RU2225114C2

RU2225114C2 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК, КОТОРЫЙ ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ИНСЕКТИЦИДНОЕ СРЕДСТВО, ИНСЕКТИЦИДНОЕ СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ), ШТАММ БАКТЕРИЙ Xenorhabdus nematophilus (ВАРИАНТЫ), ИНСЕКТИЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ-ВРЕДИТЕЛЯМИ

Info

Publication number: RU2225114C2
Application number: RU99106423/13A
Authority: RU
Inventors: Пол ДЖЭРРЕТТ (GB); Пол ДЖЭРРЕТТ; Дебора Джун ЭЛЛИС (GB); Дебора Джун ЭЛЛИС; Джеймс Элун Винн МОРГАН (GB); Джеймс Элун Винн МОРГАН
Priority date: 1996-08-29
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2004-03-10
Also published as: DE69737196T2; ATE349892T1; CN1233938A; BR9711285A; AU4024997A; MY136245A; JP2001508032A; AU732845B2; WO1998008388A8; EP0923295B1; CA2263897A1; WO1998008388A1; IL128694A0; US7214525B1; CN1146322C; ES2281107T3; NZ334847A; JP4338057B2; GB9618083D0; EP0923295A1

Abstract

Изобретение относится к материалам, средствам и композициям, обладающим инсектицидной активностью, которые получают из бактерий вида Xenorhabdus nematophilus. Предложены рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, представляющий собой инсектицидное средство, штаммы бактерий Xenorhabdus nematophilus NCIMB - 40886 и Xenorhabdus nematophilus NCIMB-40887, продуцирующие указанный белок. Также предложены инсектицидное средство, содержащее клетки указанных штаммов бактерий или надосадочную жидкость культуры клеток любого из указанных штаммов и инсектицидная композиция, содержащая инсектицидное средство и дополнительный пестицидный материал, полученный из В. Thuringiensis. Далее предложен способ борьбы с насекомыми-вредителями с использованием вышеуказанных инсектицидных средств, или штаммов, или композиции. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, используемых для борьбы с насекомыми-вредителями. 7 с. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 11 табл.

Description

Данное изобретение относится к материалам, средствам и композициям, обладающим пестицидной активностью, которые получают из бактерий, и более точно из бактерий вида Xenorhabdus. Изобретение также относится к организмам и способам применения таких соединений и композиций.

Существуют действующие требования к материалам, средствам, композициям и организмам, обладающим пестицидной активностью, например, для применения при защите урожая или для контроля болезней, распространяемых насекомыми. Новые материалы требуют решения проблемы устойчивости (резистентности) к существующим пестицидам. Идеально, такие материалы являются дешевыми для получения, стабильными, обладают высокой токсичностью (когда используются в чистом виде или в смеси) и являются эффективными при пероральном введении целевым вредителям. Следовательно, любое изобретение, обеспечивающее получение материалов, средств, композиций или организмов, в которых любое из этих свойств улучшалось, представляло бы шаг вперед в данной области.

Xenorhabdus spp. в природе часто являются симбиотически связанными с нематодами в качестве организма-хозяина и известно, что эта связь может использоваться для контроля активности вредителей. Например известно, что некоторые Xenorhabdus spp. одни способны убивать организм-хозяин насекомого при введении в гемоцель организма-хозяина.

Кроме того, был выделен один экстрацеллюлярный инсектицидный токсин из Photorhabdus luminescens (этот вид был ранее выделен из рода Xenorhabdus и близко связан с некоторыми его разновидностями. Этот токсин не эффективен при проглатывании, но является высокотоксичным при впрыскивании в некоторые личинки насекомых (см. публикацию Parasites and Pathogens of Insects Vol.2, Eds. Beckage, N.E. et al., Academic Press 1993).

Известны также некоторые гетероциклические соединения с низкой молекулярной массой из Р.luminescens и X.nematophilus, которые обладают свойствами антибиотиков при введении внутривенно или местно (см. публикацию Rhodes, S. H. et al., PCT WO 84/01775).

К сожалению, ни один из материалов предшествующего уровня не имеет идеальных пестицидных характеристик, описанных выше, и в частности, они не обладают токсичной активностью при пероральном введении.

Данное изобретение обеспечивает получение пестицидных средств и композиций из бактерий вида Xenorhabdus, организмов, которые производят такие соединения и композиции, и способы, в которых используются эти средства, композиции и организмы, что решает некоторые из проблем предшествующего уровня.

В соответствии с одним аспектом данное изобретение относится к способу уничтожения или контроля вредных насекомых, включающему введение перорально вредителям клеток вида Xenorhabdus или пестицидных материалов, полученных или доступных от него.

В заявке РСТ CSIRO, опубликованной под номером WO 95/00647, описывается токсичный белок из Xenorhabdus nematophilus; однако подробное описание токсичности белка не приводится и точно не раскрыто его применение в качестве инсектицида для перорального введения.

Таким образом, изобретение обеспечивает получение инсектицидной композиции, которая:
(I) адаптируется для перорального введения насекомому,
(II) включает белковый пестицидный материал, который можно получать из видов Xenorhabdus, или его пестицидный фрагмент, или пестицидный вариант или производную одного из них,
обладает в каждом случае токсической активностью при пероральном введении.

