3360

aaccagtgct cttgattcag agagtgaaca tttcgtgaat gttgccataa aaaacatgaa 3420

tatcaccagg gtaattattg cacacagaga aacaacgttg agaactgttg atagagttat 3480

ttctatttaa accatagagg aattacaagc gtatgaggaa tatttcttcc tgttataatt 3540

cctcgttatg ctcagatatc tgttggaggt ggaatggaag atagacaatc caccaagaag 3600

aaatatcatt ctgtgtggat tgtccaataa ct 3632

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成启动子J23109的DNA序列（DNA sequence of synthetic promoterJ23109）

<400> 3

tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成启动子J23106的DNA序列（DNA sequence of synthetic promoterJ23106）

<400> 4

tttacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成启动子J23100的DNA序列（DNA sequence of synthetic promoterJ23100）

<400> 5

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

<210> 6

<211> 150

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 6

agttgttctt attggtggtg ttgctttatg gttgcatcgt agtaaatggt tgtaacaaaa 60

gcaatttttc cggctgtctg tatacaaaaa cgccgtaaag tttgagcgaa gtcaataaac 120

tctctaccca ttcagggcaa tatctctctt 150

<210> 7

<211> 174

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 7

gatcgcccga acagcaatgt ttgggcgatt tttattacga taataaagtc tgtttttaat 60

attatcatgt taaatgttta tattataaaa agtcgttttt ctgcttagga ttttgttatt 120

taaattaagc ctgtaatgcc ttgcttccat tgcggataaa tcctactttt ttat 174

<210> 8

<211> 242

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 8

tcaagtacta atagtgatat tttaaggtct gatttttacg tgataattca ggagacacag 60

aatgcgcata aaaataacag cataaaacac cttaccacca cccaagaatt tcatattgta 120

ttgtttttca atgaaaaaat attattcgcg taatatctca cgataaataa cattaggatt 180

ttgttattta aacacgagtc ctttgcactt gcttacttta tcgataaatc ctactttttt 240

aa 242

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 9

ccctgcgcgc gagcagattt cacggaataa tttcaccaga cttattctta gctattatag 60

tta 63

<210> 10

<211> 260

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 10

ttttttctta attgatggct aaatattctg aaataattag aaaaatgtat aaaaatccaa 60

aatattgtac taaatttgac cacttttgca gattgattag tttatggatg tttgtatcta 120

aatgatttta ttgataaatt actaaagcgt aatgattatt gatctcaatt gtattttgtg 180

ctaataaaat tctaacagaa ggacgtgagg ttcctctgta aaaatcatca tactatttcc 240

atcaaataag gaacgtaaaa 260

<210> 11

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> Mutalik等人双顺反子设计的合成RBS的DNA序列（DNA sequence of syntheticRBS of bicistronic design by Mutalik et）

<400> 11

gggcccaagt tcacttaaaa aggagatcaa caatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc 60

ttaatcatgc taaggaggtt ttct 84

<210> 12

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成转录终止子的DNA序列（DNA sequence of synthetic transcriptionalterminator）

<400> 12

ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60

gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120

gcgtttata 129

<210> 13

<211> 6141

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 大肠杆菌生产和分泌EnterocinA所需载体的全序列（Full sequence ofvector required for Enterocin A production and

secretion from Escherichia coli）

<400> 13

atcacgaggc agaatttcag ataaaaaaaa tccttagctt tcgctaagga tgatttctgg 60

aattcggtct ctggagttga cggctagctc agtcctaggt acagtgctag ctacttacat 120

aacaacagca acaactaagg aggttttcaa tgcgcactct gactctgaat gaattagatt 180

ctgtttctgg tggtaccact catagcggta agtattacgg aaatggagtt tactgtacca 240

aaaataaatg caccgttgat tgggctaaag cgacaacttg tatcgctggt atgtctatcg 300

gcgggttctt agggggtgcc attccaggca aatgctaagc ttggtcgaag ctcagaggat 360

cgtacaggct tccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 420

ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct ctactagagt cacactggct caccttcggg 480

