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Die vorliegende Erfindung betrifft ein ribosomales Protein L3 (RPL3), ein DNA-Molekül, das für dieses Protein codiert, einen biologisch funktionellen Vektor, umfassend das DNA-Molekül, ein
Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toieranten rekombinanten Zellen, insbesondere Pflan- zenzellen, und Pflanzen.
Weiters betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls umfassend eine für RPL3 codierende Region, das in dem Organismus, in dem es exprimiert wird, zu einer erhöhten Trichothecen-Resistenz führt.
Trichothecene sind eine Gruppe von toxischen, sesquiterpenoiden, sekundären Metaboliten, welche hauptsächlich von pflanzenpathogenen Pilzen, wie Trichothecium, Fusarium, Myrothetium, Trichoderma, Stachybotrys gebildet werden. Insgesamt sind mehr als 180 verschiedene natürlich vorkommende Verbindungen verschiedener Gruppen isoliert worden. Meistens werden folgende vier Toxin-Gruppen beschrieben, die sich in ihrem chemischen Aufbau unterscheiden: Die grösste
Bedeutung haben die Gruppe A und B, die sich durch das Vorkommen einer Ketogruppe am C8 unterscheiden. Toxine der Gruppe C besitzen an der gleichen Stelle (zwischen C8 und C7,) eine weitere Epoxygruppe. Die makrozyklischen Trichothecene werden in Gruppe D zusammengefasst.
Tnchothecene spielen als Virulenzfaktor bei der Pflanzenpathogenese von Pilzen eine grosse
Rolle. Die toxische Wirkung der Trichothecene, die je nach Struktur der Trichothecene unterschied- lich hoch ist, beruht im Wesentlichen auf durch Bindung an ribosomale Untereinheiten verursachte
Inhibierung der Translation (Cundliffe et al., Inhibition of initiation, etongation and termination of eukaryotic protein synthesis by trichothecene fungal toxins ; Antimicrobial Agents and Chemothera- py (1977), Vol. 11, Nr. 3, S. 491-499).
Das in Getreide wichtigste Mykotoxin ist Deoxynivalenol (DON), ein Vertreter der Typ
B-Trichothecene, wobei der TDI-Wert (tolerable daily intake) für Erwachsene und Kinder auf 3 g DON/kg Körpergewicht bzw. 1,5 g/kg geschätzt wird.
Die Kontamination wichtiger landwirtschaftlicher Produkte, wie Weizen, Gerste oder Mais mit Mykotoxinen, wie den Trichothecenen, ist ein weltweites Problem. Ihre Verbreitung in diesen land- wirtschaftlichen Produkten hat nicht nur beim unmittelbaren Verzehr dieser Lebensmittel durch den Menschen, sondern auch bei der Verfütterung an Nutztiere in der Landwirtschaft, negative Auswir- kungen auf deren Gesundheit.
Trichothecen-Intoxikationen sind mit Brechreiz, Diarrhoe, Anorexie, Ataxie, Leukocystose und nachfolgend schwerer Leukopenie, Entzündungen des Magen-Darm-Traktes, Zerstörung von Ner- venzellen des Zentralnervensystems, Hämorrhagie des Herzmuskels, Läsionen von Lymphknoten, Testes und Thymus und Gewebsnekrosen verbunden.
Auch die chronische Aufnahme von geringen Mengen von Trichothecenen ist problematisch, da Effekte wie Beeinträchtigung des Immunsystems und Störungen des Neurotransmitterhaushal- tes auftreten können (B. Rotter, D. Prelusky und J. Pestka, Toxicology of deoxynivalenol (vomito- xin), J. Toxicol. Environ. Health 48 (1996), 1-34).
Die aussichtsreichste und einzige nachhaltige Lösung des Problems der Trichothecen-Konta- mination von Lebensmitteln ist die Züchtung von Pflanzen, die erhöhte Resistenz gegen Fusarium- Arten aufweisen und auch nach Befall nur niedrige Mykotoxin-Konzentrationen aufweisen. Es sind im verfügbaren Zuchtmaterial von Weizen, Gerste, etc. jedoch keine vollständigen Resistenzen bekannt, sondern nur polygen vererbte, quantitative Unterschiede. Dabei ist eine Erfahrung der Pflanzenzüchter, dass eine hohe Resistenz gegen DON in vitro stark mit hoher Feldresistenz ge- gen Fusarium (geringe visuell bonitierte Symptome) und niedrigem DON-Gehalt im Erntegut nach artifizieller Inokulation korreliert ist.
Es ist anzunehmen, dass DON als Protein Biosynthese-Inhibitor die aktive Abwehr der Pflanze unterdrückt und andererseits in Toxin-resistenteren Pflanzen die natürliche Abwehr gegen den Pilz effizienter ist.
Mit Hilfe einer semidominanten Mutante der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae Stamm CLP1, die resistent gegen Trichodermin, einem Vertreter der Trichothecene war, konnten Fried und Warner (Cloning of yeast gene for trichodermin resistance and ribosomal protein L3, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA ; Vol. 78, Nr. 1, S 238-242, Jänner 1981) zeigen, dass das ribosomale Protein L3 (RPL3) der Wirkungsort dieses Toxins ist, siehe auch L.D. Schultz und J. D. Friesen (1983): Nucle- otide sequence of the tcm1 gene (ribosomal protein L3) of Saccharomyces cerevisiae, J. Bacteriol 155, 8-14.
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In der Schrift von Ohtake et al. ("Yeast Virus Propagation depends critically on free 60S ribo- somal subunit concentration"; Molecular and Cellular Biology, May 1995, (2772-2781)) wird beschrieben, dass Mutationen in verschiedenen MAK-Genen (z. B. im RPL3-Gen) zu einer Verrin- gerung der freien 60S Ribosomen-Untereinheiten führen und sich auf die Bildung des Toxin- codierenden Satelliten M1 des L-A doppelsträngigen RNA Virus auswirken.
Gemäss der Veröffentlichung von Peltz et al. ("Ribosomal Protein L3 mutants alter translational fidelity and promote rapid loss of the yeast killer virus", Molecular and Cellular Biology, Jan. 1999 (384-391)) führen Mutationen im RPL3-Gen zu einer Verringerung der Translation des M1 Killer Virus.
In der Schrift von Liebich et al. ("Two genes encoding ribosomal protein L3 of Schizosaccha- romyces pombe and their proximal Promoter regions", Gene 142 (1994), (119-122)) wird die geklonte Sequenz von zwei Genen (RPL3-1 und RPL3-2) beschrieben. Diese Sequenzen weisen ein Sequenzfragment auf, das 75% Identität zu einem Sequenzfragment des Saccharomyces cerevisae RPL3-Gens zeigt.
Die Schrift von Steel et al. ("Sequence and developmental regulation of the gene that encodes the Dictyostelium discoideum L3 ribosomal protein" , Gene 162 (1995), (123-128)) betrifft genomi- sche und rekombinante Plasmide, die für das RPL3-Protein von Dictyostelium discoideum (Dd) codieren. Die Sequenzen dieser Plasmide weisen einen hohen Grad an Homologie zu Genen von RPL3-Proteinen von niederen und hohen Eukaryoten auf.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, aufgrund von molekular-biologischen Untersuchun- gen die Ursache der Resistenz festzustellen und aufgrund dieser Feststellung weitere zur Resis- tenz führende Mutationen des ribosomalen Proteins L3 zur Verfügung zu stellen, so dass Trichothecen-resistente Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Trichothecen-resistente Pflan- zen erhalten werden können. Es sollen weiters DNA-Moleküle, codierend für das mutierte Protein, zur Verfügung gestellt werden.
Das erfindungsgemässe RPL3 der eingangs angeführten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Serin 2 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in welchem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist.
Diese Mutationsstelle in der Aminosäuresequenz zur Herstellung von Trichothecen-resistenten Organismen kann beispielsweise durch Mutation eines gut etablierten Labororganismus, wie von Saccharomyces cerevisiae, anschliessender Selektion in Trichothecen-hältigem Nährboden und Sequenzieren der resistenten Stämme gefunden. Dabei ist jede Mutation an der Serin 2-Stelle denkbar, solange das RPL3 weiterhin funktionsfähig bleibt. Eine Mutation an der Serin 2-Stelle der Aminosäuresequenz kann bei RPL3-Proteinen eines jeden Organismus durchgeführt werden, z.B. bei Säugern, Pflanzen, Pilzen sowie Mikroorganismen. Dabei sind diese Begriffe im weitesten Sinn zu verstehen, so dass alle Organismen bzw. Zellen davon betroffen sind, die ein RPL3 aufweisen.
