DE102022119024A1

DE102022119024A1 - Neuartige genetische Werkzeuge

Info

Publication number: DE102022119024A1
Application number: DE102022119024.2A
Authority: DE
Inventors: Shrikrishnan Sankaran; Sourik Dey; Marc Blanch Asensio
Original assignee: Inm Leibniz Institut Fuer Neue Mat Gemeinnuetzige GmbH; Inm Leibniz Institut Fuer Neue Materialien Gemeinnuetzige GmbH
Current assignee: Inm Leibniz Institut Fuer Neue Mat Gemeinnuetzige GmbH; Inm Leibniz Institut Fuer Neue Materialien Gemeinnuetzige GmbH
Priority date: 2022-07-28
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2024-02-08
Also published as: WO2024022791A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen neuen Promotor für Lactobacillus, sowie die Verwendung von Toxin/Antitoxin-Systemen in Lactobacillus.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neuartige genetische Werkzeuge für Lactobacillus. Dies betrifft insbesondere einen Promotor zur Expression von Proteinen, insbesondere einen Vektor mit einem solchen Promotor. Der Vektor kann auch noch zusätzlich mindestens ein Toxin/Antitoxin-System umfassen.
Stand der Technik
Laktobazillen (Lactobacillus) sind gram-positive, stäbchenförmige Milchsäurebakterien (LAB), die typischerweise bei Menschen und Tieren als Kommensalen vorkommen. Ihre stressresistenten phänotypischen Eigenschaften ermöglichen ihnen die Besiedlung eines breiten Spektrums von Mikroumgebungen des Wirts, wie Darm, Haut, Vagina, Nasen- und Rachenhöhle. Sie bieten häufig gesundheitliche Vorteile wie entzündungshemmende, antipathogene und immunmodulatorische Aktivität. Aus diesem Grund sind sie eine der größten Klassen von Probiotika und mehrere Arten werden klinisch zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten wie Colitis ulcerosa, Mastitis, atopische Dermatitis, bakterielle Vaginose und Parodontitis verwendet. Abgesehen von ihrem gesundheitlichen Nutzen sind Laktobazillen auch für zahlreiche Fermentationsprozesse in der Lebensmittelindustrie unerlässlich, zum Beispiel bei der Herstellung von Joghurt, Käse, Sauerteigbrot, Bier und Wein. Aufgrund dieser Allgegenwärtigkeit im täglichen Leben besteht ein erhebliches Interesse daran, die Fähigkeiten dieser Bakterien sowohl für medizinische als auch für industrielle Zwecke genetisch zu verbessern und zu erweitern. Im medizinischen Bereich werden Laktobazillen als lebende biotherapeutische Produkte (LBPs) entwickelt, die Medikamente direkt am Ort von Krankheiten wie Colitis ulcerosa produzieren und abgeben. Um die Pharmakokinetik und die Besiedlung dieser therapeutischen Bakterien im Körper zu untersuchen, wurden diese Bakterien so manipuliert, dass sie Reporterproteine exprimieren, die in situ abgebildet werden können. In der Industrie werden Laktobazillen als alternative Wirte für die rekombinante Expression von E. coli in Betracht gezogen, da sie zwei entscheidende Vorteile bieten: (i) Sie produzieren keine Endotoxine, und viele Stämme haben den Status „Generally Recognized as Safe“ (GRAS), was die Gefahr minimiert, dass gereinigte therapeutische Proteine toxische Wirkungen beim Menschen hervorrufen und (ii) die Infrastruktur für ihre Kultur ist in der Lebensmittelindustrie bereits gut etabliert und optimiert.
Trotz dieses Potenzials sind die wichtigsten Einschränkungen für das Engineering von Lactobacillus der Mangel an gut charakterisierten genetischen Werkzeugen und das unzureichende Verständnis der biochemischen Wege. Mehr als zwei Jahrzehnte sorgfältiger Untersuchungen und Screenings bei phylogenetisch nahestehenden Bakterien haben eine Handvoll zuverlässiger Werkzeuge für die Verwendung in Lactobacillus hervorgebracht, wie konstitutive und induzierbare Promotoren, Operatoren, Replikons, Retentionsmodule, Signalpeptide usw. Die meisten dieser Werkzeuge wurden in einigen wenigen Arten entwickelt, die sich für eine gentechnische Veränderung als geeignet erwiesen haben, wobei Lactiplantibacillus plantarum (oder Lactobacillus plantarum) eine der am häufigsten verwendeten Arten ist. Die genomische Integration von Genen wurde bei diesen Bakterien zwar nachgewiesen, die größte Funktionsvielfalt wurde jedoch mit Hilfe von Plasmiden erreicht. Allerdings sind die verfügbaren, gut charakterisierten genetischen Werkzeuge im Vergleich zum Werkzeugkasten von E. coli immer noch winzig und müssen erweitert werden, um die Art von Kreisläufen zu konstruieren, die für Anwendungen in der Medizin- oder Lebensmittelindustrie erforderlich sind.
Aufgabe
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, in Lactobacillus Proteine in hoher Ausbeute zu exprimieren.
Lösung
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindungen umfassen auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinationen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen.
Der Klarheit halber werden bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung verwendet werden, wie folgt definiert und beschrieben:

„Assoziiert mit / operativ verbunden“ bezieht sich auf zwei Nukleinsäuren, die physisch oder funktionell miteinander verbunden sind. So wird beispielsweise ein Promotor oder eine regulatorische DNA-Sequenz als „assoziiert mit“ einer DNA-Sequenz bezeichnet, die für RNA oder ein Protein kodiert, wenn die beiden Sequenzen operativ miteinander verknüpft sind oder so angeordnet sind, dass die regulatorische DNA-Sequenz das Expressionsniveau der kodierenden oder strukturellen DNA-Sequenz beeinflusst.