tgggcctttc tgcgtttata cgctcagagg agcctgataa ctctcctatg ttgtatgttt 540

atatgatttt ccttgaaaca tataatgcaa attttcgatt tattttccat cattaatcca 600

gataaacaac aaactaatag tatgcaagga gacattattt gtttcgccat gatgctttag 660

aaaacagaaa aatgaagtgg cagggacggg caatattact tcccggaata ccactgtggt 720

taatcatgct gggaagcatt gtgtttatta cggcatttct gatgttcatt attgttggta 780

cctatagccg ccgtgttaat gtcagtggtg aggtcacaac ctggccaaga gctgtcaata 840

tatattcagg tgtacaggga tttgttgtca ggcagtttgt tcatgaaggg cagttgataa 900

aaaaagggga tcctgtttat ctgattgaca tcagtaaaag tacacgcaat ggtattgtca 960

ctgataatca tcgccgggat atagaaaacc agctggttcg tgtggacaac attatttccc 1020

gtctggaaga aagtaaaaaa ataacgctag ataccctgga aaaacaacgt ctgcaataca 1080

cagatgcgtt ccgtcgctca tcagacatta tacagcgtgc agaggaaggg ataaaaataa 1140

tgaaaaataa tatggagaat tacagatact atcagtcaaa aggactgatt aataaagatc 1200

aattaactaa ccaagttgca ttatattatc aacaacaaaa caaccttctc agtctgagcg 1260

gacaaaatga acaaaatgcc ctgcagataa ccactctgga gagtcagatt cagactcagg 1320

cagcagattt tgataatcgt atctatcaga tggaactgca acgactcgaa ttgcagaaag 1380

aactggttaa cactgatgtg gaaggcgaaa tcattatccg ggcgttgtct gacgggaaag 1440

ttgactccct gagtgtcact gtagggcaaa tggtcaatac cggagacagc cttctgcagg 1500

ttattcctga gaacattgaa aactattatc ttattctctg ggtcccgaat gatgctgttc 1560

cttatatttc ggctggtgac aaagtgaata ttcgttatga agccttcccc tcagaaaaat 1620

ttgggcagtt ctctgctacg gttaaaacta tatccaggac tcctgcgtca acacaggaaa 1680

tgttgaccta taagggagca cctcaaaata cgccgggtgc ctctgttccc tggtataaag 1740

tcattgcgac gcctgaaaag cagataatca ggtatgacga aaaatacctc cctctggaaa 1800

atggaatgaa agccgaaagt acactatttc tggaaaaaag gcgtatttac cagtggatgc 1860

tttctccttt ctatgacatg aaacacagtg caacaggacc gatcaatgac taacaggaat 1920

ttcagacaaa ttataaatct gcttgatttg cgctggcaac gtcgtgttcc ggttattcat 1980

cagacggaga ccgctgaatg tggactggcc tgcctagcaa tgatatgcgg tcattttggt 2040

aagaatattg acctgatata tcttcgccgg aagtttaatc tctctgcccg tggagcaacc 2100

cttgcaggaa tcaatggaat agcggagcaa ctggggatgg ccacccgggc tctttcactg 2160

gagttggatg aacttcgagt cctcaaaacg ccgtgtattc tccactggga tttcagtcac 2220

ttcgtcgttc tggtcagcgt aaagcgtaac cgttatgtac tgcatgatcc ggccaggggc 2280

ataagatata tcagccggga ggaaatgagc cgatatttta caggcgttgc acttgaggtc 2340

tggcccggaa gtgaattcca gtcggaaacc ctgcagaccc gcataagtct tcgttcactg 2400

attaacagta tttacggtat taaaagaacg ctggcgaaaa ttttctgtct gtcagttgta 2460

attgaagcaa tcaatctgct aatgccggtg gggacacagc tggttatgga tcatgctatt 2520

cctgcggggg acagagggct actgacgcta atttctgctg ctcttatgtt ttttatatta 2580

ctcaaagctg caacgagtac gctgcgcgca tggtcttcac tggttatgag cacgctcatc 2640

aatgtacagt ggcagtcggg gctgttcgat catcttctca gactaccgct ggcgtttttt 2700

gaacgccgaa aattaggtga tatccagtca cgttttgact cccttgacac attgagggcc 2760

acatttacca ccagtgtgat cgggttcata atggacagca ttatggttgt cggtgtttgt 2820

gtgatgatgc tgttatacgg aggatatctc acctggatag ttctctgctt taccacaatt 2880

tacattttta ttcgactggt gacatacggc aattaccgac agatatcaga agaatgtctt 2940

gtcagggagg cccgtgccgc ctcctatttt atggaaacat tatatggtat tgccacggta 3000

aaaatccagg ggatggtcgg aattcggggg gcacactggc ttaatatgaa aatagatgcg 3060

ataaattcgg gtattaagct aaccaggatg gatttgctct tcggaggaat aaataccttt 3120

gttaccgcct gtgatcagat tgtaatttta tggctgggag caggccttgt gatcgataat 3180

cagatgacaa taggaatgtt tgtagcgttt agttcttttc gtgggcagtt ttcggaaaga 3240

gttgcctctc tgaccagttt tcttcttcag ctaagaataa tgagtctgca caatgagcgc 3300

attgcagata ttgcattaca tgaaaaggag gaaaagaaac ctgaaattga aatcgttgct 3360

gatatggggc caatatccct ggaaaccaat ggtttaagct atcgttatga cagtcagtca 3420

gcaccgatat tcagtgctct gagtttatct gtagctccgg gggaaagtgt ggctataact 3480

ggtgcttccg gtgcgggaaa aaccacatta atgaaagtac tatgtggact atttgaacct 3540

gatagcggga gggtactgat aaatggtata gatatacgcc aaattggaat aaataattat 3600

caccggatga tagcctgtgt tatgcaggat gaccggctat tttcaggctc aattcgtgaa 3660

aatatctgtg gttttgcaga ggaaatggat gaagagtgga tggtagaatg tgccagagca 3720