Unter Trichothecen-Resistenz wird eine Resistenz gegen einen, mehrere oder alle Trichothe- cen-Typen verstanden, insbesondere gegen Typ B und DON, wobei Zellen, die das mutierte RPL3- Gen enthalten, bei bestimmten für Wildtypen inhibitorischen Trichothecen-Konzentrationen noch wachsen können. Diese mutierten Zellen weisen vorzugsweise eine 50 % höhere Resistenz, besonders bevorzugt eine 200 % höhere Resistenz, gegen Trichothecene, verglichen mit den je- weiligen Wildtypen, auf.
Ein vorteilhaftes RPL3 weist an der Stelle Serin 2 eine Aminosäure mit einer aliphatischen Seiten kette auf.
Vorzugsweise umfasst das RPL3 eine Aminosäuresequenz, die an Stelle des Serins 2 ein Prolin aufweist. Wurde das Serin gegen ein Prolin ausgetauscht, weisen die Zellen mit diesem rekombinanten RPL3 eine besonders hohe Resistenz gegenüber Trichothecen auf.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein RPL3, dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Prolin 9 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 expri- miert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Auch hier kann Prolin durch jegliche Aminosäure ausgetauscht werden, solange das Protein aktiv bleibt. Besonders bevorzugt ist ein RPL3, dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Prolins eine andere Aminosäure mit aliphatischer Seitenkette aufweist. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Prolins ein Leucin aufweist. Durch diese Mutation wird ein rekombinanter Organismus erhal- ten, der resistent gegenüber Trichothecenen ist.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein RPL3, ausgenommen RPL3 aus Saccharomyces cerevisiae Stamm CLP1, dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Tryp- tophans 255 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist Durch eine Mutation an dieser Stelle, wobei das Tryptophan durch jegliche andere Aminosäure ausgetauscht werden kann, werden Organis- men zur Verfügung gestellt, die eine gegenüber Trichothecenen höhere Resistenz um über 50 %, insbesondere über 200 %, verglichen mit dem Wildtyp aufweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Nummerierung der Aminosäuresequenz entsprechend der Nummerierung der Aminosäuren der Seq.ID.Nr. 1 (aus Saccharomyces cerevi- siae). Manche Organismen weisen eine durch Insertion bzw. Deletion einiger Aminosäuren ver- schobene Sequenz auf. Bei diesen Sequenzen bezieht sich die jeweilige ausgetauschte Amino- säure auf die entsprechende gleiche Aminosäure, die sich jedoch um eine oder mehrere Amino- säuren weiter oben oder unten in der Sequenz befindet.
Bei manchen Organismen befindet sich das entsprechende Tryptophan an der Stelle 252 (s. Adams et al., "Sequence identification of 2,375 human brain genes", Nature 355 (6361), 632- 634 (1992)), bzw. an der Stelle 257 (s. die Sequenz von Drosophila melanogaster, Hinterlegungs- nummer 016797, von Chan et al.), oder auch 258 (s. Nishi et al., "The primary structure of two proteins form the large ribosomal subunit of rice" ; Biophys. Acta 1216 (1), 110-112 (1993)), um nur einige Beispiele zu nennen. Selbstverständlich wird gemäss der vorliegenden Erfin- dung jeweils das dem Tryptophan 255 der Seq.ID.Nr. 1 entsprechende Tryptophan ersetzt.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Tryptophans ein Cystein oder Methionin aufweist. Durch den Ersatz des Tryptophans mit einer Aminosäure mit schwefelhältiger Seitenkette werden besonders resistente Zellen erhalten. Besonders günstig ist es, wenn die Aminosäuresequenz anstelle des Tryptophans ein Cystein aufweist. Dies stellt einen für Trichothecen-resistente Zellen besonders optimalen Austausch dar.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein RPL3, dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Tryptophans 255 eine Aminosäure mit basischer Seitenkette aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Wird das Tryptophan 255 durch eine Aminosäure mit basischer Seitenkette ersetzt, wer- den ebenfalls besonders resistente Zellen erzeugt, die gleichzeitig eine ausreichende Lebensfähig- keit aufweisen. Auch hier gilt wiederum, dass bei verschobener Aminosäuresequenz das jeweilige entsprechende Tryptophan ausgetauscht wird.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Tryptophans ein Arginin aufweist. Das Arginin wirkt an dieser Stelle besonders resistenzfördernd.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein RPL3, dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Histidins 256 eine Mutation aufweist, so dass der jeweilige Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Dabei kann das Histidin 256 durch jede mögliche Aminosäure ersetzt werden, solange die Funktion des RPL3 ge- währleistet ist. Auch hier gilt wiederum, dass bei verschobener Sequenz das jeweils entsprechende Histidin ausgetauscht wird.
Vorzugsweise weist die Aminosäuresequenz an Stelle des Histidins eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitenkette auf. Eine Aminosäure mit aromatischer Seitenkette wirkt an dieser Stelle besonders resistenzfördernd, wobei es besonders günstig ist, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Histidins ein Tyrosin aufweist. Durch den Ersatz von Histidin durch Tyrosin bleibt die Aktivität des RPL3 erhalten, wobei eine hohe Trichothecen-Resistenz erhalten wird.
Für eine hohe Resistenz ist es weiters günstig, wenn die Aminosäuresequenz des RPL3 an zwei Stellen eine Mutation wie oben beschrieben aufweist. Dabei kann jede erdenkliche Kombina- tion möglich sein, z. B. eine Mutation an der Stelle Serin 2 und eine weitere Mutation an der Stelle Prolin 9 bzw. zusätzlich eine Mutation an der Stelle des Tryptophans 255 und/oder eine Mutation an der Stelle des Histidins 256. Mutanten mit zumindest zwei der oben beschriebenen Mutationen können noch bessere Resistenzeigenschaften aufweisen als die Einzelmutanten, da sie um zumin- dest eine Konzentrationsstufe resistenter sein können.
Eine optimale Resistenz eines Organismus wird dadurch erhalten, dass die Aminosäurese- quenz des RPL3 eine Mutation im C-terminalen Bereich und eine im N-terminalen Bereich auf- weist. Auch hier sind wieder verschiedene Kombinationen möglich, so z.B. eine Mutation an der
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Stelle Serin 2 in Kombination mit einer Mutation an der Stelle Tryptophan 255 bzw. eine Mutation an der Stelle Prolin 9 in Kombination mit einer Mutation an der Stelle Histidin 256 oder umgekehrt.
Die Doppelmutante P9LIW255R zeigt eine erhöhte Trichothecen-Resistenz, die Doppelmutante mit dem Allel S2PIW255R weist besonders hohe Resistenzeigenschaften auf.
Bei all diesen oben beschriebenen Mutationen handelt es sich dabei um für die Trichothecen- Resistenz entscheidende Mutationen. Es ist selbstverständlich, dass jegliche weitere Mutationen im Rahmen dieser Erfindung vorgesehen sein können, solange sie die Aktivität des RPL3 nicht wesentlich vermindern, d. h. die Lebensfähigkeit des mutierten Organismus nicht gefährdet wird. Es können dabei z. B. andere Substitutions-, Deletions- und/oder Insertionsmutationen vorgesehen sein, die für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres erhältlich sind und auf ihre Lebens- fähigkeit und Resistenzeigenschaften vor allem mit den hierin dargestellten Methoden überprüft werden können.
Weiters kann es besonders günstig sein, wenn am C-Terminus der Aminosäuresequenz eine zusätzliche Sequenz angehängt ist. Diese zusätzliche Sequenz kann z.B. mittels PCR eingeführt werden, wobei die Sequenz für verschiedene Funktionen eingesetzt werden kann, z.B. als Epitop für Antigen-Antikörperreaktionen bzw. eine Sequenz, die zum Nachweis des Proteins dient.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das für eines der oben beschriebenen RPL3-Proteine codiert. Neben den Mutationen, die zum Austausch der oben genannten Aminosäuren führen, kann es auch jegliche andere Mutationen beinhalten, solange es für ein aktives, funktionsfähiges RPL3 mit Trichothecen-Resistenz codiert.