Eine „kodierende Sequenz“ ist eine Nukleinsäuresequenz, die in RNA wie mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA oder antisense RNA transkribiert wird. Vorzugsweise wird die RNA dann in einem Organismus übersetzt, um ein Protein herzustellen.
„Expressionskassette“ bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, die Expression einer bestimmten Nukleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle zu steuern, und die einen Promotor umfasst, der funktionell mit der interessierenden Nukleotidsequenz verbunden ist, die funktionell mit Terminierungssignalen verbunden ist. Außerdem umfasst sie in der Regel Sequenzen, die für eine ordnungsgemäße Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind. Die Expressionskassette, die die interessierende Nukleotidsequenz enthält, kann mindestens einen ihrer Bestandteile aufweisen, der im Vergleich zu mindestens einem ihrer anderen Bestandteile heterolog ist. Bei der Expressionskassette kann es sich auch um eine natürlich vorkommende Kassette handeln, die jedoch in einer für die heterologe Expression geeigneten rekombinanten Form erhalten wurde. In der Regel ist die Expressionskassette jedoch heterolog in Bezug auf den Wirt, d. h., die bestimmte Nukleinsäuresequenz der Expressionskassette kommt in der Wirtszelle nicht natürlich vor und muss durch ein Transformationsereignis in die Wirtszelle oder einen Vorfahren der Wirtszelle eingeführt worden sein. Die Expression der Nukleotidsequenz in der Expressionskassette kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines induzierbaren Promotors erfolgen, der die Transkription nur dann auslöst, wenn die Wirtszelle einem bestimmten externen Stimulus ausgesetzt ist.
Außerdem umfasst die Expressionskassette bevorzugt mindestens eine Ribosomenbindungsstelle. Diese ist bevorzugt in 5'-3'-Richtung zwischen Promotor und zu exprimierendem Protein angeordnet, bzw. Startkodon (ATG) des zu exprimierenden Proteins.
Eine Expressionskassette, die eine Nukleotidsequenz von Interesse enthält, kann chimär sein, d. h., dass mindestens einer ihrer Bestandteile heterolog in Bezug auf mindestens einen ihrer anderen Bestandteile ist. Eine Expressionskassette kann auch einen nativen Promotor enthalten, der das native Gen antreibt, aber in einer rekombinanten Form erhalten wurde, die für die heterologe Expression geeignet ist. Eine solche Verwendung einer Expressionskassette bewirkt, dass sie in der Zelle, in die sie eingeführt wurde, nicht natürlich vorkommt.
Eine Expressionskassette kann auch optional eine transkriptionelle und/oder translationale Terminationsregion (d.h. Terminationsregion) enthalten, die in Lactobacillus funktionell ist. Für die Verwendung in Expressionskassetten steht eine Vielzahl von Transkriptionsterminatoren zur Verfügung, die für die Beendigung der Transkription nach der heterologen Nukleotidsequenz von Interesse und die korrekte mRNA-Polyadenylierung verantwortlich sind. Die Terminationsregion kann für die Transkriptionsinitiationsregion nativ sein, sie kann für die operativ verknüpfte Nukleotidsequenz von Interesse nativ sein, sie kann für Lactobacillus nativ sein, oder sie kann aus einer anderen Quelle stammen (d. h. fremd oder heterolog für den Promotor, die Nukleotidsequenz von Interesse, Lactobacillus oder eine beliebige Kombination davon). Darüber hinaus kann auch der native Transkriptionsterminator einer kodierenden Sequenz verwendet werden. Jeder verfügbare Terminator, von dem bekannt ist, dass er in Lactobacillus funktioniert, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Begriff „Expression“, wenn er in Bezug auf ein Polynukleotid, wie ein Gen, einen ORF oder einen Teil davon, oder ein Transgen in Lactobacillus verwendet wird, bezieht sich auf den Prozess der Umwandlung der in einem Gen kodierten genetischen Information in RNA (z. B. mRNA, rRNA, tRNA oder snRNA) durch „Transkription“ des Gens (d. h. durch die enzymatische Wirkung einer RNA-Polymerase) und gegebenenfalls durch „Translation“ der mRNA in Protein (z. B. wenn ein Gen für ein Protein kodiert). Die Genexpression kann in vielen Phasen des Prozesses reguliert werden. Im Falle von Antisense- bzw. dsRNA-Konstrukten kann sich die Expression beispielsweise nur auf die Transkription der Antisense-RNA oder der dsRNA beziehen. In einigen Ausführungsformen bezieht sich der Begriff „Expression“ auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense-RNA (mRNA) oder funktioneller RNA. Der Begriff „Expression“ kann sich auch auf die Produktion von Proteinen beziehen.
Ein „Gen“ ist eine definierte Region innerhalb eines Genoms, die eine kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst und typischerweise auch andere, vor allem regulatorische Nukleinsäuren enthält, die für die Kontrolle der Expression, d. h. der Transkription und Translation, des kodierenden Teils verantwortlich sind. Ein Gen kann auch andere 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen und Terminationssequenzen enthalten. Weitere Elemente, die vorhanden sein können, sind z. B. Introns. Die regulatorische Nukleinsäuresequenz des Gens ist normalerweise nicht mit der in der Natur vorkommenden zugehörigen Nukleinsäuresequenz operativ verbunden und wäre somit ein chimäres Gen.
Eine „heterologe“ Nukleinsäuresequenz oder ein „heterologes“ Nukleinsäuremolekül ist eine Nukleinsäuresequenz oder ein Nukleinsäuremolekül, die bzw. das nicht auf natürliche Weise mit der Wirtszelle, in die sie bzw. es eingebracht wird, assoziiert ist. Eine heterologe Nukleinsäuresequenz oder ein heterologes Nukleinsäuremolekül kann eine chimäre Sequenz, wie z. B. eine chimäre Expressionskassette, umfassen, bei der der Promotor und die kodierende Region aus mehreren Ausgangsorganismen stammen. Bei der Promotorsequenz kann es sich um eine konstitutive Promotorsequenz, eine chemisch induzierbare Promotorsequenz, eine temperaturinduzierbare Promotorsequenz oder eine stressinduzierbare Promotorsequenz handeln. Heterolog wird auch als endogen bezeichnet.
Eine „homologe“ Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleinsäuresequenz, die von Natur aus mit einer Wirtszelle assoziiert ist, in die sie eingeführt wird.
„Homologe Rekombination“ ist der wechselseitige Austausch von Nukleinsäurefragmenten zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen.
„Identität“ oder „prozentuale Identität“ bezieht sich auf den Grad der Ähnlichkeit zwischen zwei Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen. Beim Sequenzvergleich dient in der Regel eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der die Testsequenzen verglichen werden. Bei der Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, gegebenenfalls werden Teilsequenzkoordinaten angegeben und Programmparameter für den Sequenzalgorithmus festgelegt. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die prozentuale Sequenzidentität für die Testsequenz(en) relativ zur Referenzsequenz auf der Grundlage der angegebenen Programmparameter. Der Ausdruck „im Wesentlichen identisch“ bezieht sich im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäuren oder zwei Aminosäuresequenzen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Teilsequenzen, die mindestens etwa 50 % Nukleotid- oder Aminosäurerestidentität aufweisen, wenn sie verglichen und auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet werden, wie mit einem der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Inspektion gemessen. In bestimmten Ausführungsformen weisen im Wesentlichen identische Sequenzen mindestens etwa 60 % oder mindestens etwa 70 % oder mindestens etwa 80 % oder mindestens etwa 85 % oder sogar mindestens etwa 90 % oder 95 % Nukleotid- oder Aminosäurerestidentität auf. In bestimmten Ausführungsformen besteht wesentliche Identität über einen Bereich der Sequenzen, der mindestens etwa 50 Reste lang ist, oder über einen Bereich von mindestens etwa 100 Resten, oder die Sequenzen sind über mindestens etwa 150 Reste im Wesentlichen identisch. In weiteren Ausführungsformen sind die Sequenzen im Wesentlichen identisch, wenn sie über die gesamte Länge der kodierenden Regionen identisch sind. Das Vorstehende gilt auch für regulatorische Sequenzen, wie Promotoren, dann bezogen auf ihre Nukleotidsequenz.
Eine optimale Ausrichtung der zu vergleichenden Sequenzen kann z. B. mit dem lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch die Methode der Ähnlichkeitssuche von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch computergestützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch visuelle Inspektion erfolgen.
Ein Beispiel für einen Algorithmus, der sich zur Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit eignet, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) erwähnt wird. Die Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich zugänglich. Bei diesem Algorithmus werden zunächst hoch bewertete Sequenzpaare (HSPs) ermittelt, indem kurze Wörter der Länge W in der Abfragesequenz identifiziert werden, die entweder mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz übereinstimmen oder einen positiv bewerteten Schwellenwert T erfüllen, wenn sie mit diesem Wort ausgerichtet werden. T wird als Schwellenwert für den Nachbarschaftswortwert bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese anfänglichen Worttreffer in der Nachbarschaft dienen als Startpunkt für die Suche nach längeren HSPs, die diese Wörter enthalten. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgedehnt, wie der kumulative Alignment Score erhöht werden kann. Die kumulativen Ergebnisse werden für Nukleotidsequenzen mit den Parametern M (Belohnungswert für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Strafwert für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix verwendet, um die kumulative Bewertung zu berechnen. Die Ausdehnung der Worttreffer in jede Richtung wird gestoppt, wenn der kumulative Alignment-Score um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abweicht, der kumulative Score aufgrund der Ansammlung eines oder mehrerer negativ bewerteter Rest-Alignments auf Null oder darunter geht oder das Ende einer der beiden Sequenzen erreicht wird. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Alignments. Das Programm BLASTN (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Cutoff von 100, M=5, N=-4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm standardmäßig eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).
Neben der Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Ein Maß für die Ähnlichkeit, das der BLAST-Algorithmus liefert, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit gibt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Eine Testnukleinsäuresequenz gilt beispielsweise als ähnlich zu einer Referenzsequenz, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit bei einem Vergleich der Testnukleinsäuresequenz mit der Referenznukleinsäuresequenz weniger als etwa 0,1, vorzugsweise weniger als etwa 0,01 und besonders bevorzugt weniger als etwa 0,001 beträgt.
Ein weiteres Indiz dafür, dass zwei Nukleinsäuren im Wesentlichen identisch sind, ist die Tatsache, dass die beiden Moleküle unter strengen Bedingungen aneinander hybridisieren. Der Ausdruck „spezifisch hybridisieren mit“ bezieht sich auf die Bindung, Duplexbildung oder Hybridisierung eines Moleküls nur mit einer bestimmten Nukleotidsequenz unter strengen Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch (z. B. gesamter zellulärer) DNA oder RNA vorhanden ist. „Bindung(en) im Wesentlichen“ bezieht sich auf die komplementäre Hybridisierung zwischen einer Sondennukleinsäure und einer Zielnukleinsäure und umfasst geringfügige Fehlpaarungen, die durch Verringerung der Stringenz der Hybridisierungsmedien ausgeglichen werden können, um den gewünschten Nachweis der Zielnukleinsäuresequenz zu erreichen.
„Strenge Hybridisierungsbedingungen“ und „strenge Hybridisierungswaschbedingungen“ im Zusammenhang mit Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimenten wie Southern- und Northern-Hybridisierungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich in verschiedenen Umgebungsparametern. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays“ Elsevier, New York. Im Allgemeinen werden sehr strenge Hybridisierungs- und Waschbedingungen gewählt, die etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer bestimmten Ionenstärke und einem bestimmten pH-Wert liegen. Typischerweise hybridisiert eine Sonde unter „strengen Bedingungen“ mit ihrer Zielsubsequenz, aber nicht mit anderen Sequenzen.
Der Tm-Wert ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50 % der Zielsequenz mit einer perfekt angepassten Sonde hybridisieren. Sehr strenge Bedingungen werden so gewählt, dass sie dem Tm-Wert für eine bestimmte Sonde entsprechen. Ein Beispiel für strenge Hybridisierungsbedingungen für die Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren, die mehr als 100 komplementäre Reste auf einem Filter in einem Southern oder Northern Blot aufweisen, ist 50% Formamid mit 1 mg Heparin bei 42°C, wobei die Hybridisierung über Nacht durchgeführt wird. Ein Beispiel für sehr strenge Waschbedingungen ist 0,1 5M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten. Ein Beispiel für strenge Waschbedingungen ist ein 0,2-facher SSC-Waschlauf bei 65°C für 15 Minuten (siehe J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), für eine Beschreibung des SSC-Puffers). Häufig geht einem hochstringenten Waschvorgang ein niedrigstringenter Waschvorgang voraus, um das Signal der Hintergrundsonde zu entfernen. Ein Beispiel für einen Waschvorgang mit mittlerer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 1x SSC bei 45°C für 15 Minuten. Ein Beispiel für einen Waschvorgang mit geringer Stringenz für einen Duplex von z. B. mehr als 100 Nukleotiden ist 4-6x SSC bei 40°C für 15 Minuten. Für kurze Sonden (z. B. etwa 10 bis 50 Nukleotide) umfassen strenge Bedingungen typischerweise Salzkonzentrationen von weniger als etwa 1,0 M Na-Ionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3, und die Temperatur beträgt typischerweise mindestens etwa 30°C. Strenge Bedingungen können auch durch die Zugabe von Destabilisierungsmitteln wie Formamid erreicht werden. Im Allgemeinen deutet ein Signal-Rausch-Verhältnis von 2x (oder höher) als bei einer nicht verwandten Sonde in dem jeweiligen Hybridisierungsassay auf den Nachweis einer spezifischen Hybridisierung hin. Nukleinsäuren, die unter strengen Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind dennoch im Wesentlichen identisch, wenn die Proteine, für die sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies ist z. B. der Fall, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degenerierung, die der genetische Code zulässt, erstellt wird.
Nachstehend sind Beispiele für Hybridisierungs-/Waschbedingungen aufgeführt, die zur Klonierung homologer Nukleotidsequenzen verwendet werden können, die im Wesentlichen mit den Referenznukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung identisch sind:

Eine Referenznukleotidsequenz hybridisiert vorzugsweise mit der Referenznukleotidsequenz in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 2X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, bevorzugt in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, insbesondere in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,5X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0. 5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C, noch bevorzugter in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA bei 50°C mit Waschen in 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C.