agtcatattc atgatgttat aatgaatatg ccaatgggat atgaaacatt aataggtgaa 3780

cttggggaag gtctttctgg cggtcaaaaa cagcgtatat ttattgcacg agccttatac 3840

cggaaaccag gaatattatt tatggatgag gcaaccagtg ctcttgattc agagagtgaa 3900

catttcgtga atgttgccat aaaaaacatg aatatcacca gggtaattat tgcacacaga 3960

gaaacaacgt tgagaactgt tgatagagtt atttctattt aaaccataga ggaattacaa 4020

gcgtatgagg aatatttctt cctgttataa ttcctcgtta tgctcagata tctgttggag 4080

gtggaatgga agatagacaa tccaccaaga agaaatatca ttctgtgtgg attgtccaat 4140

aactcgctgt cacgcttgag accacccctg cagtccggca aaaaagggca aggtgtcacc 4200

accctgccct ttttctttaa aaccgaaaag attacttcgc gttatgcagg cttcctcgct 4260

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 4320

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 4380

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc acaggctccg 4440

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 4500

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 4560

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 4620

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 4680

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 4740

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 4800

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 4860

tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 4920

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 4980

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 5040

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 5100

aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 5160

atatgagtaa acttggtctg acagctcgag gcttggattc tcaccaataa aaaacgcccg 5220

gcggcaaccg agcgttctga acaaatccag atggagttct gaggtcatta ctggatctat 5280

caacaggagt ccaagcgagc tcgatatcaa attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt 5340

actgttgtaa ttcattaagc attctgccga catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa 5400

cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga 5460

aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca 5520

cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca 5580

ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt 5640

cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac 5700

aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt cattgccata cgaaattccg 5760

gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat 5820

ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg ttataggtac 5880

attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa 5940

cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg 6000

ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc 6060

ttacgtgccc gatcaactcg agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 6120

ttaacctata aaaataggcg t 6141

<210> 14

<211> 47

<212> PRT

<213> Enterococcus faecium

<400> 14

Thr Thr His Ser Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Thr Lys

1 5 10 15

Asn Lys Cys Thr Val Asp Trp Ala Lys Ala Thr Thr Cys Ile Ala Gly

20 25 30

Met Ser Ile Gly Gly Phe Leu Gly Gly Ala Ile Pro Gly Lys Cys

35 40 45

<210> 15

<211> 44

<212> PRT

<213> Enterococcus faecium

<400> 15

Ala Thr Arg Ser Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Asn Asn Ser Lys Cys

1 5 10 15

Trp Val Asn Trp Gly Glu Ala Lys Glu Asn Ile Ala Gly Ile Val Ile

20 25 30

Ser Gly Trp Ala Ser Gly Leu Ala Gly Met Gly His

35 40

<210> 16

<211> 53

<212> PRT

<213> Enterococcus faecium

<400> 16

Glu Asn Asp His Arg Met Pro Asn Glu Leu Asn Arg Pro Asn Asn Leu

1 5 10 15

Ser Lys Gly Gly Ala Lys Cys Gly Ala Ala Ile Ala Gly Gly Leu Phe

20 25 30

Gly Ile Pro Lys Gly Pro Leu Ala Trp Ala Ala Gly Leu Ala Asn Val

35 40 45

Tyr Ser Lys Cys Asn

50

<210> 17

<211> 44

<212> PRT

<213> Enterococcus hirae

<400> 17

Ala Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Leu Tyr Cys Asn Lys Glu Lys Cys Trp