Von Vorteil ist weiters ein DNA-Molekül, das eine Teilsequenz des oben beschriebenen DNA- Moleküls umfasst, wobei es für eine Aminosäuresequenz codiert, die zumindest den Bereich einer Mutation eines oben beschriebenen, erfindungsgemässen RPL3-Proteins umfasst. Dieses kann z. B. eine Sequenz im C-Bereich als auch eine Sequenz im N-Bereich des RPL3 umfassen, wichtig ist lediglich, dass es zumindest eine der oben beschriebenen Mutationen, die zur Trichothecen- Resistenz führen, umfasst und zumindest eine Länge von 15-25 bp, insbesondere von über 25 bp, aufweist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind hierunter auch die jeweiligen Komple- mentärsequenzen zu verstehen. Es können z. B. zwei Teilsequenzen zur Verfügung gestellt wer- den, die als Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Dadurch können die spezifischen mutierten Sequenzen amplifiziert und so z.
B. nachgewiesen werden.
Besonders bevorzugt ist ein DNA-Molekül, das kovalent mit einer nachweisbaren Markierungs- substanz assoziiert ist. Diese molekularen Marker sind insbesondere nützlich zum Auffinden von in genetischen Resourcen natürlicherweise vorhandenen oder durch klassische Mutationsverfahren induzierte Varianten eines RPL3-Gens einer (Nutz)pflanze, die einer der in Hefe identifizierten resistenzvermittelnden Mutationen entsprechen und zu erhöhter Trichothecen-Resistenz führen.
Das DNA-Molekül bindet an die homologe Sequenz und die Markierungssubstanz wird in der Folge nachgewiesen. Diese Markierungssubstanz kann beispielsweise eine fluoreszierende, lumineszi- rende, radioaktive Substanz sowie eine nichtisotrope Markierung sein. Dadurch werden Reagen- tien bereitgestellt, die für den Nachweis, die Selektion und Quantifizierung von homologen Sequenzen in Flüssigkeitsproben aber auch in festen Gewebeproben, z.B. von Pflanzen, durch Hybridisierungsverfahren oder PCR-Verfahren nützlich sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen biologisch funktionellen Vektor, der ein oben beschriebenes DNA-Molekül umfasst. Zur Transformation in Wirtszellen ist ein eigen- ständiger vermehrungsfähiger Vektor notwendig, wobei je nach Wirtszelle, Transformationsmecha- nismus, Aufgabe und Grösse des DNA-Moleküls ein passender Vektor verwendet werden kann.
Diese Vektoren sind jedem Fachmann bestens bekannt, so dass auf eine Aufzählung aller mögli- chen Vektorenarten in dieser Anmeldung verzichtet wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toleranten rekombinanten Zellen, wobei zumindest ein erfindungsgemässes DNA- Molekül oder ein Vektor wie oben beschrieben in die Zelle eingeschleust und das mutierte RPL3 exprimiert wird.
Wird das erfindungsgemässe DNA-Molekül oder der Vektor in eine Zelle effizient eingeschleust, exprimiert die Zelle rekombinantes RPL3 und weist somit eine erhöhte Trichothecen-Resistenz auf.
Das Einschleusen des DNA-Moleküls oder des Vektors in die Zelle kann auf unterschiedliche Arten bewerkstelligt werden, beispielsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation, mittels des
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biolistischen Verfahrens (particle gun), durch Elektroporation, oder verschiedene Methoden des direkten DNA-Transfers in Protoplasten. Auch diese Methoden sind jedem Fachmann bestens bekannt, so dass auf eine detaillierte Erläuterung dieser Methoden hier verzichtet werden kann.
Die Selektion einer erfolgreichen Einschleusung des DNA-Moleküls in eine Zelle kann direkt mit Trichothecen-hältigem Nährboden durchgeführt werden (Selektions-Marker). Dabei können Medien verwendet werden, die unterschiedlichste Verbindungen der Trichothecen-Klasse im jeweiligen sinnvollen Konzentrationsbereich enthalten.
Eine weitere Selektion kann z. B. durch Selektion auf einen konventionellen Transformations- marker (z. B. Antibiotika- oder Herbizidresistenz und anschliessendes Screening auf Trichothecen-
Resistenz) erfolgen oder auch dadurch, dass das in die Zelle integrierte DNA-Molekül für ein weite- res Protein codiert, das sichtbar ist oder gemacht werden kann. Somit ist eine erfolgreiche trans- formierte Zelle sichtbar (Screening-Marker). Solche Proteine sind z. B. die #-Glucuronidase, Lucife- rase oder Grünfluoreszenz-Protein aus Quallen.
Weitere wird ein Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toleranten rekombinanten Pflan- zen bzw. Pflanzenzellen zur Verfügung gestellt, wobei zumindest ein erfindungsgemässes DNA- Molekül oder ein oben beschriebener Vektor in die Pflanze bzw. Pflanzenzellen eingeschleust und das mutierte RPL3 exprimiert wird.
Es ist jede Pflanzen-Transformations-Technologie, von der bereits eine Reihe beschrieben und erfolgreich eingesetzt wurden, möglich. Eine Möglichkeit sind direkte DNA-Transfers, so z. B. mit- tels chemischer Behandlung, Elektroporation und insbesondere Partikel-Bombardement (Methode, bei der schwere Metallpartikel, die DNA-Material tragen, mit hoher Beschleunigung direkt auf Pflanzengewebe geschossen werden). Weiters ist es möglich, die DNA in Samen unter Vakuum einzuschleusen oder mittels mikroskopischer Nadeln oder Fasern die Penetration von DNA in spezifische Pflanzengewebe, möglicherweise zum Teil verdautes Pflanzengewebe, zu erleichtern.
Auch virale Vektoren können zum Einschleusen des erfindungsgemässen mutierten RPL3 in Pflan- zen bzw. -zellen eingesetzt werden.
Zur Transformation der Pflanze kommt z. B. das Ti-Plasmid mit dem Agrobacteriumsystem in Frage. Agrobakterien verursachen bei Pflanzen Wurzelhals-Gallen. Wenn Agrobakterien eine ver- letzte Pflanze infizieren, gelangen die Bakterien selbst nicht in die Pflanze sondern sie schleusen den rekombinanten DNA-Abschnitt, die sogenannte T-DNA aus dem ringförmigen extrachromoso- malen Tumor-induzierenden Ti-Plasmid in die Pflanzenzellen ein. Die T-DNA und damit auch das darin eingefügte DNA-Molekül wird stabil in die chromosomale DNA der Zelle eingebaut, so dass die Gene der T-DNA in der Pflanze exprimiert werden. Pflanzen weisen eine besondere Eigen- schaft auf ; sind nämlich in der Lage, sich aus einer (transformierten) Zelle bzw. aus einem Protoblasten zu einer vollständigen Pflanze wieder zu entwickeln, die gezüchtet werden kann.
Verschiedene Pflanzengewebe können transformiert werden, so z.B. ein ungereiftes Embryo, ein Kallus aus Samen, ein Meristem, etc.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "Pflanze" jede Pflanzenart verstanden, insbesondere solche, die in der Landwirtschaft eine Rolle spielen, z. B. Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sojabohnen, Bohnen, Baumwolle, Tomaten, Tabak.
Wird ein Vektor umfassend eine DNA, die ein oben beschriebenes mutiertes, rekombinantes RPL3 codiert, in eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle transformiert, so wird dadurch eine Pflanze mit erhöhter Trichothecen-Resistenz hergestellt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zellen, die im Genom ein oben be- schriebenes DNA-Molekül bzw. eine oben beschriebene Mutation umfassen, so dass sie ein erfin- dungsgemäss mutiertes RPL3 exprimieren und dadurch eine Trichothecen-Toleranz aufweisen. Das Ausmass der Trichothecen-Toleranz hängt dabei von der jeweiligen Mutation im DNA-Molekül ab.
Durch bestimmte Mutationen im RPL3-Gen können weiters Zellen zur Verfügung gestellt werden, die eine Trichothecen-Hypersensitivität aufweisen. Durch das Vorsehen verschiedener Zellkulturen mit unterschiedlichen Hypersensitivitäts- bzw. Toleranzeigenschaften können z. B. die Art und Menge der Trichothecen-Kontamination in Stoffen nachgewiesen werden.
Vorzugsweise weisen die Zellen eine Typ B-Trichothecen-Toleranz und besonders bevorzugt eine Deoxynivalenol (DON)-Toleranz auf. Diese Zellen können insbesondere in der Landwirtschaft bzw. bei der Qualitätskontrolle bei der Herstellung von Landwirtschaftsprodukten eingesetzt werden.
