DE60123401T2

DE60123401T2 - Gen 763 aus dem pflanzpathogenen pilz magnoporthe grisea und dessen verwendung zum nachweis neuer fungizide

Info

Publication number: DE60123401T2
Application number: DE60123401T
Authority: DE
Inventors: Marc-Henri Lebrun; Stephanie Sibuet; Marie-Pascale Latorse
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer SAS
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: WO2001075115A1; FR2807064B1; EP1268807A1; AU2001246640A1; FR2807064A1; DE60123401D1; US7070981B2; US20070122868A1; US20100022027A1; US7566547B2; ATE340858T1; US20040038359A1; EP1268807B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Gen 763, das für die Pathogenität des Pilzes unabdingbar ist. Die Erfindung betrifft Polynukleotide 763, Polypeptide 763, nichtmenschliche Wirtsorganismen, die ein Polypeptid 763 exprimieren, sowie deren Verwendung zur Identifikation von neuen antifungalen Molekülen.
Das Prinzip der Verwendung von Genen aus pathogenen Pilzen, und zwar ganz oder teilweise, in Tests für die Identifikation von neuen wirksamen Molekülen gegen diese Pilze ist als solches bekannt (in Antifungal Agents: Discovery and Mode of Action. Dixon GK, Coppong LG und Hollomon DW Hrsg., BIOS Scientific publisher Ldt, Oxford, Großbritannien) dazu stellt die Kenntnis des Genoms eines vorgegebenen pathogenen Pilzes einen wichtigen Schritt bei der Durchführung von solchen Tests dar. Allein die Kenntnis eines gegebenen Gens ist jedoch nicht ausreichend, um dieses Ziel zu erreichen, das als Ziel für eventuelle fungizide Moleküle gewählte Gen muß auch für den Pilz lebenswichtig sein, wobei seine Hemmung durch das fungizide Molekül den Tod des Pilzes zur Folge hat, oder essentiell für die Pathogenität des Pilzes sein, wobei seine Hemmung für den Pilz nicht lethal ist, jedoch einfach seine Pathogenität hemmt. Diese zweite Gruppe von möglichen Zielgenen für fungizide Moleküle ist für die Entwicklung einer neuen Generation von umweltfreundlicheren fungiziden Produkten besonders wichtig; sie wirkt spezifisch nur auf die Pathogenität von pathogenen Pilzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation und Klonierung des neuen Gens 763, das für die Pathogenität des Pilzes unabdingbar ist. Die Mutante 763 von Magnaporthe grisea, bei der dieses Gen inaktiviert ist, weist eine um 95% reduzierte Pathogenität auf. Das Gen 763 codiert für einen Transkriptionsfaktor, der ein Motiv des Typs bZIP umfaßt, das aus einem dominanten basischen sequenzspezifischen DNA-Bindungsmotiv und im Anschluß aus einem weiteren Motiv, das „Leucin-Zipper"-Motiv, das für die Dimerisierung erforderlich ist, anschließt, besteht. Dieses Motiv ist für eine enorme Familie von Proteinen, die die Expression von Genen regulieren, charakteristisch. Die Expression von Gen 763 wird während der Frühstadien der Infektion der Pflanze nachgewiesen. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von Gen 763 zum Identifizieren von neuen antifungalen Molekülen und die Verwendung von Gen 763 zum Identifizieren von anderen Genen, die an der pilzlichen Pathogenese beteiligt sind und deren Expression von 763 reguliert wird.
Einzelheiten zur Sequenzbeschreibung

SEQ ID No. 1: Gen 763 von Magnaporthe grisea
SEQ ID No. 2: cDNA von Gen 763 von Magnaporthe grisea
SEQ ID No. 3: Polypeptid 763 von Magnaporthe grisea
SEQ ID No. 4: cDNA von Gen 763 von Neurospora crassa
SEQ ID No. 5: Polypeptid 763 von Neurospora crassa

Beschreibung der Erfindung
Polynukleotide
Die vorwiegende Erfindung betrifft Polynukleotide, die ein pilzliches Gen 763 umfassen. Gen 763 kann aus phytopathogenen Pilzen wie zum Beispiel Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum und Venturia inaequalis isoliert werden. Vorteilhaft wird Gen 763 aus phytopathogenen Pilzen der Gattung Magnaporthe (Yu et al., 1999, Datei EMBL EBI, ACC Nr. AQ397193 15. März 1999; AQ449199 9. April 1991) isoliert. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Polynukleotide ein Gen 763 von Magnaporthe grisea. Vorzugsweise umfassen die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung die Codiersequenz eines Gens 763 von Magnaporthe grisea.
Der Begriff „Polynukleotide 763" beschreibt alle Polynukleotide der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise die Polynukleotide der genomischen Sequenz von 763, die Polynukleotide der cDNA-Sequenz von 763, sowie die Polynukleotide, die für die Polypeptide 763 der vorliegenden Erfindung codieren. Der Begriff „Polynukleotide 763" beschreibt auch rekombinante Polynukleotide, die diese Polynukleotide umfassen.
Erfindungsgemäß versteht man unter „Polynukleotid" eine Einzelstrang-Nukleotidkette oder die dazu komplementäre Kette oder eine Doppelstrang-Nukleotidkette, die den DNA- oder RNA-Typ aufweisen kann. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Polynukleotide den DNA-Typ, insbesondere den Doppelstrang-DNA-Typ, auf. Der Begriff „Polynukleotid" beschreibt auch modifizierte Polynukleotide und Oligonukleotide.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung werden aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert oder aufgereinigt. Vorzugsweise können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung mit Hilfe der traditionellen molekularbiologischen Techniken, wie sie von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989) beschrieben sind, oder mittels chemischer Synthese hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft Polynukleotide, die die genomische Sequenz von Gen 763 von Magnaporthe grisea gemäß SEQ ID NO 1 umfassen. Diese genomische Sequenz umfaßt 4 Exons (Positionen 723-770, 925-1194, 1273-1554, 1663-1778 der SEQ ID NO 1), 3 Introns (Positionen 771-924, 1195-1272, 1555-1662 von SEQ ID NO 1) sowie 5' und 3' Regulationssequenzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Polynukleotide der genomischen Sequenz von 763 ein Polynukleotid aus der Reihe der folgenden Polynukleotide:

a) das Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1,
b) ein Polynukleotid, das mindestens ein Exon gemäß SEQ ID No. 1 umfaßt;
c) ein Polynukleotid, das eine Kombination von Exons gemäß SEQ ID No. 1 umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Polynukleotid, das eine 5' oder 3' Regulationssequenz von Gen 763 aus Magnaporthe grisea umfaßt. In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Gen, das den Promoter von Gen 763 aus Magnaporthe grisea, dessen Sequenz zwischen Position 1 und Position 705 von SEQ ID No. 1 beinhaltet ist, umfaßt. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, das ein biologisch aktives Fragment des Promoters von Gen 763 aus Magnaporthe grisea, dessen Sequenz zwischen Position 1 und Position 705 von SEQ ID No. 1 beinhaltet ist, umfaßt.
Unter „biologisch aktivem Fragment" versteht man oben ein Polynukleotid mit einer Promoteraktivität, genauer gesagt mit einer Promoteraktivität in Pilzen. Die Techniken, mit denen die Promoteraktivität eines Polynukleotids ausgewertet werden können, sind dem Fachmann gut bekannt. Diese Techniken beinhalten traditionellerweise die Verwendung eines Expressionsvektors, der in Transkriptionsrichtung das zu testende Polynukleotid und ein Reportergen umfaßt (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).
Die Erfindung betrifft außerdem Polynukleotide, die die cDNA von 763 aus Magnaporthe grisea gemäß SEQ ID No. 2 umfassen. Die cDNA von Gen 763 aus Magnaporthe grisea umfaßt die Codiersequenz von Gen 763 sowie eine 5' UTR-Regulationssequenz und eine 3' UTR-Regulationssequenz. Die Erfindung betrifft insbesondere Polynukleotide, die die Codiersequenz von Gen 763 aus Magnaporthe grisea umfassen, wobei diese Sequenz zwischen Position 17 und Position 733 gemäß SEQ ID No. 2 beinhaltet ist.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf Polynukleotide, die ein Polynukleotid aus der Reihe der folgenden Polynukleotide enthalten:

a) das Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1
b) das Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 2
c) das Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 4
d) ein Polynukleotid, das zu einem Polynukleotid gemäß a) oder b) oder c) homolog ist;
e) ein Polynukleotid, das selektiv mit einem Polynukleotid gemäß a) oder b) oder c) hybridisieren kann.

Unter „homolog" versteht man erfindungsgemäß ein Polynukleotid, dessen Sequenz in bezug auf die Referenzsequenz eine oder mehrere Modifikationen aufweist. Bei diesen Modifikationen kann es sich um Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden der Referenzsequenz handeln. Vorteilhafterweise wird die Homologie in Prozent mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, vorzugsweise mindestens 98% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% in bezug auf die Referenzsequenz betragen. Die Verfahren zur Bestimmung und Identifikation von Homologien zwischen Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel können die Programme PILEUP oder BLAST (insbesondere Altschul et al., J. Mol. Evol. 36:290-300, 1993; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990; Altschul et al., NAR 25:3389-3402, 1997) verwendet werden. Vorzugsweise wird man die Standardparameter verwenden. Die Erfindung betrifft also Polynukleotide, die Polynukleotide mit mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, vorzugsweise mindestens 98% und am stärksten bevorzugt mindestens 99% Homologie mit den Polynukleotiden 763, den Polynukleotiden gemäß SEQ ID No. 1-2 oder den Polynukleotiden gemäß SEQ ID No. 4 aufweisen, umfassen. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, das ein Polynukleotid mit mindestens 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 Nukleotiden umfaßt, die mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, vorzugsweise mindestens 98%, am stärksten bevorzugt mindestens 99% Homologie mit den Polynukleotiden 763, den Polynukleotiden gemäß SEQ ID No. 1-2 oder den Polynukleotiden gemäß SEQ ID No. 4 aufweisen. Vorzugsweise ist bei den Polynukleotiden, die mit einem Referenzpolynukleotid homolog sind, die Funktion der Referenzsequenz konserviert.
Unter „Sequenz, die selektiv hybridisieren kann" versteht man erfindungsgemäß die Sequenzen, die mit der Referenzsequenz in einem Ausmaß, das signifikant stärker als das Rauschen ist, hybridisiert. Das Ausmaß des Signals, das aufgrund der Wechselwirkung zwischen der Sequenz, die selektiv hybridisieren kann, und der Referenzsequenz erzeugt wird, ist im allgemeinen 10mal, vorzugsweise 100mal intensiver als dasjenige der Wechselwirkung der anderen DNA-Sequenzen, die das Rauschen verursachen. Stringente Hybridisierungsbedingungen, die eine selektive Hybridisierung ermöglichen, sind dem Fachmann gut bekannt. Im allgemeinen liegt die Hybridisierungs- und Waschtemperatur mindestens 5°C unterhalb der Tm der Sequenzreferenz bei einem gegebenen pH-Wert sowie für eine gegebene Ionenstärke. Typischerweise beträgt die Hybridisierungstemperatur mindestens 30°C für ein Polynukleotid mit 15 bis 50 Nukleotiden und mindestens 60°C für ein Polynukleotid mit mehr als 50 Nukleotiden. Beispielsweise wird die Hybridisierung in dem folgenden Puffer durchgeführt: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, 500 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Die Waschschritte werden zum Beispiel nacheinander bei niedriger Stringenz in einem 2X SSC, 0,1% SDS-Puffer, bei mittlerer Stringenz in einem 0,5X SSC, 0,1% SDS-Puffer und bei hoher Stringenz in einem 0,1X SSC, 0,1% SDS-Puffer durchgeführt. Natürlich kann die Hybridisierung auch gemäß den anderen üblichen Verfahren, mit denen der Fachmann gut vertraut ist, durchgeführt werden (siehe insbesondere Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Die Erfindung betrifft daher Polypeptide, die ein Polynukleotid umfassen, das selektiv mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1-2 oder dem Polynukleotid von SEQ ID No. 4 hybridisieren kann. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, das ein Polynukleotid mit mindestens 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 Nukleotiden umfaßt und das selektiv mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1-2 oder dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 4 hybridisieren kann. Vorzugsweise ist bei den Polynukleotiden, die selektiv mit einem Referenzpolynukleotid hybridisieren können, die Funktion der Referenzsequenz konserviert.
Vorzugsweise ist bei den erfindungsgemäßen Polynukleotiden die Funktion von Gen 763 aus Magnaporthe grisea codiert und sie codieren für einen für die Pathogenität des Pilzes essentiellen Transkriptionsfaktor, der zu Beginn des Infektivitätsstadiums exprimiert wird.
Vorzugsweise komplementieren die erfindungsgemäßen Polynukleotide eine Mutante 763 aus Magnaporthe grisea und restaurieren deren Pathogenität für Reis und Gerste. Eine erfindungsgemäße Mutante 763 ist eine Magnaporthe-grisea-Mutante, in der das Gen 763 gemäß SEQ ID No. 1 mit Hilfe von Techniken, mit denen der Fachmann gut vertraut ist, inaktiviert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Allelvarianten oder Homologe von Gen 763 aus Magnaporthe grisea.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Identifikation und Klonierung von Genen aus anderen phytopathogenen Pilzen, die zu Gen 763 aus Magnaporthe grisea homolog sind. Vorzugsweise können diese homologen Gene aus einem phytopathogenen Pilz aus der Reihe Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum und Venturia inaequalis isoliert oder kloniert werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung eines Polynukleotids oder eines Polynukleotidfragments gemäß der erfindungsgemäßen SEQ ID No. 1 und der erfindungsgemäßen SEQ ID No. 2 für die Identifikation von homologen Genen in anderen phytopathogenen Pilzen. Die Techniken für die Klonierung von 763-homologen Genen bei anderen pflanzenpathogenen Pilzen sind dem Fachmann gut bekannt. Die Klonierung wird zum Beispiel durch Mustern von cDNA-Bibliotheken oder genomischen DNA-Bibliotheken mit einem Polynukleotid oder einem Polynukleotidfragment gemäß SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2 durchgeführt. Diese Banken können auch mit Hilfe von PCR durchmustert werden, und zwar unter Verwendung von spezifischen oder degenerierten Oligonukleotiden, die sich von der SEQ ID No. 1 oder der SEQ ID No. 2 ableiten. Die Techniken für die Konstruktion und Durchmusterung dieser Bibliotheken sind dem Fachmann gut bekannt (siehe insbesondere Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Phytophatogene pilzliche Gene 763 können mit Hilfe von SEQ ID No. 1-3 auch in den BLAST-Nukleotid- oder -Proteindateien identifiziert werden.
Vorzugsweise wird bei den klonierten Genen die Funktion von Gen 763 aus Magnaporthe grisea beibehalten, und sie codieren für einen Transkriptionsfaktor, der für die Pathogenität des Pilzes essentiell ist und der zu Beginn des Infektivitätsstadiums exprimiert wird. Die Sequenzen der klonierten Gene können auf bekannte Art und Weise analysiert werden, um festzustellen, daß sie für ein Polypeptid codieren, das ein Motiv des bZIP-Typs umfaßt, das ein dominantes basisches sequenzspezifisches DNA-Bindemotiv und im Anschluß daran ein anderes, sogenanntes „Leucin-Zipper"-Motiv, das für die Dimerisierung des Proteins erforderlich ist, umfaßt. Weiterhin sind die Techniken für die Feststellung, daß ein bekanntes Gen für die Pathogenität eines Pilzes essentiell ist, dem Fachmann bekannt. Das untersuchte Gen wird zum Beispiel in dem Pilz mit Hilfe von traditionellen molekularbiologischen Techniken inaktiviert; zu nennen ist insbesondere der Ersatz des Gens durch ein Makergen mittels homologer Rekombination. Die Verringerung der Pathogenität des Pilzes, der das inaktivierte Gen umfaßt, wird mit Hilfe von phänotypischen Tests analysiert. Vorzugsweise verursacht die Inaktivierung des homologen Gens eine Verringerung der Pathogenese von mindestens 95%. Die Techniken für die Analyse der Expression eines Gens in den verschiedenen Entwicklungsstadien des Pilzes, insbesondere zu Beginn einer Infektion, sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt. Typischerweise wird Gesamt-RNA oder mRNA (PolyA+) von den verschiedenen Entwicklungsstadien des Pilzes präpariert. Diese RNAs werde anschließend mittels RT-PCR oder Northern-Blot analysiert, um das Expressionsniveau des Gens zu bestimmen. Zur Feststellung, daß bei den Polynukleotiden der Erfindung die Funktion von Gen 763 aus Magnaporthe grisea konserviert ist, können auch andere Techniken verwendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Insbesondere zu nennen ist die Komplementierung von 763-Mutanten und anschließende Tests auf Restaurierung der Pathogenität des Pilzes.
Mit Hilfe einer BLAST-Suche in Dateien konnte ein Homolog von Gen 763 aus Magnaporthe grisea in Neurospora crassa identifiziert werden. Dieses neue Gen wurde mittels BLAST-Untersuchung von nichtannotierten genomischen Sequenzen identifiziert. Die cDNA dieses Neurospora-Gens 763 entspricht der SEQ ID No. 4, und das Neurospora-Polypeptid 763 entspricht SEQ ID No. 5.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Polynukleotide, die ein Polynukleotid umfassen, das für ein Polynukleotid aus der Reihe der folgenden Polynukleotide codiert:

a) das Polypeptid gemäß SEQ ID No. 3;
b) das Polypeptid gemäß SEQ ID No. 5;
c) ein Polypeptid, das zu einem Polypeptid gemäß
a) oder b) homolog ist;
d) ein biologisch aktives Fragment eines Polypeptids gemäß a) oder b).

Polypeptide
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide 763 eines phytopathogenen Pilzes, insbesondere aus Magnaporthe grisea. Der Begriff „Polypeptide 763" bezeichnet die Gesamtheit der Polypeptide der vorliegenden Erfindung sowie die Polypeptide, für die die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung codieren. Der Begriff „Polypeptide 763" bezeichnet auch Fusionsproteine, rekombinante Proteine oder Chimäre Proteine, die diese Polypeptide umfassen. In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff „Polypeptid" sowohl Proteine und Peptide als auch modifizierte Polypeptide.
Die Polypeptide der Erfindung werden aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert oder aufgereinigt. Die Polypeptide können mit Hilfe von verschiedenen Verfahren präpariert werden. Bei diesen Verfahren handelt es sich insbesondere um die Aufreinigung aus natürlichen Quellen, wie Zellen, die diese Polypeptide auf natürliche Art und Weise exprimieren, die Produktion von rekombinanten Polypeptiden durch geeignete nichtmenschliche Wirtszellen, und ihre anschließende Aufreinigung, Herstellung durch chemische Synthese oder schlußendlich eine Kombination dieser verschiedenen Ansätze. Diese verschiedenen Vorgehensweisen der Herstellung sind dem Fachmann gut bekannt. So können die Polypeptide 763 der vorliegenden Erfindung aus Pilzen isoliert werden, die Polypeptide 763 exprimieren. Vorzugsweise werden die Polypeptide 763 der vorliegenden Erfindung aus rekombinanten nichtmenschlichen Wirtsorganismen isoliert, die ein heterologes Polypeptid 763 exprimieren. Diese Organismen stammen vorzugsweise aus der Reihe der Bakterien, der Hefen, der Pilze, der tierischen Zellen oder der Insektenzellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das ein Polypeptid 763 aus Magnaporthe grisea gemäß SEQ ID No. 3 umfaßt. Die Erfindung betrifft auch Polypeptide, die ein biologisch aktives Fragment oder ein Homolog von Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 3 umfassen.
In einer anderen Ausführungsform ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das ein Polypeptid 763 aus Neurospora crassa gemäß SEQ ID No. 5 umfaßt. Die Erfindung betrifft auch Polypeptide, die ein biologisch aktives Fragment oder ein Homolog von Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 5 umfassen.
Der Begriff „Fragment" eines Polypeptids bezeichnet ein Polypeptid, das einen Teil des Polypeptids, jedoch nicht das gesamte Polypeptid, von dem es abstammt, umfaßt. Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das ein Fragment von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200 Aminosäuren eines Polypeptids gemäß SEQ ID No. 3 umfaßt.
Der Begriff „biologisch aktives Fragment" bezeichnet ein Fragment eines Polypeptids, bei dem die Funktion des Polypeptids, von dem es abstammt, konserviert ist. So ist bei den biologisch aktiven Fragmenten des Polypeptids gemäß SEQ ID No. 3 die Funktion von Polypeptid 763 aus Magnaporthe grisea konserviert. Diese biologisch aktiven Fragmente weisen also eine Aktivität eines in Pilzen funktionellen Transkriptionsfaktors auf. Vorzugsweise ist diese Aktivität für die Pathogenität des Pilzes essentiell.
Der Begriff „Homolog" bezeichnet ein Peptid, das eine Deletion, eine Addition oder eine Substitution von mindestens einer Aminosäure aufweisen kann. Gegenstand der Erfindung ist ein Polypeptid mit mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, vorzugsweise mindestens 99% identischen Aminosäuren mit einem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 3 oder gemäß SEQ ID No. 5. Die Verfahren zur Messung und Identifikation von Homologien zwischen Polypeptiden oder Proteinen sind dem Fachmann bekannt. So kann man zum Beispiel für die Berechnung der Homologien das Software-Paket UWGCG und das Programm BESTFITT verwenden (Devereux et al., Nucleic Acid Res. 12, 387-395, 1984). Vorzugsweise werden die Standard-Parameter verwendet.
Vorzugsweise ist bei diesen homologen Polypeptiden die gleiche biologische Aktivität wie Polypeptid 763 aus Magnaporthe grisea gemäß SEQ ID No. 3 konserviert. Es wird bevorzugt, daß diese Polypeptide also eine pilzliche Transkriptionsfaktoraktivität aufweisen.
Es wird bevorzugt, daß diese Aktivität für die Pathogenität des Pilzes essentiell ist. In einer bevorzugten Ausführungsform können die homologen Polypeptide aus phytopathogenen Pilzen isoliert werden. Vorzugsweise werden diese Polypeptide in den phytopathogenen Pilzen zu Beginn der Infektion der Pflanze exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Fusionspolypeptid, das ein wie oben beschriebenes Polypeptid 763 in Fusion mit einem Reporterpolypeptid umfaßt. Das Reporterpolypeptid ermöglicht den raschen Nachweis der Expression eines Polypeptids 763 in einem Pilz oder in einem anderen nichtmenschlichen Wirtsorganismus. Unter den Polypeptiden, die so mit einem Polypeptid 763 fusioniert sein können, sind insbesondere GFP („green fluorescent protein") und das Protein GUS (β-Glucuronidase) zu nennen. Diese Fusionsproteine und ihre Konstruktionen sind dem Fachmann gut bekannt.
Expressionskassetten, Vektoren und nichtmenschliche Wirtsorganismen
Gen 763 kann in verschiedenen nichtmenschlichen Wirtsorganismen, wie Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen Zellen oder Insektenzellen exprimiert werden. Gen 763 kann in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus unter der Kontrolle des 763-Promoters der vorliegenden Erfindung oder unter Kontrolle eines heterologen Promoters exprimiert werden.
Expressionskassetten
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid 763 codiert, mit Hilfe von Klonierungstechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, in eine Expressionskassette insertiert. Diese Expressionskassette umfaßt die für die Transkription und Translation von Sequenzen, die für Polypeptid 763 codieren, erforderlichen Elemente. Diese Expressionskassette umfaßt sowohl Elemente für die Produktion eines Polypeptids 763 durch eine nichtmenschliche Wirtszelle, als auch Elemente, die für die Regulation dieser Expression erforderlich sind. In einer ersten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in Transkriptionsrichtung einen in einer nichtmenschlichen Wirtsorganismus funktionellen Promoter, Gen 763 oder die Codiersequenz von Gen 763 und eine Terminatorsequenz in dem nichtmenschlichen Wirtsorganismus. Vorteilhafterweise umfaßt die Expressionskassette in Transkriptionsrichtung einen in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus funktionellen Promoter, ein Polynukleotid aus der Reihe der folgenden Polynukleotide:

a) ein Polynukleotid, das für Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 3 oder für ein biologisch aktives Fragment von Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 3 codiert;
b) ein Polynukleotid, dessen Sequenz zwischen Position 17 und Position 733 gemäß SEQ ID No. 2 beinhaltet ist;
c) ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1;
d) ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 2
e) ein Polynukleotid, das für Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 5 oder für ein biologisch aktives Fragment von Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 5 codiert;
f) ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 4;
g) ein Polynukleotid, das zu einem Polynukleotid gemäß b), c), d) oder f) homolog ist;
h) ein Polynukleotid, das spezifisch mit einem Polynukleotid gemäß b), c), d) oder f) hybridisieren kann; und eine Terminatorsequenz in diesem nichtmenschlichen Wirtsorganismus.

In den erfindungsgemäßen Expressionskassetten kann jegliche Art von Promotersequenz verwendet werden. Die Wahl des Promoters wird insbesondere von dem nichtmenschlichen Wirtsorganismus, der für die Expression des interessierenden Gens gewählt wird, abhängen. Mit gewissen Promotern ist eine konstitutive Expression möglich, während im Gegensatz dazu andere Promotern induzierbar sind. Zu den in Pilzen funktionellen Promotern sind insbesondere der Promoter der Glyceraldehyd-3-phosphat-Deshydrogenase aus Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genet. 15: 177-180, 1989) zu nennen. Unter den in Bakterien funktionellen Promotern ist insbesondere der Promoter der RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 zu nennen (Studier et al., Methods in enzymology 185: 60-89, 1990). Unter den in Hefe funktionellen Promotern ist insbesondere der Promoter des Gall-Gens (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88: 1731-1735, 1991) oder der GAL4- und der ADH-Promoter aus S.cerevisiae zu nennen. Unter den in Insektenzellen funktionellen Promotern ist insbesondere der Polyhydrinpromoter des Baculovirus AcMNPV zu nennen (Weyer et al., J. Gene. Virol. 72: 2967-2974, 1991). Unter den in tierischen Zellen funktionellen Promotern sind insbesondere der Metallothioneinpromoter und der Virus- und Adenoviruspromoter zu nennen. Alle diese Promoter sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann gut bekannt.
Der 763-Promoter kann für die Expression eines heterologen Gens in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus, insbesondere in Pilzen, verwendet werden. Gegenstand der Erfindung sind daher auch Expressionskassetten, die den Promoter eines Gens 763 in operativer Verknüpfung mit einer Codiersequenz für ein heterologes Protein umfassen, wodurch die Expression dieses Proteins in den Pilzen ermöglicht wird. Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Expressionskassette in Transkriptionsrichtung ein Polynukleotid, dessen Sequenz zwischen Position 1 und Position 705 gemäß SEQ ID No. 1 beinhaltet ist, oder ein biologisch aktives Fragment des Polynukleotids, dessen Sequenz zwischen Position 1 und Position 705 gemäß SEQ ID No. 1 beinhaltet ist, wobei die Sequenz für ein heterologes Polypeptid und eine in Pilzen funktionale Terminatorsequenz codiert. Jedes interessierende Gen kann in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus unter der Kontrolle eines 763-Promoters exprimiert werden. Vorzugsweise wird der 763-Promoter für die Expression eines heterologen Gens in Pilzen verwendet. Die Aktivität des 763-Promoters unter unterschiedlichen Bedingungen kann mit Hilfe eines Reportergens, wie dem GUS-Reportergen (β-Glucuronidase), dem GFP-Reportergen („green fluorescent protein"), dem LUC-Reportergen (Luciferase), dem CAT-Reportergen (Chloramphenicol-Transferase) oder dem β-Galactosidase-Reportergen (lacZ) ausgewertet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der 763-Promoter funktionell mit der Codiersequenz eines Markergens verknüpft. Die Expression des Markergens ermöglicht die Selektion von transformierten Organismen aufgrund ihrer Resistenz gegen z.B. Antibiotika oder Herbizide. Zu nennen sind insbesondere die Codiersequenzen für ein Gen für Toleranz gegenüber einem Antibiotikum oder einem Herbizid, wie die Gene für Resistenz gegen Hygromycin (hph: Punt et al., 1987), gegen Phleomiycin (ble: Drocourt, 1990) oder gegen das Herbizid Bialaphos (Bar: Pall et Brunelli, 1993).
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können weiterhin jegliche sonstige Sequenz umfassen, die für die Expression von Gen 763 oder für die Expression des heterologen Gens, wie zum Beispiel Regulationselemente oder Signalsequenzen für die Zielsteuerung des Polypeptids 763, erforderlich sind. Insbesondere kann jede beliebige Regulationssequenz verwendet werden, die es ermöglicht, das Expressionsniveau der Codiersequenz, die in diese Expressionssequenz insertiert ist, zu verstärken. Erfindungsgemäß kann man insbesondere andere Regulationssequenzen, die zwischen dem Promoter und der Codiersequenz liegen, wie Transkriptionsaktivatoren (Enhancer) in Kombination mit der Promoterregulationssequenz verwenden. Als Signal für die Zielsteuerung an Membranen in den nichtmenschlichen Wirtsorganismen ist insbesondere das bakterielle Protein-A-Signal zu nennen (Nilsson et al., Methods in Enzymology 198: 3, 1991).
Für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können verschiedenste Terminatoren verwendet werden, wobei die Sequenzen die Termination der Transkription und Polyadenylierung der mRNA ermöglichen. Es kann jede Terminatorsequenz verwendet werden, die in dem gewählten nichtmenschlichen Wirtsorganismus funktional ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polynukleotid, das eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt; vorteilhaft sind die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in einem Vektor insertiert.
Vektoren
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Replikations- oder Expressionsvektoren für die Transformation eines nichtmenschlichen Wirtsorganismus, die mindestens ein Polynukleotid 763 oder eine Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung umfassen. Dieser Vektor kann insbesondere aus einem Plasmid, einem Cosmid, einem Bakteriophagen oder einem Virus bestehen, in das bzw. den ein Polynukleotid 763 oder eine Expressionskassette der vorliegenden Erfindung insertiert ist. Die Techniken für die Konstruktion solcher Vektoren und für die Insertion eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in diese Vektoren sind dem Fachmann gut bekannt. Im allgemeinen kann jeder beliebige Vektor verwendet werden, der sich in einer nichtmenschlichen Wirtszelle erhalten, replizieren oder vermehren kann, insbesondere um die Expression eines Polynukleotid oder Polypeptids zu induzieren. Vorteilhaft umfassen die erfindungsgemäßen Vektoren mindestens einen Replikationsursprung, um in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus replizieren zu können. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Vektoren auch mindesten einen Selektionsmarker wie ein Gen für Resistenz gegen ein Antibiotikum. Insbesondere zu nennen sind Vektoren wie pBluescript (Stratagene, la Jolla, Ca), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, Ca) sowie Expressionsvektoren, die sich von Baculoviren ableiten, wie diejenigen, die vom Autographica californica-Polyedervirus (AcMNPV) abstammen. Ein bevorzugtes System, bei dem ein Baculovirus und eine Insektenzelle kombiniert werden, ist das System Baculovirus pV111392/Sf21-Zellen (Invitrogen, la Jolla, Ca). Für die Expression in tierischen Zellen verwendet man insbesondere Vektoren, die sich vom Adenovirus ableiten. Der Fachmann wird geeignete Vektoren insbesondere in Abhängigkeit von der zu transformierenden nichtmenschlichen Wirtszelle und in Abhängigkeit von der verwendeten Transformationsmethode auswählen. Die Methoden zur Transformation von nichtmenschlichen Wirtszellen sind dem Fachmann gut bekannt (Inoue et al., Gene 96: 23-28, 1990; Fincham, Microbiological Reviews 53: 148-170, 1989).
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung werden insbesondere für die Transformation eines nichtmenschlichen Wirtsorganismus zwecks Replikation des Vektors und/oder Expression eines Polypeptids 763 in diesem nichtmenschlichen Wirtsorganismus verwendet. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids M763, das die folgenden Schritte umfaßt:

– Transformieren eines nichtmenschlichen Wirtsorganismus mit einem Expressionsvektor, der eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt,
– Isolieren der Polypeptide M763, die von dem nichtmenschlichen Wirtsorganismus produziert werden.

Die von einem mit einem Polynukleotid transformierten nichtmenschlichen Wirtsorganismus produzierten rekombinanten Polypeptide 763 können nach Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, aufgereinigt oder isoliert werden. Die Polypeptide M763 können in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus in Form von Fusionsproteinen exprimiert werden. Insbesondere zu nennen sind die pGEX-Vektoren für die Expression von Fusionsproteinen mit der Glutathion-S-Transferase (GTS). Diese Fusionsproteine werden leicht mittels Absorption an Glutathion-Agaroseperlen aufgereinigt. Die GST-Gruppe kann anschließend durch Spaltung mit Protease Xa entfernt werden. Dem Fachmann sind auch andere Systeme für die Expression und die Aufreinigung von Fusionsproteinen bekannt.
Nichtmenschliche Wirtsorganismen
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Transformation eines nichtmenschlichen Wirtsorganismus durch Integration von mindestens einem Polynukleotid 763 oder einer Expressionskassette oder eines Vektors der Erfindung in diesem nichtmenschlichen Wirtsorganismus. Das Polynukleotid kann in das Genom des nichtmenschlichen Wirtsorganismus integriert sein oder in dem nichtmenschlichen Wirtsorganismus stabil replizieren. Die Verfahren zur Transformation von nichtmenschlichen Wirtsorganismen sind dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der Literatur beschrieben (Inoue et al., Gene 96: 23-28, 1990; Fincham, Microbiological Reviews 53: 148-170, 1989).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen mit einem Polynukleotid 763, einer Expressionskassette oder einem Vektor der Erfindung transformierten nichtmenschlichen Wirtsorganismus. Unter nichtmenschlichen Wirtsorganismus versteht man erfindungsgemäß insbesondere jeglichen ein- oder mehrzelligen niedrigen oder höheren Organismus, insbesondere aus der Reihe der Bakterien, Hefen, Pilze, tierischen Zellen und Insektenzellen. Vorteilhafterweise stammen die Bakterien aus der Reihe Escherichia coli und Bacillus subtilis, die Hefe aus der Reihe Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellen aus der Reihe Spodoptera frugiperda und Drosophila melanogaster, und die tierischen Zellen aus der Reihe der CHO-, HeLa- und COS-Zellen.
Die Techniken für die Konstruktion von Vektoren, für die Transformation von nichtmenschlichen Wirtsorganismen und für die Expression von heterologen Proteinen in diesen Organismen sind ausführlich in der Literatur beschrieben (Ausubel F.M. et al., „Current Protocols in Molecular Biology" Band 1 und 2, Greene Publishing Associates und Wiley -Interscience, 1989; T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, A laboratory Handbook, 1982).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Polynukleotide 763 und der Polypeptide 763 für die Identifikation von Genen, die an der Pathogenität von Pilzen beteiligt sind, oder für die Identifikation von neuen fungiziden Molekülen, die die pilzliche Pathogenität hemmen.
Hemmung der pilzlichen Pathogenität
Pilze, in denen Gen 763 inaktiviert oder inhibiert ist, weisen eine um 95% reduzierte Pathogenität auf. Die Erfindung betrifft Verfahren zur Hemmung der Pathogenität von Pilzen durch Inaktivierung oder Hemmung der Expression von Gen 763. Die Pilze stammen vorzugsweise aus der Reihe Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum und Venturia inaequalis.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung Verfahren zur Hemmung der Pathogenität eines Pilzes, wobei diese Verfahren die Hemmung der Expression eines Polypeptids 763 gemäß der Erfindung in diesem Pilz oder die Hemmung der biologischen Aktivität eines Polypeptids 763 gemäß der vorliegenden Erfindung in diesem Pilz umfassen. Vorzugsweise betrifft diese Hemmung spezifisch die Expression von Gen 763 und die biologische Aktivität von Polypeptid 763. Die Erfindung betrifft daher nicht die allgemeine Hemmung der Genexpression in dem Pilz. Es ist jedoch klar, daß die Hemmung der Expression von Gen 763 zur Hemmung von anderen Genen führen kann.
Zur Hemmung der Pathogenität von Pilzen durch Hemmung der Expression von Gen 763 in diesen Pilzen können verschiedene Verfahren angewandt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Gen 763 durch Insertionsmutagenese oder durch homologe Rekombination (Genersatztechniken bzw. „knock out"-Techniken) inaktiviert. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Expression eines Polypeptids 763 durch die Expression eines Antisense-Polynukleotids von Gen 763 in diesen Pilzen gehemmt. In einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird die Expression von Gen 763 durch eine Hemmstoffverbindung gehemmt.
Das Expressionsniveau eines Polynukleotids 763 oder eines Polypeptids 763 in Pilzen kann nach Verfahren bestimmt werden, die in der Literatur beschrieben sind. Insbesondere zu nennen sind Northern-Blot-PCR sowie DNA-Arrays (DNA-Chips) für Polynukleotide und Western- Blot für Polypeptide. Diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt.
Identifikation von neuen Molekülen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen
Die Inaktivierung von Gen 763 bei Magnaporthe grisea, einem reispathogenen Pilz, führt zu einer 95%igen Verringerung der Pathogenität dieses Pilzes. Außerdem konnten homologe Gene bei anderen Pilzen identifiziert werden. Verbindungen, die die Expression von Gen 763 oder die Aktivität von Polypeptid 763 bei Pilzen hemmen, können also zur Hemmung der Pathogenität von Pilzen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft also Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren einen Schritt der Identifikation einer Verbindung, die spezifisch die Expression eines Polynukleotids 763 in diesem Pilz hemmt, oder einen Schritt der Identifikation einer Verbindung, die die Expression eines Polypeptids 763 in diesem Pilz hemmt, oder einen Schritt der Identifikation einer Verbindung, die die biologische Aktivität eines Polypeptids 763 in diesem Pilz hemmt, umfaßt.
Vorzugsweise stammen die Pilze aus der Reihe Botrytis cinerea, Mycosphaerella graminicola, Stagnospora nodorum, Blumeria graminis, Colleotrichum lindemuthianum, Puccinia graminis, Leptosphaeria maculans, Fusarium oxysporum, Fusarium gramineaum und Venturia inaequalis.
So können die Polynukleotide 763, die Polypeptide 763, die Vektoren und die nichtmenschlichen Wirtsorganismen der vorliegenden Erfindung in unterschiedlichen Screening-Tests für die Identifikation von neuen antifungalen Verbindungen verwendet werden.
Identifikation von Hemmern, die an Protein 763 binden Moleküle, die die Aktivität von Polypeptid 763 direkt hemmen, könnten die Pathogenität des Pilzes hemmen und zur Entwicklung von neuen Fungiziden führen.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

– In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem Polypeptid 763, und
– Nachweisen der Bindung dieser Verbindung an das Polypeptid; und vorzugsweise umfaßt das Verfahren auch einen Schritt, in dem man bestimmt, ob die Verbindung die Pathogenität von Pilzen hemmt.

In den erfindungsgemäßen Verfahren kann jegliche Methode, mit der ein Polypeptid 763 hergestellt oder aufgereinigt oder isoliert werden kann, verwendet werden.
Vorzugsweise wird das Polypeptid 763 in einem heterologen Expressionssystem (zum Beispiel Bakterien, Hefe, tierische Zelle oder Insektenzelle) mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Polynukleotid 763 exprimiert; mit Hilfe der vereinfachten Aufreinigung des Polypeptids 763 kann man anschließend neue Moleküle, die an das Protein 763 binden, modifizieren. Diese Moleküle werden nach Verfahren identifiziert, mit denen der Fachmann wohlvertraut ist, insbesondere mit Verfahren zum physischen Nachweisen der Bindung der Prüfverbindungen an das Protein 763 (BIACORE-System; Karlson & al., J. of Biomolecular Interaction Analysis, special issue Drug Discovery: 18-22).
Identifikation von Hemmern von Regulatoren der Expression von Gen 763
Moleküle, die die Expression des Gens 763 hemmen, können auch die Pathogenität des Pilzes hemmen und zur Entwicklung von neuen Fungiziden führen. In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Hemmung der Expression von Gen 763" die Hemmung der Expression eines Polynukleotids 763 sowie die Hemmung der Expression eines Polypeptids 763 in den nichtmenschlichen Wirtsorganismen, vorzugsweise in phytopathogenen Pilzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

– In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus, der mit einem Polynukleotid oder einem Vektor der Erfindung so transformiert ist, daß dieser nichtmenschliche Wirtsorganismus ein Reportergen unter der Kontrolle des Promoters von Gen 763 exprimiert; und
– Nachweisen der Hemmung der Expression des Reportergens.

Vorzugsweise umfaßt das Verfahren auch einen Schritt, in dem bestimmt wird, ob die Verbindung die Pathogenität des Pilzes hemmt.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung umfassend den 763-Promoter in Assoziation mit der Codiersequenz eines Reportergens (zum Beispiel GUS oder GFP) ermöglicht es, die Promoteraktivität des 763-Promoters in einer pilzlichen Zellen oder in einer nichtmenschlichen Wirtszelle: zu messen. Mit diesem Verfahren können Verbindungen identifiziert werden, die die Aktivität des 763-Promoters hemmen und dadurch die Expression des Gens 763 auf Transkriptionsebene hemmen. Ein rekombinierter Stamm, der das oben genannte Gen umfaßt, wird also dazu verwendet, um Moleküle zu identifizieren, die die Expression von Gen 763 hemmen, was sich darin ausdrückt, daß die Expression des Reporterproteins des rekombinierten Stamms unter Bedingungen für die Expression von Gen 763 gehemmt werden. Diese Art von Test ist dem Fachmann gut bekannt und in der Literatur beschrieben, insbesondere bei Axiotis et al. (1995. S. 1-7 in Antifungal Agents: Discovery and Mode of Action. Dixon GK, Coppong LG und Hollomon DW Hrsg., BIOS Scientific publisher Ltd, Oxford, Großbritannien).
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

– In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus, der mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist, wobei der nichtmenschliche Wirtsorganismus ein Polypeptid 763 exprimiert; und
– Nachweisen der Hemmung der Expression des Polypeptids 763.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polypeptid 763 um ein Fusionspolypeptid, das ein Reporterpolypeptid wie GUS oder GFP umfaßt, dessen Expression leicht zu messen ist. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren auch einen Schritt, in dem bestimmt wird, ob die Verbindung die Pathogenität von Pilzen hemmt. Mit diesem Verfahren können Verbindungen identifiziert werden, die die Expression von Gen 763 auf Transkriptions- oder auf Translationsebene hemmen. Solch ein rekombinierter Stamm, der ein Polypeptid 763, vorzugsweise Polypeptid 763 in Fusion mit einem Reporter, exprimiert, wird also dazu verwendet, um Moleküle zu identifizieren, die die Expression von Gen 763 hemmen, was sich in einer Hemmung der Expression des Polypeptids 763 des rekombinierten Stamms unter den Bedingungen der Expression von Gen 763 ausdrückt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmt und die mit der Expression von Gen 763 gekoppelt ist, wobei das Verfahren darin besteht, daß man mit einer Verbindung oder einer Mischung von Verbindungen einen geeigneten Test für die Identifikation von Hemmstoffverbindungen der Pathogenität des Pilzes durchführt und diejenigen Verbindungen, die in diesem Test positiv reagieren, auswählt und gegebenenfalls isoliert und anschließend identifiziert.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem geeigneten Test um einen wie oben beschriebenen Test.
Vorzugsweise wird eine nach diesen Vorgehensweisen identifizierte Verbindung anschließend auf die antifungalen Eigenschaften sowie auf ihre Fähigkeit, die Pathogenität des Pilzes für Pflanzen zu hemmen, nach Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, getestet. Vorzugsweise wird die Verbindung mit Hilfe von phänotypischen Tests wie Pathogenitätstests an Blättern oder an ganzen Pflanzen durchgeführt.
Erfindungsgemäß versteht man unter dem Begriff „Verbindung" jegliche chemische Verbindung oder Mischung von chemischen Verbindungen, darunter auch Peptide und Proteine.
Unter Mischung von Verbindungen versteht man erfindungsgemäß mindestens zwei unterschiedliche Verbindungen, wie zum Beispiel die (Dia-) Stereoisomere eines Moleküls, Mischungen natürlichen Ursprungs, die durch Extraktion von biologischem Material (Pflanzen, pflanzlichem Gewebe, Bakterienkulturen, Hefe- oder Pilzkulturen, Insekten, tierischen Geweben usw.) erhalten werden, oder nicht aufgereinigte bzw. ganz oder teilweise aufgereinigte Reaktionsmischungen, oder auch Mischungen von Produkten, die mit Hilfe der kombinatorischen Chemie erhalten werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch neue Verbindungen, die die pilzliche Pathogenität, die mit der Expression von Gen 763 gekoppelt ist, hemmen, insbesondere die Verbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden und/oder die Verbindungen, die von Verbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden, abstammen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen, die mit der Expression von Gen 763 gekoppelt ist, hemmen, nicht um allgemeine Enzymhemmstoffe. Ebenfalls bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Verbindungen nicht um Verbindungen, von denen bereits bekannt ist, daß sie eine fungizide Aktivität und/oder eine Aktivität auf die Pathogenität von Pilzen aufweisen.
Mit Hilfe der folgenden Beispiele kann die Erfindung nun erläutert werden, ohne dabei jedoch ihren Umfang einzuschränken.
Alle unten in diesen Beispielen angegebenen Vorgehensweisen oder Verfahren sind beispielhaft und entsprechen einer Auswahl aus den unterschiedlichen Verfahren, die verfügbar sind, um zum gleichen Ergebnis zu gelangen. Diese Auswahl hat keinen Einfluß auf die Qualität des Ergebnisses, und es kann daher vom Fachmann jegliches beliebiges Verfahren verwendet werden, um zum gleichen Ergebnis zu gelangen. Die meisten Methoden zur Rekombination von DNA-Fragmenten sind in „Current Protocols in Molecular Biology" Band 1 und 2, Ausubel F.M. et al., Hrsg. Greene Publishing Associates und Wiley-Intersience (1989), oder in Molecular cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982) beschrieben. Die pilzspezifischen Verfahren sind bezüglich der verwendeten Vektoren für die Transformation von Pilzen bei Sweigard et al. (Fungal Genetics Newletter, 44: 52-53, 1997), bezüglich der Konstruktion einer Cosmidbibliothek bei Orbach (Gene 150: 159-162, 1994), für die Herstellung von pilzlicher genomischer DNA bei Sweigard et al. (Fungal Genetics Newletter, 37: 4-5, 1990), sowie bei Agnan et al. (Fungal Genetics and Biology 21: 292-301, 1997) beschrieben.
Beschreibung der Abbildung
1: Autoradiogramm der Hybridisierung, mit einer Sonde pAN7.1, des Transfers von genomischen DNA-Spaltungen der Mutante 763 auf Nylonmembranen (E:EcoRI; A: ApaI; C: ClaI; K: KpnI)
2: „Plasmid rescue" bei der Mutante 763. Genomische DNA der Mutante 763 (fettgedruckt) und Insertionsstelle des Plasmids. Die Lage der EcoRI- und der KpnI-Stelle auf der genomischen DNA ist willkürlich.
3: Insertionsstelle des Plasmids pAN7.1 und BglII-Xho2-Restriktionsfragment (6 kB), das die Mutante m763 komplementiert. Die Lage der genomischen Sonde (0,4 kB) aus PRK763 ist fettgedruckt angegeben. Die Pfeile geben die Lage der PCR-Primer für die Amplifikation der Insertionsstelle des Plasmids im Wildtypstamm an. Die Insertionsstelle des Plasmids pAN7.1 ist ebenfalls angegeben.
4: Identifikation einer basischen „Leucin-Zipper"-Domäne. Durch „Alignment" der Sequenz von Protein 763 mit den Sequenzen der Transkriptionsfaktoren YAP-1 und GCN4 aus Saccharomyces cerevisiae sowie MEAB aus Aspergillus nidulans erhaltener Konsensus. Diese Domäne umfaßt eine basische Domäne (A) und eine „Leucin-Zipper"-Domäne als solche (B).
5: Durch „Alignment" der Sequenz von Protein 763 aus Magnaporthe grisea mit den Sequenzen der Transkriptionsfaktoren YAP-1 und GCN4 aus Saccharomyces cerevisiae sowie CPC-1 aus Neurospora crassa erhaltener Konsensus.
6: Autoradiogramme der Hybridisierung, mit einer Sonde, die aus der cDNA von Gen 763 besteht, mit Southern-Membranen der Amplifikationsprodukte mittels Raumtemperatur-PCR und nested-PCR der mRNA dieses Gens unter verschiedenen Bedingungen.
7: „Alignment" des Proteins 763 aus Magnaporthe grisea und des homologen Proteins aus Neurospora crassa.
Das Alignment wurde mit Hilfe des Programms clustal-W durchgeführt.

(*: identische Aminosäuren)

BEISPIELE
Die Strategie, die verwendet wurde, um zur Identifikation und Charakterisierung von Gen 763, das für die Pathogenität von Magnaporthe grisea essentiell ist, zu gelangen, umfaßte zwei Hauptpunkte:

1) Die Inaktivierung eines für die Pathogenität essentiellen Gens durch zufallsmäßige Insertion eines Fremd-DNA-Fragments in seine Nukleotidsequenz (Insertionsmutagenese).
2) Wiedergewinnung und Charakterisierung der so modifizierten pilzlichen Nukleotidsequenz sowie Nachweis dafür, daß diese an der Pathogenität des Pilzes bei Reis und Gerste beteiligt ist.

Bei den erfolgreich durchzuführenden Verfahrensschritten handelt es sich um folgende:

1) Gewinnung einer Sammlung von pilzlichen Isolaten, die zufallsmäßig ein Fremd-DNA-Fragment in ihr Genom integriert haben (Transformanten). In diesem Fall handelt es sich bei der Fremd-DNA um ein Plasmid, das das hph-Gen aus Escherichia coli umfaßt, was ihre Selektion auf der Basis der Hygromycinresistenz gestattet. Dieses wurde in das Genom des Pilzes durch Protoplasten-Transformation eingeführt.
2) Suche nach Transformanten, die für Reis und Gerste nicht pathogen sind, innerhalb der Sammlung (Pathogenitätsmutanten). Das für die nicht-Pathogenität einer Transformante verwendete Kriterium war die Unfähigkeit, nach Inokulation von Sporen dieser Transformante auf Reis- und Gerstenpflanzen Blattläsionen zu verursachen.
3) Genetischer Nachweis der Inaktivierung eines Pathogenitätsgens durch das Plasmid bei denjenigen Mutanten, die nicht zur Infektion von Reis und Gerste fähig sind. Dabei erstellte man eine vollständige genetische Kopplung zwischen dem Merkmal Hygromycinresistenz, das das Vorliegen des Plasmids im Genom der Mutante widerspiegelt, und dem Merkmal der nicht-Pathogenität, das die Inaktivierung eines Gens, das für die Infektiosität des Pilzes essentiell ist, widerspiegelt. Das Ausmaß dieser Kopplung wurde durch Spaltungsanalyse der Merkmale Hygromycinresistenz und nicht-Pathogenität bei der Nachkommenschaft einer Kreuzung zwischen der untersuchten Mutante und einem Wildtyp-Stamm, der für Reis und Gerste pathogen ist und der einen mit der Mutante kompatiblen Kreuzungstyp aufweist, ausgewertet.
4) Gewinnung der Genomregion des Pilzes, wo die Insertion des mutierenden Plasmids stattgefunden hat. Das Prinzip bestand darin, ein DNA-Fragment der Mutante, das gleichzeitig Plasmid- und Genomsequenzen umfaßt, zu isolieren, was mit Hilfe eines Hybridisierungsversuchs mit einer Probe, die von einem Plasmid stammte, nachgewiesen werden konnte. Mit dem Teil des Genoms, der in diesem Fragment vorkam, konnte anschließend die vollständige Region des Wildtypgenoms auf gleiche Art und Weise isoliert werden.
5) Nachweis, daß die Genomregion, die der Insertionsstelle des Plasmids benachbart ist, das Pathogenitätsgen enthält. Wenn sich das gesuchte Pathogenitätsgen in der Genomregion neben der Insertionsstelle des Plasmids befindet, so müßte dessen Einführung in das Genom der Isolatmutante mit Hilfe eines Plasmidvektors, der einen anderen nachweisbaren Marker umfaßt, es ermöglichen, die Pathogenität dadurch zu restaurieren, daß die Funktion, die durch Insertion des ersten Plasmid defekt gemacht wurde, komplementiert wird. Dies wird dadurch bewiesen, wenn die Sporen von mindestens einer Transformante, die mit diesem Versuch erhalten wurde, genauso viele Blattläsionen hervorrufen können wie der Wildtypstamm.
6) Charakterisierung der Genomsequenz des Pilzes in der Nähe der Insertionsstelle des Plasmids. Das Produkt der Sequenzierung der Genomregion, die an neben der Insertionsstelle des Plasmid liegt, wird mit Sequenzverarbeitungs-Software analysiert, so daß versucht wird, eine Nukleotidsequenz, die in eine Proteinsequenz translatiert werden kann, nachzuweisen (offenes Leseraster). Diese Suche wird auf Grundlage einer Suche nach Konsensus-Signalen für die Initiation und Termination der Translation in das Protein durchgeführt. Der Beweis für das Vorhandensein eines offenen Leserasters (und daher eines Gens) in dieser Region wurde durch Klonierung der entsprechenden Transkriptionseinheit erstellt, und zwar mit Hilfe der Durchmusterung einer Bibliothek von DNAs, die zu den Messenger-RNAs, komplementär sind (cDNAs) mit einer Sonde, die ausgehend von einem Fragment dieser Region erstellt wurde. Die Sequenz dieser cDNA ermöglicht nun die genaue Bestimmung der Größe und der Primärsequenz des entsprechenden Proteins sowie der Lage von gegebenenfalls vorhandenen Introns in der genomischen Sequenz des Gens.

Beispiel 1
Insertionsmutagenese
Um nach den Pathogenitätsgenen des Ascomyceten-Pilzes und Reisparasiten Magnaporthe grisea zu suchen, wurde für die Insertionsmutagenese die Transformation von Protoplasten mit einem integrativen Plasmid, das einen Selektionsmarker trägt, verwendet. Die Bedingungen für die Kultur, und Gewinnung von Protoplasten, für die Transformation sowie für die Aufreinigung und Aufbewahrung von Magnaporthe grisea-Transformanten sind bei Silue et al. (Physiol Mol. Plant Pathol., 53, 239-251, 1998) beschrieben. Die Transformation wurde mit 1 μg Plasmid pAN7.1 (Punt et al., Gene 78: 147-156, 1987) sowie 10⁷ Protoplasten des Magnaporthe grisea-Stamms P1.2 durchgeführt. Dieser Stamm stammt aus der Sammlung des Phytopathologielabors des CIRAD in Montpellier. Die Selektion der Transformanten wurde dadurch durchgeführt, daß man Hygromycin in die Agar-Kulturmedien einarbeitete, und zwar in einer Konzentration von 240 ppm für das Primärselektionsmedium und 120 ppm für das Sekundärselektionsmedium.
Beispiel 2
Durchmusterung der Sammlung von Transformanten, und Identifikation der nichtpathogenen Mutante 763
A) Pathogenitätsversuche mit am Leben erhaltenen Blättern
Die Pathogenitätsversuche wurden mit zwei Reissorten, nämlich Maratelli und Sariceltick, sowie einer Gerstensorte, nämlich Express, durchgeführt. Bei Maratelli handelt es sich um Sorten, die sehr stark für die Reisfleckenkrankheit anfällig sind und die keine Gene für Resistenz gegen den Stamm P1.2 aufweisen. Die Gerstensorten sind äußerst stark für Magnaporthe grisea anfällig. Der Reis wurde bei Tag-Nacht-Temperaturen von 25°C bzw. 15°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von über 70% und die Gerste unter kühlen Bedingungen (20-22°C) herangezogen. Vom mittleren Teil des jüngsten Blatts von Pflanzenalter von ungefähr 20 Tagen wurden Blattsplitter (2,5 cm) von Reis und Gerste entnommen. Diese Stücke wurden in Schalen mit mehreren Abteilungen, die 1% Agar mit einem Zusatz von 2 mg/l Kinetin enthielten, gegeben, einem Medium, das es ihnen ermöglicht, 14 Tage zu überleben. Es ist wichtig, festzustellen, daß der Reis während Hitzeperioden eine starke physiologische Resistenz gegen die Reisfleckenkrankheit entwickelt. Diese Resistenz kann dadurch, daß man die Pflanzen mit einem Stickstoffdünger versorgt, gemildert werden: zweimal Gießen mit einer Ammoniumsulfatlösung in einer Aufwandmenge von 5 g/m² im Abstand von einer Woche. Das zweite Gießen findet 2-3 Tage vor der Inokulation statt.
Die Sporulationsbedingungen und die Bedingungen der Herstellung von Magnaporthe grisea-Sporen sind bei Silue et al. (op. cit.) beschrieben. Die Inukolation wurde mit Hilfe eines feuchten Wattestäbchens durchgeführt, das mit einer Sporensuspension getränkt war und mit dem über die Blattstücke, die am Leben erhalten wurden, gestrichen wurde. Die Menge an aufgetragenen Sporen wurde dadurch abgeschätzt, daß man einen Tropfen der Suspension auf eine Blattspreite auftrug. Die Symptome wurden nach 4-7 tägiger Inkubation bei 24°C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100% beobachtet. Jede Transformante bei der ersten Durchmusterung wurde anhand von 4 Reisblattstücken jeder Sorte und 4 Gerstenblattstücken getestet. Bei der Transformante 763 wird eine Reduktion der Pathogenität beobachtet, die zu 95% der Anzahl der Läsionen, die vom wildtypstamm verursacht werden, quantifiziert wird. Um den Phänotyp der Transformante 763 zu bestätigen, wurde diese ein zweites Mal mit einer Sporensuspension, deren Konzentration auf 10⁵ Sporen pro ml eingestellt wurde, inokuliert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten dargestellt.
Tabelle 1: Eindringen der Mutante 763 in Gerstenblätter
B) Pathogenitätsversuche an ganzen Pflanzen
Um den durch Inokulation von Blättern unter Überlebensbedingungen bestätigen Phänotyp der nichtpathogenen Mutante 763 zu bestätigen, wurden von der phytopathologischen Abteilung des CIRAD, Montpellier, ganze Pflanzen mit Sporen dieser Pflanze inokuliert. Die beiden Reissorten, die gegen den Stamm P1.2 anfällig waren, nämlich Maratelli und Sariceltick, wurden unter Glas ausgesät und herangezüchtet. Während der ersten drei Anzuchtwochen wurde dreimal mit Stickstoff gedüngt (5, 10 bzw. 20 Tage nach dem Aussäen). Die Inokulation mittels Versprühen mit einer Sporensuspension findet 10 bis 15 Tage nach der letzten Stickstoffgabe statt, je nach dem Reifezustand der Pflanzen. Die Sporenkonzentration wurde durch Zellen in einer Thoma-Kammer bestimmt und auf einen Wert von 20.000 Sporen/ml eingestellt. Die Suspensionen der Sporen der Mutante 763 sowie des nichttransformierten Stamms P1.2 wurden auf 30 Pflanzen gesprüht, und zwar im Verhältnis von 1 ml Sporensuspension pro Pflanze, wobei man einen Aerographen verwendete. Um die Anzahl Läsionen nach deren Entwicklung (5-7 Tage) zu zählen, wurde von jeder dieser Pflanzen ein Blatt entnommen. Auch an den ganzen Pflanzen wurde ein 93%iger Abfall der Pathogenität beobachtet (siehe Tabelle unten).
Tabelle 2: Sprühbehandlung von ganzen Pflanzen (Reis, Sorte Sariceltick) mit einer Sporensuspension
Beispiel 3
Phänotypische Analyse der Mutante 763
Bei der Mutante 763 findet eine Reduktion der Pathogenität statt, die mengenmäßig zu 93% der Anzahl Läsionen, die vom Wildtypstamm verursacht werden, bestimmt wird, ohne daß ihre Fähigkeit, zu sporulieren, verringert ist. Die selten auftretenden Läsionen, die beobachtet wurden, waren zwar klar sichtbar und bestanden einer negrotischen Zone, die von einem bräunlichen Rand umgeben waren (typisches Symptom der Reisfleckenkrankheit), sie waren jedoch alle, im Gegensatz zu denjenigen, die vom Wildtypstamm verursacht wurden, klein und sporulierten nicht (Oberfläche –90%). Ein Infektionsversuch an verwundeten Blättern zeigt, daß das Fortschreiten der Hyphen dieser Mutante in der Pflanze auf die Verwundungsstelle beschränkt bleibt. Die zytologische Analyse der Infektion in dieser Mutante zeigt, daß die Mutante zwar die Epidermiszellwand der Gerste durchdringen kann, ein Fortschreiten jedoch anschließend rasch blockiert wird.
Die Transformante 763 weist eine Physiologie und Morphologie der Konidien und des Myceliums auf, die normal erscheinen. Ihre Fähigkeit, Appressorien auf der Gerstenepidermis sowie auf künstlichen hydrophoben Oberflächen (PVC, Teflon, PET) auszubilden unterscheidet sich nicht von derjenigen des Wildtypstamms.
Das Wachstum dieser Mutante wurde auch in Gegenwart von Salzen und von Wirkstoffen, die die Assimilation von Stickstoffverbindungen stören, untersucht. Dabei sollte herausgefunden werden, ob sie den Phänotyp des Verlusts der metabolischen Repression von Stickstoff aufweist, einem Merkmal der Mutante meaB von Aspergillus nidulans (siehe unten, molekulare Analyse; Polley und Caddick, 1996). Bei diesem Pilz zeigt sich die metabolische Repression von Stickstoff in Gegenwart von Ammonium oder L-Glutamin anhand der Hemmung der für die Aufnahme und Verwertung von anderen Stickstoffquellen erforderlichen Gene. Die Mutation meaB ist durch ihre Resistenz gegen Methylammonium (einem toxischen Induktionsmittel der metabolischen Repression von Stickstoff), jedoch auch durch ihre Resistenz gegen Parafluorphenylalanin und seine Überempfindlichkeit gegen Stickstofftoxizität gekennzeichnet. Der Phänotyp der Mutante 763 unterscheidet sich unter allen Prüfbedingungen nicht von demjenigen des Wildtypstamms. 763 wächst auch normal auf Minimalmedium (MM).
Beispiel 4
Genetische und molekulare Analyse der Mutante 763
Es wurden 20 zufällig gewählte Ascosporen und eine Tetrade aus der Kreuzung M4 X 763 analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich und zeigen, daß die Hygromycinresistenz gemeinsam mit dem Verlust der Pathogenität aufspaltet: Das mutierte Pathogenitätsgen ist mit dem Plasmid pAN7.1 in 763 markiert.
Tabelle 3: Analyse der Nachkommnenschaft der Kreuzung M4 X 763
Die Kopienzahl des Plasmids pAN7.1 im Genom dieser Transformante und die relative Lage der Integrationsstelle wurden durch Hybridisierung mit einer Plasmidsonde bestimmt (siehe 1). Je nach der Anzahl der gewünschten Spaltungen wurden drei Arten von Restriktionsenzym verwendet: EcoRI (2 Schnittstelle); BamHI (1 Schnittstelle); ApaI, ClaI und KpnI (keine Schnittstelle). Die Hybridisierungsprofile der erhaltenen Restriktionsfragmente zeigen, daß diese Transformante nur eine Kopie des Plasmids umfaßt (3 EcoRI Fragmente, nur ein Fragment mit BamHI, ApaI, ClaI und KpnI). Außerdem weist das einzige BamHI-Hybridisierungsfragment eine Größe von 6,75 kB auf. Dies zeigt, daß die Kopie dieses Plasmids, die in das Genom dieser Transformanten integriert ist, an diesen Enden die beiden BamHI-Stellen aufweist, die im Anschluß an die Transformation in Gegenwart von diesem Restriktionsenzym erwartet werden. Gemäß der an zahlreichen mittels REMI-Transformationen erhaltenen Transformanten durchgeführten Analyse ist es wahrscheinlich, daß die Integration des Plasmid zu kurzen Diletionen in einem bzw. in beiden kohäsiven Enden der BamHI-Stelle des Plasmid geführt hat, wodurch keine BamHI-Restriktionsstelle an den Übergängen zwischen der Plasmid-DNA und der genomischen DNA der Transformante erzeugt wurden. Was die Spaltungen mit den Enzymen angeht, die die Sequenz von pAN7.1 nicht schneiden (ApaI, ClaI und KpnI), so wurde das kleinste Restriktionsfragment, das das gesamte Plasmid enthielt, in der Bahn erhalten, die der Spaltung mit KpnI entsprach (Größe 11 kB). Ein zusätzlicher Versuch bestand darin, SSPI-Restriktionsfragmente der genomischen DNA der Transformante 763 mit einer pUC19-Sonde zu hybridisieren, und es konnte gezeigt werden, daß die Sequenzen des Replikationsursprungs des Plasmid in E.coli und des Ampicillinresistenzgens intakt waren.
Beispiel 5
Klonierung und Charakterisierung des Pathogenitätsgens 763
Für die Klonierung der Genomregionen, die an der Insertionsstelle des Plasmid lagen, wurde die „Plasmid rescue"-Technik (Timberlake, 1991) verwendet. Aufgrund seiner kleinen Größe wurde das in der molekularen Analyse der Mutante identifizierte 11 kB große KpnI-Fragment für die Durchführung dieses Versuchs gewählt (2). Mit 4 erhaltenen ampicillinresistenten Kolonien wurde eine Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA durchgeführt. Eine Kolonie, die das erwartete Plasmid (PRK763) trug, wurde zwecks DNA-Maxipräparation ausgestrichen und vermehrt. Um die Cosmidbank des Stamms 96/0/76 mit einer Probe zu testen, verwendet man ein NdeI-SspI-Fragment der genomischen DNA von PRK763 mit einer Größe von 0,4 kB, das im Anschluß an die Sequenzierung der Regionen genomischen Ursprungs dieses Plasmids lokalisiert wurde. Es wurden zwei Cosmide, die mit diesem Fragment hybridisierten, isoliert (21C7 und 35F3).
Ein 6 kB großes XhoI-BglII-Restriktionsfragment des Cosmids 35F3, das mit dem NdeI-SspI-Restriktionsfragment von PRK763 hybridisierte, wurde in das Plasmid pCB1265 kloniert (3). Dieses Konstrukt, das pC763 genannt wurde, wurde mittels Protoplastentransformation in das Genom Mutante 763 eingeführt. Ein Pathogenitätsversuch an isolierten Blättern hat gezeigt, daß die erhaltenen phosphinothricinresistenten Transformanten die gleiche Virulenz aufweisen wie der Wildtypstamm.
Die Bibliothek von komplementären DNAs der Messenger-RNAs von Genen, die in Kultur in flüssigem Vollmedium exprimiert werden, wurde mit dem NdeI-SspI-Fragment von PRK763 durchmustert. Es wurden zwei Arten von Klon mit einer ungefähren Länge von 2 kB gewonnen. Einer war an seinem 5'-Ende um 113 Bp kürzer, jedoch an seinem 3'-Ende um 16 Bp länger als der andere, gerade vor der terminalen Polyadenylationssequenz. Diese Polyadenylationssequenz war am 3'-Ende von beiden Typen von Klon, die isoliert wurden, vorhanden. Mit Hilfe eines Vergleichs dieser cDNA-Sequenz mit derjenigen der genomischen Wildtyp-DNA konnten drei Introns mit einer Größe von 153, 78 bzw. 108 Bp nachgewiesen werden. Die Lage des Translationsinitiationssignals und des Translationsterminationssignals in der cDNA-Sequenz definiert ein 714 Bp langes offenes Leseraster. Dieses beginnt 25 Bp vom 5'-Ende der Sequenz des längsten cDNA-Klons und hört 1,22 kB vom 3'-Ende der Sequenz dieses Klons auf. Diese lange 3'-nichttranslatierte Sequenz umfaßt zahlreiche potentielle Terminationssignale in den drei möglichen Leserastern.
Die Suche nach Proteinen, deren Sequenzen zu der Sequenz von P763 homolog sind, wurde mit dem Sequenz-Alignment-Programm BLASTP 2.0.8 (Altschul et al., 1997) in allen verfügbaren Dateien durchgeführt, wobei die Standard-Einstellungen verwendet wurden. Die einzigen Proteine mit einem signifikanten Ausmaß an Homologie zu dem Pathogenitätsprotein 763 aus Magnaporthe grisea sind der putative Transkriptionsfaktor MEAB aus Aspergillus nidulans sowie die Transkriptionsfaktoren GCN4 und YAP1 von Saccharomyces cerevisiae.
Es wird angenommen, daß MEAB an der Kontrolle der Stickstoffassimilation in Abhängigkeit von den verfügbaren natürlichen Quellen dieses Elements beteiligt ist (Polley und Caddick, FEBS letters 388: 200-205, 1996). Aufgrund seiner Sequenz ist MEAB mit der Familie der eukaryontischen Transkriptionsfaktoren des Typs bZIP verwandt, bestehend aus einem dominanten basischen sequenzspezifischen DNA-Bindungsmotiv und im Anschluß daran einem anderen, das „Leucin-Zipper"-Motiv genannt wird und das für die Dimerisierung des Proteins erforderlich ist. Das Ausmaß der Ähnlichkeit zwischen P763 und MEAB ist im Amino-terminalen Abschnitt ihrer Sequenzen, dem, der der bZIP-Domäne entspricht, am höchsten. Abgesehen von dieser Region ist die MEAB-Sequenz länger (400 AA im Vergleich zu 238 bei P763) und weist in ihren Carboxy-terminalen Abschnitten nur wenig Ähnlichkeit mit P763 auf (4).
Tabelle 4: Suche nach Proteinen mit Homologie zu dem von Gen 763 abgeleiteten Protein (Blast P Version 2.0.8)
Aufgrund der Phänotypanalyse der Mutante 763 in Abhängigkeit von ihrem Verhalten gegenüber verschiedenen Wirkstoffen, die den Stickstoffmetabolismus beeinflussen, kann in Erwägung gezogen werden, daß es sich bei dem von dem Plasmid markierten Gen in der Mutante 763 nicht um ein Äquivalent zu MEAB bei Magnaporthe grisea handelt. Die Sequenz der bZIP-Domäne von P763 zeigt in derselben Suche ein teilweises Alignment mit denjenigen von zwei Transkriptionsfaktoren von Saccharomyces cerevisiae, nämlich GCN4 (Protein, das die Expression von Aminosäurebiosynthese-Genen reguliert; Hinnebusch, PNAS 81: 6442-6446, 1984) und YAPI (Transkriptionsaktivator von Zellabwehrgenen gegen Oxidationsstreß; Schnell et al., Curr. Genet. 21(4-5): 269-73 1992) und mit dem Gen CPC-1 aus Neurospora crassa (5). Gene mit einer Sequenz mit Homologie zu der Sequenz des GCN4-Gens wurden in den Fadenpilzen Neurospora crassa (Paluh et al., PNAS 85 (11) 3728-3732, 1988) mit dem CPC-1-Gen und Cryphonectria parasitica (Wang et al., Fungal Genet. Biol. 23(1): 81-94, 1998) identifiziert und unterscheiden sich trotz Verwandtschaft vom Gen 763.
Beispiel 6
Expression des Pathogenitätsgens 763
Ein Northern-Blot, der mit 10 μg Gesamt-RNA durchgeführt wurde, die aus Proben von Mycelium, das unter verschiedenen Bedingungen (Flüssigkultur in Vollmedium oder Minimalmedium) kultiviert worden war, extrahiert worden war, wurde erfolglos mit einer Sonde, die der Sequenz von cDNA von Gen 763 entsprach, hybridisiert.
Mit Primern, die sich beidseitig des putativen Translationsterminationssignals (das aufgrund der Analyse der cDNA-Sequenz definiert wurde) befanden und mit 5 μg Gesamt-RNA, die aus Mycelium von einer Flüssigkultur in Vollmedium extrahiert worden war, wurde ein RT-PCR-Versuch durchgeführt. Das Amplifikationsprodukt, das mittels Hybridisierung mit einer 763-Sonde nachgewiesen worden war, wurde kloniert und sequenziert. Es unterscheidet sich nicht bezüglich der Größe oder Sequenz von den zuvor isolierten cDNA-Klonen, insbesondere in dem Abschnitt, der der 3'-nichttranslatierten Sequenz der Messenger-RNA des Gens entspricht.
Mit 5 μg RNA aus infizierten Gerstenblättern, die 20 Stunden nach der Inokulation extrahiert worden waren, und einer zweiten Amplifikation mit einem zweiten internen Primer-Paar wurde ein Nested-RT-PCR-Versuch durchgeführt. Durch Hybridisierung mit einer 763-Sonde, mit der die Expression dieses Gens während der Frühstadien der Kolonisierung des nichtmenschlichen Wirts nachgewiesen wurde, wurde ein Amplifikationsprodukt nachgewiesen (6).
SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

1) Polynukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid aus der Reihe der folgenden Polynukleotide enthält: a) Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1; und b) Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 2; und c) Polynukleotid mit der Sequenz zwischen Position 17 und Position 733 gemäß SEQ ID No. 2.

Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es das Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 3 oder ein biochemisch aktives Fragment des Polypeptids 763 gemäß SEQ ID No. 3 mit einer in Pilzen funktionellen Transkriptionsfaktoraktivität enthält.

Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid mit mindestens 80% Homologie zu dem Polypeptid 763 gemäß SEQ ID No. 3 enthält.

Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es einen in Pilzen funktionellen Transkriptionsfaktor enthält.

Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Transkriptionsrichtung a) einen in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus funktionellen Promoter; und b) ein Polynukleotid nach Anspruch 1 und c) eine Terminatorsequenz in dem nichtmenschlichen Wirtsorganismus enthält.

Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Transkriptionsrichtung a) einen in einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus funktionellen Promoter; und b) ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 2-4 codiert; und c) eine Terminatorsequenz in dem nichtmenschlichen Wirtsorganismus enthält.

Vektor, enthaltend ein Polynukleotid nach Anspruch 1 oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 5 oder 6.

Nichtmenschlicher Wirtsorganismus, der mit einem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder mit einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 5 oder 6 oder mit einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist.

Verfahren zur Transformation von nichtmenschlichen Wirtsorganismen durch Integration von mindestens einem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 5 oder 6 oder einem Vektor nach Anspruch 7 in diesen Wirtsorganismus.

Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem Polypeptid 763 nach einem der Ansprüche 2-4; und b) Nachweisen der Bindung dieser Verbindung an das Polypeptid.

Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus, der mit einem Polynukleotid einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 oder 7 transformiert ist, wobei der Wirtsorganismus ein Reportergen unter der Kontrolle des Promoters von Gen 763 exprimiert; und b) Nachweisen der Hemmung der Expression des Reportergens.

Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einem nichtmenschlichen Wirtsorganismus, der mit einem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 5 oder 6 oder einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist, wobei der Wirtsorganismus ein Polypeptid 763 exprimiert; und b) Nachweisen der Hemmung der Expression des Polypeptids 763.

Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, das weiterhin einen Schritt umfaßt, bei dem man bestimmt, ob die Verbindung die Pathogenität von Pilzen hemmt.

Verbendung eines Polynukleotids, einer Expressionskassette, eines Vektors, eines nichtmenschlichen Wirtsorganismus und/oder von Polypeptid 763 nach einem der Ansprüche 1-8 zum Identifizieren von Genen, die in der Pathogenität von Pilzen impliziert sind oder zum Identifizieren von neuen fungiziden Molekülen, die die Pathogenität von Pilzen hemmen.