1 5 10 15

Val Asp Trp Asn Gln Ala Lys Gly Glu Ile Gly Lys Ile Ile Val Asn

20 25 30

Gly Trp Val Asn His Gly Pro Trp Ala Pro Arg Arg

35 40

<210> 18

<211> 289

<212> PRT

<213> Enterococcus faecalis

<400> 18

Met Ala Gly Glu Val Phe Ser Ser Leu Ile Thr Ser Val Asn Pro Asn

1 5 10 15

Pro Met Asn Ala Gly Ser Arg Asn Gly Ile Pro Ile Asp Thr Ile Ile

20 25 30

Leu His His Asn Ala Thr Thr Asn Lys Asp Val Ala Met Asn Thr Trp

35 40 45

Leu Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ala His Tyr Glu Cys Thr Pro

50 55 60

Thr Glu Ile Ile Gly Cys Val Gly Glu Gln Tyr Ser Ala Phe His Ala

65 70 75 80

Gly Gly Thr Gly Gly Ile Asp Val Pro Lys Ile Ala Asn Pro Asn Gln

85 90 95

Arg Ser Ile Gly Ile Glu Asn Val Asn Ser Ser Gly Ala Pro Asn Trp

100 105 110

Ser Val Asp Pro Arg Thr Ile Thr Asn Cys Ala Arg Leu Val Ala Asp

115 120 125

Ile Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Pro Cys Asp Arg Gln His Val Leu Gly

130 135 140

His Asn Glu Val Thr Ala Thr Ala Cys Pro Gly Gly Met Asp Val Asp

145 150 155 160

Glu Val Val Arg Gln Ala Gln Gln Phe Met Ala Gly Gly Ser Asn Asn

165 170 175

Ala Val Lys Pro Glu Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Lys Pro Ser Asn

180 185 190

Asn Lys Asn Lys Glu Gly Val Ala Thr Met Tyr Cys Leu Tyr Glu Arg

195 200 205

Pro Ile Asn Ser Lys Thr Gly Val Leu Glu Trp Asn Gly Asp Ala Trp

210 215 220

Thr Val Met Phe Cys Asn Gly Val Asn Cys Arg Arg Val Ser His Pro

225 230 235 240

Asp Glu Met Lys Val Ile Glu Asp Ile Tyr Arg Lys Asn Asn Gly Lys

245 250 255

Asp Ile Pro Phe Tyr Ser Gln Lys Glu Trp Asn Lys Asn Ala Pro Trp

260 265 270

Tyr Asn Arg Leu Glu Thr Val Cys Pro Val Val Gly Ile Thr Lys Lys

275 280 285

Ser

<210> 19

<211> 410

<212> PRT

<213> 噬菌体F1（phage F1）

<400> 19

Met Ser Asn Ile Asn Met Glu Thr Ala Ile Ala Asn Met Tyr Ala Leu

1 5 10 15

Lys Ala Arg Gly Ile Thr Tyr Ser Met Asn Tyr Ser Arg Thr Gly Ala

20 25 30

Asp Gly Thr Gly Asp Cys Ser Gly Thr Val Tyr Asp Ser Leu Arg Lys

35 40 45

Ala Gly Ala Ser Asp Ala Gly Trp Val Leu Asn Thr Asp Ser Met His

50 55 60

Ser Trp Leu Glu Lys Asn Gly Phe Lys Leu Ile Ala Gln Asn Lys Glu

65 70 75 80

Trp Ser Ala Lys Arg Gly Asp Val Val Ile Phe Gly Lys Lys Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Gly Ser Ala Gly His Val Val Ile Phe Ile Ser Ser Thr Gln

100 105 110

Ile Ile His Cys Thr Trp Lys Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Tyr Val