Композиция может фактически включать клетки Xenorhabdus или в качестве альтернативы надосадочную жидкость, взятую из культур клеток вида Xenorhabdus. Однако композиция предпочтительно включает токсины, выделенные из Xenorhabdus, как описано далее. Токсическая активность связана с материалом, кодированным нуклеотидной последовательностью, представленной на фигуре 2. Таким образом, композиция приемлемо включает пестицидный материал, который кодируется всей или частью нуклеотидной последовательности фигуры 2. Могут также использоваться пестицидные фрагменты, а также варианты или производные таких токсинов.

Последовательность, представленная на фигуре 2, представляет собой последовательность длиной порядка 40 т.п.н. Полагают, что эта последовательность может кодировать более чем один белок, каждый из которых может регулировать инсектицидную активность или быть инсектицидным либо в отдельности, либо когда они представлены вместе. Вопросом методики является определение, какие части являются необходимыми или достаточными для инсектицидной активности.

Термин "вариант", используемый в данном описании, относится к токсинам, которые имеют модифицированную аминокислотную последовательность, но которые вообще сходны по активности. Некоторые аминокислоты могут заменяться другими аминокислотами без значительного влияния на природу активности. Замена может производиться способом "осторожной замены", при которой аминокислоту заменяют аминокислотой с аналогичными в общих чертах свойствами, или могут производиться значительные замены. Однако обычно варианты будут по меньшей мере на 60% гомологичными по отношению к природному токсину, приемлемо - на 70% гомологичными и более предпочтительно по крайней мере на 90% гомологичными.

Термин "производное" относится к токсинам, которые были модифицированы, например, с помощью химических или биологических методов.

Эти токсины являются новыми, и они, а также нуклеиновые кислоты, которые кодируют их, составляют дополнительный аспект данного изобретения.

Предпочтительный вид Xenorhabdus представляет собой бактерии X.nematophilus. Конкретными примерами линий X. nematophilus, полезных в контексте изобретения, являются линия АТТС 19061, доступная от National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland (NCIMB). Кроме того, подходящие линии включают две новых линии Xenorhabdus, которые были помещены на хранение в NCIMB 10 июля 1997 года и обозначены номерами NCIMB 40886 и NCIMB 40887. Эти последние линии образуют дополнительный аспект изобретения.

Общие характеристики этих линий приведены в таблице 1 (таблицы 1-11 см. в конце описания).

Предпочтительно целевым вредителем является насекомое, и более предпочтительно это насекомое отряда Lepidopera, особенно Pieris brassicae, Pieris rapae или Plutella xylostella, или отряда Diptera, в частности Culex quinquefaciatus.

В предпочтительном воплощении изобретения клетки из линии Xenorhabdus или средства, полученные из них, используют в сочетании с Bacillus thuringiensis в качестве пестицида для перорального введения.

В других воплощениях вместо самого Bacillus Thuringiensis применяют пестицидные материалы, которые могут быть получены из В.thuringiensis (например, дельта-эндотоксины или другие изоляты) в сочетании с видом Xenorhabdus.

Термин "которые можно получать из", как подразумевается, охватывает не только материалы, которые выделили непосредственно из указанных бактерий, но также те материалы, которые последовательно клонированы в них и произведены другими организмами.

Таким образом, неожиданное открытие того, что бактерии рода Xenorhabdus (и материалы, полученные из них) обладают пестицидной активностью при проглатывании, и что такие бактерии и материалы могут преимущественно использоваться в сочетании с В.thuringiensis (и токсинами или материалами, полученными из него), составляет основу дополнительного аспекта данного изобретения. Пестицидная активность изолятов B.thuringiensis была хорошо известна. Однако синергическая пестицидная активность таких изолятов и бактерий вида Xenorhabdus (или материалов, полученных из них) ранее не демонстрировалась.

В других воплощениях изобретения вместо клеток вида Xenorhabdus в способах, описанных выше, используется кулътуральная надосадочная жидкость, взятая из культур вида Xenorhabdus, в частности вида X.nematophilus.

Все эти способы помимо прочих могут использоваться для борьбы с вредителями.

Изобретение также делает доступными пестицидные композиции, включающие клетки, полученные из вида Xenorhabdus, предпочтительно X.nematophilus, в сочетании с В.thuringiensis. Как и в способах, описанных выше, пестицидный токсин из В. thuringiensis (предпочтительно дельта-эндотоксин) может использоваться в качестве альтернативного для В.thuringiensis композициях данного изобретения.

Аналогично, культуральная надосадочная жидкость, полученная из культур вида Xenorhabdus, предпочтительно X. nematophilus, может использоваться вместо клеток из вида Xenorhabdus.

Такие композиции могут применяться среди прочего, для защиты урожая, например опрыскиванием культур, или для защиты домашнего скота. Кроме того, композиции изобретения могут применяться для векторного контроля.

Изобретение также охватывает новые пестицидные средства, которые могут быть выделены из Xenorhabdus spp. Методы получения таких средств должны быть понятны квалифицированному специалисту.

В частности, такие методы включают выделение и идентификацию белков токсина либо на уровне белка, либо на уровне ДНК.

Заявители клонировали и частично секвенировали область ДНК из Xenorhabdus NCIMB 40887, которая кодирует инсектицидную активность, и она представлена на фигуре 2 (последовательность SEQ ID 1) далее. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретение также обеспечивает получение токсина, который кодирован последовательностью ДНК SEQ ID 1 или ее вариантом или фрагментом.