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Dabei ist es besonders günstig, wenn die Zellen eine erhöhte Trichothecen-Resistenz von über 50 %, vorzugsweise über 200 %, verglichen mit dem jeweiligen Wildtyp aufweisen. Dies gewährlei- stet eine Toxin-Kontrolle auch bei höheren Toxin-Konzentrationen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Pflanze bzw. Pflanzenzellen, die im Genom ein oben beschriebenes DNA-Molekül bzw. eine derartige Mutation umfasst bzw. umfas- sen, so dass sie ein erfindungsgemäss mutiertes RPL3 exprimiert bzw. exprimieren und dadurch eine Trichothecen-Toleranz aufweist bzw. aufweisen. Diese Toxin-resistenten Pflanzen sind in der natürlichen Abwehr gegen den Pilz effizient. Auf diese Weise werden Pflanzen gezüchtet, die weniger anfällig auf Pilzkontaminationen sind, so dass dadurch die Ertragseinbussen, z. B. bei Getreide, und die Wertminderung des Erntegutes stark verringert werden.
Vorzugsweise weist bzw. weisen die Pflanze bzw. die Pflanzenzellen eine Typ B-Trichothecen- Toleranz, besonders bevorzugt eine DON-Toleranz auf. Die Typ B-Trichothecene sind wie oben bereits beschrieben, besonders für die Kontamination landwirtschaftlicher Produkte verantwortlich, wobei DON ein Vertreter der Typ B-Trichothecene von besonderer Wichtigkeit ist. Durch das Zur- verfügungstellen von Trichothecen-toleranten Pflanzenzellen können Trichothecen-tolerante Pflan- zen herangezüchtet werden, wobei die Typ B-Trichothecen-toleranten Pflanzen und insbesondere die DON-toleranten Pflanzen für die Landwirtschaft von Bedeutung sind.
Dabei ist es von besonderem Vorteil, wenn die Pflanze bzw. die Pflanzenzellen eine erhöhte Trichothecen-Resistenz von über 50 %, vorzugsweise über 200 %, verglichen mit dem jeweiligen Wildtyp aufweist bzw. aufweisen. Hierbei hängt wiederum die Toleranzeigenschaft der Pflanze bzw. der Pflanzenzellen von der Art der Mutation ab, wobei manche Mutationen eine geringere Toleranz herbeiführen und andere wiederum eine höhere Toleranz. Auch ist der Toleranztyp von der Mutation abhängig. Dabei kann je nach Einsatz der Pflanze bzw. Pflanzenzellen jeweils eine bestimmte Mutation besonders bevorzugt sein.
Das Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls der eingangs angeführten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Wildtyp-RPL3-Gen ausgenommen an der Stelle Tryptophan 255, punkt- mutiert wird, wonach das mutierte Gen in einen Testorganismus eingeschleust wird, das daraufhin mutiertes RPL3 exprimiert, wobei der Testorganismus anschliessend auf einem Nährmedium um- fassend Trichothecen kultiviert und selektiert wird, wonach mutierte DNA-Moleküle aus den selek- tierten Klonen isoliert und gereinigt und gegebenenfalls sequenziert werden.
Das Wildtyp-RPLB-Gen wird mutiert, entweder durch Zufallsmutationsmethoden oder auch zielgerichtete Mutation, wobei einzelne Basen ausgetauscht werden. Es kann dabei eine einzige Base ausgetauscht werden, möglich sind aber auch zwei bis drei oder mehr Basen. Wichtig ist dabei lediglich, dass zumindest eine, verglichen zum Wildtyp-Gen andere Aminosäure durch den Basenaustausch entsteht. Das Gen wird mit Hilfe von den oben bereits beschriebenen Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, in einen Testorganismus eingeschleust, wobei der Testorganis- mus z. B. Hefe oder Bakterien sein kann. Der Testorganismus, der das mutierte RPL3 exprimiert, wird auf einem Nährmedium umfassend Trichothecen irgendeines Typs und in verschiedenen Konzentrationen kultiviert.
Lediglich die Testorganismen, die das mutierte RPL3-Gen erfolgreich aufgenommen und ein funktionelles RPL3 exprimieren, können auf dem Nährmedium umfassend Trichothecen wachsen, wenn die in das RPL3-Gen eingefügte Mutation zu einer Trichothecen- Toleranz führt. Je nach Mutation werden Testorganismen erhalten, die mehr oder weniger gut in diesem Nährmedium umfassend Trichothecen wachsen können. Einzelne Klone der Trichothecen- toleranten Testorganismen werden ausgewählt, können gegebenenfalls einzeln vermehrt werden, so dass eine ausreichende Menge an DNA isoliert und gereinigt werden kann. Anschliessend kann zur Überprüfung der Mutation das jeweilige DNA-Molekül sequenziert werden, wobei jede bekann- te Sequenziermethode angewandt werden kann.
Dabei ist es besonders von Vorteil, wenn der Testorganismus, in den das mutierte DNA- Molekül eingeschleust ist, eine Hypersensitivität gegenüber Trichothecene aufweist. Die Hypersen- sitivität des Testorganismus kann z. B. durch Beeinträchtigung von Detoxifikationsenzymen, etwa durch Deletion des entsprechenden Gens, gewährleistet werden. Dadurch wird ermöglicht, dass die Selektion des Testorganismus auf einem Nährmedium mit einer geringeren Konzentration an Trichothecen durchgeführt werden kann. Dies verringert den Verbrauch an Trichothecen, was kostengünstiger ist, und auch bessere Arbeitsbedingungen im Labor sind dadurch gewährleistet.
Vorzugsweise weist der Testorganismus, in den das mutierte DNA-Molekül eingeschleust ist,
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eine Genunterbrechung im genomischen RPL3 auf. Dies ist eine einfache und effiziente Methode, einen gegenüber Trichothecen hypersensitiven Testorganismus zu erhalten, ohne jegliche andere
Eigenschaften des Testorganismus zu beeinflussen.
Dabei ist es weiters günstig, wenn das mutierte DNA-Molekül zumindest einen Selektions-
Marker aufweist. Man kann z. B. eine Antibiotika-Resistenz im Testorganismus hervorrufen, wobei das Nährmedium zusätzlich zum Trichothecen bestimmte Antibiotika enthält. Eine andere Möglich- keit stellt z. B. ein DNA-Molekül dar, das für ein Protein codiert, das in einem bestimmten Nährme- dium zur Färbung bzw. Entfärbung des Klons führt, s. z. B. den ADE2-Marker. Durch diese zusätzli- che Selektion von erfolgreich eingeschleuster DNA wird eine eindeutige Erkennung dieser Klone sichergestellt.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation mittels
Hydroxylamin durchgeführt wird (s. L. Fishbein, W.G. Flamm und H.L. Falk (1970) : Chemical Mutagens, Academic Press, NY ; Sikorski und J. D. Boeke (1991): In vitro mutagenesis and plasmid shuffling: from cloned gene to mutant yeast, Methods in Enzymology 194,302-318). Das
Hydroxylamin wird in einer bestimmten Konzentration zugesetzt, was zu Zufalismutationen in DNA-
Molekülen führt. Dadurch werden DNA-Moleküle erhalten, die Mutationen an den verschiedensten
Stellen aufweisen. Je mehr DNA-Moleküle mit unterschiedlichen Mutationen erhalten werden, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass Mutationen, die zur Trichothecen-Toleranz führen, wenn das mutierte RPL3-Gen im Organismus exprimiert wird, erhalten werden.
Eine weitere günstige Möglichkeit besteht darin, dass die Mutation in einem E. coli-
Mutationsstamm, z.B. XLI-Red, durchgeführt wird (s. A. Greener, M. Callahan und B. Jerpseth : Anefficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Methods in Molecular
Biology, Bd. 57 (In vitro Mutagenesis Protocols, Hrsg. M. K. Trower), S. 375-385, Humana Press, Totowa, NJ). Dieser E. coli-Stamm weist eine ausgesprochen hohe Spontan-Mutationsrate für
DNA-Moleküle, die in diesen Stamm eingeschleust werden auf. Auch diese Mutationen beruhen auf dem Zufallsprinzip, so dass eine Reihe von DNA-Molekülen mit verschiedensten Mutationen gewonnen werden.