115 120 125

Asp Asn Glu Ala Thr Thr Cys Pro Tyr Ser Met Gly Trp Tyr Val Tyr

130 135 140

Arg Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala

165 170 175

Lys Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln

180 185 190

Arg Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly

210 215 220

Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly

225 230 235 240

Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr

245 250 255

Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu

260 265 270

Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly

275 280 285

Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro

290 295 300

Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys Gln Asp Ile Glu Gly Gly

305 310 315 320

Tyr Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly

325 330 335

Phe Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr

340 345 350

Thr Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu

355 360 365

Tyr Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly

370 375 380

Tyr Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro

385 390 395 400

Val Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys

405 410

<210> 20

<211> 328

<212> PRT

<213> 噬菌体EFAP-1（phage EFAP-1）

<400> 20

Met Lys Leu Lys Gly Ile Leu Leu Ser Val Val Thr Thr Phe Gly Leu

1 5 10 15

Leu Phe Gly Ala Thr Asn Val Gln Ala Tyr Glu Val Asn Asn Glu Phe

20 25 30

Asn Leu Gln Pro Trp Glu Gly Ser Gln Gln Leu Ala Tyr Pro Asn Lys

35 40 45

Ile Ile Leu His Glu Thr Ala Asn Pro Arg Ala Thr Gly Arg Asn Glu

50 55 60

Ala Thr Tyr Met Lys Asn Asn Trp Phe Asn Ala His Thr Thr Ala Ile

65 70 75 80

Val Gly Asp Gly Gly Ile Val Tyr Lys Val Ala Pro Glu Gly Asn Val

85 90 95

Ser Trp Gly Ala Gly Asn Ala Asn Pro Tyr Ala Pro Val Gln Ile Glu

100 105 110

Leu Gln His Thr Asn Asp Pro Glu Leu Phe Lys Ala Asn Tyr Lys Ala

115 120 125

Tyr Val Asp Tyr Thr Arg Asp Met Gly Lys Lys Phe Gly Ile Pro Met

130 135 140

Thr Leu Asp Gln Gly Gly Ser Leu Trp Glu Lys Gly Val Val Ser His

145 150 155 160

Gln Trp Val Thr Asp Phe Val Trp Gly Asp His Thr Asp Pro Tyr Gly

165 170 175

Tyr Leu Ala Lys Met Gly Ile Ser Lys Ala Gln Leu Ala His Asp Leu

180 185 190

Ala Asn Gly Val Ser Gly Asn Thr Ala Thr Pro Thr Pro Lys Pro Asp

195 200 205

Lys Pro Lys Pro Thr Gln Pro Ser Lys Pro Ser Asn Lys Lys Arg Phe

210 215 220

Asn Tyr Arg Val Asp Gly Leu Glu Tyr Val Asn Gly Met Trp Gln Ile

225 230 235 240

Tyr Asn Glu His Leu Gly Lys Ile Asp Phe Asn Trp Thr Glu Asn Gly

245 250 255

Ile Pro Val Glu Val Val Asp Lys Val Asn Pro Ala Thr Gly Gln Pro

260 265 270

Thr Lys Asp Gln Val Leu Lys Val Gly Asp Tyr Phe Asn Phe Gln Glu

275 280 285

Asn Ser Thr Gly Val Val Gln Glu Gln Thr Pro Tyr Met Gly Tyr Thr

290 295 300

Leu Ser His Val Gln Leu Pro Asn Glu Phe Ile Trp Leu Phe Thr Asp

305 310 315 320

Ser Lys Gln Ala Leu Met Tyr Gln

325

<210> 21

<211> 289

<212> PRT

<213> 噬菌体jEF24C（phage jEF24C）

<400> 21

Met Ala Gly Glu Val Phe Ser Ser Leu Ile Thr Ser Val Asn Pro Asn

1 5 10 15

Pro Met Asn Ala Gly Ser Arg Asn Gly Ile Pro Ile Asp Thr Ile Ile

20 25 30

Leu His His Asn Ala Thr Thr Asn Lys Asp Val Ala Met Asn Thr Trp

35 40 45

Leu Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ala His Tyr Glu Cys Thr Pro

50 55 60

Thr Glu Ile Ile Gly Cys Val Gly Glu Gln Tyr Ser Ala Phe His Ala

65 70 75 80

Gly Gly Thr Gly Gly Ile Asp Val Pro Lys Ile Ala Asn Pro Asn Gln

85 90 95

Arg Ser Ile Gly Ile Glu Asn Val Asn Ser Ser Gly Ala Pro Asn Trp

100 105 110

Ser Val Asp Pro Arg Thr Ile Thr Asn Cys Ala Arg Leu Val Ala Asp

115 120 125

Ile Cys Thr Arg Tyr Gly Ile Pro Cys Asp Arg Gln His Val Leu Gly

130 135 140

His Asn Glu Val Thr Ala Thr Ala Cys Pro Gly Gly Met Asp Val Asp

145 150 155 160

Glu Val Val Arg Gln Ala Gln Gln Phe Met Ala Gly Gly Ser Asn Asn

165 170 175

Ala Val Lys Pro Glu Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Lys Pro Ser Asn