Изобретение также обеспечивает получение рекомбинантной ДНК, которая кодирует такой токсин. Рекомбинантная ДНК изобретения может включать последовательность фигуры 2 или ее вариант или фрагмент. Другие последовательности ДНК могут также кодировать аналогичные белки как следствие вырожденности генетического кода. Все эти последовательности охватываются данным изобретением.

Последовательность, обеспечиваемая данным изобретением, достаточна, чтобы позволить получить зонды, которые могут быть использованы для идентификации и затем для выделения ДНК генов токсина. Эта ДНК затем может быть клонирована в векторы с использованием клеток организма-хозяина, в соответствии с практикой данной области.

ДНК, которая включает последовательность фигуры 2 или гибридизуется с последовательностью фигуры 2 в строгих условиях, составляет еще один аспект данного изобретения.

Выражение "гибридизуется" означает, что нуклеотидная последовательность будет отжигаться (гибридизоваться) со всей или с частью последовательности фигуры 2 в жестких условиях гибридизации, например, как описано в публикации "Molecular Cloning", A Laboratory Mannual", Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, N.Y.

Длина последовательности, используемой в любом конкретном аналитическом методе, будет зависеть от природы метода, степени комплементарности последовательности, природы последовательности и особенно GC содержания зонда или праймера и особых условий гибридизации, которые используются. В условиях высокой строгости только последовательности, которые являются полностью комплементарными, будут связываться, но в условиях низкой строгости будут связываться последовательности, которые являются на 60% гомологичными целевой последовательности, более приемлемо - на 89% гомологичными. Условия как высокой, так низкой строгости, охватываются термином "строгие (жесткие) условия", используемым в данном описании.

Подходящие фрагменты ДНК фигуры 2, то есть фрагменты, которые кодируют пестицидные средства, могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов. Например, можно использовать методы транспозонтного мутагенеза, например, описанные в публикации H.S. Siefert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1986), 83, 735-739. Векторы, такие как космида cHRIMI, могут быть мутированы с использованием различных транспозонов и затем скринированы на потерю инсектицидной активности. Этим методом могут быть идентифицированы области ДНК, которые кодируют белки, ответственные за токсическую активность.

Например, мини-транспозон mTn3(HIS3) может быть введен в токсический Xenorhabdus клон, такой как cHRIM1, который далее в описании обозначают как "клон 1", посредством электропорации ДНК cHRIMI в E.coli RDP146(pLB101), скрещиванием этой линии с E.coli RDO146(pOX38), а затем с E.coli NS2114Sm. Конечная линия будет содержать cHRIM1 ДНК с единственной инсерцией транспозона mTn3(HIS3). Эти колонии могут быть выращены и испытаны на инсектицидную активность, как описано в примере 8, приведенном ниже. Рестрикционное картирование или ДНК секвенирование может быть использовано для идентификации области инсерции mTn3(HIS3) и, следовательно, областей ДНК, вовлеченных в токсичность. Аналогичный подход может быть использован для других транспозонов, таких как Tn5 и mТn5.

Сайт-направленный мутагенез cHRIMl, описанный в публикации "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Maniatis, Fritsch and Sambrook, (1982) Cold Spring Harbor, также может быть использован для оценки важности специфических областей ДНК для токсической активности.

В качестве альтернативы методы субклонирования могут использоваться для определения областей клонированной ДНК, которые кодируют инсектицидную активность. В этом случае субклонируют специфические фрагменты ДНК меньших размеров и определяют активность. Для этого космидная ДНК может быть расщеплена подходящим рестрикционным ферментом и легирована в совместимый рестрикционный сайт на плазмиде, например, такой как pUC19. Далее лигазной смесью можно трансформировать E.coli и трансформированные клоны могут быть отобраны с использованием селекционного маркера, такого как устойчивость к антибиотику, кодируемого плазмидой. Подробное описание этих методов приводится, например, в публикациях Maniatis et al., supra (см. стр.390-391) и Methods in Molecular Biology, L.G.Davies, M.D.Dibner and J.F.Battey, Elsevier (см.стр. 222-224).

Индивидуальные колонии, содержащие специфические клонированные фрагменты, могут быть выращены и протестированы на активность, как описано в примере 8, приведенном ниже. Субклоны с инсектицидной активностью могут быть дополнительно усечены с использованием той же методологии для дополнительной идентификации областей ДНК, кодирующий активность.

Изобретение также описывает выделенное пестицидное средство, отличающееся тем, что средство может быть получено из культур X.nematophilus или его вариантов, обладает пестицидной активностью при пероральном введении по отношению к Pieris brassicae, Pieris rapae и Plutella xylostella, устойчиво к нагреванию до 55^oС, является белком, действует синергически с клетками B. thuringiensis в качестве пестицида для перорального введения и является по существу стойким к протеолизу с помощью трипсина и протеиназы К.

Выражение "по существу стойкое к нагреванию до 55^oС" означает, что средство сохраняет некоторую пестицидную активность при испытании после выдерживания в суспензии при температуре 55^oС в течение 10 минут, и предпочтительно сохраняет по меньшей мере 50% активности необработанного образца.