Besonders bevorzugt umfasst das Nährmedium zur Selektion der transformierten Wirtsorga- nismen zumindest 100 ppm DON, vorzugsweise zumindest 200 ppm DON. Insbesondere bei
Konzentrationen von 200 ppm DON können erfolgreich transformierte Testorganismen selektiert werden, da die Konzentration ausreichend ist, um nicht-transformierte Testorganismen an einem Wachstum in diesem Nährmedium zu hindern, und andererseits nicht zu hoch ist, so dass erfolg- reich transformierte Testorganismen mit den gewünschten Mutationen im DNA-Molekül wachsen können.
Vorzugsweise werden nach Isolierung und Reinigung der mutierten DNA-Moleküle diese in Wirtszellen eingeschleust, die auf Nährmedium umfassend Trichothecen kultiviert und selektiert werden, wonach mutierte DNA-Moleküle gegebenenfalls wiederum isoliert und gereinigt werden.
Diese Wirtszellen können andere sein als die oben genannten Testorganismen, mit dem Ziel, be- stimmte Trichothecen-tolerante Zellen herzustellen, die dann zu weiteren Zwecken dienen können.
Zur Sicherstellung, dass diese eingeschleusten DNA-Moleküle dieselbe Trichothecen-Toleranz- Mutation aufweisen, können aus diesen Wirtszellen DNA-Moleküle wiederum isoliert und gereinigt und in der Folge sequenziert werden. Selbstverständlich können diese Wirtszellen wiederum die- selben Zellen wie die oben genannten Testorganismen sein, etwa um weitere Versuche durchzu- führen.
Gemäss einem besonders vorteilhaften Verfahren wird das Wildtyp-RPL3-Gen an der Stelle Serin 2 und/oder Prolin 9 und/oder Histidin 256 punktmutiert. Auf diese Weise werden DNA- Moleküle erhalten, die in dem Organismus, in dem es exprimiert wird, zu einer besonders hohen Trichothecen-Resistenz führen.
Besonders bevorzugt werden nach Isolierung und Reinigung der mutierten DNA-Moleküle diese in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen transformiert. Dies können z. B. die aus dem oben genann- ten Testorganismus isolierten DNA-Moleküle sein, vorzugsweise sind es jedoch die aus den oben genannten Wirtszellen isolierten DNA-Moleküle, da durch die nochmalige Transformation in die Wirtszellen die Resistenz gegenüber Trichothecen bestätigt wurde. Die Transformation in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen wurde bereits oben beschrieben, wobei wiederum die unterschiedlichsten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen transformiert werden können.
Dadurch sollte es möglich sein,
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Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften für die Landwirtschaft herzustellen (erhöhte Resistenz gegen Trichothecene, dadurch erhöhte Resistenz gegen Trichothecen-produzierende Pilze, und somit geringere Trichothecen-Rückstände im Erntegut).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zellen, ausgenommen eine W255CMutation umfassende Saccharomyces cerevisiae-Zellen Stamm CLP1, die mit einem mutierten DNA-Molekül wie oben beschrieben, transformiert wurden, mutiertes RPL3 exprimieren und eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
Ebenfalls betrifft die Erfindung Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die mit einem mutierten DNAMolekül wie oben beschrieben transformiert wurden, mutiertes RPL3 exprimieren und eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
Die Trichothecen-Toleranz dieser transformierten Zellen, Pflanzen bzw. -Pflanzenzellen kann dabei jeden möglichen Trichothecen-Typ betreffen, vorzugsweise jedoch Typ A und Typ B. Auch das Ausmass der Trichothecen-Toleranz ist unterschiedlich, je nach Mutation im DNA-Molekül.
Die vorliegende Erfindung wird nun an Hand von den Beispielen sowie den in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert, wobei die Fig. 1 die allgemeine Formel der Gruppe A-Trichothecene, die Fig. 2 die allgemeine Formel der Gruppe B-Trichothecene, die Fig. 3 die allgemeine Formel der Gruppe C-Trichothecene, Fig. 4 die allgemeine Gruppe der Typ D-Trichothecene, Fig. 5 das Plasmid pZGA121 und Fig. 6 eine Liste von Teilsequenzen von RPL3-Genen verschiedener Organismen, wobei die Stelle umfassend das W255 und H256 gezeigt ist, darstellen. Dabei sind in Tabelle 1 die Seitengruppen der Trichothecene gezeigt.
Tabelle 1
Seitengruppen der Trichothecene in Fig. 1-4
EMI8.1
<tb> Trivialname <SEP> R1 <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> R4 <SEP> R5
<tb>
<tb>
<tb> Gruppe <SEP> A
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichothecene <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichodermol <SEP> H <SEP> OH <SEP> H <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Verrucarol <SEP> H <SEP> OH <SEP> OH <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Scirpentriol <SEP> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> T-2 <SEP> tetraol <SEP> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> H <SEP> OH
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichodermin <SEP> H <SEP> OAc <SEP> H <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Diacetoxyscirpenol <SEP> OH <SEP> OAc <SEP> OAc <SEP> H <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> HT-2 <SEP> toxin <SEP> OH <SEP> OH <SEP> OAc <SEP> H <SEP> OiVal
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> T-2 <SEP> toxin <SEP> OH <SEP> OAc <SEP> OAc
<SEP> H <SEP> OiVal
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Gruppe <SEP> B
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichothecolone <SEP> H <SEP> OH <SEP> H <SEP> H <SEP> =O
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Deoxynivalenol <SEP> (DON) <SEP> OH <SEP> H <SEP> OH <SEP> OH <SEP> =0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3-ADON <SEP> OAc <SEP> H <SEP> OH <SEP> OH <SEP> =0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nivalenol <SEP> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> =0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fusarenon-X <SEP> OH <SEP> OAc <SEP> OH <SEP> OH <SEP> =O
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichothecin <SEP> H <SEP> OBe <SEP> H <SEP> H <SEP> =0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> OAc=OCOCH3 <SEP> OiVAI=OCOCH2CH(CH3)2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> OBe=OCOCH=CHCH3(z)
<tb>
B e i s p i e l 1:
Mutation von RPL3-Genen mittels E. coli-Stamm XLI-Red
Das Plasmid pZGA121 (siehe Fig. 5), dass als E. coli-Hefe-Shuttlevektor verwendet wird und eine RPL3-Mutation komplementieren kann, umfasst eine EcoRI-Schnittstelle, in die das WildtypHefe (Saccharomyces cerevisiae) RPL3-Gen cloniert wurde. In Fig. 6 sind Teilsequenzen von
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RPL3-Proteinen aus verschiedenen Organismen gezeigt, wobei deutlich ist, dass die Sequenz konserviert ist. Das Gen steht im Plasmid unter Wirkung des eigenen Promotors und kann die Funktion einer RPL3-disruptierten Hefe komplementieren.
Das Plasmid pZGA121 enthält zusätz- lich ein Hefegen (ADE2), das als Indikator der Effizienz der Mutagenese dient : ein intaktes ADE2-Gen in einen ade2-Hefestamm eingebracht, ist die resultierende Kolonie weiss, ist das mit- mutierte ADE2*-Gen jedoch defekt, zeigt die Kolonie so wie die ade2-Mutante Rotfärbung aufgrund der Akkumulation einer pigmentierten Vorstufe aus der Adeninbiosynthese. Weiters ist das Plasmid pZGA121 in Hefe konditional instabil (auf Galaktosemedium), da ein GAL1-Promotor neben dem Centromer plaziert ist und dessen Funktion stört. Als Selektionsmarker für die Hefetransformation dient das TRP1-Gen. Zusätzlich enthält das Plasmid als Antibiotika-Resistenz das Gen für die #-Lactamase, um in E. coli-Transformanten auf Antibiotika-versetzten Nährbäden kultiviert werden zu können.
Das Plasmid wurde in den E. coli-Stamm XLI-Red transformiert. Dieser E. coli-Stamm besitzt eine Spontan-Mutationsfrequenz, die um ca. das 5000fache erhöht ist als beim Wildtyp-Stamm.
Die DNA, die in diesen Stamm transformiert und amplifiziert wird, wird fortlaufend fehlerhaft repro- duziert und erhält dadurch Mutationen in ihrer Sequenz, mit einer Mutationswahrscheinlichkeit, die für alle Basen etwa gleich ist.
Transformation des E. coli-Mutationsstammes:
1) Transformation des E. coli-Mutationsstammes XLI-Red (siehe 3. 13) mit dem Plasmid pZGA121 wie in 3. 2.2. beschrieben (CaCI2 -kompetent).
- 400 l XLI-Red werden mit 2 g DNA gemischt und 30 Minuten auf Eis gesetzt.
- 90 Sekunden bei 42 C im Wasserbad inkubieren.