180 185 190

Asn Lys Asn Lys Glu Gly Val Ala Thr Met Tyr Cys Leu Tyr Glu Arg

195 200 205

Pro Ile Asn Ser Lys Thr Gly Val Leu Glu Trp Asn Gly Asp Ala Trp

210 215 220

Thr Val Met Phe Cys Asn Gly Val Asn Cys Arg Arg Val Ser His Pro

225 230 235 240

Asp Glu Met Lys Val Ile Glu Asp Ile Tyr Arg Lys Asn Asn Gly Lys

245 250 255

Asp Ile Pro Phe Tyr Ser Gln Lys Glu Trp Asn Lys Asn Ala Pro Trp

260 265 270

Tyr Asn Arg Leu Glu Thr Val Cys Pro Val Val Gly Ile Thr Lys Lys

275 280 285

Ser

<210> 22

<211> 237

<212> PRT

<213> 噬菌体F168/08（phage F168/08）

<400> 22

Met Val Lys Leu Asn Asp Val Leu Ser Tyr Val Asn Gly Leu Val Gly

1 5 10 15

Lys Gly Val Asp Ala Asp Gly Trp Tyr Gly Thr Gln Cys Met Asp Leu

20 25 30

Thr Val Asp Val Met Gln Arg Phe Phe Gly Trp Arg Pro Tyr Gly Asn

35 40 45

Ala Ile Ala Leu Val Asp Gln Pro Ile Pro Ala Gly Phe Gln Arg Ile

50 55 60

Arg Thr Thr Ser Ser Thr Gln Ile Lys Ala Gly Asp Val Met Ile Trp

65 70 75 80

Gly Leu Gly Tyr Tyr Ala Gln Tyr Gly His Thr His Ile Ala Thr Glu

85 90 95

Asp Gly Arg Ala Asp Gly Thr Phe Val Ser Val Asp Gln Asn Trp Ile

100 105 110

Asn Pro Ser Leu Glu Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ile His His Asn

115 120 125

Met Asp Gly Val Trp Gly Val Ile Arg Pro Pro Tyr Glu Ala Glu Ser

130 135 140

Lys Pro Lys Pro Pro Ala Pro Lys Pro Asp Lys Pro Asn Leu Gly Gln

145 150 155 160

Phe Lys Gly Asp Asp Asp Ile Met Phe Ile Tyr Tyr Lys Lys Thr Lys

165 170 175

Gln Gly Ser Thr Glu Gln Trp Phe Val Ile Gly Gly Lys Arg Ile Tyr

180 185 190

Leu Pro Thr Met Thr Tyr Val Asn Glu Ala Asn Asp Leu Ile Lys Arg

195 200 205

Tyr Gly Gly Asn Thr Asn Val Thr Thr Tyr Asn Tyr Asp Asn Phe Gly

210 215 220

Leu Ala Met Met Glu Lys Ala Tyr Pro Gln Val Lys Leu

225 230 235

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 23

Gly Ala Trp Lys Asn Phe Trp Ser Ser Leu Arg Lys Gly Phe Tyr Asp

1 5 10 15

Gly Glu Ala Gly Arg Ala Ile Arg Arg

20 25

<210> 24

<211> 32

<212> PRT

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 24

Arg Arg Ser Arg Lys Asn Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ala Val Glu Arg Ala Val Leu Gly Gly Ser Arg Asp Tyr Asn Lys

20 25 30

<210> 25

<211> 33

<212> PRT

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 25

Phe Asn Arg Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Lys Ser Val Arg His Val Val