Ein weiteres Indiz dafür, dass zwei Nukleinsäuren oder Proteine im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das von der ersten Nukleinsäure kodierte Protein mit dem von der zweiten Nukleinsäure kodierten Protein immunologisch kreuzreaktiv ist oder spezifisch daran bindet. So ist ein Protein typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Protein, wenn sich die beiden Proteine nur durch konservative Substitutionen unterscheiden.
Eine Nukleinsäuresequenz ist „isokodierend“ mit einer Referenz-Nukleinsäuresequenz, wenn die Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid kodiert, das die gleiche Aminosäuresequenz hat wie das Polypeptid, für das die Referenz-Nukleinsäuresequenz kodiert.
Ein „isoliertes“ Nukleinsäuremolekül oder ein isoliertes Toxin ist ein Nukleinsäuremolekül oder Toxin, das durch Menschenhand außerhalb seiner natürlichen Umgebung existiert und daher kein Produkt der Natur ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül oder Toxin kann in gereinigter Form vorliegen oder in einer nicht natürlichen Umgebung existieren, z. B. in einer rekombinanten mikrobiellen Zelle.
Ein „Nukleinsäuremolekül“ oder eine „Nukleinsäuresequenz“ ist ein Segment einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, das aus einer beliebigen Quelle isoliert werden kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül typischerweise ein DNA-Segment. In einigen Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle isolierte Nukleinsäuremoleküle.
Die Begriffe „Protein“, „Peptid“ und „Polypeptid“ werden hier austauschbar verwendet.
Der Begriff „kodonoptimierte“ Sequenz bezeichnet die Nukleotidsequenz eines rekombinanten, transgenen oder synthetischen Polynukleotids, bei dem die Kodons so gewählt werden, dass sie den besonderen Kodon-Bias widerspiegeln, den eine Wirtszelle haben kann. Dies geschieht so, dass die Aminosäuresequenz des durch das kodonoptimierte Polynukleotid kodierten Polypeptids erhalten bleibt. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Nukleotidsequenz des rekombinanten DNA-Konstrukts eine Sequenz, die für die Zelle (z. B. eine Tier-, Pflanzen- oder Pilzzelle), in der das Konstrukt exprimiert werden soll, kodonoptimiert wurde.
Ein „Promotor“ ist eine nicht-translatierte DNA-Sequenz stromaufwärts der kodierenden Region, die die Bindungsstelle für die RNA-Polymerase enthält und die Transkription der DNA einleitet. Die Promotorregion kann auch andere Elemente enthalten, die als Regulatoren der Genexpression wirken.
Als „regulatorische Elemente“ werden Sequenzen bezeichnet, die an der Kontrolle der Expression einer Nukleotidsequenz beteiligt sind. Regulatorische Elemente umfassen einen Promotor, der funktionsfähig mit der interessierenden Nukleotidsequenz verbunden ist, sowie optional Terminierungssignale. Sie umfassen in der Regel auch Sequenzen, die für eine ordnungsgemäße Translation der Nukleotidsequenz erforderlich sind.
„Transformation“ ist ein Verfahren zur Einführung heterologer Nukleinsäure in eine Wirtszelle oder einen Organismus. Insbesondere bedeutet „Transformation“ die stabile Integration eines DNA-Moleküls in das Genom (Kern oder Plastid) eines Organismus von Interesse.
„Transformiert / transgen / rekombinant“ bezieht sich auf einen Wirtsorganismus wie ein Bakterium oder eine Pflanze, in den ein heterologes Nukleinsäuremolekül eingeführt wurde. Das Nukleinsäuremolekül kann stabil in das Genom des Wirtsorganismus integriert sein oder auch als extrachromosomales Molekül vorliegen. Ein solches extrachromosomales Molekül kann selbstreplizierend sein. Unter transformierten Zellen, Geweben oder Pflanzen sind nicht nur die Endprodukte eines Transformationsprozesses zu verstehen, sondern auch deren transgene Nachkommenschaft. Ein „nicht transformierter“, „nicht transgener“ oder „nicht rekombinanter“ Wirt bezieht sich auf einen Wildtyp-Organismus, z. B. ein Bakterium, den das heterologe Nukleinsäuremolekül nicht enthält.
Nukleotide werden durch ihre Basen mit den folgenden Standardabkürzungen angegeben: Adenin (A), Cytosin (C), Thymin (T) und Guanin (G). Die Aminosäuren werden ebenfalls mit den folgenden Standardabkürzungen angegeben: Alanin (Ala; A), Arginin (Arg; R), Asparagin (Asn; N), Asparaginsäure (Asp; D), Cystein (Cys; C), Glutamin (Gln; Q), Glutaminsäure (Glu; E), Glycin (Gly; G), Histidin (His; H), Isoleucin (Ile; 1), Leucin (Leu; L), Lysin (Lys; K), Methionin (Met; M), Phenylalanin (Phe; F), Prolin (Pro; P), Serin (Ser; S), Threonin (Thr; T), Tryptophan (Trp; W), Tyrosin (Tyr; Y) und Valin (Val; V).
Die Aufgabe wird unter anderem durch Expressionskassette zur Expression in Lactobacillus umfassend einen Promotor in operativer Verknüpfung mit einer Nukleinsäure, welche mindestens ein Protein kodiert, wobei der Promotor im Wesentlichen identisch mit dem P_tlpA-Promotor ist, bevorzugt mit einer Sequenz, welche im Wesentlichen identisch mit der Sequenz ID Nr. 1 ist, gelöst. Bevorzugt weist der Promotor eine Identität von mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, oder 100 % Identität mit der Sequenz der SEQ-ID Nr. 1 auf.
Der Promotor ist dabei ein heterologer Promotor, bevorzugt aus Salmonella typhimurium.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass dieser Promotor in Lactobacillus eine sehr hohe Expression des operativ verknüpften Proteins ermöglicht. Die Expression ist dabei insbesondere in dem Bereich bei Temperaturen zwischen 31 °C und 45 °C verstärkt, insbesondere in einem Temperaturbereich von 37 bis 43 °C.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass der P_tlpA-Promotor auch in Abwesenheit seines zugehörigen Repressors eine sehr starke Expressions ermöglicht, insbesondere im bevorzugten Temperaturbereich.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Expressionskassette mindestens eine mit dem Promotor operativ verknüpfte Ribosomenbindungsstelle, welche bevorzugt zwischen Promotor und kodiertem Protein angeordnet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Abstand zwischen Ribosomenschnittstelle und Startkodon des kodierten Proteins mindestens 8 Basenpaare, insbesondere mindestens 9 Basenpaare, bevorzugt von 9 bis 24 Basenpaare, insbesondere 9 bis 15 Basenpaare.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Vektor, insbesondere ein Plasmid, umfassend die Expressionskassette.
Es kann sich dabei um beliebige Vektoren handeln, welche für Lactobacillus geeignet sind.
Die Vektoren können noch weitere regulatorische Elemente umfassen.
Unter Lactobacillus im Sinne der Anmeldung wird bevorzugt ein Bakterium der Ordnung der Milchsäurebakterien (Lactobacillales), bevorzugt der Familie Lactobacillaceae verstanden, besonders bevorzugt der Gattung Lactobacillus, Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus.
Bevorzugt sind dabei die Arten Lactobacillus reuteri, Lactobacillus paracasei (Lacticaseibacillus paracasei), Lactobacillus plantarum (Lactiplantibacillus plantarum), Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei (Lacticaseibacillus casei), Lactococcus lactis, bevorzugt Lactobacillus plantarum (Lactiplantipacillus plantarum), besonders bevorzugt Lactobacillus plantarum WCFS1 (Lactiplantibacillus plantarum WCFS1).
Das von der Nukleinsäure kodierte Protein kann ein zu Lactobacillus homologes oder heterologes Protein sein, bevorzugt ein heterologes Protein.
Das Protein kann entsprechend der Verwendung des Lactobacillus angepasst werden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend die mindestens eine Expressionskassette.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Expressionskassette.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Lactobacillus umfassend mindestens einen Vektor umfassend die mindestens eine Expressionskassette.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Expressionskassette mit mindestens einem Toxin/Antitoxin-System operativ verknüpft. Dies bedeutet, dass zusätzlich zur Expressionskassette mindestens ein Toxin und mindestens ein Antitoxin exprimiert werden kann. Solche Systeme sind aus der Antibiotikum-freien genetischen Stabilisierung bekannt. Dabei wird bei der Expression eines Proteins auch ein Toxin und ein zugehöriges Antitoxin exprimiert. Das Toxin bewirkt dabei in der Regel eine Wachstumshemmung des Lactobacillus. Das Antitoxin neutralisiert dabei das Toxin, wobei das Toxin langsamer abgebaut wird, als das Antitoxin. Wenn bei einer Zellteilung eine Zelle ohne das Antitoxin-Gen entsteht, wird sie durch das Toxin abgetötet. Diese Systeme werden daher bevorzugt zur Generhaltung, insbesondere Plasmiderhaltung, in Zellen über mehrere Generationen eingesetzt. Da sie keine Antibiotika dafür benötigen, sind sie geeignet auch in lebenden Systemen, wie z. B. dem Magen-DarmTrakt, eingesetzt zu werden.
Das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System kann homolog oder heterolog sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System auf dem gleichen Vektor wie die Expressionskassette angeordnet.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Expressionskassette mit mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, bevorzugt mindestens zwei unterschiedlichen Toxin/Antitoxin-Systemen, operativ verknüpft. Im Falle eines Vektors sind diese Elemente auf dem Vektor angeordnet.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Toxin/Antitoxin-System mit einem Promotor verknüpft, bevorzugt einem anderen Promotor, als der Promotor der Expressionskassette. Wichtig ist nur, dass der Promotor mindestens auch aktiv ist, wenn der Promotor der Expressionskassette aktiviert wird. Bevorzugt handelt es sich um einen konstitutiven Promotor, welcher nicht von einem externen Stimulus geschaltet wird. Dadurch ist diese Plasmidretention immer aktiv, wenn das Plasmid in der Zelle ist. In diesem Fall kann „operativ verknüpft“ auch bedeuten, dass die Expressionskassette und die TA-Systeme auf dem gleichen Vektor angeordnet sind und die Plasmidretention durch das Toxin/Antitoxin-System die operative Verknüpfung darstellt.
Es sind viele Toxin/Antitoxin-Systeme bekannt.
Es werden verschiedene Typen von solchen Systemen unterschieden (Singh G. et al. Current Research in Microbial Sciences 2, 2021, 100047, Bacterial toxin-antitoxin modules: classification, functions, and association with persistence).
Bei Typ-I-TA-Systemen ist das Antitoxin eine antisense RNA, welche die Translation der mRNA der Toxins inhibiert. Ein Beispiel dafür ist das hok-sok-Modul (Gerdes, K., Bech, F.W., J⌀rgensen, S.T., Løbner-Olesen, A., Rasmussen, P.B., Atlung, T., Boe, L., Karlstrom, O., Molin, S., von Meyenburg, K., 1986. Mechanism of postsegregational killing by the hok gene product of the parB system of plasmid R1 and its homology with the relF gene product of the E.coli relB operon. EMBO J 5 (8), 2023-2029.). Bei Typ-II-TA-Systemen sind Toxin und Antitoxin Proteine, welche miteinander einen Komplex bilden. Viele der Toxine sind dabei Endoribonucleasen oder Inhibitoren der DNA Gyrase.
Bei einem Typ-III-TA-System ist das Antitoxin eine RNA, welche direkt mit dem Toxin-Protein interagiert.
Bei einem Typ-IV-TA-System sind Antitoxin und Toxin proteine, welche nicht direkt miteinander interagieren, sondern kompetitiv an ein Protein binden.
Bei einem Typ-V-TA-System ist das Antitoxin eine Endoribonuklease gegen die mRNA des Toxins.
Bei einem Typ-VI-TA-System hemmt das Toxin die Replikation, während das Antitoxin die Zersetzung des Toxins verursacht.
Bei einem Typ-VII-TA-System modifiziert das Antitoxin das Toxin.
Das TA-System kann ein System vom Typ I, Typ II, Typ III, Typ IV, Typ V oder Typ VI sein.
Beispiele für Typ-I-TA-Systeme sind Hok und Sok, Fst und RNAII, TisB und IstR, LdrB und RdlD, FlmA und FlmB, lbs und Sib, TxpA/BmT und RatA, SymE und SymR, and XXCV2162 und ptaRNAl.
Beispiele für Typ-II-TA-Systeme sind CcdB und CcdA, ParE und ParD, MaxF und MazE, yafO und yafN, HicA und HicB, Kid und Kis, Zeta und Epsilon, DarT und DarG, Txe und Axe, YafQ und DinJ, HigB und HigA, HipA und HipB, PhD und Doc, RelB und RelE, VapB und VapC, RnlA und RnlB, MqsR und MqsA.
Ein Beispiel für ein Typ-III-TA-System ist ToxN und Toxl.
Ein Beispiel für ein Typ-IV-TA-System ist
Ein Beispiel für ein Typ-V-TA-System ist GoT and GoS.
Ein Beispiel für ein Typ-VI-TA-System ist SocA and SocB.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System ein Typ-II-TA-System, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Txe (SEQ ID Nr. 8) / Axe (SEQ ID Nr. 9), YafQ (SEQ ID Nr. 10) / DinJ (SEQ ID Nr. 11), HicA (SEQ ID Nr. 12) / HicB (SEQ ID Nr. 13) , HigB (SEQ ID Nr. 14) / HigA (SEQ ID Nr. 15) und MazF (SEQ ID Nr. 16) / MazE (SEQ ID Nr. 17). Die Sequenzen sind bevorzugt benachbart angeordnet, wobei sie sich auch überlappen können.
Ein solches Toxin/Antitoxin-System kann dabei die Retention eines Plasmids über mehrere Generationen von Lactobacillus erhöhen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch die Anwesenheit von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, insbesondere zwei Toxin/Antitoxin-Systemen, ganz besonders zwei verschiedene Toxin/Antitoxin-Systemen, die Retention deutlich verbessert wird.
Bevorzugt ist eine Retention mindestens 15 % nach 100 Generationen, insbesondere mindestens 20 %.
Bei Anwesenheit von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen ist eine Retention von mindestens 40 %, bevorzugt über 50 % nach 100 Generationen, bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erreicht das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System einen G₅₀-Wert von mindestens 50, insbesondere mindestens 60. Dabei ist der G₅₀-Wert die Zahl der Generationen bis der Anteil an Zellen mit Plasmid auf unter 50 % fällt. Im Falle von mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen ist ein G₅₀-Wert von über 100 bevorzugt.
Diese Retentionen sind zwar geringer, als bei der Retention unter dem Einfluss von Antibiotika. Allerdings kommen diese Systeme ohne externe Zugabe von Antibiotika aus. Außerdem führt der Plasmidverlust zum Entstehen eines natürlichen Organismus ohne genetische Modifikation. Ein Lactobacillus mit einem solchen Vektor kann daher auch als temporärer genmodifizierter Organismus (GMO) bezeichnet werden. Im Laufe der Generationen verliert dieser Organismus die genetische Modifikation. Dies ist insbesondere von Interesse, wenn die Lactobacillus im medizinischen oder humanen Umfeld eingesetzt werden sollen.
Der Vektor kann noch weitere regulatorische Elemente enthalten, beispielsweise Resistenzen von Antibiotika, welche die Herstellung vereinfachen.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungsgemäßen Promotors der Expressionskassette in Lactobacillus.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors in Lactobacillus, insbesondere in Lactobacillus plantarum.
Gerade die verbesserte Expression des Proteins durch den erfindungsgemäßen Promotor ermöglicht viele neue Anwendungen. So erlaubt die hohe Expression auch die Detektion von exprimierten fluoreszierenden Proteinen in vivo, was bei den bekannten Promotoren aufgrund der geringen Expression nur schlecht möglich war. Dadurch kann der Promotor besser bei der Analyse und Diagnose eingesetzt werden.
Materialien und Methoden
Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt.
Die Ausführungsbeispiele sind in den Figuren schematisch dargestellt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:

1 A) Fluoreszenzmikroskopie der P_tlpA getriebenen mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1, kultiviert bei 31°C und 39°C für 18 h. Skalenbalken = 10 pm. B) Durchflusszytometrische Analyse der P_tlpA , P₂₃ ,P₄₈ , P_spp und P_Tuf Promotor-gesteuerten mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1 nach 18 Stunden Inkubation bei 37°C. C) Fluoreszenzspektroskopische Analyse der durch den P_tlpA , P₂₃ , P₄₈ , P_spp und P_Tuf Promotor gesteuerten mCherry-Expression nach 18 Stunden Inkubation bei Temperaturen von 31°C bis 41°C. D) Messung der Wachstumsrate (OD₆₀₀) der Kontrolle (leerer Vektor) und der P_tlpA getriebenen mCherry-Expression in L. plantarum WCFS1 für 18 Stunden bei 37°C. In C und D entsprechen die Linien dem Mittelwert von drei biologischen Replikaten und die schwachen Streifen der Standardabweichung;
2 A) Schematische Darstellung der direkten Klonierung der verschiedenen Toxin/Antitoxin-Genmodule in das Plasmid mit P_tlpA gesteuerter mCherry-Expression. B) Durchflusszytometrisches Histogramm des Stammes mit einem Plasmid, das kein TA-Modul enthält, nach 50 Generationen serieller Passage in Abwesenheit von Antibiotika. Das rechte Kästchen entspricht der Bakterienpopulation, die das Plasmid enthält, und das linke Kästchen der Bakterienpopulation ohne das Plasmid in Abwesenheit von Selektionsdruck. C) Grafische Darstellung des Ausmaßes der Plasmid-Retention durch die TA-Module in L. plantarum WCFS1 für 100 Generationen im Vergleich zu ohne TA-System (No TA) oder antibiotischer Kontrolle (Antibiotic). Die Linien entsprechen dem Mittelwert von drei biologischen Replikaten, die schwachen Streifen sind die Standardabweichung; Die Reihenfolge der Messungen von oben nach unten ist: Antibiotic, Combo, YafQ/DinJ; HicA/HicB, MazF/MazE, HigB/HigA, Txe/Axe, No TA);
3 A) Phylogenetischer Baum, der die Abstände zwischen den Arten aufzeigt, von denen verschiedene genetische Teile in L. plantarum getestet wurden. Die blauen Markierungen entsprechen den Bakterien, von denen in dieser Studie Promotoren adaptiert wurden, und die orangefarbenen Markierungen entsprechen den Bakterien, von denen TA-Systeme adaptiert wurden. L. plantarum WCFS1 ist grün markiert, da sowohl Promotoren als auch TA-Systeme von diesem Bakterium adaptiert wurden. B) Homologieanalyse von σ70 RpoD-Genen aus L. plantarum, E. coli und S. typhimurium. Höhe und Helligkeit der gelben Balken zeigen an, inwieweit einzelne Reste über alle 3 Bakterien hinweg konserviert sind;
4 G50 Werte der verschiedenen TA-Systeme (No TA: kein TA-System, Combo: 2 TA-Systeme); und
5 A) Durchflusszytometrische Analyse der P_R, P_L und P_TlpA promotorkodierten mcherry-Konstrukte in L. plantarum WCFS1 nach 18 h Inkubation bei 37°C. B) Fluoreszenzspektroskopische Analyse der P_R, P_L und P_TlpA promotorkodierten mcherry-Konstrukte nach 18-stündiger Inkubation bei Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C. Die Daten beziehen sich auf drei biologische Wiederholungen. C) Fold Change (n-fache Zunahme) der auf dem P_TlpA Promotor basierenden mcherry-Expression im Vergleich zu den P_R und P_L Promotoren bei 37°C. D) RFU-Plot der auf P_TlpA und P_TlpA39 basierenden mcherry-Expression nach 18-stündiger Inkubation bei Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C. Die Daten entsprechen drei unabhängig voneinander durchgeführten biologischen Replikaten;
6 A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von P_TlpA, P₂₃, P₄₈, P_spp, P_Tuf kodierten mcherry-Konstrukten und leeren Vektorkonstrukten in L. plantarum WCFS1, kultiviert bei 37°C für 18 h (Maßstab = 10pm). B) Fold Change der P_TlpA, P₂₃, P₄₈ und P_spp kodierten mcherry-Konstrukte in Bezug auf die P_Tuf Promotor-basierte mcherry-Expression bei 31°C bzw. 39°C. Die Daten beziehen sich auf drei unabhängig voneinander durchgeführte biologische Wiederholungen;
7 A) RFU-Plot von P₂₃, P₄₈ und P_Tuf kodierten mcherry-Konstrukten, die eine verstärkte Fluoreszenzexpression im Gegensatz zu der auf P_spp basierenden Proteinexpression innerhalb der Temperaturgradienten von 31°C bis 41°C zeigen. Die Daten beziehen sich auf drei unabhängig voneinander durchgeführte biologische Wiederholungen. B) Fold Change der P_TlpA Promotor-basierten mcherry-Expression mit 9 bp Spacer (zwischen RBS und Startcodon) im Vergleich zum P_TlpA -6 bp Spacer-Konstrukt;
8 A) Durchflusszytometrie-Plots, die zeigen, dass Stämme mit P₄₈ -getriebener mCherry-Expression relativ geringe Intensitäten erzeugen, wobei sich ein Teil der Population mit dem Signal überschneidet, das von Bakterien stammt, die keine fluoreszierenden Proteine exprimieren (Kontrolle). Im Vergleich dazu ist das Signal von P_tlpA deutlich von dem der Kontrolle abgegrenzt. B) Agarplattenbasierte Analyse der Plasmid-Retention, die von den verschiedenen TA-Systemen bereitgestellt wird. Die Gesamtzahl der Kolonien kann aus den Hellfeldbildern (obere Reihe) bestimmt werden, und die in den Fluoreszenzbildern sichtbaren Kolonien (untere Reihe) stellen die Plasmid-enthaltenden Bakterien dar;
9 Messung der Wachstumsrate (OD₆₀₀) von P_tlpA -mcherry-Konstrukten in Kombination mit den TA-Modulen im Vergleich zu dem P_tlpA -mcherry-Konstrukt, das in Abwesenheit (ohne TA) und in Anwesenheit (Antibiotikum) des Selektionsdrucks 18 Stunden lang bei 37°C gewachsen ist. Die Daten beziehen sich auf drei biologische Wiederholungen und die schwachen Banden sind die jeweiligen Standardabweichungen (No TA: kein TA-System; Combo: 2 TA-Systeme; Antibiotic: Anwesenheit Antibiotikum) ;
10 Erhalt unterschiedlicher Plasmide unter antibiotischer Kontrolle (A) und unter Toxin/Antitoxin-Kontrolle (B) (Combo: 2 TA-Systeme);
11 Schematische Darstellung des Vektors mit Replikationsbeginn (ori); eryR: Erythromycinresistenz; Toxin/Antitoxin; Die Pfeile stehen für Promotoren und die T für Terminatoren;