Выражение "по существу стойкое к протеолизу" означает, что средство сохраняет некоторую пестицидную активность при выдерживании в протеазах при 30^oС в течение 2 часов, и предпочтительно сохраняет по меньшей мере 50% активности необработанного образца.

Выражение "действует синергически" означает, что активность смеси компонентов больше, чем можно ожидать, исходя из применения компонентов индивидуально. Например, при применении смеси с клетками B.thuringiensis в качестве пестицида для перорального применения, концентрация клеточного материала В. thuringiensis, необходимая для получения 50% смертности P.brassicae при применении его одного, снижается по меньшей мере на 80%, когда он используется в сочетании со средством, которое используется в концентрации, достаточной для получения 25% смертности при применении одного средства.

Было обнаружено, что активность материала сохраняется при ультрафильтрации через мембраны с порами пропускания до 30 кДа, но только частично сохраняется при использовании мембран с порами до 100 кДа.

Предпочтительно средство дополнительно отличается тем, что пестицидная активность теряется при обработке при 25^oС додецилсульфатом натрия (SDS-0,1%, 60 минут) и ацетоном (50%, 60 минут).

Ясно, что характеристические свойства выделенного средства, описанного выше, могут использоваться для его очистки или для повышения его концентрации в клетках вида Xenorhabdus и надосадочных жидкостях культуральной среды. Способы очистки белков от гетерогенных смесей хорошо известны в данной области (например, осаждение сульфатом аммония, протеолиз, ультрафильтрация через мембраны с порами пропускания известной молекулярной массы, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и т.д.). Пестицидная активность при пероральном применении обеспечивает удобный способ оценки содержания средства после каждой стадии или в каждом образце элюата. Такая методология не требует изобретательности от квалифицированного специалиста.

Изобретение также раскрывает пестицидные композиции для перорального введения, включающие одно или более средств, описанных выше. Такие композиции предпочтительно дополнительно включают другие пестицидные материалы, не относящиеся к виду Xenorhabdus. Эти и другие материалы могут выбираться так, чтобы иметь комплементарные свойства со средством, описанным выше, или действовать синергически с ним.

Предпочтительно пестицидные композиции для перорального введения включают одно или большее количество пестицидных средств, описанных выше, в сочетании с В.thuringiensis (или с токсином, полученным из него, предпочтительно эндотоксином).

Рекомбинантная ДНК, кодирующая указанные белки, также составляет дополнительный аспект данного изобретения. ДНК может вводиться в экспрессирующий вектор под контролем подходящих регуляторных элементов, таких как протомотеры, энхансеры, сигнальные последовательности и т.д., в соответствии, с практикой данной области. Эти экспрессирующие векторы составляют еще один аспект данного изобретения. Они могут использоваться для изменения организма-хозяина, чтобы гарантировать производство организмом токсина.

Изобретение также делает доступным организм-хозяин, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидное средство, которое описано выше.

Методы клонирования последовательности для характеризуемого белка в организм-хозяин хорошо известны в данной области. Например, белок может быть очищен и секвенирован: поскольку активность не требуется для секвенирования, для очистки белка можно использовать SDS - электрофорез с последующим блоттингом. Аминокислотная последовательность может быть использована для синтеза нуклеотидных зондов, которые далее могут быть использованы для идентификации подходящих фрагментов генома из библиотеки вида Xenorhabdas. Эти фрагменты могут быть затем введены с помощью подходящего вектора в организм-хозяин, который может экспрессировать белок. Применение такой общей методики известно в практике и не является новым для квалифицированного специалиста. Такие методы могут быть применены для получения токсинов из Xenorhabdus, отличных от тех, что кодированы последовательностью фигуры 2.

Может быть желательно манипулировать (например, мутировать) средство посредством изменения его нуклеотидной последовательности (и, следовательно, структуры белка), чтобы оптимизировать его физические или токсикологические свойства.

Может быть желательно для организма-хозяина получать его методом генной инженерии или выбирать так, чтобы он также экспрессировал другие белковые пестицидные материалы (например, дельта-эндотоксин из В.thuringiensis). В равной степени может быть желательно генерировать организм-хозяин, который экспрессирует слитый белок, состоящий из активной части средства плюс какие-либо другие материалы, повышающие токсичность.

Организм-хозяин может быть выбран для получения больших количеств пестицидных материалов с целью последующей очистки, например с использованием В. thuringiensis, трансформированного с геном, кодирующим средство. Однако предпочтительно организм-хозяин представляет собой растение, которое получило бы таким образом улучшенную устойчивость вредителю. Подходящие растительные векторы, например Ti плазмида из Agrobacterium tumefaciens, хорошо известны в данной области. В качестве альтернативы организм-хозяин может быть выбран таким образом, чтобы быть непосредственно патогенным к вредителям, например бакуловирус насекомых.

Положения и область данного изобретения охватывает все эти хозяйские организмы плюс средства, мутированные средства или "слитые" средства, которые они экспрессируют.

Таким образом, изобретение делает доступными способы, композиции, средства и организмы, обладающие пестицидной активностью, которые могут быть использованы в промышленности, причем особенно полезны для улучшения защиты урожая или контроля болезней, распространяемых насекомыми.

Способы, композиции и средства данного изобретения далее будут описаны только с целью иллюстрации со ссылками на приведенные, но не ограничивающие примеры и фигуры. Другие воплощения, входящие в область данного изобретения, будут осуществляться квалифицированными специалистами в свете этих примеров.

ФИГУРЫ
Фигура 1 представляет изменение роста Х.nematophilus АТСС 19061 и активности клеток и надосадочных жидкостей во времени в отношении P.brassicae, как описано в примере 3.

Фигура 2 представляет последовательность главной части клонированного гена токсина из Xenorhabdus.

Фигура 3 представляет сравнение рестриктных карт клонированных генов токсинов из двух линий Xenorhabdus (клон 1, описанный выше, и клон 3, описанный ниже).

ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Применение клеток X.nematophilus в качестве инсектицида для перорального введения
Выращивание клеток: пересев клеток X.nematophilus (АТСС 19061, линия 9965, доступная от National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland) применяют для инокуляции Бульона Луриа (Luria Broth, LB), содержащего 10 г триптона (tryptone), 5 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl на литр. Культуры выращивают в колбах при 27^oС в течение 40 часов на шюттель-аппарате с круговым вращением.

Получение суспензии клеток: культуры центрифугируют при 5000 g в течение 10 минут. Надосадочные жидкости отбрасывают и клеточные осадки промывают один раз и повторно суспендируют в равном объеме фосфатно-буферного раствора (8 г NаСl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄ на литр) при рН 7,4 (РВС).

Активность клеточной суспензии по отношению к насекомым: количественное определение биологической активности (биотест) проводят следующим образом:
Р. brassicae: личинки выращивают на искусственной среде на основе агара (как описано в публикации David and Cardiner (1965) London Nature, 207, 882-883), в которое вводят серию разбавлений клеточной суспензии. Биотест проводят с использованием серии из 5 доз с как минимум 25 личинками на дозу. Используют клетки, не обработанные и прошедшие тепловую обработку (55^oС в течение 10 минут). Смертность регистрируют спустя 2 и 4 дня при сохранении температуры на уровне 25^oС (см. табл.2).

Aedes aegypti: личинку выдерживают в серии из 5 различных растворов клеточной суспензии в деионизированной воде. Биотест выполняют, используя 2 дозы на разбавление 50 мл клеточной суспензии в 9,5 см пластиковых чашках с 25 личинками второй возрастной стадии на дозу. Используют клетки, не обработанные и прошедшие тепловую обработку (55^oС или 80^oС в течение 10 минут). Смертность регистрируют спустя 2 дня при сохранении температуры на уровне 25^oС (см. табл.3).

Culex guinguefaciatus: личинку выдерживают в клеточной суспензии одной концентрации, содержащей 4•10⁷ клеток/мл. Биотест проводят с использованием 2•50 мл клеточных суспензий в 9,5 см пластиковых чашках с 25 личинками второй возрастной стадии на чашку. Тестируют клетки, необработанные и прошедшие тепловую обработку (при 55^oС или при 80^oС в течение 10 минут). Смертность регистрируют спустя 2 дня, поддерживая температуру на уровне 25^oС (см. табл. 4).

Таким образом, эти результаты четко показывают, что клетки из X.nematophilus эффективны в качестве инсектицида при пероральном введении против насекомых ряда видов (и особенно эффективны в отношении P.brassicae). Инсектицидная активность не зависит от жизнеспособности клеток (то есть на нее в значительной степени не влияет тепловая обработка при 55^oС, которая уменьшает жизнеспособность клеток на >99,99%), но она в значительной степени снижается в результате тепловой обработки при 80^oС, которая денатурирует большинство белков.

ПРИМЕР 2
Применение надосадочной жидкости X.nematophilus в качестве инсектицида для перорального введения
Выращивание клеток: культуры выращивают по методике примера 1.

Получение надосадочной жидкости: культуры центрифугируют дважды при 1000 g в течение 10 минут. Клеточные осадки отбрасывают.

Активность надосадочной жидкости по отношению к насекомым: биотест выполняют следующим образом:
Активность в отношении неонатальных P.brassicae и личинок Pieris rapae и Plutella xylostella в возрасте двух дней определяют как и активность в отношении P.brassicae в примере 1, но с использованием серии необработанных разбавлений надосадочной жидкости вместо клеточных суспензий, причем смертность регистрируют только через 4 дня (см. табл.5).

Кроме того, на личинках, которые выращивали на искусственной среде, содержащей надосадочную жидкость X. nematophilus обнаруживают рострегуляторную активность (уменьшение размера личинок) в отношении Matestra brassicae (данные не приведены).

Таким образом, эти результаты четко показывают, что надосадочная жидкость из культуры X.nematophilus эффективна в качестве инсектицида при пероральном введении против ряда видов насекомых, и особенно активна в отношении P.brassicae.

Тепловая обработка надосадочных жидкостей при 55^oС в течение 10 минут вызывает частичную потерю активности, в то время как обработка при 80^oС вызывает полную потерю активности. Активность также полностью теряется в результате обработки SDS (0,1% мас./объем в течение 60 минут) и ацетоном (50% объем/объем), но не чувствительна к действию Triton X-100 (0,1%, 60 мин), нонидет NР40 (0,1, 60 минут), NaCl (IV в течение 60 минут) или к хранению при охлаждении до 4^oС или до -20^oС в течение 2 недель. Все эти свойства согласуются с белковым средством.