1 5 10 15

Asp Ala Ile Gly Ser Val Ala Gly Ile Arg Gly Ile Leu Lys Ser Ile

20 25 30

Arg

<210> 26

<211> 34

<212> PRT

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 26

Val Phe His Ala Tyr Ser Ala Arg Gly Val Arg Asn Asn Tyr Lys Ser

1 5 10 15

Ala Val Gly Pro Ala Asp Trp Val Ile Ser Ala Val Arg Gly Phe Ile

20 25 30

His Gly

<210> 27

<211> 75

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 27

Ala Gly Asp Pro Leu Ala Asp Pro Asn Ser Gln Ile Val Arg Gln Ile

1 5 10 15

Met Ser Asn Ala Ala Trp Gly Ala Ala Phe Gly Ala Arg Gly Gly Leu

20 25 30

Gly Gly Met Ala Val Gly Ala Ala Gly Gly Val Thr Gln Thr Val Leu

35 40 45

Gln Gly Ala Ala Ala His Met Pro Val Asn Val Pro Ile Pro Lys Val

50 55 60

Pro Met Gly Pro Ser Trp Asn Gly Ser Lys Gly

65 70 75

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 28

gatcgcccga acagcaatg 19

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 29

ataaaaaagt aggatttatc cgc 23

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 30

tcaagtacta atagtgatat tttaagg 27

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 31

ttaaaaaagt aggatttatc gataaag 27

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 32

cacacacaaa cgggagctgt t 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 33

cttcccgcag catagttcca t 21

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 34

aagtcaaagc aggggttgcc cg 22

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 35

gacgccgaca ttaagacgca g 21

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 36

tcatcccgga agcctccctc actactat 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 37

tagcgtttgc tgcactggct tctgatac 28

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 38

ggcgatttag gcattccgat actc 24

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 39

acggggtcgc tagttaagga 20

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 40

cagcagcgct tcggacaaaa tctcct 26

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 41

ttccccacca ctctccgttc tcaaac 26

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 42

cagcaacccg aaccacttga tg 22

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 43

agcattgcca gagcggcaga a 21

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 44

ggctggacat catgggaact gg 22

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 45

cgtcgggaac gggtagaatc g 21

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 46

gatgactcag ccacgggtaa 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 47

ccaggactca cctcacgaat 20

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 48

gtggcagtat gagtaatgac cgtta 25

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 49

atatcctttc tgcagggatg caata 25

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> ⅡA类细菌素N端共有序列（Class IIa bacteriocin N-terminal consensussequence）

<220>

<221> UNSURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa can be Valine or Lysine

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸。（Xaa can be any naturally occurringamino acid.）

<400> 50

Tyr Gly Asn Gly Xaa Xaa Cys

1 5

Claims

1.一种用于治疗动物的组合物，包含：

从动物肠道分离的细菌，并且包含外源性多核苷酸，所述外源性多核苷酸包含：

第一异源启动子；和

编码抗菌蛋白的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸可操作地连接所述第一异源启动子。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述外源性多核苷酸还包含：

第二异源启动子；和

编码合适分泌基因的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸可操作地连接所述第二异源启动子。

3.权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述细菌是以ATCC登录号PTA-126596保藏的大肠杆菌菌株GP00700，并且所述组合物还包含医药上可接受的载体。

4.权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中抗菌肽对产气荚膜梭菌具有溶菌或抑菌活性。

5.权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述治疗的动物是鸡。

6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述细菌从健康鸡的空肠中分离。

7.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述细菌使感染产气荚膜梭菌的鸡的胃肠道重新定植。

8.权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述细菌在鸡的胃肠道内具有代谢活性。

9.权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中选择所述第一异源启动子和所述第二异源启动子以响应从σ70(RpoD)、σ19(FecI)、σ24(RpoE)、σ28(RpoF)、σ32(RpoH)、σ38(RpoS)和σ54(RpoN)组成的组中选择的不同σ因子。

10.权利要求2-9中任一项所述的组合物，其中选择所述第一异源启动子和所述第二异源启动子以响应在动物胃肠道中发现的不同外源性环境条件，该外源性环境条件由营养成分、氧含量、pH值和胆汁浓度中的一个或多个定义。

11.权利要求2-10中任一项所述的组合物，其中所述第一异源启动子和所述第二异源启动子中的至少一种选自组成启动子、外源诱导启动子、pH诱导启动子、渗透压诱导启动子、厌氧诱导启动子、饥饿诱导启动子、温度诱导启动子、炎症诱导启动子和群体感应启动子。

12.权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述细菌为益生菌。

13.权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述细菌选自芽孢杆菌、拟杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌。

14.权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述细菌是不属于血清型O26、O55、O103、O111、O121、O129abc、O145、O157和O45的大肠杆菌菌株。