Stämme, Medien und Plasmide
L. plantarum WCFS1 (ATCC Nummer BAA-793) wurde als Elternstamm für die Charakterisierung der Promotorstärke und der Plasmidretention verwendet. Der Stamm wurde in den Medien von De Man, Rogosa und Sharpe (MRS) gehalten. Die Kulturmedien, Antibiotika und ergänzenden Reagenzien wurden von der Carl Roth GmbH, Deutschland, bezogen. Das Nährmedium wurde mit 10 µg/ml Erythromycin ergänzt, um die manipulierten L. plantarum WCFS1-Stämme zu kultivieren. Die in dieser Studie verwendeten Plasmide pSIP403 und pLp_3050sNuc wurden von Prof. Lars Axelsson (Addgene Plasmid # 122028) (Sørvig E, Mathiesen G, Naterstad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versatile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7):2439-49) und Prof. Geir Mathiesen (Addgene-Plasmid Nr. 122030) (Mathiesen G, Sveen A, Brurberg MB, Fredriksen L, Axelsson L, Eijsink VG. Genome-wide analysis of signal peptide functionality in Lactobacillus plantarum WCFS1. BMC genomics. 2009;10(1):1-13) beziehungsweise das Plasmid pTlpA39-Wasabi wurde von Prof. Mikhail Shapiro zur Verfügung gestellt (Addgene Plasmid # 86116) (Piraner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeutics. Nature chemical biology. 2017;13(1):75-80). Das Plasmid pUC-GFP-AT wurde von Prof. Chris Barnes zur Verfügung gestellt (Addgene-Plasmid Nr. 133306) (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid postsegregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Der L. plantarum WCFS1-Stamm wurde von Prof. Gregor Fuhrmann (Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung, Saarland) zur Verfügung gestellt. Die in dieser Studie erstellten sequenzgeprüften genetischen Konstrukte wurden in einem E. coli DH5α-Stamm konserviert.
Molekularbiologie
Die in dieser Studie entwickelten genetischen Konstrukte basieren auf dem pLp3050sNuc/ pSIP403 Vektor-Backbone. Der HiFi Assembly Master Mix, das Quick Blunting Kit und das T4 DNA Ligase enyzme wurden von New England BioLabs (NEB, Deutschland) bezogen. Die PCR wurde mit dem Q5 High Fidelity 2X Master Mix (NEB) und Primern von Integrated DNA Technologies (IDT) (Louvain, USA) durchgeführt. Die Oligonukleotid-Genfragmente wurden als eBlocks von IDT (Coralville, USA) erworben. Diese wurden für eine maximale Expression im Wirtsstamm mit dem Java Codon Optimization Tool (JCAT) oder dem IDT Codon Optimization Tool (Coralville, USA) optimiert. Für die Plasmidextraktion und die DNA-Aufreinigung wurden Kits der Qiagen GmbH (Hilden, Deutschland) bzw. der Promega GmbH (Walldorf, Deutschland) verwendet. Die Sanger-Sequenzierung der Kolonie-PCR-amplifizierten genetischen Segmente wurde durch die Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt, indem der kommerziell angebotene zusätzliche DNA-Reinigungsschritt gewählt wurde. Die in dieser Studie verwendeten Promotorsequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
L. plantarum WCFS1 Herstellung kompetenter Zellen und DNA-Transformation
Eine einzelne Kolonie von L. plantarum WCFS1 wurde in 5 mL MRS-Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) kultiviert. Die Primärkultur wurde im Verhältnis 1:50 (v/v) in einer 25-mL-Sekundärkultur verdünnt, die aus MRS-Medien und 1 % (w/v) Glycin bestand, das im Verhältnis 4:1 vorgemischt wurde. Die Sekundärkultur wurde bei 37 °C und 250 U/min bebrütet, bis die OD600 0,8 erreichte. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 4000 U/min (3363 × g) für 10 Minuten bei 4 °C pelletiert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 mL eiskalter 10 mM MgCl₂ und anschließend zweimal mit 5 mL bzw. 1 mL eiskalter Sac/Gly-Lösung [10% (v/v) Glycerin (Gly) und 1 M Saccharose (Sac) im Verhältnis 1:1 (v/v)] gewaschen. Schließlich wurde der restliche Überstand verworfen und das Pellet in 500 µl Sac/Gly-Lösung resuspendiert. Die kompetenten Zellen wurden dann in 60 µl Aliquots für die DNA-Transformation verteilt. Für alle Transformationen wurden den kompetenten Zellen 1 ug dsDNA (zirkuläres Plasmid oder DNA-ligierte Mischung) zugesetzt und dann in gekühlte Elektroporationsküvetten mit 2 mm Abstand (Bio-Rad Laboratories GmbH, Deutschland) überführt. Die Elektroporationstransformation wurde mit einem einzigen Puls bei 1,8 kV durchgeführt, woraufhin sofort 1 ml lauwarmes MRS-Medium zugegeben wurde. Die Mischung wurde für eine Erholungsphase von 3 Stunden bei 37 °C und 250 U/min bebrütet. Nach der Erholungsphase wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 4000 U/min (3363 × g) zentrifugiert, 800 µl des Überstands verworfen und 200 µl des resuspendierten Pellets auf MRS-Agar mit 10 µg/ml Erythromycin ausplattiert. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C bebrütet, um das Wachstum einzelner Kolonien zu ermöglichen.
Konstruktion von genetischen Modulen in L. plantarum WCFS1
Die Plasmide wurden unter Verwendung der in dieser Studie optimierten DNA-Assembly-Methode konstruiert und direkt in den L. plantarum WCFS1-Stamm transformiert. Komplementäre Überhänge für die HiFi-Assemblierung wurden entweder mit PCR-Primern erzeugt oder als kundenspezifische eBlocks von IDT (Coralville, USA) synthetisiert. Gereinigte überlappende DNA-Fragmente wurden mit dem HiFi DNA Assembly Master Mix gemischt und wie im Standardreaktionsprotokoll empfohlen assembliert. Das assemblierte DNA-Produkt wurde dann durch eine weitere PCR-Runde exponentiell vervielfältigt, wobei ein Primerpaar verwendet wurde, das sich spezifisch an das Insert-Segment anlagert. 5 µl der HiFi-Assembly-Reaktion wurden als Template für die PCR-Amplifikation des assemblierten Produkts verwendet (100 µl Endvolumen). Das gereinigte PCR-Produkt wurde anschließend mit dem Quick Blunting Kit phosphoryliert. 2000 ng des gereinigten PCR-Produkts wurden mit 2,5 µl 10X Quick Blunting-Puffer und 1 µl Enzymmix gemischt (Milli-Q-Wasser wurde auf 25 µl aufgefüllt). Die Reaktion wurde zunächst 30 Minuten lang bei 25 °C und anschließend 10 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Anschließend wurden die phosphorylierten Produkte mit Hilfe des Enzyms T4-Ligase ligiert. 6 µl der phosphorylierten DNA wurden mit 2,5 µl 10X T4 Ligase Buffer und 1,5 µl T4 Ligase Enzym gemischt (Milli-Q Wasser wurde auf 25 µl aufgefüllt). Pro Klonierung wurden zwei Ligationsreaktionen durchgeführt (jeweils 25 µl). Die jeweiligen Reaktionen wurden 2 Stunden lang bei 25 °C und anschließend 30 Minuten lang bei 70 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Die ligierten Reaktionen wurden zusammengemischt und gereinigt. Um das gereinigte Endprodukt zu konzentrieren, wurden drei Elutionsrunden statt einer durchgeführt. Jede Elution basierte auf 10 µl Milli-Q-Wasser. Die Konzentration des gereinigten Ligationsprodukts wurde mit dem NanoDrop Microvolume UV-Vis-Spektrophotometer (ThermoFisher Scientific GmbH, Deutschland) gemessen. Schließlich wurden 1000 ng des ligierten Produkts in L. plantarum WCFS1 elektrokompetente Zellen transformiert.
Mikroplatten-Reader-Setup für die thermische Gradientenanalyse
Die Bakterienkulturen wurden in 5 mL MRS-Medium (ergänzt mit 10 µg/mL Erythromycin, außer für den unveränderten Elternstamm) bei 30°C und kontinuierlichem Schütteln (250 U/min) kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Kulturen in 3 mL mit Antibiotika angereichertem frischem MRS-Medium auf 0,1 OD₆₀₀ verdünnt und bei 30°C und 250 U/min vermehrt. Bei OD₆₀₀ = 0,4 wurden die Kulturen in Fisherbrand™ 0,2mL PCR Tube Strips mit flachen Kappen (Thermo Electron LED GmbH, Deutschland) abgefüllt und in den Biometra Thermocycler (Analytik Jena. GmbH, Deutschland) gegeben. Für das P_spp-mCherry-Konstrukt wurden 25 ng/ml des 19 Aminosäuren umfassenden Sakacin P-Induktionspeptids (SppIp) mit der Sequenz NH₂-MAGNSSNFIHKIKQIFTHR-COOH (GeneCust, Frankreich) zu der Kultur gegeben und vor der Herstellung der Aliquots gründlich vortexen. Der thermische Test wurde mit einem Temperaturgradienten von 31°C auf 41°C mit regelmäßigen Steigerungen von 2°C durchgeführt. Die Deckeltemperatur wurde auf 50°C eingestellt, um die Verdunstung der Flüssigkeit zu verhindern und eine homogene Temperatur in den räumlich verteilten PCR-Gefäßen aufrechtzuerhalten. Nach einem Zeitintervall von 18 h wurden die PCR-Streifen in einer Tisch-Minizentrifuge (Biozym GmbH, Deutschland) zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu verwerfen. Die Zellen wurden dann in 200 µl 1X PBS resuspendiert und in die 96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem Boden (Corning® 96 Well Opak Black Plate, USA) gegeben. Die Proben wurden dann im Microplate Reader Infinite 200 Pro (Tecan Deutschland GmbH, Deutschland) analysiert und sowohl die Absorption (600 nm Wellenlänge) als auch die mCherry-Fluoreszenzintensität (Ex_λ / Em_λ = 587 nm/625 nm) wurden gemessen. Die z-Position und die Verstärkungseinstellungen für die Aufnahme der mCherry-Fluoreszenzintensität wurden auf 19442 pm bzw. 136 eingestellt. Die Fluoreszenzwerte wurden mit der optischen Dichte der Bakterienzellen normalisiert, um die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) nach der Formel RFU = Fluoreszenz/OD600 zu berechnen.
Analyse der Fluoreszenzmikroskopie
Die Bakterienkulturen wurden über Nacht in 5 mL MRS-Medium (ergänzt mit 10 pg/mL Erythromycin, außer bei der Negativkontrolle) bei 37°C unter ständigem Schütteln (250 U/min) gezüchtet. Am folgenden Tag wurde die OD₆₀₀ des P_spp-mCherry-Konstrukts gemessen und bei OD₆₀₀ = 0,01 subkultiviert. Als die P_spp-mCherry-Bakterienkultur eine OD₆₀₀ = 0,3 erreichte, wurde sie mit 25 ng/mL SppIp induziert, und die übrigen Konstrukte wurden in frischem Medium bei 0,01 OD₆₀₀ subkultiviert. Alle Kulturen wurden dann 18 Stunden lang unter denselben Wachstumsbedingungen (37°C, 250 U/min) wachsen gelassen, um jegliche Heterogenität in der Promotorstärkeexpression aufgrund unterschiedlicher Wachstumsparameter zu verhindern. Anschließend wurden 1 mL der Kulturen durch Zentrifugation (15700 × g, 5 min, 4 °C) geerntet, zweimal mit Dulbeccos 1X PBS (Phosphatpuffersalzlösung) gewaschen und schließlich in 1 mL 1X PBS resuspendiert. 10 pL der Suspensionen wurden auf 1,5 mm dicke Glasobjektträger (Paul Marienfeld GmbH, Deutschland) gegeben und 1,5H-Glasdeckgläser (Carl Roth GmbH, Deutschland) daraufgelegt. Die Proben wurden dann unter dem Plan Apochromat 100X Ölimmersionsobjektiv (BZ-PA100, NA 1,45, WD 0,13 mm) des Fluoreszenzmikroskops BZ-X800 (Keyence Corporation, Illinois, USA) beobachtet. Das mCherry-Signal wurde mit dem BZ-X TRITC-Filter (Modell OP-87764) bei einer Anregungswellenlänge von 545/25 nm und einer Emissionswellenlänge von 605/70 nm mit einem dichroitischen Spiegel bei einer Wellenlänge von 565 nm aufgezeichnet. Die Bilder wurden auf identische Helligkeits- und Kontrasteinstellungen eingestellt und mit der Software FiJi ImageJ2 bearbeitet.
Durchflusszytometrische Analyse