- 900 l SOC (LB)-Medium zufügen und 30 Minuten bei 37 C inkubieren.
- Jeweils 200 l der Transformationslösung auf eine LB-Amp100-Platte ausplattieren und über Nacht bei 37 C inkubieren.
2) Platten mit LB-Amp100 waschen (ca. 3 ml) und in einen Erlenmeyerkolben mit LB-Amp100 überführen. Über Nacht bei 37 C am Schüttler bebrüten.
3) Am nächsten Tag 50 l der Bakteriensuspension in frisches LB-Amp100 (50 ml) überführen und wieder über Nacht bei 37 C am Schüttler inkubieren. Gleichzeitig werden von der Sus- pension Aliquots (2 x 2 ml) entnommen und zum Miniprepen eingefroren (-20 C).
4) Punkt 3) wird 7 mal wiederholt und man erhält 8 Plasmidpools.
5) Von jedem Pool werden die Plasmide gewonnen (3. 1.1.) und in kompetente (CaCI2)
Bakterien (E. coli) transformiert, um alle Klone in mutationsstabilen Bakterien zu erhalten:
Die Durchführung der Transformation erfolgte wie in 1).
6) Die Platten der Retransformation werden mit 4 ml LB-Amp100 abgewaschen und in 50 ml
LB-Amp100 über Nacht bei 37 C inkubiert.
7) Von der Suspension jeweils 1 ml bei -70 C und -20 C einfrieren und von der restlichen
Suspension eine DNA-Präparation machen: - Suspension in einem 50 ml-Flacon abzentrifugieren (5 min; 5000 rpm).
- In 4 ml Lösung I (50 mM Glucose; 2 mM Tris-HCI (pH 8,0); 10 mM EDTA (pH 8,0) resuspendieren (10 min schütteln).
- Mit 8 ml Lösung 11 (0,2 N NaOH; 1 % SDS) durch Invertieren mischen (nicht vortexen) und bei Raumtemperatur nicht länger als 5 min inkubieren.
- 6 ml eisgekühlte Lösung lll (60 ml 5 M Kaliumacetat+11,5 ml Eisessig+28,5 ml H20; die resultierende Lösung ist 3 M an K+-Ionen und 5 M an Acetat-Ionen) zusetzen, mischen und mindestens 20 Minuten auf-20 C setzen.
- 15 Minuten 10000 rpm abzentrifugieren und den Überstand über Glaswolle abfiltrieren.
- Mit 0,7fachem Volumen an Isopropanol fällen und 20 min abzentrifugieren (10000 rpm).
- Pellet in 70 % Ethanol waschen und abzentrifugieren.
- Pellet in 0,5 ml Wasser oder TE lösen.
8) Zum Quantifizieren der Ausbeute wird ein Aliquot mit RNAse verdaut und auf ein Agarose- gel aufgetragen (nicht gezeigt).
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Beispiel l 2: Mutation des RPL3-Gens mittels Hydroxylamin 1) 10 g DNA (pZGA121) werden mit 500 l Hydroxylamin-Reaktionslösung gemischt und bei
75 C inkubiert.
2) Von der Inkubationsmischung werden alle 20 Minuten jeweils 100 l-Aliquots entnommen (5 DNA-Pools).
3) Die 100 l-Aliquots werden mit 70 l Isopropanol (oder 200 l Ethanol 98 %) gefällt, abzentrifugiert und in 50 l Wasser gelöst 4) Von den Proben werden jeweils 3 l entnommen und für die Elektroporation eingesetzt.
5) Die gesamten Ansätze auf LBAmp100-Platten ausplattieren und über Nacht bei 37 C inku- bieren.
6) Von jedem DNA-Pool des Hydroxylamin-Ansatzes die Platten mit LBAmp100 abwaschen, vereinigen und in einem Erlenmeyerkolben 2 Stunden bei 37 C inkubieren.
7) Bei 5000 g 7 min abzentrifugieren.
8) Midiprep der Proben; 9) Nach dem Abfiltrieren über Glaswolle, Fällen mit Isopropanol und Waschen mit 70 %
Ethanol sind die Proben für die Hefetransformation bereit.
Herstellung der Hydroxylamin-Reaktionslösung: - 0,5 M Pyrophosphatpuffer (pH 7,99):
13,295 g Na4P207 einwiegen und auf 100 ml mit H20 auffüllen.
11,095 g Na2H2P207 einwiegen und auf 100 ml mit H20 auffüllen.
Beide Lösungen mit solchen Verhaltnissen vereinigen, dass der resultierende pH-Wert =
7,00 ist.
- 5 M Hydroxylaminlösung:
3,5 g Hydroxylamin mit 7 ml H20 mischen (pH ca. 2,1) und auf einen pH von 7,00 mit
10 N NaOH bringen. Mit H20 auf 10 ml auffüllen.
- Mischen der Reaktionslösung:
EMI10.1
<tb> Chemikalie <SEP> Stammlösung <SEP> Endkonzentration <SEP> Menge <SEP> der
<tb>
<tb> Stammlösung
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaCI <SEP> 5 <SEP> M <SEP> 100 <SEP> mM <SEP> 200 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> EDTA <SEP> 0,5 <SEP> M <SEP> 2 <SEP> mM <SEP> 40 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pyrophosphat <SEP> 0,25 <SEP> M <SEP> 50 <SEP> mM <SEP> 2 <SEP> ml
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hydroxylamin <SEP> 5 <SEP> M <SEP> 1M <SEP> 2 <SEP> ml
<tb>
Mit H20 auf 10 ml auffüllen und das Gemisch zu 1 ml in Eppis abfüllen und bei -20 C einfrieren.
Beispiel l 3: Transformation von Hefe mit mutagenisierter Plasmid-DNA.
Die oben beschriebenen mutagenisierten Plasmid-DNA-Moleküle wurden für die Retransformation in den Hefestand YZGA315 verwendet. Dieser Hefestamm ist abgeleitet von YPH252 und hat folgende Eigenschaften :
YZGA315: MATa; ura3 leu2 his3 trp1 ade2 fys2
EMI10.2
Der transformierte Hefestamm YZGA315 weist neben einem trp1- und ade2-Marker folgende wesentliche Eigenschaften auf : daschromosomale Wildtyp-RPL3-Gen ist disruptiert (rpl3: :LYS2).
Da RPL3 ein essentielles Gen ist, enthält der Stamm eine weitere, modifizierte RPL3-Kopie auf dem Plasmid pZGA196. Das RPL3-Gen auf diesem Plasmid ist unter Kontrolle eines GAL1- Promotors. Auf Glucosemedium ist dieser Promotor inaktiv und folglich kann der Stamm YZGA315 nicht auf Medien mit Glucose als C-Quelle wachsen, sondern nur auf Galaktosemedien. Weiters
<Desc/Clms Page number 11>
enthält der Stamm ein inaktiviertes PDR5-Gen (pdr5. :hisG), wodurch dieser hypersensitiv auf
Trichothecene ist (PDR5 codiert für ein ABC-Transporter-Protein, das in der Plasmamembran loka- lisiert ist und unter ATP-Aufwand in die Zelle eingedrungenes Toxin wieder entfernt.
Werden Hefen mit Lithium-haltiger Lösung gewaschen und mit Polyethylen gemischt, sind diese in der Lage, Fremd-DNA aufzunehmen.
Die DNA-Transformation wird durch Anwesenheit von einzelsträngiger Carrier-DNA (Hering- sperma-DNA) begünstigt.
1) Der zu transformierende Hefestamm wird, ausgehend von einer Einzelkolonie, in einem geeigneten Medium (50 ml) bei 30 C über Nacht herangezogen. Abhängig vom Wachstum der Hefen muss die Bebrütungsdauer auf 48 Stunden oder mehr ausgedehnt werden.
2) Die Ernte erfolgt bei einer OD600=1. Dann wird die Suspension 5 min, 4000 g (Sorvall GSA :
5000 rpm) abzentrifugiert (50 ml Falcon) und der Überstand verworfen.
3) Die Zellen werden in 1-2 ml Lösung A resuspendiert und 30 min am Schüttler inkubiert.
4) Die Suspension in ein 2,2 ml Eppendorf überführen, abzentrifugieren und Überstand verwerfen. Das Pellet in geeigneter Menge Lösung A resuspendieren.