15.权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述细菌是不编码志贺毒素的大肠杆菌菌株。

16.权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述细菌是不编码以下毒力基因cvaC、iroN、ompTp、hlyF、etsB、iss、aerJ/iutA、ireA、papC的大肠杆菌菌株。

17.权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述细菌是对以下抗生素敏感的大肠杆菌菌株：利福平、萘啶酸、氯霉素、氨苄西林、卡那霉素和大观霉素。

18.权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中，抗菌蛋白选自：肠霉素A、肠霉素B、肠霉素P、肉杆菌素、车前霉素EF和Hiracin JM79、或它们的保守变体。

19.权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中编码所述抗菌蛋白的异源启动子和多核苷酸位于所述细菌的染色体上。

20.权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中编码所述抗菌蛋白的异源启动子和多核苷酸位于所述细菌中的质粒上。

21.权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中所述细菌从健康动物的肠道中分离。

22.权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中编码所述抗菌蛋白的外源性多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同源性。

23.一种医药上可接受的组合物，包含权利要求1-22中任一项所述的组合物。

24.权利要求23所述的医药上可接受的组合物，其中所述组合物配制为口服施用。

25.权利要求23-24中任一项所述的医药上可接受的组合物，其中所述组合物配制成引入动物的供水中。

26.权利要求23-24中任一项所述的医药上可接受的组合物，其中所述组合物配制成引入动物的饲料供应中。

27.一种用于预防、减轻或治疗由产气荚膜梭菌引起的动物坏死性肠炎的方法，包括向需要的动物施用权利要求1-26中任一项所述的组合物。

28.权利要求27所述的方法，其中所述治疗的动物是哺乳动物。

29.权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物是人、狗、猫或猪。

30.权利要求29所述的方法，其中所述治疗的动物是禽类。

31.权利要求30所述的方法，其中所述禽类是鸡、火鸡或鸭子。

32.权利要求29所述的方法，其中所述治疗的动物是鱼。

33.一种恢复由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎动物体重增加率的方法，包括向有需要的动物施用权利要求1-26中任一项所述的组合物。

34.权利要求33所述的方法，其中所述治疗的动物是哺乳动物。

35.权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物是猪。

36.权利要求35所述的方法，其中所述治疗的动物是禽类。

37.权利要求36所述的方法，其中所述禽类是鸡、火鸡或鸭子。

38.一种用于治疗动物的组合物，包含：

从动物肠道分离并用质粒转染的细菌，所述质粒包含外源性多核苷酸，所述外源性多核苷酸包含：

第一异源启动子；和

39.权利要求38所述的组合物，其中所述质粒包含与SEQ ID NO:13至少92％的序列同源性。

40.权利要求38所述的组合物，其中所述质粒包含与SEQ ID NO:13至少95％的序列同源性。

41.权利要求38所述的组合物，其中所述质粒包含与SEQ ID NO:13至少98％的序列同源性。

42.权利要求38所述的组合物，其中所述质粒包含与SEQ ID NO:13至少99％的序列同源性。

43.权利要求38所述的组合物，其中所述质粒包含与SEQ ID NO:13的100％的序列同源性。

44.一种用于治疗动物的组合物，包含：

从动物肠道分离的细菌，包含：

外源性多核苷酸，包含：

与SEQ ID No.1具有至少95％序列同源性的多核苷酸序列；和

与SEQ ID No.2具有至少95％序列同源性的多核苷酸序列。

45.权利要求44所述的组合物，其中所述细菌包括大肠杆菌。

46.权利要求44所述的组合物，其中所述细菌包括以ATCC保藏号PTA-126596保藏的大肠杆菌。

47.权利要求44所述的组合物，其中所述外源性多核苷酸包含：

与SEQ ID No.1具有100％序列同源性的多核苷酸序列；和

与SEQ ID No.2具有100％序列同源性的多核苷酸序列。

48.分离的多核苷酸，包含：

可操作以表达肠霉素A的多核苷酸序列，与SEQ ID No.1具有至少95％的序列同源性；和

可操作以表达肠霉素A分泌成分的多核苷酸序列，与SEQ ID No.2具有至少95％的序列同源性。

49.权利要求48所述的分离多核苷酸，包含：

与SEQ ID No.1具有至少100％序列同源性的多核苷酸序列；和

与SEQ ID No.2具有至少100％序列同源性的多核苷酸序列。