Die Quantifizierung der Fluoreszenzprotein-Expressionsniveaus der Stämme wurde mit dem Guava easyCyte BG-Durchflusszytometer (Luminex, USA) durchgeführt. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden Bakterienkulturen verwendet, die den oben genannten Behandlungsbedingungen unterworfen waren. 1 mL der Bakteriensuspensionen wurden durch Zentrifugation bei 13000 U/min (15700 × g) geerntet. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 1 mL steriler Dulbecco's 1X PBS resuspendiert.
Die Proben wurden dann mit einem Verdünnungsfaktor (DF) von 104 seriell verdünnt und 5.000 Bakterienereignisse wurden für die Analyse aufgezeichnet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung an drei verschiedenen Tagen durchgeführt. Bei jeder Analyse diente der nicht fluoreszierende Wildtyp-Stamm als Negativkontrolle. Zur Entfernung von Debris und Doubletten während der Ereignissammlung und -analyse wurde ein vorgefertigter Schwellenwert auf der Grundlage von Vorwärts-Seitenstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) verwendet. Die Fluoreszenzintensität von mCherry wurde durch Anregung mit einem grünen Laser bei 532 nm (100 mW) und Signalanalyse mit dem Orange-G-Detektionskanal bei 620/52 nm gemessen. Die für die Datenaufzeichnung verwendeten Verstärkungseinstellungen waren: Vorwärtsstreuung (FSC) - 11,8; Seitenstreuung (SSC) - 4 und Orange-G-Fluoreszenz - 1,68. Die Kompensationssteuerung für die Fluoreszenzaufzeichnung wurde auf 0,01 mit einer Erfassungsrate von 5 Dekaden eingestellt. Die Datenanalyse und -darstellung erfolgte mit der Luminex GuavaSoft 4.0 Software für EasyCyte.
Konstruktion von Plasmiden auf der Grundlage von Toxin/Antitoxin-Modulen
Auf der Grundlage einer Literaturrecherche wurde die Wirkung des Txe/Axe-Moduls (Toxin/Antitoxin) aus E. faecium (Grady R, Hayes F. Axe-Txe, a broad-spectrum proteic toxin-antitoxin system specified by a multidrug-resistant, clinical isolate of Enterococcus faecium. Molecular microbiology. 2003;47(5):1419-32) in L. plantarum WCFS1 getestet, um seine Rolle bei der antibiotikafreien Plasmidretention zu untersuchen. Das Werkzeug TA Finder Version 2.0 (Xie Y, Wei Y, Shen Y, Li X, Zhou H, Tai C, et al. TADB 2.0: an updated database of bacterial type II toxin-antitoxin loci. Nucleic acids research. 2018;46(D1):D749-D53) wurde verwendet, um weitere Typ-II-TA-Systeme (Toxin/Antitoxin) in Lactobacillus-Genomen auszuwählen. Die Genome von L. acidophilus, L. crispatus, L. casei, L. reuteri und L. plantarum WCFS1 wurden vom NCBI Genome abgerufen. Die in diesen Genomen enthaltenen TA-Systeme wurden mit den Standardparametern des TA-Finders durchsucht. Nur TA-Systeme, die von NCBI BlastP annotiert wurden, wurden als Testkandidaten ausgewählt. Die TA-Systeme YafQ/DinJ, HicA/HicB, HigB/HigA, MazF/MazE aus L. casei, L. acidophilus und L. plantarum WCFS1 wurden für weitere Tests und Analysen ausgewählt.
Das Axe/Txe-System wurde durch PCR aus dem Plasmid pUC-GFP-AT amplifiziert (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Die Systeme DinJ/YafQ und HicA/HicB wurden als kundenspezifische eBlocks von IDT (Coralville, USA) synthetisiert. HigA/HigB und MazE/MazF wurden aus dem Genom von L. plantarum WCFS1 amplifiziert. Die TA-Systeme wurden in das P_tlpA-mCherry-Plasmid eingefügt, wodurch die Plasmide P_tlpA-mCherry-Txe/Axe, P_tlpA-mCherry-YafQ/DinJ, P_tlpA-mCherry-HicA/HicB, P_tlPA-mCherry-HigB/HigA, P_tlpA-mCherry-MazF/MazE entstanden. Alle diese Plasmide wurden mit der in dieser Studie optimierten DNA-Montagemethode direkt in L. plantarum WCFS1 kloniert. Für die Konstruktion des kombinatorischen TA-Moduls (P_tlpA-mCherry Combo) wurden die besten endogenen und nicht endogenen TA-Systeme, die nach 100 Generationen erfasst wurden (MazF/MazE und YafQ/DinJ), subkloniert und in das gleiche Plasmid in umgekehrter Orientierung integriert.
TA-vermittelte Plasmid-Retentionsanalyse
Die TA-Module, die die Konstrukte enthielten, wurden in 5-mL-Kulturen mit 10 pg/mL Erythromycin-angereichertem MRS-Medium beimpft und über Nacht bei 37 °C unter ständigem Schütteln (250 U/min) bebrütet. Am folgenden Tag wurden die Konstrukte bei einer anfänglichen OD₆₀₀ = 0,01 in frischem MRS-Medium (sowohl mit als auch ohne Antibiotikazusatz) subkultiviert. Die Bakterienkulturen wurden an 12 aufeinanderfolgenden Tagen mit einer täglichen Wachstumszeit von 24 Stunden bebrütet, um eine durchschnittliche Anzahl von 8 Generationen pro Tag zu gewährleisten, bis die endgültige Schwelle von 100 Generationen überschritten war. Die Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse erfolgte nach dem oben genannten Protokoll. Die mCherry-positive Zellpopulation korrelierte direkt mit der Bakterienpopulation, die das manipulierte Plasmid enthielt. Das gesamte Experiment wurde in biologischen Triplikaten wiederholt.
Für die qualitative Analyse wurden die 100 Generationen lang gezüchteten Bakterienkulturen ohne Antibiotikazusatz zentrifugiert und in 1 ml sterilem Dulbeccos 1X PBS resuspendiert. Die resuspendierte Bakterienlösung wurde verdünnt (DF=10⁶) und auf MRS-Agarplatten mit und ohne Antibiotikazusatz aufgebracht und 48 Stunden lang in einem statischen Inkubator bebrütet. Die Platten wurden dann mit dem GelDocumentation System Fluorchem Q (Alpha Innotech Biozym GmbH, Deutschland) sowohl im Ethidiumbromid-Kanal (Ex_λ /Em_λ = 300 nm/600 nm) als auch im Cy3-Kanal (Ex_λ /Em_λ = 554 nm/568 nm) abgebildet, um die mCherry-Fluoreszenz produzierende Zellpopulation sichtbar zu machen.
Messungen der Wachstumsrate
Um den Einfluss der heterologen Proteinproduktion und der Toxin-Antitoxin-Module auf die bakterielle Wachstumsrate zu untersuchen, wurden die Bakterienkulturen über Nacht in mit Antibiotika angereicherten MRS-Medien bei 37°C unter ständigem Schütteln (250 rpm) kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Bakterienkulturen in Sekundärkulturen bei einer anfänglichen OD₆₀₀ = 0,01 subkultiviert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C erreichte die OD₆₀₀ der Kulturen 0,1 und 200 µL der Kulturen wurden in UV STAR Flat Bottom 96 Well Mikrotiterplatten (Greiner BioOne GmbH, Deutschland) verteilt. Die 96-Well-Assay-Platte wurde unter ständigem Schütteln bei einer Inkubationstemperatur von 37°C in den Microplate Reader gestellt. Der kinetische Assay wurde so eingestellt, dass die Absorption der Bakterienkulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Intervall von 10 Minuten über einen Zeitraum von 18 Stunden aufgezeichnet wurde. Der Versuch wurde in dreifacher Ausführung an drei unabhängigen Tagen durchgeführt.
Experimentelle Ergebnisse
Direkte Klonierung in L. plantarum WCFS1
Um ausreichende Plasmidmengen (~1 pg) für die Transformation in Lactobacillus zu erhalten, werden häufig Shuttle-Vektoren verwendet, die in E. coli amplifiziert werden können. Dabei ist bekannt, dass bestimmte Plasmidkonstrukte, die in E. coli passagiert wurden und Signalpeptide und sich wiederholende Sequenzen im interessierenden Gen enthalten, Mutationen hervorgerufen haben. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine PCR-basierte Amplifikation und Zirkularisierung der rekombinanten Plasmide durchgeführt, um 1000 ng zirkuläres Plasmid zu erhalten, was für die Transformation in L. plantarum WCFS1 ausreichend war. Die Transformationseffizienz war mit 50 cfu/µg Plasmid relativ gering, aber die genetische Treue betrug >95%, da L. plantarum drei endogene Plasmide beherbergt. Da L. plantarum drei endogene Plasmide besitzt, wurde die Sequenzierung an PCR-amplifizierten Abschnitten des transformierten Plasmids aus Zelllysaten durchgeführt. Diese direkte Klonierungsstrategie wurde im Folgenden für die Transformation aller Plasmide in L. plantarum WCFS1 verwendet.
1 - Der tlpA-Promotor von Salmonella treibt die konstitutive Expression auf hohem Niveau an
Auf der Suche nach einem hitze-induzierbaren Promotor für therapeutische Anwendungen wurde die mCherry-Expression stromabwärts des von Salmonella stammenden P_tlpA-Promotors zusammen mit dem thermoreaktiven TlpA-Repressor (Piraner DI, Abedi MH, Moser BA, Lee-Gosselin A, Shapiro MG. Tunable thermal bioswitches for in vivo control of microbial therapeutics. Nature chemical biology. 2017;13(1):75-80; Hurme R, Berndt KD, Normark SJ, Rhen M. A proteinaceous gene regulatory thermometer in Salmonella. Cell. 1997;90(1):55-64) kodiert. Während der Repressor die Genexpression nicht unterdrückte (5D), schien der Promotor überraschenderweise konstitutiv eine hohe Proteinexpression mit einem geringen Grad an thermischer Regulation (<5-facher Anstieg von 31°C auf 39°C) zu bewirken (1A). Im Vergleich dazu erwiesen sich pR und pL, zwei andere häufig verwendete Promotoren mit einem thermoreaktiven Repressor, cI, aus E. coli lambda-Phagen, als sehr schwach und trieben nur geringe Mengen an mCherry-Expression an (5A, 5B). Die Fluoreszenzspektroskopie zeigte, dass die Stärke des P_tlpA Promotors bei 37 °C 26- bzw. 39-mal höher war als die des P_R- bzw. P_L-Promotors ( 5C). Besonders bemerkenswert ist, dass die Fluoreszenzmikroskopie und die Durchflusszytometrie-Analyse auch zeigten, dass die mCherry-Expression, die durch den P_tlpA -Promotor ausgelöst wird, deutlich über derjenigen liegt, die durch die stärksten Promotoren ausgelöst wird, über die zuvor in L. plantarum berichtet wurde - P₂₃(Meng Q, Yuan Y, Li Y, Wu S, Shi K, Liu S. Optimization of electrotransformation parameters and engineered promoters for Lactobacillus plantarum from wine. ACS Synthetic Biology. 2021; 10 (7) :1728-38), P₄₈(Rud I, Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbiology. 2006;152(4) :1011-9), P_spp (Sørvig E, Mathiesen G, Naterstad K, Eijsink VG, Axelsson L. High-level, inducible gene expression in Lactobacillus sakei and Lactobacillus plantarum using versatile expression vectors. Microbiology. 2005;151(7) :2439-49) und P_Tuf (Spangler JR, Caruana JC, Phillips DA, Walper SA. Broad range shuttle vector construction and promoter evaluation for the use of Lactobacillus plantarum WCFS1 as a microbial engineering platform. Synthetic Biology. 2019;4(1) :ysz012) (1B, 6A). Bei 31°C war die mCherry-Expression mindestens 2-fach höher als bei den anderen Promotoren, während sie bei 39°C auf das 5-fache anstieg ( 1C, 6B). Die konstitutiven Promotoren (P₂₃ ,P₄₈ , P_Tuf) waren leicht thermoreaktiv, während der induzierbare Promotor (P_spp) dies nicht war (7A). Bemerkenswert ist, dass in allen Fällen die Spacerlänge zwischen der Ribosomenbindungsstelle (RBS, 5'-AGGAGA-3') und dem Startcodon das Expressionsniveau stark beeinflusste. In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde eine hohe mCherry-Expression bei einer Spacer-Länge von 9 bp beobachtet, die deutlich abnahm, wenn sie auf 6 bp reduziert wurde (25-fach niedriger für P_tlpA) (7B). Trotz der hohen Proteinexpression, die durch P_tlpA mit einem 9 bp Spacer ausgelöst wurde, war die Wachstumsrate dieses Stammes bei 37°C ähnlich wie die des leeren Kontrollstammes, was darauf hindeutet, dass diese Proteinüberexpression die Zelle überraschenderweise nicht metabolisch überlastet (1D).
Es wurden folgende Vektoren hergestellt und verwendet:

Promotor P_L (pL mcherry; SEQ-ID Nr. 18), Promotor P_R (pR mcherry; SEQ-ID Nr. 19), Promotor P_TlpA (pTlpA mcherry; SEQ-ID Nr. 20), Promotor P_TlpA + TlpA-Repressor (pTlpA A39 mcherry; SEQ-ID Nr. 21), Promotor P₂₃ (P23 mcherry; SEQ-ID Nr. 22), Promotor P₄₈ (P48 mcherry; SEQ-ID Nr. 23), Promotor P_spp (SPP mcherry; SEQ-ID Nr. 24), Promotor P_tuf (tuf mcherry; SEQ-ID Nr. 25), leerer Vektor (SEQ-ID Nr. 32)

2 - Toxin/Antitoxin (TA)-basierte Plasmid-Retention und transiente GVOs
TA-Systeme gewährleisten den Verbleib von Plasmiden in einer Bakterienpopulation durch einen Mechanismus zur Abtötung nach der Segregation. Sie exprimieren konstitutiv langlebige Toxine und kurzlebige Antitoxine. Solange das Plasmid vorhanden ist, wird ausreichend Antitoxin produziert, um das entsprechende Toxin zu neutralisieren. Erhält eine Tochterzelle bei der Bakterienteilung keine Plasmidkopien, wird das Antitoxin rasch abgebaut, und das aktive Toxin tötet die Zelle. Es wurden mehrere natürliche TA-Systeme untersucht (Yamaguchi Y, Inouye M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nature Reviews Microbiology. 2011;9(11):779-90) und einige davon mit vielversprechenden Ergebnissen auf Plasmidrückhaltung in E. coli untersucht (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34; Wright O, Delmans M, Stan G-B, Ellis T. GeneGuard: a modular plasmid system designed for biosafety. ACS synthetic biology. 2015;4(3):307-16; Abedi MH, Yao MS, Mittelstein DR, Bar-Zion A, Swift MB, Lee-Gosselin A, et al. Ultrasound-controllable engineered bacteria for cancer immunotherapy. Nature communications. 2022;13(1):1-11), wurde ihre Verwendung in Lactobacillus bisher nicht erforscht. Dazu wurde zunächst das TA-System vom Typ II, Txe/Axe untersucht, das aus Enterococcus faecium stammt und nachweislich eine langfristige Plasmidretention in E. coli gewährleistet (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). In diesem System ist Txe eine Endoribonuklease und Axe das entsprechende inhibitorische Protein. Dieses Modul wurde zu dem Plasmid hinzugefügt, das für die P_tlpA-gesteuerte mCherry-Expression kodiert (2A), und der daraus resultierende Stamm wurde bis zu 100 Generationen lang wiederholt subkultiviert. Die Plasmid-Retention wurde quantifiziert, indem der Anteil der mCherry exprimierenden Bakterienpopulation mit Hilfe von Durchflusszytometrie und Agarplatten-Koloniebildanalyse bestimmt wurde (8B). Die Sensitivität dieser Analyse wurde durch die hohe Expressionsrate, die durch den P_tlpA-Promotor angetrieben wurde, erheblich verbessert, was eine klare Abgrenzung von Zellen mit Plasmid-Retention und solchen ohne Plasmid ermöglichte (2B). Eine solch klare Abgrenzung war mit anderen Promotoren wie P₂₃ nicht möglich, da sich das Fluoreszenzsignal teilweise mit dem Hintergrundsignal von nicht fluoreszierenden Zellen überschnitt (8A). In Abwesenheit eines TA-Systems (PtlpA mCherry-Plasmid) nahm der Anteil der Plasmid-tragenden Bakterien stetig um etwa 1 % pro Generation ab und endete mit -15 % der Population, die das Plasmid nach 100 Generationen behielten (2C). Im Vergleich dazu unterstützte das Txe/Axe-System anfangs eine bessere Retention mit einem Plasmidverlust von etwa 0,5 %/Generation für 40 Generationen, danach beschleunigte sich dieser Verlust auf etwa 1,2 %/Generation und endete bei -18 % der Population, die das Plasmid nach 100 Generationen behielten. In einem Versuch, potenziell leistungsfähigere TA-Systeme zu identifizieren, wurde das Bioinformatik-Tool TA-Finder verwendet, und es wurden 4 weitere TA-Systeme vom Typ II ausgewählt - YafQ/DinJ aus L. casei (Levante A, Folli C, Montanini B, Ferrari A, Neviani E, Lazzi C. Expression of DinJ-YafQ System of Lactobacillus casei group strains in response to food processing stresses. Microorganisms. 2019;7(10):438), HigB/HigA und MazF/MazE aus L. plantarum WCFS1 und HicA/HicB aus L. acidophilus. Bei all diesen TA-Kandidaten handelt es sich um ein Endoribonuklease-Toxin, das auf den RNA-Pool des metabolisch aktiven und sich schnell teilenden mikrobiellen Wirts abzielt. Ähnlich wie das Txe/Axe-Modul wurden diese TA-Module dem P_tlpA_mCherry-Plasmid hinzugefügt (2C). Die Analyse der Plasmid-Retention ergab, dass die Systeme HigB/HigA und MazF/MazE größtenteils ähnlich wie Txe/Axe funktionierten, aber nach 100 Generationen eine etwas bessere Retention aufwiesen (20 % bzw. 30 %). HicA/HicB verlangsamte den Plasmidverlust auf 0,5 %/Generation für 50 Generationen und 0,8 %/Generation danach, was zu einem Retentionsniveau von ~35 % nach 100 Generationen führte. Schließlich wurde festgestellt, dass YafQ/DinJ die besten Rückhaltefähigkeiten mit einem Plasmidverlust von 0,5 %/Generation für 70 Generationen und 1 %/Generation danach bietet, was zu einem Rückhaltegrad von -40 % nach 100 Generationen führt (10A, 10B) .
10A zeigt den Plasmiderhalt verschiedener Plasmide über 100 Generationen unter antibiotischer Kontrolle. Wie erwartet, bleiben die Plasmide nahezu vollständig erhalten. 10B zeigt die Retention unter Kontrolle der Toxin/Antitoxin-Systeme. Es zeigt eine deutlich verbesserte Retention im Vergleich zum Wildtyp. Die Kombination von zwei Toxin/Antitoxin-Systemen führt noch einmal zu einer deutlichen Verbesserung.
Grundlegende Studien haben gezeigt, dass verschiedene TA-Systeme kumulativ bessere Plasmidrückhaltefähigkeiten bieten können (Bardaji L, Añorga M, Echeverria M, Ramos C, Murillo J. The toxic guardians-multiple toxin-antitoxin systems provide stability, avoid deletions and maintain virulence genes of Pseudomonas syringae virulence plasmids. Mobile DNA. 2019;10(1) :1-17). Auf dieser Grundlage wurde das leistungsstärkste endogene TA-System von L. plantarum WCFS1 (MazF/MazE) mit dem leistungsstärksten nicht endogenen System (YafQ/DinJ) kombiniert. Interessanterweise wurde bei dieser Kombination bessere Plasmid-Retentionsfähigkeiten mit einem Plasmidverlust von 0,2 %/Generation für 50 Generationen und einem allmählichen Anstieg auf 0,8 %/Generation danach beobachtet, was zu einer deutlich höheren Retention von 60 % über 100 Generationen führte. Im Vergleich dazu wurden Plasmide, die unter antibiotischem Selektionsdruck gehalten wurden, erwartungsgemäß über 100 Generationen hinweg zu >90 % erhalten. Bei allen TA-Systemen unterschieden sich die bakteriellen Wachstumsraten über 10 Generationen nicht wesentlich von den Bedingungen ohne TA oder mit Antibiotika-Retention, was darauf hindeutet, dass die Toxine die reguläre Funktion der Zellen nicht drastisch beeinträchtigten (9). Bei den TA-Systemen führt der Verlust des Plasmids lediglich dazu, dass das Bakterium in seinen natürlichen, genetisch unveränderten probiotischen Status zurückversetzt wird, was die Konstruktion von transienten GVO ermöglicht.
Aufgrund der vorteilhaften Präsenz von Laktobazillen im menschlichen Körper, in der Nahrung und in der Umwelt besteht ein erhebliches Interesse an der gentechnischen Herstellung von hochgradig heterologer Proteinproduktion für medizinische und industrielle Anwendungen. Unter den verschiedenen Stämmen ist L. plantarum einer der am intensivsten untersuchten, und bei der Suche nach starken Promotoren wurde in der Regel das Genom des Wirtsstamms durchleuchtet und Anpassung der Promotoren, die eine hochgradige Proteinexpression in phylogenetisch nahen Milchsäurebakterien (3A). Nur sehr wenige Studien haben Promotoren von phylogenetisch entfernten Arten wie P. megaterium (P_xylA) oder E. coli (P_T7 von lambda phage) getestet (Heiss S, Hörmann A, Tauer C, Sonnleitner M, Egger E, Grabherr R, et al. Evaluation of novel inducible promoter/repressor systems for recombinant protein expression in Lactobacillus plantarum. Microbial cell factories. 2016;15(1):1-17), obwohl die Expressionsraten gering waren. Überraschenderweise ermöglicht der Promotor (P_tlpA) aus dem phylogenetisch weit entfernten gramnegativen Salmonella typhimurium, die Proteinexpression stärker anzutreiben als die zuvor berichteten starken Promotoren in L. plantarum WCFS1. In Salmonella ist P_tlpA ein Promotor der σ70-Sigma-Faktoren, die in den meisten Prokaryonten an der Regulierung der Expression von Housekeeping-Genen beteiligt sind. Todt et al., (Todt TJ, Wels M, Bongers RS, Siezen RS, Van Hijum SA, Kleerebezem M. Genome-wide prediction and validation of sigma70 promoters in Lactobacillus plantarum WCFS1. 2012) verwendeten einen genomweiten Analyseansatz zur Identifizierung von σ70-basierten Promotor-Konsensussequenzen in L. plantarum WCFS1 und sagten 568 Promotorregionen in unmittelbarer Nähe der Transkriptionsstartstellen (<40 nt) voraus. Ihre Ergebnisse in Kombination mit ähnlichen Analysen aus anderen Organismen (Davis MC, Kesthely CA, Franklin EA, MacLellan SR. The essential activities of the bacterial sigma factor. Canadian journal of microbiology. 2017;63(2):89-99; Paget MS, Helmann JD. The σ 70 family of sigma factors. Genome biology. 2003;4(1):1-6) deuten darauf hin, dass die σ70-Promotor-Bindungsmotive in verschiedenen Gattungen konserviert sind und dass divergente Promotoren, die σ70 zur Steuerung der Transkription in diesen Bakterienarten rekrutieren, möglich sind. Multiple Sequence Alignment (MSA) zwischen den wichtigsten RNA-Polymerase-σ70-Proteinen (RpoD) von E. coli, S. typhimurium und L. plantarum-Stämmen (3B) ergab eine signifikante Ähnlichkeit zwischen den Domäne-2- und Domäne-4-Regionen, die für die Bindung an die -10- und -35-Regionen des Promotors während der Transkriptionseinleitung verantwortlich sind.
Abgesehen von der hohen Expressionsrate erfordern die medizinische und industrielle Anwendbarkeit von Laktobazillen Strategien, um heterologe Gene in den manipulierten Bakterien auf kostengünstige und kompatible Weise zu erhalten. Während die genomische Integration eine stabile Retention heterologer Gene gewährleistet, bieten Plasmide eine weitaus größere Vielseitigkeit und einfachere Technik. Meistens wird die Retention durch die Bereitstellung eines Antibiotikaresistenzgens im Plasmid und die Kultivierung der Bakterien in Gegenwart des Antibiotikums sichergestellt. Die wichtigste antibiotikafreie Retentionsstrategie für Laktobazillen besteht darin, auxotrophe Stämme zu erzeugen, indem ein wesentliches Stoffwechselgen ausgeschaltet und in das Plasmid eingebaut wird. Die Notwendigkeit, auxotrophe Stämme durch Gen-Knockout zu entwickeln, schränkt jedoch die breite Anwendbarkeit dieser Strategie ein. Hier wurden zum ersten Mal Toxin-Antitoxin-Systeme für die Plasmid-Retention in Laktobazillen erforscht, die keine Genom-Manipulationen erfordern und leicht auf verschiedene Stämme angewendet werden können, ohne dass externe Selektionsdruckbedingungen erforderlich sind. Solche TA-Systeme wurden bisher nur bei einigen wenigen Bakterienarten erprobt und haben in E. coli beträchtliche Rückhaltefähigkeiten gezeigt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl homologe als auch heterologe TA-Systeme dazu beitragen, den Plasmidverlust über mehrere Generationen zu verlangsamen, obwohl die Retention über 100 Generationen nur zwischen 10 und 30 % lag. Interessanterweise führte die Kombination von zwei TA-Systemen in einem einzigen Plasmid zu einer erheblichen Verbesserung der Retention, nämlich bis zu 60 % über 100 Generationen (10 B). Diese verbesserte kumulative Wirkung von TA-Systemen ist zwar in der Natur beobachtet worden (Bardaji L, Añorga M, Echeverria M, Ramos C, Murillo J. The toxic guardians-multiple toxin-antitoxin systems provide stability, avoid deletions and maintain virulence genes of Pseudomonas syringae virulence plasmids. Mobile DNA. 2019;10(1):1-17), wurde aber bisher noch nicht bei einem gentechnisch veränderten Plasmid gezeigt, insbesondere bei einer Kombination von heterologen und homologen TA-Systemen.
Es ist wichtig zu beachten, dass eine einzige Generation einer bakteriellen Verdopplung entspricht, so dass 10 Generationen = 2¹⁰ oder ~10³ Bakterien und 100 Generationen = 2¹⁰⁰ oder ~10³⁰ Bakterien aus einer einzigen Zelle sind. Potenzielle Anwendungen von Lactobacillus für lebende Therapeutika oder künstlich hergestellte lebende Materialien werden voraussichtlich keine so hohen Generationszahlen erreichen, entweder aufgrund kurzer Anwendungszeiträume (Watterlot L, Rochat T, Sokol H, Cherbuy C, Bouloufa I, Lefevre F, et al. Intragastric administration of a superoxide dismutase-producing recombinant Lactobacillus casei BL23 strain attenuates DSS colitis in mice. International journal of food microbiology. 2010;144(1):35-41; Janahi EMA, Haque S, Akhter N, Wahid M, Jawed A, Mandal RK, et al. Bioengineered intravaginal isolate of Lactobacillus plantarum expresses algal lectin scytovirin demonstrating anti-HIV-1 activity. Microbial pathogenesis. 2018;122:1-6; Wang M, Fu T, Hao J, Li L, Tian M, Jin N, et al. A recombinant Lactobacillus plantarum strain expressing the spike protein of SARS-CoV-2. International journal of biological macromolecules. 2020;160:736-40) oder externer Wachstumsbeschränkungen (Bhusari S, Sankaran S, del Campo A. Regulating bacterial behavior within hydrogels of tunable viscoelasticity. bioRxiv. 2022). Daher sollten die >90% Retentionsraten, die das Combo-TA-System für bis zu 40 Generationen bietet, für diese Anwendungen mehr als ausreichend sein. Da der Verlust des Plasmids die Bakterien nur in ihren probiotischen Nicht-GVO-Status zurückversetzt, könnten solche transienten GVO für solche Anwendungen sogar wünschenswert sein. Dementsprechend könnte durch Variation des verwendeten TA-Systems die GVO-Lebensdauer dieser Organismen eingestellt werden. Auf der Grundlage dieses Konzepts wurde eine neue Metrik, G₅₀ , zur Charakterisierung solcher transienten GVO eingeführt. Der Wert G₅₀ entspricht der Generation, in der die Hälfte der Population eines Stammes ihr Plasmid verloren hat. Wie in 4 dargestellt, kann G₅₀ von 50 gens für die Bedingung „Keine TA“ bis zu 110 gens (extrapoliert) für das Combo-System eingestellt werden. Die weitere Erforschung zusätzlicher TA-Systeme in zukünftigen Studien wird zu einer feineren Abstimmung der Retentionslebensdauern beitragen und möglicherweise sogar zu einer nahezu perfekten Retention führen, wie sie in E. coli durch das Txe/Axe-System erreicht wurde (Fedorec AJ, Ozdemir T, Doshi A, Ho Y-K, Rosa L, Rutter J, et al. Two new plasmid post-segregational killing mechanisms for the implementation of synthetic gene networks in Escherichia coli. Iscience. 2019;14:323-34). Es wird erwartet, dass diese G₅₀ -Werte von Kulturparametern und Umweltfaktoren abhängen, weshalb sie auch zu einem nützlichen Maßstab für die Bewertung der natürlichen und industriellen Bedingungen werden könnten, unter denen Laktobazillen wachsen und funktionieren.
Es wurden folgende Vektoren verwendet:

P_TlpA + Txe/Axe (pTlpA mcherry Txe/Axe; SEQ-ID Nr. 26) , P_Tlpa + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry YafQ/DinJ; SEQ-ID Nr. 27), P_TlpA + HigB/HigA (pTlpA mcherry HigB/HigA; SEQ-ID Nr. 28), P_TlpA + MazF/MazE (pTlpA mcherry MazF/MazE; SEQ-ID Nr. 29), P_TlpA + HicA/HicB (pTlpA mcherry HicA/HicB; SEQ-ID Nr. 30), P_TlpA + MazF/MazE + YafQ/DinJ (pTlpA mcherry Combo; SEQ-ID Nr. 31). In den Figuren und in der Beschreibung werden die Vektoren auch ohne die Angabe „pTlpA mcherry“ bezeichnet, z. B. HigB/HigA oder Combo). TlpA wird auch als tlpA angegeben.

Alle Sequenzen und ihre Bezeichnungen sind auch in Tabelle 2 angegeben.

11 zeigte die schematische Darstellung des Vektors mit Replikationsbeginn (ori); eryR: Erythromycinresistenz; Toxin/Antitoxin. Die Pfeile stehen für Promotoren und die T für Terminatoren. Die Antibiotikumresistenz ist optional. Das Toxin/Antitoxin-System weist einen eigenen Promotor auf. Die Reihenfolge von Toxin/Antitoxin kann auch umgekehrt sein. Der Vektor kann auch mehrere Toxin/Antitoxin-Systeme aufweisen. Tabelle 1

Seq-ID	Promotor	Sequenz (5`-3`)
1	P_tlpA	tttaatttgtttgttagttagtttatttgttggtttgtttgtgttataatat
2	PL	ttgacataaataccactggcggtgatact
3	PR	ttgactattttacctctggcggtgataa
4	P_Tuf	tctgtttacaaatcagattaggctatatataatatttaagga
5	P_spp	gcccatattaacgtttaaccgataaagttgaacgttaatatttttttt
6	P₄₈	agttgttgacatggaacgaggaatgtgataatctgtgagt
7	P₂₃	ctgatgacaaaaagagaaaattttgataaaatagtcttagaattaaattaaaaa

Tabelle 2

SEQ-ID Nr.	Name	Länge (bp)
1	PtlpA	52
2	PL	29
3	PR	28
4	PTuf	42
5	Pspp	48
6	P48	40
7	P23	54
8	Txe	258
9	Axe	270
10	YafQ	303
11	DinJ	270
12	HicA	210
13	HicB	342
14	HigB	228
15	HigA	255
16	MazF	348
17	MazE	219
18	pL mcherry	3535
19	pR mcherry	3535
20	pTlpA mcherry	6084
21	pTlpA A39 mcherry	7330
22	P23 mcherry	3535
23	P48 mcherry	3533
24	SPP mcherry	6161
25	tuf mcherry	3535
26	pTlpA mcherry Txe/Axe	9432

SEQ-ID Nr.	Name	Länge (bp)
27	pTlpA mcherry YafQ/DinJ	5208
28	pTlpA mcherry HigB/HigA	5196
29	pTlpA mcherry MazF/MazE	5182
30	pTlpA mcherry HicA/HicB	4992
31	pTlpA mcherry Combo	5643
32	vector_emtpy	2675

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Expressionskassette zur Expression in Lactobacillus umfassend einen Promotor in operativer Verknüpfung mit einer Nukleinsäure, welche ein zu exprimierendes Protein kodiert, wobei der Promotor im Wesentlichen identisch mit dem P_tlpA-Promotor ist
Expressionskassette, wobei der Promotor eine Sequenz aufweist, welche im Wesentlichen identisch mit der Sequenz ID Nr. 1 ist.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Expressionskassette mit mindestens einem Toxin/Antitoxin-System operativ verknüpft ist.
Expressionskassette nach Anspruch 3, wobei die Expressionskassette mit mindestens zwei Toxin/Antitoxin-Systemen operativ verknüpft ist.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei das mindestens eine Toxin/Antitoxin-System ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Txe (SEQ ID Nr. 8) / Axe (SEQ ID Nr. 9), YafQ (SEQ ID Nr. 10) / DinJ (SEQ ID Nr. 11), HicA (SEQ ID Nr. 12) / HicB (SEQ ID Nr. 13) , HigB (SEQ ID Nr. 14) / HigA (SEQ ID Nr. 15) und MazF (SEQ ID Nr. 16) / MazE (SEQ ID Nr. 17)
Vektor umfassen die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Lactobacillus umfassend mindestens eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Lactobacillus umfassend mindestens einen Vektor nach Anspruch 6.
Verwendung des Promotors der Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Lactobacillus.