Общий механизм действия клеток и надосадочной жидкости X.nematophilus, то есть снижение размера личинки и гибель через 2 дня при высоких дозах, а также другие свойства, например стойкость к температурам, оказывается в равной степени вызывающимся единственным средством или типом средства, может быть ответственным за инсектицидную активность при пероральном введении как клеток, так и надосадочных жидкостей.

ПРИМЕР 3
Временная шкала появления инсектицидной активности при проглатывании
Выращивание клеток: 1 мл культуры X.nematophilus, которая выдерживалась в течение ночи, используют для инокуляции в колбу Эрленмейера (Erlenmeyer). Затем клетки выращивают по методике примера 1. Рост оценивают изменением оптической плотности при 600 нм.

Получение клеточной суспензии и надосадочных жидкостей: проводят по методике примеров 1 и 2.

Активность клеток и надосадочных жидкостей в отношении P.brassicae: биотест клеточной суспензии проводят по методике примера 1, но используя единственную дозу суспендированных клеток, эквивалентную 50 мкл бульона/г среды, и оценивая смертность через 2 дня. Биотест надосадочной жидкости клеток проводят по методике примера 2, но используя единственную дозу, эквивалентную 50 мкл надосадочной жидкости/г среда (то есть более чем двойная LC₅₀), и изменяя смертность через 2 дня.

Результаты представлены на фиг.2. Таким образом, эти результаты четко показывают, что клетки, полученные из культуральной среды X.nematophilus, являются высокоэффективными в отношении P.brassicae, спустя только 5 часов, и надосадочные жидкости являются высокоэффективными через 20 часов. Хотя наблюдается некоторый слабый лизис клеток на ранних стадиях роста, позднее значительного лизиса клеток не наблюдается, что говорит о том, что активность надосадочной жидкости может быть обусловлена аутеничным экстрацеллюлярным средством (в отличие от того, которое выделяется только после разрыва клетки).

ПРИМЕР 4
Синергизм между клетками X.nematophilus и порошкообразными препаратами B.thuringiensis
Выращивание клеток и получение суспензии: клетки X.nematophilus выращивают и суспендируют в соответствии с методикой примера 1. HD1 линию B.thuringiensis (от Bacillus Genetic Stock Centre, The Ohio State University, Columbs, Ohio 43210, USA) выращивают, собирают и приготавливают в виде порошка, как описано в публикации Dulmage et al. (1970). Invertebrate Pathology 15, 15-20.

Активность клеток Nematophilus и порошка B.thuringiensis в отношении Brassicae: биотест проводят при использовании в X.nematophilus в сочетании с B. thuringiensis или с использованием одного клеточного порошка B.thuringiensis. Биотест проводят по методике примера 1, но с различными разбавлениями порошка B.thuringiensis вместо X.nematophilus. Для испытания смеси постоянную дозу клеточной суспензии X.nematophilus, достаточную для получения 25% смертности, также добавляют к пище. Смертность регистрируют спустя 2 дня (см. табл.6).

Эти результаты четко показывают синергизм между клетками X.nematophilus и порошком B.thuringiensis при действии в качестве инсектицида при пероральном введении в отношении P.brassicae.

ПРИМЕР 5
Синергизм между надосадочными жидкостями X.nematophilus и порошком B. thuringiensis
Выращивание клеток и получение надосадочных жидкостей: клетки X.nematophilus выращивают и готовят надосадочные жидкости в соответствии с методикой примера 2. B.Thuringiensis выращивают и обрабатывают в соответствии с методикой примера 4.

Активность надосадочных жидкостей X.nematophilus и клеток порошка Bt в отношении P.brassicae:
Биотест проводят с использованием смеси надосадочных жидкостей X.nematophilus и B.thuringiensis. Биотест в отношении неонатальных P.brassicae и личинок Pieris rapae и Plutella xylostella в возрасте 2 дней проводят в соответствии с методикой примера 2, но используя различные разбавления B. thuringiensis вместо X.nematophilus. Для опыта со смесью в среду добавляют также постоянную дозу надосадочной жидкости X.nematophilus, достаточную для получения 25% смертности. Смертность регистрируют спустя 4 дня (см. табл.7).

Эти результаты четко показывают синергизм надосадочных жидкостей X.nematophilus и порошка B.thuringiensis при применении в качестве инсектицидов для перорального введения в отношении некоторых видов насекомых. Тот факт, что как клетки, так и надосадочные жидкости X.nematophilus, демонстрируют синергизм, четко говорит о том, что само средство или тип средства ответственно за проявленные активности.

ПРИМЕР 5 А
Характеристика инсектицидного средства из X.nematophilus посредством протеолиза
Выращивание клеток и получение надосадочных жидкостей: выращивание клеток X. nematophilus и получение надосадочных жидкостей проводят в соответствии с методикой примера 2.

Протеолиз надосадочных жидкостей: надосадочную жидкость культуры (50 мл) подвергают диализу против 0,5 М NaCl (3•1 л) в течение 48 часов при 4^oС. Объем надосадочной жидкости в пробирке для диализа уменьшают в пять раз с помощью полиэтиленгликоля 8000 (Sigma chemicals). Образцы удаляют и обрабатывают либо трипсином (Sigma Т8253=10000 единиц/мг), либо протеиназой К (Sigma Р0390=10 единиц/мг) при концентрации 0,1 мг протеазы/мл образца в течение 2 часов при 30^oС.