5) Für jede Transformation werden < 5 g zu transformierende DNA, 50 g Carrier-DNA,
100 l Hefesuspension, sowie 700 l Lösung B gemischt und 30 min bei 30 C inkubiert
6) Hitzeschock: 15 min bei 42 C
7) Die Hefesuspension wird 5 s zentrifugiert und in 200 l 1 x TE-Puffer (pH 7,5) resuspen- diert.
8) Die Suspension auf geeignetem Selektionsmedium (z. B. SC-Trp-Platten) ausplattieren und bei 30 C bebrüten.
9) Hefekolonien auf demselben Nährmedium auf Einzelkolonien ausstreichen und bei 30 C bebrüten.
Material und Geräte: Lösung A : mM Li-Acetat
10 mM TncCI (pH 7,5)
1 mM EDTA
Lösung B: 40 % PEG (Polyethylenglykol) 4000 (Cat.No. 81240, Fluka)
100 mM Li-Acetat
10 mM TrisCI (pH 7,5)
1 mM EDTA
Carrier-DNA : Heringsperma-DNA 10 mg/ml (Cat.No. 31162, FLUKA) (denaturiert durch Hitzebehandlung) SC-Trp/%Ade-Platten (vereinfacht) : 1,43 g/l YNB (Yeast Nitrogen Base, Cat.No. 25685-033, GIBCO) 5,00 g/l NH4S04, 10 ml/l Stammlösung (100 x konzentriert) der Komponenten (Aminosäu- ren) : Thr, Leu, His, lle, Arg, Lys, Adenin, Uracil, kein Trp ; einer Endkonzentration von 20 mg/l, ausser Leu (60 mgll). 2 % Agar und 2 % Glucose getrennt von den anderen Bestandteilen autokla- vieren und vor dem Ausgiessen gründlich mischen.
Transformanten, die auf SC-TRP-Medium (mit Glucose als C-Quelle) wachsen können und die folglich ein Plasmid mit einem funktionellen RPL3-Gen aufgneommen haben, werden selektiert.
Die Transformanten werden anschliessend auf Trichothecen-hältiges Medium übergeführt und to- xinresistende Mutanten selektiert.
Von den Platten wurden mit flüssigem YPD (4 ml) die Hefetransformanten abgewaschen und sorgfältig die Pools gemischt. Von dieser Mischung wurden jeweils ca. 50 l auf YPD-Platten mit 200 ppm DON(Deoxynivalenol) aufgetragen und bei 30 C bebrütet.
Die hochkommenden Kolonien wurden wiederum auf YPD (+DON200ppm)-Platten auf Einzelkolonien ausgestrichen.
Insgesamt konnten auf diese Weise aus insgesamt ca. 280 000 gescreenten Hefetransforman- ten 50 neue DON-resistente Hefestämme gewonnen werden (YARM1 bis YARM50).
Zum Beweis, dass die für die Resistenz verantwortliche Mutation auf dem Plasmid lokalisiert ist, kann das Plasmid entweder wieder verloren werden (instabil auf Galaktose-Medium), oder zuerst aus der Hefe in E.coli übergeführt werden und der Test durch Retransformation des Hefe-
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stammes YZGA315 geführt werden. Durch Subklonierung und DNA-Sequenzierung kann die für die Resistenz verantwortliche Mutation identifiziert werden.
Das Resistenzverhalten der Hefe wurde durch Isolierung der Plasmide aus den selektierten Hefetransformanten, neuerliche Transformation in frische Hefezellen und Selektion auf YPD(+DON200ppm)-Platten bestätigt.
YPD : 1 % Yeast-Extrakt (Cat. No. 70161, FLUKA) 2 % Pepton (aus Fleisch ; MERCK)
2 % Dextrose (Glucose; Cat. No. 49159, FLUKA)
Beispiel I 4: Sequenzieren der Toxin-resistenten Klone
Prinzip:
Die Plasmide wurden mit dem Nukleospin-Reinigungskit aus den resistenten Hefekolonien ge- wonnen und gereinigt. Sequenziert wurde nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Methode mit dem System ABI310 von Perkin Eimer.
Bei diesem System sind die für den Kettenabbruch verantwortlichen Dideoxy-NTP's fluores- zenzmarkiert und können dadurch voneinander unterschieden werden.
Die Reaktion wird in einem Ansatz durchgeführt.
Die Proben werden im Gerät auf einer Trennsäule getrennt und jedes Fragment einzeln regist- riert.
Der Vorteil dieses Systems ist es, dass nur ein Ansatz pro Sequenzierung notwendig ist.
Durchführung:
1) PCR-Programm : [(96 C/30sec-50 C/15sec-60 C/4min)x25] hotlid on/kein Öl
2) Ansatz (20 l); 4,0 111 TRR-Mix 2,0 l DNA (30-500 ng je nach Herkunft : PCR,Plasmid)
3,2 l Primer (1 pmol/ l)
10,8 l H20
3) Der Ansatz wird mit 50 l 95 % Ethanol und 2 l 3 M Natriumacetat (pH 4,6) in einem
1,5 ml Eppendorf gefällt und für mindestens 10 Minuten auf Eis (-20 C) gestellt. Der Ansatz kann auch über Nacht oder länger auf -20 C gefällt werden, um eventuelle höhere Ausbeu- ten an DNA zu erhalten.
4) Die Fällung 20-30 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (14000 Umdrehungen/Minute) abzentrifugieren und Überstand vorsichtig verwerfen.
5) Das Pellet in ca. 100-200 l 70 % Ethanol waschen und 15 Minuten abzentrifugieren (14 000 U/min).
6) Überstand vollständig abheben, 3-5 Minuten gut trocknen lassen und in 20 l Template
Supression Reagent (TSR) oder Formamid lösen.
7) 5 Minuten bei 96 C am Heizblock denaturieren und sofort auf Eis stellen (DNA quenchen).
8) Die Proben wurden am ABI310-SEQUENCE ANALYSER sequenziert.
9) Auswertung der Sequenzen mit den Programmen EDITSEQ und SEQMAN von DNASTAR (DNASTAR Inc.) und SEQUENCE ANALYSIS.
Material und Geräte:
DNA Sequenzing Kit No. 403044 (enthält TRR-Mix); PERKIN ELMER
3 M Natriumacetat (pH 4,6)
95 % oder 98 % Ethanol
70 % Ethanol
Template Supression Reagent (TSR) No. 402844 (POP 6) PERKIN ELMER
Formamid
SEQUENCE ANALYSER ABI310; PERKIN ELMER
Thermocycler OMN-E(HYBAID)
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Die Plasmide wurden mit dem Nukleospin-Reinigungskit gewonnen und gereinigt. Zum Sequenzieren des RPL3-Gens der Plasmide standen die in Tabelle 2 angeführten, schon vorhandenen Pnmer zur Verfügung.
Tabelle 2
EMI13.1
<tb> Pri- <SEP> Pnmer-Sequenz <SEP> Seq.
<tb> mer <SEP> ID.Nr.