Активность обработанной надосадочной жидкости протеазой, в отношении P. brassicae: биотест в отношении неонатальных личинок P.brassicae: проводят, распределяя 25 мкл каждого "гидролизата" на поверхности искусственной среды на основе агара, как описано в примере 1, в пластиковых чашках диаметром 4,5 см. Для каждой обработки используют четыре чашки, каждая из которых содержит 10 личинок. Смертность регистрируют спустя 1 и 2 дня. Для сравнения таким же образом тестируют контрольные образцы, содержащие только воду, трипсин (0,1 мг/мл) и протеиназу К (0,1 мг/мл) (см. табл.8).

ПРИМЕР 6
Инсектицидная активность других Xenorhabdus
Используя методику примеров 1 и 2, испытывают четыре различных линии Xenorhabdus в отношении вредных насекомых.

Получают следующие результаты (см. табл.9, 10).

Было установлено, что инсектицидная активность клеток и надосадочной жидкости снижается более чем на 99%, когда все четыре линии выдерживают при 80^oС в течение 10 минут.

Таким образом, все линии значительно снижают рост Heliothis virescens.

ПРИМЕР 7
Клонирование генов токсина из линий Xenorhabdus
Тотальную клеточную ДНК выделяют из NCIMB 40887 и АТСС 19061, используя набор Quiagen для очистки геномной ДНК. Клетки выращивают в L-бульоне (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl на л) при 28^oС со встряхиванием (150 об/мин) до оптической плотности 1,5 А₆₀₀. Культуры собирают центрифугированием при 4000 • g, повторно суспендируют в 3,5 мл буфера В1 (50 мМ Tris/HCl, 0,05% Tween 20, 0,5% Triton X-100, рН 7,0) и инкубируют в течение 30 минут при 50^oС. ДНК выделяют из бактериальных лизатов, используя наконечники Quiagen 100/G в соответствии с инструкциями производителей. Полученную очищенную ДНК хранят при -20^oС в ТЕ буфере (10 мМ Tris, 1 мМ EDTA, рН 8,0).

Представительный банк ДНК получают, используя тотальную ДНК NCIMB 40887 и АТСС 19061, частично расщепляли рестрикционным ферментом Sau3a. Приблизительно 20 мкг ДНК из каждой линии инкубируют при 37^oС с 0,25 единицами фермента. С интервалом 10, 20, 30, 45 и 60 минут образцы отбирают, нагревают до 65^oС и выдерживают при этой температуре в течение 15 минут. Для определения размеров фрагментов ДНК образцы разделяют электрофорезом в 0,5% (мас./объем) агарозных гелях.

Образцы ДНК с наивысшим содержанием фрагментов размером от 30 до 50 т.п. н. объединяют и обрабатывают 4 единицами щелочной фосфатазы креветки (Boehringer) в течение 15 минут при 37^oС с последующей тепловой обработкой при 65^oС для инактивации фосфатазы.

Фрагменты ДНК отобранного размера лигируют в BamH1 сайт космиды SuperCos (Stratagent) и упаковывают с помощью Еscherichia coli линии XL Blue 1, используя упаковочный набор Gigapack II (Stratgene) в соответствии с инструкциями производителей.

Для отбора для космидных клонов с инсектицидной активностью отдельные колонии, выбранные на L агарных чашках, содержащих 25 мг/мл ампициллина, выращивают в L бульоне (содержащем 25 мкг/мл ампициллина) в течение ночи при 28^oС. Культуры бульона (50 мкл) распределяют отдельно по поверхности среды для выращивания насекомых, помещенного в чашки диаметром 4,5 см, как описано в примере 5. В каждый контейнер добавляют по 10 неонатальных личинок P. brassicae. Личинки проверяют спустя 24, 72 и 96 часов, регистрируя смертность и размер выживших личинок. Всего тестируют 220 клонов NCIMB 40887, из которых, как установлено, два вызывают уменьшение роста личинок и гибель в пределах 72 часов. Их 370 клонов из АТСС 19061 обнаружен один, который вызывает гибель личинок в течение 72 часов.

ПРИМЕР 8
Активность клонированных генов токсина в отношении Pieris brassicae
Три активных клона из примера 7 выращивают в L-бульоне, содержащем 25 мкг/мл ампициллина, в течение 24 часов при 28^oС на шюттель-аппарате с круговым вращением при скорости вращения 150 об/мин. Активность клонов токсина по отношению к неонатальным личинкам определяют введением цельных бульонных культур в среду насекомых (см. табл.11), как описано в примере 1.

Когда клоны токсина E. coli выдерживают при 80^oС в течение 10 минут и добавляют в среду в дозе 100 мкл/г, активность в отношении личинок не обнаруживают, что говорит о чувствительности токсинов к нагреванию.

ПРИМЕР 9
Секвенирование клонированных токсинов из NCIMB 40887
Космидную ДНК инсектицидного клона 1, описанного выше, из NCIMB 40887 очищают, используя систему Wizard Plus SV DNA (Promega) в соответствии с инструкциями производителей. Частичную карту клонированного фрагмента получают для рестрикционных ферментов EcoR1, BamH1, HindIII, Sal1 и Sac1, как показано на фигуре 3. Секвенирование ДНК начинают от pUC18 и pUC19 основного субклона космиды, используя ферменты EcoR1, BamH1, Hind, EcoRV и PvuII. Бреши в определяемой последовательности заполняют, используя метод "рассеянной затравки" с очищенной космидной ДНК. Последовательность реакций выполняют, используя набор ABI PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit с AmmpliTag ДНК, полимеразой FS в соответствии с инструкциями производителей. Образцы анализируют на автоматическом секвенаторе марки ABI в соответствии с инструкциями производителей. Основная часть последовательности ДНК для фрагмента клонированного токсина показана на фигуре 2.

ПРИМЕР 10
Рестриктная карта клонированного токсина клона 3
Космидную ДНК инсектицидного клона 3, описанного выше, очищают по методике примера 9. Рестриктную карту клонированного фрагмента, представленную на фигуре 3, получают для рестрикционных ферментов BamH1, HindIII, Sal1 и Sac1. При сравнении с картой клона 1 (фигура 3) ясно, что карты перекрывающихся областей очень схожи.

Единственное обнаруженное отличие между двумя клонами состоит в уменьшении размера двух HindIII фрагментов в клоне 3, соответствующих 11,4 т.п.н. и 7,2 т. п. н. и HindIII фрагментов клона 1 размером приблизительно 2 т.п.н и 200 п. н. соответственно. Эти результаты показывают полное сходство области ДНК, кодирующей токсичность двух бактериальных линий.

ПРИМЕР 11
Опыты гибридизации с использованием саузерн-блоттинга
Фрагмент BamH1-Sal1 ДНК из клона 1 размером 10,3 т.п.н. используют в качестве зонда для гибридизации с тотальной ДНК Xenorhabdus линий АТСС 19061, NCIMB 40886 и NCIMB 40887, расщепленной HindIII. Гибридизацию проводят с 20 нг/мл DIG-меченного зонда ДНК при 65^oС в течение 18 часов. Фильтры отмывают перед иммунологическим детектированием дважды в течение 5 минут 2 x SSC (0,3М NaCl, 30 мМ цитрата натрия, рН 7,0), 0,1% (мас./объем) SDS при комнатной температуре и дважды в течение 15 минут 0,1 x SSC (15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрата натрия, рН 7,0) с 0,1% SDS при 65^oС. Зонд метят и опыты проводят в соответствии с инструкциями производителей, используя набор для нерадиоактивного DIG-мечения и детектирования ДНК (Boehringer). Зонд гибридизуется с HindIII фрагментом размером приблизительно 8 т.п.н. во всех трех линиях, а также с фрагментом NCIMB размером 11,4 т.п.н. и фрагментом размером приблизительно 9 т.п.н. в линиях NCIMB 40886 и АТСС 19061. Эти результаты показывают, что линии NCIMB 40886 и АТСС 19061 содержат ДНК с близкой гомологией к гену токсина клона 1, описанному выше, подтверждая схожесть между токсинами, полученными с помощью трех линий.

Claims

1. Рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, который представляет собой инсектицидное средство, и включающая нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг.2, или ее вариант, или ее фрагмент, где указанный вариант или фрагмент гибридизуется в строгих условиях с частью или полной последовательностью, приведенной на фиг.2, происходит от Xenorhabdus nematophilus и кодирует белковый продукт, обладающий инсектицидной активностью.

2. Рекомбинантная ДНК по п.1, содержащая последовательность, приведенную на фиг.2.

3. Рекомбинантная ДНК по п.1 или 2, которая представляет собой экспрессирующий вектор.

4. Рекомбинантная ДНК по п.3, введенная в клетку.

5. Рекомбинантная ДНК по п.4, где указанной клеткой является клетка растения.

6. Инсектицидное средство, представляющее собой белок, который кодируется ДНК по п.1.

7. Штамм бактерий Xenorhabdus nematophilus NCIMB 40886, продуцирующий белок по п.6, обладающий инсектицидной активностью.

8. Штамм бактерий Xenorhabdus nematophilus NCIMB 40887, продуцирующий белок по п.6, обладающий инсектицидной активностью.

9. Инсектицидное средство, содержащее клетки бактерий Xenorhabdus nematophilus NCIMB 40886, или клетки бактерий Xenorhabdus nematophilus NCIMB 40887, или надосадочную жидкость культуры клеток любого из двух указанных штаммов.

10. Инсектицидная композиция, включающая средство по п.6 и дополнительный пестицидный материал, который может быть получен из В. thuringiensis, в эффективном количестве.

11. Композиция по п.10, которая дополнительно включает клетки из В. thuringiensis.

12. Композиция по п.10, где пестицидные материалы, которые могут быть получены из В. thuringiensis, включают дельта-эндотоксин.

13. Композиция по любому из пп.10-12, которая дополнительно включает приемлемый для использования в сельском хозяйстве носитель.

14. Композиция по п.13, в которой носитель включает компоненты пищи насекомого.

15. Способ борьбы с насекомыми-вредителями путем перорального введения вредителю или введения в среду его обитания средства по п.6, штамма бактерий по п.7 или 8, средства по п.9 или композиции по любому из пп.10-14.

16. Способ по п.15, где вредителями являются насекомые отряда Lepidoptera или Diptera.