<tb>
<tb>
TCM-A <SEP> 5'-AAT <SEP> GAA <SEP> TTC <SEP> AGT <SEP> GGT <SEP> AAT <SEP> GCA <SEP> ACA <SEP> GCA <SEP> AG-3' <SEP> 2
<tb>
<tb> TCM-B <SEP> 5'- <SEP> GAC <SEP> TTC <SEP> GTC <SEP> AGA <SEP> CAA <SEP> ATG <SEP> TTC <SEP> AG-3' <SEP> 3
<tb>
<tb> TCM-C <SEP> 5'- <SEP> TGC <SEP> CAA <SEP> GAA <SEP> AGA <SEP> CTC <SEP> ACA <SEP> GAG <SEP> G-3' <SEP> 4
<tb>
<tb> TCM-D <SEP> 5'-AAG <SEP> AAT <SEP> TCT <SEP> GTT <SEP> GTA <SEP> TGT <SEP> AGC <SEP> TAA <SEP> CAA <SEP> TAC <SEP> TA-3' <SEP> 5
<tb>
<tb> TCM-E <SEP> 5'-ACC <SEP> AAG <SEP> CTT <SEP> CAA <SEP> TCA <SEP> TGT <SEP> CTC <SEP> ACA <SEP> GAA <SEP> AGT <SEP> ACG <SEP> A-3' <SEP> 6
<tb>
<tb> TCM-F <SEP> 5'-GCA <SEP> CCA <SEP> ATA <SEP> CAA <SEP> GCA <SEP> ACC-3' <SEP> 7
<tb>
<tb> TCM-G <SEP> 5'-CAC <SEP> TCC <SEP> ACC <SEP> AGT <SEP> TGT <SEP> CGT-3' <SEP> 8
<tb>
<tb> TCM-H <SEP> 5'-CTG <SEP> GTA <SEP> GCA <SEP> CCG <SEP> TTA
<SEP> GC-3' <SEP> 9
<tb>
<tb> TCM-I <SEP> 5'-CAA <SEP> CGG <SEP> TGA <SEP> CAG <SEP> CTT <SEP> CGA-3' <SEP> 10
<tb>
Die fünf Plasmide wurden vollständig sequenziert, dabei wurden folgende Mutationen gefunden (Tabelle 3):
Tabelle 3
Mutationen der Plasmide
EMI13.2
<tb> Plasmid- <SEP> Nucleotid- <SEP> Tnplett-Verän- <SEP> Ammosäure-
<tb>
<tb> Mutante <SEP> Austausch <SEP> derung <SEP> Austausch
<tb>
<tb>
<tb> pARM8a <SEP> T4C <SEP> TCT <SEP> CCT <SEP> S2P
<tb>
<tb>
<tb> pARM34A <SEP> C26T <SEP> CCA <SEP> CTA <SEP> P9L
<tb>
<tb>
<tb> pARM14B <SEP> C766T <SEP> CAT <SEP> TAT <SEP> H256Y
<tb>
<tb>
<tb> pARM49B <SEP> --1 <SEP> T763C <SEP> TGG <SEP> CGG <SEP> W255R
<tb>
<tb>
<tb> pARM561 <SEP> G765C <SEP> TGG <SEP> TGC <SEP> W255C
<tb>
Beispiel l 5:
Herstellung von Doppelmutanten
Um zu untersuchen, ob eine Resistenzsteigerung mit zwei Mutationen im RPL3-Gen möglich ist, wurden Doppeimutanten kloniert, die jeweils eine N-Mutation und eine C-Mutation enthielten (Tabelle 4).
Tabelle 4
EMI13.3
<tb> Plasmid <SEP> Austausch <SEP> Mutation
<tb>
<tb> pARM8A14B <SEP> T4C/C766T <SEP> S2P/H256Y
<tb>
<tb>
<tb> pARM34A14B <SEP> C26T/C766T <SEP> P9L/H256Y
<tb>
<tb>
<tb> pARM8A49B <SEP> T4C/T763C <SEP> S2PIW255R
<tb>
<tb>
<tb> pARM34A49B <SEP> C26T/T763C <SEP> P9UW255R
<tb>
<tb>
<tb> pARM8A561 <SEP> T4C/G765C <SEP> S2P/W255C
<tb>
<tb>
<tb> pARM34A561 <SEP> C26T/G765C <SEP> P9L/W255C
<tb>
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Die Plasmide mit Doppel-Mutation wurden in den Hefestamm YZGA315 transformiert und ver- einzelt. Die isolierten Hefemutanten (jeweils 3 l einer Hefesuspension (OD600=0,01)) wurden nun auf YPD-Platten verschiedener TTC (Trichothecin)-Konzentrationsstufen ausplattiert und deren Resistenzverhalten nach fünf Tagen beobachtet. Als Vergleichskontrolle wurden die Hefen auf eine YPD-Platte mit 200 ppm DON aufgetragen.
Als Nullkontrolle wurde eine YPD-Platte (0,4 % Aceton, 0,4 % Ethanol) verwendet. Diese Menge an Ethanol und Aceton entsprach jener Menge der beiden Komponenten, die in der höchsten Konzentrationsstufe (10 ppm) als Lösungsmittel für das Toxin enthalten war.
Die Doppelmutanten schienen generell schlechter zu wachsen als die Einfachmutanten. Je- doch waren die Doppelmutanten pARM8A49B, pARM34A49B und pARM34A14B alle um eine Konzentrationsstufe (Wachstum bis 0,9 ppm bis 1 ppm) resistenter als die Einzelmutanten. Die Resistenz der Doppelmutante pARM8A49B reichte bis in den 2 ppm-Bereich im Gegensatz zur Einfachmutante pARM49, die bei 2 ppm TTC nicht mehr wachsen kann.
Damit konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Doppelmutante scheinbar ein schlechteres Wachstum besitzt, diese resistenter gegenüber Trichothecen sind, als die Einzelmutanten.
SEQUENZPROTOKOLL < 110 > Adam Dr, Gerhard lnnovationsagentur < 120 > RPL3 < 130 > R35564 < 140 > < 141 > < 160 > 10 < 170 > Patentin Ver. 2.1 < 210 > 1 < 211 > 387 < 212 > PRT < 213 > Saccharomyces cerevisiae < 400 > 1
Met Ser His Arg Lys Tyr Glu Ala Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe 1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Arg Ala Ala Ser lle Arg Ala Arg Val Lys Ala Phe
20 25 30
Pro Lys Asp Asp Arg Ser Lys Pro Val Ala Leu Thr Ser Phe Leu Gly
35 40 45
Tyr Lys Ala Gly Met Thr Thr lle Val Arg Asp Leu Asp Arg Pro Gly
50 55 60
Ser Lys Phe His Lys Arg Glu Val Val Glu Ala Val Thr Val Val Asp
65 70 75 80
Thr Pro Pro Val Val Val Val Gly Val Val Gly Tyr Val Glu Thr Pro
85 90 95
<Desc/Clms Page number 15>
Arg Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Trp Ala Glu His Leu Ser Asp
100 105 110 Glu Val Lys Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Tyr Lys Ser Lys Lys Lys
115 120 125 Ala Phe Thr
Lys Tyr Ser Ala Lys Tyr Ala Gin Asp Gly Ala Gly Ile
130 135 140 Glu Arg Glu Leu Ala Arg lle Lys Lys Tyr Ala Ser Val Val Arg Val 145 150 155 160 Leu Val His Thr Gin lle Arg Lys Thr Pro Leu Ala Gin Lys Lys Ala
165 170 175 His Leu Ala Glu lle Gin Leu Asn Gly Gly Ser lle Ser Glu Lys Val
180 185 190 Asp Trp Ala Arg Glu His Phe Glu Lys Thr Val Ala Val Asp Ser Val
195 200 205 Phe Glu Gln Asn Glu Met Ile Asp Ala lle Ala Val Thr Lys Gly His
210 215 220 Gly Phe Glu Gly Val Thr His Arg Trp Gly Thr Lys Lys Leu Pro Arg 225 230 235 240 Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala cys lle Gly Ala Trp His
245 250 255 Pro Ala His Val Met Trp Ser Val Ala Arg Ala Gly Gin Arg Gly Tyr
260 265 270 His Ser Arg Thr Ser lle Asn His Lys lle Tyr Arg Val Gly Lys Gly
275 280 285 Asp Asp Glu Ala Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asp Arg Thr Lys Lys Thr
290 295 300 lle Thr Pro Met Gly Gly Phe Val His Tyr Gly Glu lle
Lys Asn Asp 305 310 315 320 Phe lle Met Val Lys Gly Cys Ile Pro Gly Asn Arg Lys Arg lle Val
325 330 335 Thr Leu Arg Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu
340 345 350 Glu Val Ser Leu Lys Trp lle Asp Thr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Gly
355 360 365 Arg Phe Gin Thr Pro Ala Glu Lys His Ala Phe Met Gly Thr Leu Lys
370 375 380
<Desc/Clms Page number 16>
Lys Asp Leu 385 < 210 > 2 < 211 > 29 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 2 aatgaattca gtggtaatgc aacagcaag 29 < 210 > 3 < 211 > 23 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Primer < 400 > 3 gacttcgtca gacaaatgtt cag 23 < 210 > 4 < 211 > 22 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 4 tgccaagaaa gactcacaga gg 22 < 210 > 5 < 211 > 32 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 5 aagaattctg ttgtatgtag ctaacaatac ta 32 < 210 > 6 < 211 > 34 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer
<Desc/Clms Page number 17>
< 400 > 6 accaagcttc aatcatgtct cacagaaagt acga 34 < 210 > 7 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 7 gcaccaatac aagcaacc 18 < 210 > 8 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Primer < 400 > 8 cactccacca gttgtcgt 18 < 210 > 9 < 211 > 17 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 9 ctggtagcac cgttagc 17 < 210 > 10 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:Primer < 400 > 10 caacggtgac agcttcga 18
PATENTANSPRÜCHE: 1. Ribosomales Protein L3 (RPL3), dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäurese- quenz an der Stelle Serin 2 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist.