JPH04505250A - 細菌遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌遺伝子 本発明は、新規な細菌遺伝子、及び細菌バチルス・スリンジこンシス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の新規菌株、並びにそれらの使用法に 関する。

細菌バチルス・スリンジエンシスは、昆虫の幼虫を殺す結晶性蛋白質である菌体 内毒素（エンドトキンンともいう）を産生ずる。しかしながら、該菌体内毒素は 唾乳動物に対しては毒性を示さない。従って、該菌体内毒素は農業用殺虫剤とし て、特に鱗翅目昆虫、甲虫目昆虫及び双翅目昆虫に対する殺虫剤として極めて有 用である。バチルス・スリンジエンシスの種々の菌株は、農業用殺虫剤として長 年の間使用されている。

甲虫目害虫に対して活性なバチルス・スリンジエンシスの最も広く特性が明らか にされた菌株は、ザ・ジャーマン・コレクション・オブ・ミクロオルガニスムズ ［（ｔｈｅ　Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ ｎｉｓｍｓ）すなわちＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｃｒ ｏｏｒｇａｎｉｓｍ〕に寄託番号ＤＳＭ　２８０３として寄託されであるような 、バチルス・スリンジエンシスの変種株であるテネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉ ｏｎｉｓ　）株である。本発明者らは今般、ＤＳＭ２８０３に大体において類似 した特性を有するが、ディアブロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属の甲虫目幼虫 に対する特異的な殺虫活性と鱗翅目幼虫に対する毒性とによりＤＳＭ２８０３と 区別されるバチルス・スリンジエンシスの複数の新規菌株を見出だした。これら の菌株の新規な特性は、これらの菌株か含をしている新規な遺伝子によって生じ るものと思われる。

本発明者らは本発明によって、ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダ ストリアル・アンド・マリン・バクテリアにそれぞれ寄託番号ＮＣＩＢ　４００ ９１及びＮＣＩＢ　４００９０として寄託されである、バチルス・スリンジエン シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の新規菌株ＪＨＣＣ４ ８３５及びＪＨＣＣ４３５３を提供する。

また、本発明者らは、前記の菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３５３から単 離可能な新規な複数のδ−菌体内毒素遺伝子を提供する。かかる遺伝子は、細菌 染色体又はプラスミドのいずれかに配置（ｌｏｃａｔｅ）され得ると思われる。

別の聾様によれば、本発明は、添付の図５〜ＩＯに示したＤＮＡ配列であって、 分子量約８１２キロダルトンの新規な殺虫的に活性なδ−菌体内毒素（以下、″ ８１ｋＤ菌体内毒素゛という）をコードするＤＮＡ配列と相同性（ｈｏｍｏｇｅ ｎｅｏｕｓ　ｖｉｔｈ）の組換えＤＮＡを包含する。本発明の具体的な聾様にお いては、殺虫性菌体内毒素をコードする組換えＤＮＡは、バチルス・スリンジエ ンシスＪＨＣＣ４８３５からす・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダス トリアル・アンド・マリン・バクテリアにそれぞれ寄託番号４０２７５及び４０ ２７８として寄託されである大腸菌株ＢＬ２１＃１ＪＨ１１及びＭＣ１０２２／ ｐＪＨ１２中にクローンされている。後者の寄託菌株中の菌体内毒素遺伝子は、 鱗翅目に特異性である。即ち、鱗翅目に特異的に有効な内毒素をコードする。ま た本発明者らは、バチルス・スリンジエンシスの菌株ＪＨＣＣ４１１３５から誘 導される鱗翅目に特異的に有効な内毒素を産生ずる第２の菌体内毒素遺伝子をコ ードする組換えＤＮＡを提供する。該組換えＤＮＡは、バクテリオファージλＥ ＭＢＬ４クローンＣＬ　５の形態てザ・ナショナル・コレクションス・オブ・イ ンダストリアル・アント・マリン・バクテリアに寄託番号４０２７９として寄託 されである。　本発明の組換えＤＮＡは、殺虫的に活性な蛋白質をコートする種 々の長さの遺伝子を含有し得る。細菌染色体由来のＤＮＡをクローニングする場 合には、バクテリオファージλヘクター類を使用するか又は相同性の組換え体を 生起する宿主細胞酵素から組換えＤＮＡを切り取る（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）他の クローニングヘツタ−類を使用することが好都合である。

発明者らはまた、殺虫剤組成物において該組成物が前記の菌株Ｊｌ（ＣＣ４８３ ５、ＪＨＣＣ４３５３及び大腸菌［３Ｌ２１／Ｉ）ＪＨＩＩにより産生されたδ −菌体内毒素を含有することを特徴とする新規な殺虫剤組成物を提供し、さらに 前記の菌株ＪＨＣＣ４３５３、ＪＨＣＣ４８３５及び大腸菌ＢＬ２１／Ｉ）ＪＨ ｌｌにより産生されたδ−菌体内毒素に前記の鱗翅目及び甲虫目の幼虫を暴露さ せることからなる害虫の襲撃から植物を保護する方法を提供する。

前記の菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３５３は、それぞれアメリカ合衆国 アイオワ用マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌ　ｌ）及びアメリカ合衆国アイオワ州ダ ラスで採取した土壌がら単離される。コロニーの形態学的性状においては、上記 の菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３５３は、大体においてＤＳＭ　２８０ ３に類似しており、しかも鱗翅目幼虫に対して殺虫性である菌株）ｆＤ−１に類 似している。

本発明の菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３５３の形態学的性状は、第１表 において公知の菌株の形態学的性状と比較される。

新規菌株と公知菌株の生化学的特性は、第２表〜第４表において比較される。こ れらの菌株同志の間には多くの類似性かあることか認められる。

これらの生化学的類似性からみて、大腸菌ＢＬ２１／ｐＪＨ１Ｉ中の１ｌＩｋＤ Ｗ体内毒素をコートする遺伝子が、ＤＳＭ　２８０３のバチルス・スリンジエン シス変種株テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ　）の菌体内毒素遺伝子に 対して極めてわずかのＤＮＡ配列相同性しか示さないことは予想外のことである 。比較的穏やかな緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下（３７°Ｃて３Ｘ標準ク エン酸塩溶液で）で、ＤＮＡプローブとしてバチルス・スリンジエンシスの変種 株テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ　）の菌体内毒素遺伝子をコードす る配列を使用することは、菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３５３中の上記 菌体内毒素遺伝子をコードする配列から信号を発生させるのには十分てはない。

同様に、バチルス・スリンジエンシスの変種株ｋｕｒｓｔａｋｉ特表平４−５０ ５２５０　（３） 株由来の鱗翅目特異性のＣｒｙｌＡ　（Ｃ）　（この命名系は、Ｈ６ｆｔｅとＶ ｈｉｔｅｌｙによる論文、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　Ｒｅｖｉｅｗｓ。

５３．２４２−２５５（１９ｇ９）に記載されている〕菌体内毒素遺伝子をコー ドする配列を使用することは、８１ｋＤ菌体内毒素をコードする配列からＤＮＡ バイブリド形成信号を発生させるのには十分ではない。また、前記の新規遺伝子 をコードする配列をＤＮＡプローブとして使用すると、テネブリオニス（ｔｅｎ ｅｂｒｉｏｎｉｓ　）遺伝子又は前記の３種のＣｒｙｌＡ遺伝子からバイブリド 形成信号を発生しない。

本発明の新規に見出されたバチルス・スリンジエンシス菌株ＪＩＩＣＣ４８３５ 及びＪＩＩＣＣ４３５３は、菌株ＤＳＭ　２８０３と比べて殺虫活性において著 しく異なる特異性を示す。

特に、ＪＩＩＣＣ４８３５及びＪＩＩＣＧ　４３５３は、これらがディアブロチ 力種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｓｐｐ、）に対して特異的に殺幼虫性であるとい う点において、甲虫に対して公知の甲虫目殺虫活性のバチルス・スリンジエンシ ス菌株よりも選択性を示す。さらにまた、菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪｌｌＣＣ ４３５３は、鱗翅目害虫に対して殺幼虫性であるが、これに対して菌株ＤＳＭ　 ２８０３は、鱗翅目害虫に対して殺幼虫性ではない。分子レベルでは、バチルス ・スリンジエンシス菌株ＪＩＩＣＣ４８３５及び４３５３中の新規に見出された 遺伝子は、菌株ＤＳＭ　２８０３中の甲虫目特異性の菌体内毒素遺伝子と比べて 、又はｌＩＤ−１及び他の変種株ｋｕｒｓ比べて著しく異なる殺虫活性スペクト ラムを示す遺伝子生産物をコードする。

上記の新規な菌体内毒素遺伝子は、全く新規な活性スペクトラムを有する８１， ２キロダルトンの菌体内毒素をコートする。該菌体内毒素は、鱗翅目幼虫及び甲 虫目幼虫の両方に対して毒性を示す。このことは、上記の菌体内毒素遺伝子を誘 導するバチルス・スリンジエンシス菌株が、必すしも甲虫目全体に対して毒性を 示さず、むしろディアブロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）特異性であることから して特に予想外のことである。この知見に関する可能な説明としては、微生物か 産生ずる結晶中における上記蛋白質の濃度か低い二と、該結晶中で上記蛋白質に 接近し難いこと、上記結晶蛋白質中において前記毒素がある種の昆虫の腸内て活 性体に転化されないプロトキシンとして存在する二と、又は他のこれまで認譚さ れていない要因か挙げ得る。

本発明のバチルス・スリンジエンシス菌株は、ザ・ナショナル・コレクションズ ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリアから入手されるＮＣｌ Ｂ４Ｏ０９１又は４００９０の菌株試料を適当な培地中で適当な条件下で培養す ることによって必要とされる量を調製し得る。かかる培養条件及び培地は当業者 には周知である。例えば、培地は、一般的には窒素源（例えば、魚肉蛋白質）や 炭水化物源例えば澱粉を含有する。適）　当な培養条件としては、１５〜４５℃ の範囲内の温度及びほぼ中性のｐＨが挙げられる。培養は回分式で典型的には３ 〜５日間行うのが好都合である。

本発明のクローンされた菌体内毒素遺伝子を保持する大腸菌株は、細胞を固体栄 養培地（例えば、Ｌ寒天）上で定常期まで増殖させ、その後に細胞増殖物を培地 表面から削り取り、凍結乾燥し、次いて凍結し、その後に殺虫性物質を溶解し次 いで量り分けすることによって調製し得る。

本発明の殺虫剤組成物は、培養液から濃縮することにより、例えば遠心分離する か又は濾過し、その後に所望の適当な配合剤を添加することによって製造し得る 。有用であり得る配合剤としては、例えば界面活性剤例えば湿潤剤、固体希釈剤 、分散剤及びＵ■安定剤が挙げられる。所望ならば、固体組成物を公知の方法で 調製し得る。

本発明の甲虫目又は鱗翅目のδ−菌体内毒素感受性昆虫による虫害から植物を保 護する方法は、一般に昆虫か蔓延している植物又は昆虫か蔓延しそうな植物を、 希釈剤例えば水で希釈した前記の殺虫剤組成物で処理する（噴霧する）ことによ って実施される。該殺虫剤の有効成分は前記の有毒性のδ−菌体内毒素である。

所望ならば、該殺虫剤有効成分は、上記δ−菌体内毒素を産生ずる細菌から独立 して、植物に又は該植物に蔓延する昆虫に施用し得る。しかしなから、前記の細 菌バチルス・スリンジエンシスから上記の結晶性蛋白質を分離すること又は大腸 菌からクローン化（ｃｌｏｎｅｄ）遺伝子産生物を分離することは一般に必要か ない。

本発明の方法を実施する別の方法は、虫害（ｉｎｓｅｃｔａｔｔａｃｋ）に感受 性の植物かその生体内の現場で前記δ−菌体内毒素を産生ずるように準備、設定 する（ａｒｒａｎｇｅ＞ことである。これは菌株ＮＣＩＢ　４００９０又は４０ ０９１からδ−菌体内毒素遺伝子を公知の方法でクローンニングし、植物体内に 該遺伝子の発現を生起させるプロモーター配列（例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモー ター）を該遺伝子に具備させ、次いて虫害に感受性の植物を公知の方法で形質転 換させることによって行われる。適当な形質転換法としては、アクロバクテリウ ム媒介の双子葉植物の形質転換用のＴｉプラスミドの使用、又は直接ＤＮＡ接種 （ｕｐｔａｋｅ）法例えば胚ミクロ注入法、又はミクロ投射物の次後のプロトプ ラスト再生法の使用か挙げられる。遺伝子の発現の程度を最大規模で得るために は、プロモーター配列は適切に選択され且つ操作されるべきてあり、また他の諸 因子（例えば、フトンの使用）か植物体内で（ｉｎ　ｐｌａｎｔａ　）発現を最 大にするために適合させられるべきである。

本発明の方法により防除される甲虫目幼虫は種々の種であり得る。上記のように 、本発明のバチルス・スリンジエンシス株はディアブロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔ　 １ｃａ）、例えば以下の第５Ａ表に示したディアブロチ力のみを殺５　す。一方 、本発明のクローン化遺伝子由来の殺虫性産特表平４−５０５２５０　（４） 生物は、そのうえ更に別の甲虫目幼虫も殺す。

（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃｏｒ ｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）（ Ｍｅｘｉｃａｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）ハンプノド−Ｄｉａｂｒｏｔｉ ｃａ　ｂａｌｔｅａｔａキュウカンバ鳴ビートル （Ｂａｎｄｅｄ　Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　Ｂｅｅｔｌｅ）（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｓｐｏ ｔｔｅｄ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　Ｂｅｅｔｌｅ） 本発明の方法により防除される鱗翅目幼虫としては、第５Ｂ表に示したものか挙 げられる。

第５Ｂ表 タバコガ　Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓオオタバコガ　Ｈｅ１ｉｏ ｔｈｆｓ　ｚｅａアワツメイガ　０ｓｔｒｆｎｆａ　ｎｕｂｆｌａｌｆｓクマナ キンウワバガ　Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｊａ　ｎｉコナガ　Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘ ｙｌｏｓｔｅｌｌａコアオヨトウ　５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ ａシロイチモジョトウ　５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ本発明の方法は、 甲虫目昆虫〔バチルス・スリンジエンシス菌株が使用される場合には、ディアブ ロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）　）又は鱗翅目昆虫か蔓延しやすい種々様々な 植物を保護するのに使用し得る。本発明の方法により保護される市販の重要な植 物の具体例は、トウモロコシ、トマト類、ジャガイモ類、ワタ、タバコ及びウリ 類である。

バチルス・スリンジエンシスＪＨＣＣ４８３５及び４３５３は、鞄毛抗原に対す る抗体を用いる試験による変種ｋｕｒｓｔａｋｉ株である。今日まで、変種ｋｕ ｒｓｔａｋｉ株については、鱗翅目幼虫に対する殺虫効果のみが知られている。

これらの菌株ＪＨＣＣ４８３５及び４３５３及びアイ・シー・アイ（ＩＣＩ）社 によって本出願以前に文献記載された全く別ノｋｕｒｓｔａｋｉ株（例えば、す ・ナショナル・コレクンヨンズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バ クテリアに寄託番号、’１１ＣＩＢ　１２５７０として寄託されである菌株Ａ２ ０及び本出願人の先願である１９８７年１２月２４日付は出願の英国特許出願第 ８７３（１１３２号の主題のもの）か、これらの予期される鱗翅目昆虫に対する 活性のほかに、ディアブロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）　Ｒの甲虫目幼虫に対 して活性であることは予想外のことである。さらにまた、８１ｋＤ菌体内毒素遺 伝子をハイブリダイゼーションプローブとして使用する場合には、強くハイブリ ダイシングする配列が、染色体と、別の公知バチルス・スリンジエンシス菌株由 来のプラスミドＤＮＡ試料との同友において認めることができる。これら公知の 菌株としらず、本発明の８１ｋＤ菌体内毒素遺伝子は、未た文献に記載されてい ないか、あるいは上記の菌株又は他のバチルス・スリンジエンシス株中に存在す るものとして認められていない。

本発明は添付図面を参照してさらによく理解し得る。

添付図面において、 図１は、組換えプラスミドｐＪＨ１ｌ中のクローン化８１ｋＤ菌体内毒素遺伝子 の誘導を図解的に示すものであり。

図２は、ｐＪＨＩ　Ｌの構造、並びに同一のベクター系（ＰＴ７１２）中にクロ ーンされ、それぞれｐｌｃ２２６及びｐｌｃ２２８と命名される、甲虫目昆虫特 異性のテネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）型遺伝子及びＣｒｙＡ　６． Ｂ型遺伝子の構造を図解的に示すものであり。

図３は、組換えプラスミドｐＪＨ１２中のクローン化された鱗翅目特異性の菌体 内毒素遺伝子の構造を図解的に示すものであり。

図４は、組換えλクローンＣＬＳ中のクローン化された鱗翅目特異性の菌体内毒 素遺伝子の構造を図解的に示すものであり、 図５〜１０は、ｐ」旧１によって保持される８１ｋＤ菌体内毒素遺伝子の塩基配 列、アミノ酸配列及び主要な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示すものであり 。

図１１は、ウェスタン・コーン・ルートウオーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　 Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）の第−齢期幼虫に対する組換え大腸菌株ＭＣ１０２２＃１ｌ Ｃ２４４の処理後４日目の効果を試験する個々の１２個の生物検定値の平均値を グラフにより示すものであり。

図１２は、ウェスタン・コーン・ルートウオームの第−齢期幼虫に対する組換え 大腸菌株ＭＣ１０２２／ｐｌＣ２４４の処理後５日目の効果を試験する個々の１ ２個の生物検定値の平均値をグラフにより示すものである。

また図１については、この図解図においてスケール（ｓｃａｌｅ）に対して描か れていないか、Ｎは制限エンド限部位はクローン化ＤＮＡ中にあり、これに対し て制限地図の下の制限部位はベクター中にある。丸括弧は、フレノウＤ　Ｎ　Ａ ポリメラーゼを用いて２本鎖からなる特表千４−５０５２５０　（５） ＤＮＡ分子内の切れ目のある１本鎖の切れ目を埋めること（ｒｉｌｌｉｎｇ−ｉ ｎ）によって機能しないようにされた部位を示す。ダッシュ線（ｄａｓｈｅｄ　 １ｉｎｅ）はｐＵｃ　１９ベクターＤＮＡを表わす。点線はクローンｐＪＨ１ｌ 中のＰＴ７１２ベクターＤＮＡを表わし、また矢じり形（ａｒｒｏｗｈｅａｄ） はバクテリオファージエフプロモーターを表わす。星印は３２ｐで標識したＤＮ Ａ断片を表わす。

図２において、制限地図の下の数値はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位と転 写解読枠の始点との間の塩基対の数を表わす。大きな矢しり形は、バクテリオフ ァージエフプロモーターを表わす。２丁７１２中の立体形ブロック（ｓｏｌｉｄ 　ｂｌｏｃｋ）はクローニング部位を表わし、Ｈ−Ｈｉｎｄ　Ｉ［［及びＳ−Ｓ ｍａｆである。Ａｐ　Ｒはアンピシリン耐性をコードする遺伝子を示す。

図３において、開放箱形（オーブンボックス）は約７キロ塩基対の長さのクコー ン化断片を表わす。ダッシュ線は１）ＵＣ１９ベクターＤＮＡを示し、ＡｐＲは アンピンリン耐性をコードする遺伝子でる。丸括弧は、ＮＤｅ工制限部位を示し 、該部位は示された領域内にほんの暫定的に置かれている。他の制限部位は、Ｄ 、Ｅ、Ｈ及びＮにより表わされ、Ｄ−Ｄｒａｌ　、Ｅ−ＥｃｏＲｌ　＝　Ｈ−Ｈ ｉｎｄ　ｍ及びＮ−Ｎｄｅｌである。

図４については、示されたわずかなＥｃｏＲＩ　（Ｅ）制限部位は、そこでλベ クターとクローン化挿入断片とが結合されている部位である。複数の転写解読枠 （ＯＲＦｓと略記する）は制限地図の上の矢印により示される。

制限地図の上の数値は、複数の選択されたＨＩｎｄ　ｍ断片のおおよその断片の 長さである。示されたＣＩａＩ（Ｃ）制限部位は挿入断片内の唯一のＣ１ａｒ（ Ｃ）制限部位ではない。図解図においてスケールに対して描かれていないが、ク ローンされた挿入断片は約１６キロ塩基対の長さである。

図５〜】０は、８１ｋＤ菌体内毒素遺伝子とフランキング（ｆ　Ｉａｎｋｉｎｇ ）　Ｄ　Ｎ　Ａとをコートすル遺伝子ノ塩基配列、アミノ酸配列及び主要な制限 部位を示す。転写解読枠は塩基番号３５５て始まり、終始（Ｔｅｒ）コドンＴＡ ＧのうちのＧをもつ塩基番号２５１４て終わる。

図ＩＩは、ウェスタン・コーン・ルートウオームに対するクローン化菌体内毒素 遺伝子産生物の処理後４日目（ＤＡＴ）の生物検定値のグラフ表示である。

図１２は、ウェスタン・コーン・ルートウオームに対するクローン化菌体内毒素 遺伝子産生物の処理後５日目（ＤＡＴ）の生物検定値のグラフ表示である。グラ フの点は、所定の施用量での死生率の平均値である。

本発明を以下の実施例により説明する。

実施例１ 本発明のバチルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８３５の単離 土壌試料を、その５０ｇを０５％ペプトン４５ｍ　ｌ中に装入することにより希 釈してｌＯ〜ｌ希釈液を得、その後に乳化させた。次いて、この希釈液試料を湯 浴中で６０℃に１０分間加熱した。次いて連続希釈液を調製し、その後に得られ た１０−３〜１０−’希釈液の０．１ｍｌを、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓｕ）選択寒天平板培地〔バチルス・セレウス寒天基剤、オ キソイド（Ｏｘｏｊｄ）社製〕とエスクリン（ｅｓｃｕｌ　ｉｎ）寒天平板培地 （水１ｐ当たりのｇ数て：エスクリンＬ、Ｏｇ；クエン酸第二鉄（１，５，ｇ、 ペプトン１０ｇ　；　ＮａＣ１５ｇ　；オキソイド寒天１０ｇ）とに塗抹した。

塗抹平板にした試料を３０℃で５日間培養した。

潜在しているバチルス・スリンジエンシスのコロニー（集落ともいう）のスライ ドガラス試料を作り、スミルノフ（Ｓｍｉｒｎｏｆｆ）染色法によって染色し、 染色された副胞子（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ）の結晶の存在を顕微鏡で倍率１００ ０倍で調べた。

結晶が認められた陽性コロニーを、純粋培養物を確実に収得するためにＬ寒天（ ｌｉｔ当たり、トリプトン１０ｇ１酵母エキスＬｏｇ　、　ＮａＣｌ　５ｇ　、 寒天１０ｇ）上に画線塗抹し、３０℃で培養した。純化したコロニーをＬブイヨ ン中で１夜培養し、培養後に等容の８０％滅菌グリセロールを添加し、その後に 一７０℃で保存した。

バチルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４３５３を同様の方法で単離した（ｅ Ｘｔｒｕｃｔｅｄ）。

実施例２ バチルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８３５株及びＪｌ（ＣＣ４３５３株 の固体培地上での増殖接種試料をグリセロール保存ガラス瓶（ｖｉａｌ）がらＬ 寒天平板上に移植し純度を調べた。次いて、コロニーの標本を掻き取って使用し て、５ｎ＋Ｉのブイヨン（１４７当たりに、トリプトン１０ｇ、酵母エキス１０ ｇ　、　ＮａＣｌ　Ｓｇ）に接種し、その後に３０℃で３〜５時間振盪培養した 。

次いで、この培養物の１ミリリツトルを使用してＣＲＬＮｏ、ｌ寒天培地（水１ Ｉ当たりのｇ数又はｍＩ数で：普通ブイヨン８ｇ１グルコース６ｇ：酵母エキス ５ｇｌキシロース０．５ｇ、綿実粉エキス３０＋＋＋ｌ　；コーン浸液３．２ｍ ｌ：マリ−・メンデル（Ｍａｒｙ　Ｍｅｎｄｅｌ）の塩混合物１ｍｌ；オキソイ ド寒天１５ｍ１）　３００ｍ１を入れた調製用ベトリ皿（２１釦ｍｘ２１０酊） に接種した。マリ−・メンデルの塩混合物の組成は次の通りである マリ−・メンデル塩 蒸留水　４９５ｍ１ ｉＨｃｌ　５ｍ１ ＦｅＳＯ４２，５ｇ Ｍｎ５Ｏｎ・Ｈ＋Ｏ又はＭｎＣｌ２・４１１２０　０．９８ｇＺｎＣｌ　２又は Ｚｎ５Ｏ＜’４１１ｚ０　１．７６ｇ培養物を３０℃で５時間培養した。次いて 、寒天表口から融合増殖物を削り取ることによって細胞、胞子及び結晶を収穫し 、その後に凍結乾燥した。

実施例３ 本発明のバチルス・スリンジエンンス菌株ＪＩＩＣＣ４８３５株及びＪＩＩＣＣ ４３５３株の液体培地中での増殖特表平４−５０５２５０　（ｅ５） 接種試料をグリセロール保存ガラス瓶（ｖｉａｌ）から、ＣＲＬＮｏ、１培地（ 水１ｐ当たりのｇ数又は１数て：普通ブイヨン８ｇニゲルコース６ｇ：酵母エキ ス５ｇ：キシロース０．５ｇ　、綿実粉エキス３０１：コーン浸液３．２＋ｎｌ ：マリ−メンデルの塩混合物Ｌａ１ｌ）　１００ｍ１を入れた２５ｏ１エルレン マイヤーフラスコに移植し、３０℃で３４００ｒｐｍで攪拌しながら培養した。

２４時間後に、得られた１００ｍｌ全量を使用して２Ｌフラスコに入れた上記と 同一の培地１リツトルに接種した。これを攪拌しながら３０’Ｃて５日間培養し た。次いで、細胞、胞子及び結晶を遠心分離することにより集菌し、ダルメージ （Ｄｕ１ｇ＋ａｇｅ）法を用いてアセトンで沈降させた。

実施例４ 本発明の製剤 ＪＨＣＣ４３５３株又はＪＨＣＣ４８３５株は、前記の培養サイクルの完了時に 実施例２に記載の培養液がらまずバチルス・スリンジエンシスの胞子と結晶とを 分離することによって収穫できる。回収した胞子と結晶とを水１゜Ｏａｌに再懸 濁し、次いでＭｏｒｗｅｔ　Ｄ−４２５（分散剤）　４．９ｇ、ＶｅｅｇｕＩＩ ＨＶ（懸濁剤）　４．９ｇＳＴｗｅｅｎ　８０　（湿潤剤）　４．９０１１及び ５ｏｒｂｏ（凍結防止剤）　２４．４ａ＋Ｉを加えることによって濃厚液剤に製 剤した。上記の各成分は上記した順序で別々に加えた。得られた生成物は、使用 前は４℃て保存した。

実施例５ バチルス・スリンジエンシス菌株４８３５からの、プラスミド由来の菌体内毒素 遺伝子のクローニングバチルス・スリンジエンシス菌株４８３５から調製した共 有結合閉環状Ｃｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ｃｌｏｓｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　（以 下、ＣＣＣと略記する）〕ププラスミド由来から、菌体内毒素遺伝子を次のよう にしてクローニングした。

菌株４８３５の培養液５００ａ＋Ｉを、Ｌブイヨン中で３７℃で振盪しなから８ （１０ｎＩ１１の波長における吸光度の値が１，００光学密度（以下、０．Ｄと 略記する）ユニットになるまで増殖させた。細胞を４℃で１０分間、１分間当た りの回転数（以下、ｒｐｏｌと略記する）　ｇｏｏｏで遠心分離することにより 収穫し、次いてＴＥ緩衝液（５０ＩＩＩＭトリスＨＣｌｐＨ７，６，２ＯｎＭ　 ＥＤＴＡ）５ｍｌ中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、ドデンル硫酸ナトリ ウム（以下、ＳＤＳと略記する）１％と０．０８５Ｍ　）ＪａＯＨ５Ｉ）ＨＬ２ ．４とを含むＴＥ緩衝液９５１に加える。該細胞懸濁液の溶解（ｌｙｓｉｓ）が 室温での培養中に生じる。次いて、得られた細胞溶解物に１０％ＳＤＳ　１ｏ１ １１を加えた。得られた溶液を穏やかに混合した後に、穏やかに攪拌しながら２ ＭトリスＨＣＩ　ｐＨ７，０１０１ｍｌを徐々に加えた。５Ｍ　ＮａＣｌ　３４ ｍ１を加え、得られた溶液を十分に混合した後に氷水上で１夜インキュベート。

細胞溶解物を４℃で１５分間９０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清を新し い遠心分離管に注意深く移し、その後にＴＥ緩衝液に溶解した５０９６ポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）　６０（ｌ溶液３６１を加えた。細胞溶解物は、氷水 上で３時間（最小時間）〜１夜インキュベートした後に、４℃でｌＯ分間ｔｏ、 ０００ｒｐａ＋で遠心分離した。得られたペレットをＴＥｔｌ衝液９１と５ｏ＋ ｇ／ｍ　ｌ濃度のＲＮＡ　（使用前に１００℃で５分間処理した）１００μｐと に溶解し、４５℃でＩＯ分間インキュベートし、その後セシウムクロリド（以下 、ＣｓＣＩと略記する）　９．２３ｇを加えた。ＣｓＣ１が溶解した後に、５１ １℃ｇ／ｍｌ濃度のエチジウムプロミド０．９１を加え、その後に混合物を１５ ℃で４８時間４０．０００ｒｐａ＋で等密度遠心分離し、ｃｃｃＤＮＡバンドを 単離した。ＣＳＣ＋とエチジウムプロミドを慣用の方法で除去した後に、高分子 量のプラスミドＣｃｅ　ＤＮＡ　（４０キロ塩基対よりも大きい）を、１０％〜 ４０％のショ糖密度勾配で分画することにより単離し、その後に適当な制限エン ドヌクレアーゼ（すなわち、菌体内毒素構造遺伝子中のＤＮＡを切断しない制限 エンドヌクレアーゼ）で消化し、適当に消化されたプラスミドクローニングベク ター（例えば、ｐＵｃ１８又はｐＵＣ１９）中に結合し、次いて適当な大腸菌宿 主株〔使用した具体的な菌株はＭＣＩＯ２２てあり、これは遺伝子型ａｒａ　Ｄ １３９、Δ（ａｒａ　、　ｌｅｕ　）７６９７、Δ（ｌａｃ　Ｚ）　Ｍ２Ｓ、ｇ ａｌ　Ｕ　Ｓｇａｌ　Ｋ　、　ｓｔｒ＾のアンピシリン感受性味である〕中に取 り込ませて形質転換させた。次いて、誘導されたプラスミドベクターを選択する 適当な抗生物質に対して耐性の形質転換体を、プローブとしてクローン化テネブ リオニス遺伝子（それにフランキング配列を加えて）とクローン化ＣｒｙｌＡ遺 伝子とを用いて標準的ＤＮＡハイブリダイゼーション法により選別して、組換え 菌体内毒素遺伝子を選別した。

実施例６ バチルス・スリンジエンシス菌株４８３５からの染色体菌体内毒素遺伝子のクロ ーニング バチルス・スリンジエンシス菌株４８３５から調製した染色体ＤＮＡから、菌体 内毒素遺伝子を次のようにしてクローンニングした。

菌株４８３５の培養液５００ｍ　ｌを、Ｌブイヨン中で３７℃で振盪しながら波 長［１１００ｎにおける吸光度の値が１．００光学密度ユニットになるまで増殖 させた。細胞を４℃で１０分間８０００ｒｐｍて遠心分離することにより収穫し 、次いてＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，５０ＩｎＭ　 ＮａＣ１。

５ａＭ　ＥＤＴＡ）　５ｍｌ中に再懸濁させた。細胞を、リゾチーム（最終濃度 ０．５ｍｇ／ｍｌ）とＲＮアーゼ（使用前に１００℃で５分間沸騰させた５ｍｇ ／ｍｌ濃度の保存溶液から取り出した最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのもの）を用い て３７℃で３０分間処理した。細胞溶解は５ａｒｃｏｓｙｌを添加することによ り完結させて０．８％の最終濃度を得、次いでプロナーゼ（使用前に３７℃で６ ０分間前培養した５　ｍｇ／α１濃度の保存溶液から取り出した最終濃度ｏ、５ ａ＋ｇ／ｍｌのもの）の存在下で３７℃で６０分間インキュベートした。得られ た細胞溶解物を５０１ｎＭトリスーＨＣｌ　ｐＨ７，６、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ中 に溶解して９０ｍ１に調整し、その後にセンウムクロリド（Ｃ特表平４−５０５ ２５０　（７） ｓｃｌ）９．２ｇを加えた。ＣｓＣｌを溶解した後に、エチジウムプロミドの５ Ｄ／ｍｌ濃度溶液１．２５ｍ１を加え、その後に混合物を１５℃で４８時間４０ ．００Ｏｒｐｍで等密度遠心分離した。

ＣｓＣｌとエチジウムプロミドを慣用の方法で除去した後に、精製した染色体Ｄ ＮＡの一定分量Ｃａ１ｉｑｕｏｔ）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩて部分 的に消化し、その後にＥｃｏＲＩで消化されたバクテリオファージλＥＭＢＬ４ ベクターＤＮＡ中に結合させた。連結反応混合物を、Ａｔｎｅｒｓｈａｍ　Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ社から市販のキットを用いて生存可能な（ｖｊ ａｂｌｅ）ファージ粒子中に詰め込んた。

得られた組換えファージ粒子を、大腸菌宿主株ＰＥ３９２上で増殖させることに よって選択した。菌株ＬＥ３９２のＰ２溶原菌（ｌｙｓｏｇｅｎ）は遺伝子型ｈ ｓｄ　Ｒ５Ｌ４　（ｒ　ｋ−１Ｍｋ４）、二Ｅ４４、二Ｆ５８．１ａｃＹＬ又は ６皿１２Ｙ）、ｇａｌ　Ｒ２、ｇａｌ　Ｔ２２　、　ａｂｅｔ　Ｂｌ、ｔｒｐ　 Ｒ５５をもつ。

８１ｋＤ蛋白質用のプローブとしてＣｒｙｌＡ−菌体内毒素遺伝子の放射能標識 断片と該遺伝子の３゛−末端断片とを用いて、正副一対の（ａ　ｄｕｐｌｉｃａ ｔｅ　ｓｅｔ　ｏｆ）ニトロセルロース濾紙に固着した溶菌プラークのハイブリ ダイゼーションにより、１種又はそれ以上の菌体内毒素遺伝子を保持する組換え ファージを検出した。

菌体内毒素遺伝子を含むプラークを精製し、当業者に周知の制限酵素地図作成法 により特定した。

また染色体菌体内毒素遺伝子はプラスミドベクター（例えばｐＵｃ１９）中に直 接にクローンニングできる。これは当業者に“染色体歩行法として周知の方法に より小さい断片中に遺伝子をクローニングすることを必要とし得る。宿種を媒介 した相同組換えによる染色体欠失現象（ｅｖｅｎｔ）を伴う問題は、この方法で クローニングし、次いて重複する遺伝子断片の適当な数を配列決定した後に遺伝 子を一緒に継ぎ合わせることによって所望の転写解読枠を再構築することによっ て回避できる。

実施例７ 本発明のクローン化菌体内毒素遺伝子を保持する殺虫的に活性な大腸菌株の固体 培地増殖 接種試料をグリセロール保存ガラス瓶（ｖｉａｌ）からクローニングベクターの 選別に適した抗生物質を入れたし寒天ペトリ皿に移植した。次いて、接種したＬ 寒天ペトリ皿を特徴的なコロニーの形態学的性状の出現を可能にするため２４〜 ７２時間培養した。正確な形態学的性状をもつ個々のコロニーの選択物（例えば クローン化８１ｋＤ菌体内毒素遺伝子を保持する大腸菌株ＢＬ２１／ｐ」旧１の 場合にはラフコロニー）を用いて、クローン化菌体内毒素遺伝子を保持するプラ スミドベクターの選別に適した抗生物質（例えば、アンビンリン）を含む小容量 のＬブイヨン（全容ｊｌ１５００ｍｌ当たり、トリプトン１５ｇ、酵母エキス７ ．５ｇ、　ＮａＣｌ　７．５ｇ）に接種した。培養液を、波長ＢＯＯｎｍにおけ る吸光度の値が０，５．〜０．７０Ｄ、ユニットになるまで増殖させた。培養液 の１ｍｌを用いて、Ｌ寒天（オキソイド寒天１６ｇと適当な抗生物質とＬ２０μ ｇ／ｍ　ｌの最終濃度までのＩＰ丁Ｇとを追加した前記のしブイヨン）を入れた Ｒ装用（すなわち２４５ｍｍＸ２４５ｍｍ　ｘ２０ｍｍ）ペトリ皿にガラス製″ 塗抹棒′を用いて塗抹することにより接種した。調製用ペトリ皿を３７℃で１夜 培養した。細菌増殖物をガラス製塗抹棒を用いて調製用ベトリ皿から削り落とし た。削り落とした生成物を、必要ならば数枚の皿から溜めておき、滅菌プラスチ ック容器に移し、−２０℃で２時間凍結させ、その後に１６〜１８時間凍結乾燥 した。得られた材料を−２０℃で保存した。乾燥させた生成物を一様な粉末に粉 砕し、その後に殺虫性物質として昆虫の生物検定に使用した。

実施例８ 組換え大腸菌ＭＣ１０２２／ＩＩＪＨＬＩ株から本発明の新規８１．２ｋＤ菌体 内毒素蛋白質の精製 大腸菌ＭＣ１０２２／ｐＪＨ１１株を実施例７に記載のようにして固体培地上で 調製したが、調製用ベトリ皿から削り取った細胞塊は、凍結乾燥せずに一２０℃ で保存した。

凍結させた細胞を氷上で溶かし、その後に直径１ｃｍのプローブ（ｐｒｏｂｅ＞ を用いて１４ミクロンの振幅で９×２０秒間超音波処理することによって粉砕し た。次いて超音波処理した細胞を４℃て９３００　Ｘ　ｇて遠心分離して未破壊 細胞を除去し、その後に高速遠心分離して（１００゜００ＱＸｇて４℃で６０分 間）膜を除去した。次いて、高速遠心分離抽出物をｐＨ８，０でＤＥＡＥ−セフ ァロース上でイオン交換クロマトグラフィーにかけた。次いて、カラムをＯ〜５ ００　ｍＨのＮａＣＩ濃度勾配を用いて溶出し、各両分を５ＤＳ−ＰＡＧＥで監 視した。８１．２ｋＤの蛋白質を含む画分を蓄えておき、■釦ＨトリスｐＨ８， ０に対して透析し、次いて第二のＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィ一工程に かけ、再び０〜５００　ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配を用いて結合した蛋白質を溶出 させた。部分的に精製された８Ｌ、２ｋＤの蛋白質を含む画分を同定し、蓄えて おき、その後にケル濾過クロマトクラフィーによりさらに精製した。

この方法により純度９０％であり且つ昆虫の生物検定に（濃縮工程を伴って又は 伴わずに）使用し得る菌体内毒素蛋白質を得た。

実施例９及び実施例１０により、種々のディアブロチカ種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃ ａ　５ｐｐ）昆虫に対する本発明の新規なバチルス・スリンジエンシス菌株の活 性を説明する。

実施ｆＰＩ９ ウェスタン・コーン・ルートウオーム（Ｄｉａｂｒｏｔｊｃａｖ：ｒｇｒｆｅｒ ａ　ｖｊｒｇｊｆ’ｅｒａ）に対するバチルス・スリンジエンシス菌株ＪＩＩＣ Ｃ４８３５の殺幼虫活性の効果各々のバチルス・スリンジエンシス菌株について 、実施例２に記載のようにして該菌株を２１０ｍ１Ｘ　２１０龍特表千４−５０ ５２５０　（８） のペトリ皿上て３０℃て５日間培養し、寒天培地表面から融合性増殖物を削り取 り、次いで凍結乾燥することにより、胞子と結晶の混合物をｉ！Ｊ製した。ウエ スタン−：ｌ−ンールートウォーム（ＤｉａｂｒｏＬｉｃａ　ｖｉｒｇｉｒｃｒ ａｖｉｒｇｉｆｅｒａ）の第−齢期幼虫に対する試験については、１　凍結乾燥 した胞子と結晶を滅菌水と滅菌蔗糖溶液と混合して、第６表にパーツ・パー・ミ リオン（以下、ｐｐｍと略記する）で示した処理剤施用＊Ｂ度と２，５％の最終 Ｗ糖濃度を得た。得られた可溶化した胞子と結晶の（処理用）混合物を、水浴超 音波処理話中で５分間超音波処理することにより均質に分散させた。次いて、得 られた処理薬剤を、”Ｔｅｒｉタオル’　（ＫｊＩ＋１ｂｅｒｌｙ　Ｃ１ａｒｋ 社の製品Ｎｏ、３４７７０）から切り取った直径１．５ｃｍの円盤に対して、０ ．０７５ｍ１の溶液として渦巻き状に攪拌後に施用した（ｖｏ　ｒ仁ａｘｅｄ　 ａｎｄ　ａｐρＩｊｃｄ）。１つの試験は、処理を施したＴｅｒｉタオルの円盤 ５枚からなり、各々の円盤を個々のプラスチック製Ｐａ　ｌ　Ｃｏｎ試験皿に入 れ、その後に試験匝１枚当たりにつき第−齢期幼虫５匹を蔓延させた。試験器を 、湿度源として湿したＴｅｒｉタオルと共に密閉式発泡スチロール箱に入れた。

この箱を７８０Ｆ〜８０″Ｆに保った部屋の中に、処理後の日数（以下、ＤＡＴ と略記する）で３日間又はそれ以上の日数、温置しく　１ｎｃｕｂａｔｅｄ）、 その後に生物検定の評価を行った。

発泡スチコール箱の中の条件は、７４″Ｆ〜７６°Ｆ、相対湿度８０％であった 。試験は解剖顕微鏡を用いて評価した。

これらの種々の濃度（施用量）のこれら処理剤の効果を第６表に示した。

実施例１０ す４ｆン−：＋　−ン−／Ｌ／　−ト’ｙ　ｔ−ム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕ ｎｄｅｃｉａ＋ｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ）に対するバチルス、スリン ジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８３５の殺幼虫活性の効果各々のバチルス・スリンジ エンシス菌株について、実施例２に記載のようにして菌株を２１０ｍｇ＋ｘ　２ １０＋ｎｍのベトリ皿上で３０℃で５日間培養し、寒天培地表面から融合性増殖 物を削り取り、次いて凍結乾燥することにより、胞子と結晶の混合物を調製した 。サザン・コー＞ルートウオーム（Ｄｉａｂｒｏｔｊｃａ　ｕｎｄｅｃ：ｍｐｕ ｎｃｔａｔａｈｏｖａｒｄｌ）の第−齢期幼虫に対する試験は、実施例９に記載 のようにして調製し、温室し、評価した。種々の濃度（施用量）のこれら処理剤 の効果を第７表に示した。

実施例１１ バチルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４ｆｔ３５及びＪＨＣＣ４３５３の殺 虫活性の特異性 実施例２に記載のようにしてバチルス・スリンジエンシス菌を２１０１１１ｍＸ 　２１０ｍ５のベトリ皿上で３０℃で５日間培養し、寒天培地表面から融合性増 殖物を削り取り、次いて凍結乾燥することにより、胞子と結晶の混合物を調製し た。サザン・コーン・ルートウオーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｊｍ ｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ）の第−齢期幼虫に対する試験用には、上記 の凍結乾燥した胞子と結晶を２．５％滅菌蔗糖溶液と混合した。コロラド・ポテ ト・ビートル　（（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｂｅｅｔｌｅ）　Ｌｅｐ ｔｉｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｇ＋　Ｉ　１ｎｅａｔａ）の第−齢期幼虫に対する 試験用には、上記の凍結乾燥した胞子と結晶を、滅菌水と混合し、次いでこの懸 濁液中に浸したジャガイモの葉の上に存在させた。７タミハナゾウムシ（Ａｎｔ ｈｏｎｏｍｕｓ　ｇｒａｎｄｊｓ）の成虫に対する試験用には、上記の凍結乾燥 した胞子と結晶を、滅菌水と混合し、次いてこの懸濁液中に浸した棉の子葉の上 に存在させた。種々のｐｐＩ＋＋濃度におけるこれらの製剤（ｐｒｅｐａｒａｔ 　１ｏｎ）の効果を第８表に示した。バチルス・スリンジエンシスの変種菌株テ ネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）（ＤＳＭ　２１１０３）の活性スペク トラムと、バチルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３ ５３の活性スペクトラムとを比較すると、後者の２つの菌株の方がより良い選択 的効果を示す（第８表）。

種々の鱗翅目幼虫の防除におけるバチルス・スリンジエンシス菌株Ｊ）Ｉｃｅ　 ４８３５の効果を実施例１２〜Ｌ５において説明する。

実施例１２ 種々の鱗翅目幼虫の防除におけるバチルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８ ３５の効果胞子と結晶の混合物を、実施例２に記載のようにして調製し、次いて 適当な慣用の人工昆虫食餌と混合した。得られた結果を、以下の第９表に示した 。バチルス・スリンジエンシスの変種菌株テネブリオニス（ＤＳＭ２８０３　） の効果と、菌株ＪＨＣＣ４８３５の効果とを比較すると菌株ＪＨＣＣ４８３５の みが鱗翅目幼虫に対して殺虫性であることが示され、また公知の変種ｋｕｒｓｔ ａｋｉ株Ｊ　ＩＣＣ４３６０も鱗翅目幼虫に対して殺虫性であることが示された （第９表）。

実施例１３ コアオヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｊｐｅｒｄａ）の防除における バチルス・スリンジエンシス菌株Ｊ　ＩＣＣ４８３５の効果 胞子と結晶の混合物を、実施例２に記載のようにして調製し、次いて適当な慣用 の人工昆虫食餌と混合した。得られた結果を＝１０表に示した。バチルス・スリ ンジエンシス菌株ＪＨＣ０４５８０（変種菌株テネブリオニスに極めて類似した 分離株）の効果と、菌株Ｊ）ＩＣＣ４８３５の効果とを比較すると菌株ＪＨＣＣ ４８３５のみがコアオヨトウ幼虫に対して殺虫性であることが示され、また公知 の変種ｋｕｒｓｔａｋｊ株ＪＨＣＣ４３８０もコアオヨトウ幼虫に対して殺虫性 であることが示された（第１０表）。

実施例１４ シロイチモジョトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｊｇｕａ）の防除におけるバ チルス・スリンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８３５の効果 胞子と結晶の混合物を、実施例２に記載のようにし特表千４−５０５２５０　（ ９） で調製し、次いて適当な慣用の人工昆虫食餌と混合した。バチルス・スリンジエ ンシス菌株ＪＨＣＣ４５８０（ｉ種菌株テネブリオニスに極めて類似した分離株 ）の効果と、菌株ＪＨＣＣ４８３５の効果とを比較すると菌株Ｊ　）ＩＣＣ４８ ３５のみがシロイチモジョトウ幼虫に対して殺虫性であることが示され、また公 知の変種ｋｕｒｓｔａｋｉ株ＪＨＣＣ４３６０もシロイチモジョトウ幼虫に対し て殺虫性であることが示される。

実施例１５ オオタバコガ（）ｔｅｌｊｏｔｈｊｓ　ｚｅａ　）の防除におけるバチルス・ス リンジエンシス菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ４３５３の効果 胞子と結晶の混合物を、実施例２に記載のようにして調製し、次いて適当な慣用 の人工昆虫食餌と混合した。得られた幼虫の防除結果を以下の第１２表に示した 。

８１．２ｋＤの蛋白質をコードするクローン化菌体内毒素遺伝子を保持する組換 え大腸菌細胞の効果及び新規な殺幼虫活性スペクトラムを実施例１６〜１８にお いて説明する。

実施例１６ アワツメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｊｓ）の防除における組換え 大腸菌株ＭＣＬＯ２２／ｒＪＪＨ１ｋによって発現される８１ｋＤ菌体内毒素の 殺幼虫活性の効果 大腸菌株ＭＣ１０２２／ｐＪ旧１を実施例７に記載のようにして固体培地上で調 製した。凍結乾燥した細胞を溶かし、適当な慣用の人工昆虫食餌と混合して第１ ３表に示したパーツ・バー・ミリオン（ｐｐｍ）の最終処理濃度を得た。

試験は、第−齢期のアワツメイガ幼虫を蔓延させ、処理後６日目（ＤＡＴ）に評 価した。８１ｋＤの菌体内毒素遺伝子をもつ組換えプラスミド（ｐＪ旧１）を保 持する大腸菌株及びＣｒｙｌＡ　６．６型の鱗翅目特異性遺伝子（ｐｌｃ２２８ ）を保持する大腸菌株は殺虫性であり、これに対してベクター（ＰＴ７１２）の みを保持する大腸菌株又はテネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｊｏｎｉｓ）型の遺伝 子（ｐｌｃ２２１３）を保持する大腸菌株は殺虫性かなかフた。

実施例１７ コロラド・ポテトφビートル（Ｌｅｐｔｊｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃ−ｅｍ　ｌ　 ｊｎｅａｔａ）の防除における組換え大腸菌株ＭＣＬＯ２２／ｐＪＨ１１によっ て発現される８１ｋＤ菌体内毒素の殺幼虫活性の効果 大腸菌株ＭＣ１０２２／Ｉ）ＪＨＩＩを実施例７に記載のようにして固体培地上 で調製した。凍結乾燥した細胞を溶かし、滅菌水と混合し、次いてコロラド・ポ テト・ビートル（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）の第 −齢期幼虫に対する試験用のこの懸濁液に浸したポテトの葉の上に存在させて第 １４表に示すｐｐｍの最終処理濃度を得た。８１ｋＤの菌体内毒素遺伝子をもつ 組換えプラスミド（ｐＪＨｌｌ）を保持する大腸菌株及びテネブリオニス型の遺 伝子（ｐｌｃ２２６）を保持する大腸菌株は殺虫性であり、これに対してベクタ ー（ＰＴ７１２）のみを保持する大腸菌株又はＣｒｙｌＡ　Ｂ、Ｂ型の鱗翅目特 異性遺伝子（ｐｌｃ２２８）を保持する大腸菌株は殺虫性かなかった。

実施例Ｉ８ ウェスタン・コーン・ルートウオーム（ＪａｂｒｏｔｉｃａｖｉｒｇＨｅｒａ　 ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）の防除における組換え大腸菌株ＭＣ１０２２／ｐＪＨＬｌ によって発現される８１ｋＤ菌体内毒素の殺幼虫活性の効果 大腸菌株ＭＣ１０２２／Ｉ）ＪＨＩＩを実施例７に記載のようにして固体培地上 で調製した。ウェスタン・コーン・ルートウオーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖ ｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）の第−齢期幼虫に対する試験について は、凍結乾燥した細胞を溶かし、滅菌水及び滅菌蔗糖溶液と混合して以下の表に 示した薬剤施用量濃度及び２．５％の最終的蔗糖濃度を得た。可溶化した細胞（ 処理用）混合物を水浴超音波処理話中で５分間超音波処理することによって分散 させた。次いで、処理薬剤を、実施例９に記載のようにして“Ｔｅｒｉタオ／ｌ ／”　（ＫｉＩＩｌｂｅｒｌｙ　Ｃ１ａｒｋ社の製品Ｎｏ、３４７７０）から切 り取った直径１．５ｃｖｌの円盤に対してＯ５０７５ｍｌの溶液として渦巻き状 に攪拌後に施用して、第１５表及び第１６表に示した最終処理濃度ｐｐｍを得た 。これらの試験は処理処理後４日目及び５日月又（ＤＡＴ）に評価し、得られた 結果を十分な分析にかけた。得られた結果を第１１図及び第１２図にグラフで示 した。結果は、１１１ｋＤ菌体内毒素遺伝子をもつ組換えプラスミド（ｐＪ旧１ ）を保持する大腸菌株及びテネブリオニス型の遺伝子（ｐｌｃ２２Ｂ）を保持す る大腸菌株は殺虫性であり、これに対してベクター（ＰＴ７１．２）のみを保持 する大腸菌株又はＣｒｙｌＡ　６．Ｂ型の鱗翅目特異性遺伝子（ｐｌｃ２２８＞ を保持する大腸菌株は殺虫性がないことを示す。これら２つの群（ｐＪＨｌｌと ｐｌｃ２２Ｂの群対ＰＴ７Ｌ２とｐＩＣ２２８の群）の間の活性の差異は十分に 顕著にある。

部分精製した及び精製した新規な８１．．２ｋＤの菌体内毒素蛋白質の効果及び 新規な殺幼虫活性スペクトララムを実施例１９〜２１て説明する。

実施例１９ アワツメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）の防除における部分精 製した及び精製した８ＬｋＤ菌体内毒素の殺幼虫活性の効果 部分精製した及び精製した８１ｋＤ菌体内毒素蛋白質を、実施例８に記載のよう にして凍結乾燥した組換え大腸菌細胞ＭＣ１０２２／ｐＪＨＩ　ｌから調製した 。第二のＦＰＬＣイオン交換カラムから得た画分をＭｏｎｏＱ　Ａ、　Ｂ及びＣ と命名した。これらは、それぞれ８１．２ｋＤの菌体内毒素蛋白質を約５０％、 ５０％及び２５％を含有していた。これらの両分を、慣用の人工昆虫食餌に加え て、アワツメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）の第−齢期幼虫に 対する殺虫活性を試験する生物検定における第１７表に示した処理剤施用量を得 た。第１８表の結果は、上記の画分全てか特表千４−５０５２５０　（１０） 幼虫を死滅させるか又は幼虫の成長を抑制するかいずれかにおいて活性があるこ とを示す。精製したｇＬ、２ｋＤ菌体内毒素蛋白質もまた試験し、アワツメイガ の幼虫に対して殺虫性かあること及び幼虫の成長を抑制することが認められた（ 第１８表）。

実施例２０ ８１ｋＤ菌体内毒素の殺幼虫活性の効果部分精製した及び精製した８１．．２ｋ Ｄ菌体内毒素蛋白質を、実施例８に記載のようにして凍結乾燥した組換え大腸菌 株ＭＣＩ（１２２／ｐｊＨ１ｌから調製した。第二のＦＰＬＣイオン交換カラム から得た画分をＭｏｎｏＱ　Ａ、　Ｂ及びＣと命名した。これらは、ｇｌ、２ｋ Ｄの菌体内毒素蛋白質をそれぞれ約５０％、５０％及び２５９６含有していた。

これらの画分及び精製した８１．２ｋＤ菌体内毒素蛋白質を滅菌水と混合し、次 いでコロラド・ポテト・ビートル（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉ ｎｅａｔａ）の第−齢期幼虫に対する試験用のこの懸濁液に浸したポテトの葉の 上に置いて第１９表に示すｐｐＩｌｌの最終処理濃度を得た。第１９表の結果は 、上記の両分全てがコロラド・ポテト・ビートルの幼虫に対して殺虫活性がある ことを示す。

実施例２１ び精製した８１ｋＤ菌体内毒素の殺幼虫活性の効果部分精製した及び精製した８ １ｋＤ菌体内毒素蛋白質を、実施例８に記載のようにして凍結乾燥した組換え大 腸菌株ＭＣ１０２２／ｐＪＨ１ｌから調製した。第二のＦＰＬＣイオン交換カラ ムから得た画分をＭｏｎｏＱ　Ａ、　Ｂ及びＣと命名した。これらは、８１．２ ｋＤの菌体内毒素蛋白質をそれぞれ約５０％、５０％及び２５％含有していた。

これらの両分及び精製した８１．２ｋＤ菌体内毒素蛋白質を滅菌水及び滅菌蔗糖 溶液と混合し、第２０表に示した処理施用量濃度、及び２．５％の最終的蔗糖濃 度を得た。ウェスタン・コーン・ルートウオームの第−齢期幼虫に対する試験は 、実施例１８に記載のようにして行った。第２０表の結果は、８１．２ｋＤ菌体 内毒素がウェスタン・コーン・ルートウオームの幼虫に対して殺虫活性があるこ とを示す。

本明細書で挙げた以下の微生物類及びクローンは、スコツトラント、アバディー 　ンＡＢ２１ＲＹ、２３Ｓｔ、Ｍａｃｈａｒ　Ｄｒｉｖｅのザ・ナショナル・コ レクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリアに寄託し である。

菌株名　寄託番号　寄託日 Ａ２０　１２５７０　１９８７年１０月２０日ＪＨＣＣ４８３５４００９１１９ ８８年１２月７日ＪＨＣＣ４３５３４００９０１９８ｇ年１２月７日大腸菌 ＢＬ２１／ｐＪ！４１１　４０２７５　Ｌ！１１９０年４月６日ＭＣ１０２２／ １）ＪＨ１２４０２７８１９９０年４月２４日バクテリオファージ λ　ＥＭＢＬ４クローンＣＬ５　４０２７９　１９９０年４月２６日第２表 マイクロタイター平板培地（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅ）での生化学的 特性第２表（続き） 第２表（続き） ＋　＝陽性反応 −＝陰性反応 ＋／−＝弱い反応 第３表 ＩＤ−ＩＤＥＮＴ平板培地上での生化学的特性ＩＤ−ＩＤＥＮＴはＡＰＩ　Ａｎ ａｌｙｔａｂ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓの商標である第６表 ＢＷ＝ワタミハナゾウムシ （ＲＦ）　＝摂餌減率％ 第７表 ＊１試験群当たり第−齢期幼虫２５匹である。

第８表 結果＝死生率％ ＤＡＴ＝処理後の日数 第９表 結果＝処理後４ロ目の死生率％ 第１０表 バチルス・スリンジエンシス菌株類の殺虫効果結果は薬剤濃度８０ｐｐｍにおけ る死生率％として表わした。

第１２表 処理後６日目のオオタバコガに対する バチルス・スリンジエンシス菌株類の殺虫効果対照１＝３．５％　対照２＝２％ 結果は薬剤濃度８０ｐｐｍにおける死生率％として表わした。

第１３表 アワツメイガ幼虫に対する生物検定 結果＝処理後６臼目の死生率％ ％Ｒ，Ｓ、　＝低減された体長の生虫率％第１４表 コロラド・ポテト・ビートル （Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｂｅｅｔｌｅ）に対する生物検定結果＝処 理後３臼目の死生率％ 第１５表 ウェスタン・コーン・ルートウオーム （Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）に対する生物検定結果＝処理 後４臼目の死生率％ 第１６表 結果＝処理後５臼目の死虫率％ 第１８表 アワツメイガ幼虫に対する８１ｋＤ蛋白質の殺虫効果ＩＡ＝ＩＯＷＡ　、　Ｊ） ｌ＝ＪＥＡＬＯＴＴ−３ＨＩＬＬＳＣｔｒｌ＝対照平均体長＝生存幼虫の平均体 長 第１９表 コロラド・ポテト・ビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｂｅｅｔｌｅ ）に対する８１ｋＤ蛋白質の殺虫効果 対照　Ａ　Ｂ　Ｃ８１ｋＤ　４５８０ 施用１（ｐｐｍ）ニー３３０　２１３　２７０−４０対照　Ａ　Ｂ　Ｃ８１ｋＤ 　４５８０ 施用量（ｐｐｍ）；−４６６３６６３４２１４８４０対照　Ａ　Ｂ　Ｃ８１に０ 　４５８０ 施用量（１）戸）：　−−−−−−５８８’２５７　４０結果＝処理後３日目の 死虫率％ 第２０表 ウェスタン・コーン・ルートウオーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔｗ ｏｒｍ）に対する８１ｋＤ蛋白質の殺虫効果 ＤＡＴ＝処理後の日数 ＦＩＧ．５． Ｍｓｐｓａｑ　Ｖ５．ｌＯ〜ＨＥ−｝１１．ＳＥＱ（１．２９６５）　Ｒｅａｄ ｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ：　ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｉｌｅ　Ａ撃戟DＥｎｚ　Ｌ　 ”９”　’ ＧｌｕＡｓＩｔｙｓＡｌａＬｅｕＩ　ｌ＃Ａｒ９ｖａ　ｌＰｈｅＩ　ｌｅＧｌｙ ｗａ　ＩＴｅｒＳｅｒｌ１ｒＰｈｅＳｅｒＳｅｒＰｈｅＬｅ浮kｙｉＬｙｌＶａ 　ＩＴｅｒ＾ｒ９＾ｒｇｌｅｒＬｙｓＶａｌｌｌｅＬｙｓＧｌｕＴｅｒ１．．， ．，．申−．．．，一一一一．，◆．．．．，−．命，．−一．．一一，．，． 一，一画．．一中，．，―奔，−●！．．．一．．D帝．１−．一令一 ＦＩＧ．６、 Ｍａｐｓｅｑ　Ｖ５．ｌＯｘＮＤＥ−Ｈ１．ＳＥＱ（１．２９６５）　Ｒｅａｄ ｉｎｇ　ｆｒａｍａｓ：　ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｉｌｅ　Ａ撃戟DＥｎｚ　Ｌ　 ｐ．，　２ ＾ｓｍＶａｌＧｌｕＰｒｅＰｈｅＶａｌＳｅｒ＾ｊａｓｅｒＴｈｒｌｌｅＧＩｎ ＴｈｒＧＩｙｌｌｅＧｌｙｌＩｅ＾ｌａｌ；ＩｙＬｙｓ＋１■kｅｕＣｌｙＴｈ ｒＬｅｕＧＩｙνａｌＰｗＰｈｅＡｌａＴ；Ｉｙｌｉｌｒ＃ａｌ＾ｌａＳｅｒｔ ｅｕ＋ｙｒＳｅｒＰｈｅ　Ｉ　ＩｅＬｅｕＧ　ｌｙＧ　ＩｕＬｗ＋ｒｐＰｒｏＬ ｙｓＧ　ｌｙＬｙｓ＾ｓｎＧ　ｌｎ＋ｒｐＧ@Ｉｕ　Ｉ　ｌｅＰｈｅＦｌｅｔＧ 　ｌｕｌｌ　Ｉ　ｓＶａ　Ｉｃ　ｌｕｃ　ｌｕｌ　ｌｅｌ　ｌｅＡｕｖｃｌａｙ ｓｌ　ｌｅＳｅｒＴｈｒ＋ｙｒ＾ＩＭｒ９Ａ＄ＩＩＬ）ＩＩ＾ｌａＬｅｕＴｈｒ ＾ｓＤｔｅｕＬｙｓＧｌｙｔｅｕＧＩｙ＾ｔＮｌａＬｅｕＡＩａＭＩＴ凾奄撃撃 堰OｓｐＳｅｒＬｅｕＧＩｕｋｒＴｒｐｖａｌＧｌｙ＾＋ｎＡｒｑ＾ｉｎ＾ｓｎ ＴｈｒｕｇＡｌａ＾ｒｇＳｅｒＶａｌＶｓｌＬｙｓＳｅｒＣｌｉＴｙｒｌｌｅ＾ ｌａＬｅｕＧｌｕＬｅｕＸＩＰｈｅＶａｌＧＩ獅kｙｓＬｅｕｐｒｏＳｅｒｐｈ ｓＡ＋ａｖａｌＳｅｒＧｌｙｃｌｕ（＋ｌｕｖａｌＰｒｏＬｅｕＬｅｕＰｒａ１ １ｅｌｙｒＡｌａＧｌｎ＾１番＾＋ａｉｔａｅｕｐｔｓＬｅｉｅｕｔｔｕ（ａｕ ＾ｒ９＾−ｐｋｌａｋｒhｌｅＰｍＧｌｙＬｙｓｃｌｕｌｒｐＧｌｙＬｔｕｓｔ ｒｓｗｓｅｒＧｌｕＦＩＧ．７． Ｍａｐｓｅｑ　Ｖ５．ｌＯ〜ＮＤＥ−ＨＩ．ＳＥＱ（１，２９６５）　Ｒ＠ａｄ ｉｎｇ　ｆｒａ＋ｍｅ＋ｓ：　ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｉｌｅ@Ａ１１．Ｅｎｚ　 Ｌ　Ｐａ＠ｅ　ｓ ＦＩＧ．８， Ｍａｐｉｅｑν５．１０′Ｓ’ＤＥ−｝ＩＩ．ｓＥＱ（１，２９６５）　Ｒｅａ ｄｉｎｇ　ｆｒａｌＩ＠ｓ：　ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｉｌｅ@Ａｌｌ．Ｅｎｚ　 Ｌ　Ｐａｇｅ． ＾ｓｎＴｈｒｓｅｒｌｌｅＡｓｎＰｒｏＶａｌＴＩＩｒＬｅｕＰｒｏ＃ｈｓＴｈ ｒＳｅｒ＾ｒ９＾ｆｌｌＶａｌＴｙｒ＾ｒｇｒｈｒＧｌｕＳ■窒kｅｕＡｌａＧ ｌｙＬｅｕ＾ｓｒＬｅｕＰｈｅＬｅｕＴｔｗｈｎＰｒｅｒＷａｌ＾ｉｎＧｌｙＶ ａｌＰｒｏＡｒｇν１＾ｓＮｈｅＭ＋ｓ＋ｒｏＬｙｓＰｈｅＶａｌＴｈｒＨｌｓ Ｐｒｏｌ　ｌｃＡＩａｓｅｒ＾−ｐ＾ｔｎＰｈｅＴ凾窒sｙｒＰｒｏＧｌｙＴｙ ｒ＾ｌａＧＩｙｌ　ｌｅＧＩｙＴｈｒＧｌ＋ｔｅｕＧ　ｌ　ｎＡｓｐＳｅｒＧ　 ｌｕＡｓｎＧ　ｌ　ｕＬｅｕＰｒｏＰｒｏｃ　ｌｕＡ　ｌａＴｍｌ；　ｌｙｃ　 ｌｎＰｒａＡｓｎ＋　ｙＧ　Ｉ浮rｅｒＴｙｒＳｅｒＨ　Ｉｓ＾ｒｇＬｅｕＳｅ ｒｌｌｌｓｌｌｅＧｌｙｖｅｕｌｌｅＳｅｒ＾１６『唱＄νａｌＬｙｓＡｌａＬ ｅｕＶａｌ＋ｙｒＳｅｒ＋ｒｐｌｈｒＨｌｓ＾『φｅｒ＾１畠＾＄ｐ＾ｒｇ＋ｈ ｒＡｓｎ＋ｈｒｌｌｅＧＩｕＰｒ■OｓｎｓｅｒｌｌｅＴｈｒｃＩｎｌｌｅＰｒ ｏｔｅｕｖａＩＬｙｚ＾ｌａＰｈｅ＾ｓｎＬｅｕｓｅｒｓｅｒｃｌｙ＾１ａＡＩ ａＶａｌν１＾ｒｇ（＋ｌｙＰｒｏＧｌｙＰｈｅＴｈｒＣｌｙｌ，Ｉｙ＾−ｐｌ ｌ畦ｅｕ＾ｒｇ`ｒｇ＋ｈｒＡｓｎＴｈｒＧｌｙＴｈｒＰｈｅＧＩｙＡｓＤｌｌ ｅ＾ｒｇＶａ１ＦＩＧ．９． Ｈａｐｓｅｑ　Ｖ５．ＩＯ　＋′ＮＤＥ−ＨＩ．ＳＥＱ（１．２９６５）　Ｒｅ ａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ：　ｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｉｌｅ@Ａｌｌ．Ｅｎｚ　 Ｌ Ｐ中５ ＾ｓｎ１１ｅＡｓｎＰ＋−ｏＰｒｏＰｈｅ＾ｌａｃｌｎ＾ｒｑｌｙ＾ｒｇＶａｌ ＾ｒｇ１１ｅＡｒ（ｌｙｒＡｌａＳｅｒｌｈｒＴｈｒＡｉｐkｅｕＣＩｎＰｈｅ ｊｌｌｓ▼ｈｒｓｅｒｌｌｗ＾ｓｎＧｌｙＬｙｓ＾１１１ｔＧＩｎＳｅｒＴｈｒ ｐｈｅＴｈｒ１　１ｔＧＩｙ＾１ａＴｒｐＡ１ｎＰｍ！ｉｅｒｓｅｒＧｌｙ＾ｓ ｎＧｌｕＶａｌＴｙｌｌａＡｓｐＡ＋１P１ｅＧｌｕＰｈｅＶａｌＰｒｏνａｌ ＧＩｕＶａｌＴｈｒＴｙｒＧｌｕＡＩａＧＩｕＴｙｒＡｓｏＰｈｅＧｌｕＬｙｓ ＾１ａＣｌｎＣＬｕＬｙｓＶａｌＴｈｒ＾１ａＬｅｕＰｈｅ▼ｈｒｓｔｒ＋ｈｒ ＾ｓ＋ｒｏｉｒｇＧhｄｅ＋＋Ｌｙｉｒｈｒ＾％＊Ｖａ＋ＬｙｓＡｓＣＴｙｒＨ ＋＠Ｈａ＾ｓｐＧｌｎＶａｌＳｅｒ＾ＳｎＬｅｕＶａ１１１＋ｌＵＳｔｒＬｅｕ Ｓ＠ｒ＾ｓｐＧｌｕＰｈｔＴｙＬｅｕ＾ｓｐＧＩｕＬｙｓＡｒｇＣＩｕＬｔ浮o ｈｅＧｌｕ口ｅＶａｌＬｙｓＴｙｒ＾ｌａＬｙｓｌ＋ＩｎＬｅｕＨｌｓｌＩｅＧ Ｉｕ−■一１−−ｔ今φ−―−一骨伊−一雫●−一会−伊争−串一琲−−−−− −彎−一菅中●一一―◆●一●−―−−−◆―−−−−―−●争|一伊一●番一 一魯−一―−―−一拳令−一一−●一曲−ゆＦＩＧ．１０． Ｍｎｐｊｅｑ　Ｖ５．ｌＯＮＮＤＥ−Ｈ１．ＳＥＱ（１，２９６５）　Ｒｅａｄ ｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ叫Ｅｎｚｙｍｅ　ｆｉｌｅ　Ａｌｌ．dｎｚ　Ｌ　Ｐａｇ ｅ ＾ｒＱｋＳｍｔ１ｅｒＡ％ｎＩｙ＾ｉｎｔ＠ｕｐｒｏｔｙｓｓｅｒ＾ｒｇしｙｉ ｌＩｅＬｙｓＧＩｙＬ彎ｕＡｓｎ１１ｅｌ；ｌｎＰｈｅＬｅ堰{ＴｙｒＧＩｎＴ ｙｒＰれｅＧｌｕＴｅｒＬｅｕ＾ｉｇｖａＩＧｌｙＴｅｒＡｓｎＬｅｕｌｌｅν ａｌＣｙｓ＋ｙｒＬｅｕ＋ｈｒＶａｌＧＩｕｌ　ＩｅＬｅｕＬｙｓ口ｅ＾ｓｎＬ ｅｕｓｅｒｌ　ｌｅＨＩｓ＋ｅｒＴｅ窒sｙｒ＾ｒ９＋１１ｓＴｈｒ＾ｓｎｌ　 Ｉｅ＾ｒｇＧｌｕｕｌｓｃｙｓＬｅｕＰｈｅＣｙＳＬｅｕｌｙｒＬ　ｙｓＧ　ｈ ａｅｌＬｅｕＰｈｔＰｒａＴｅｒ＾ｓ　ｎｌ　ｙＷａ　ｌＰｒｏＰｈｅＡｓｐＬ ｅｕｋ　ｓｕ　ｌ　ｌ　■@Ｉ　ｌ　ｅＬｅｕ＋Ｌｓ　ｎＬｅｕＴｙｒＰｈｅＮ 　＋　ｓ　Ｔ　ｙｓｅｒ＾市τｅｒＴｅｒＨ＋ｓＬｙ＋＋ｙ＾−ｏｖａｌＩＩｅ ＩｙｒＣＩｕＣｌｙＰｈｅｓｅｒＰｈｔＨｉｓＧｌｎＬｙ＋ＰｒｏＬｅｕ（ｙｓ ｌｌｅｓｅｒＬｅｕｌｅｒ＾ｌａｓ■■ 国際調査報告

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．スコットランドのザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリア ル・アンド・マリン・バクテリアにそれぞれ寄託番号ＮＣＩＢ　４００９１及び ＮＣＩＢ　４００９０として寄託されてある、バチルス・スリンジエンシス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の新規菌株ＪＨＣＣ４８３５及 びＪＨＣＣ　４３５３。
2. ２．　前記の菌株ＪＨＣＣ４３５３及びＪＨＣＣ４８３５のいずれかにより産生 された殺虫性δ−菌体内毒素を有効成分として含有してなる、鱗翅目及びディア プロチ力（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）属の害虫防除用の殺虫剤組成物。
3. ３．さらに固体希釈剤又は界面活性剤を含有してなる請求の範囲第２項記載の殺 虫剤組成物。
4. ４．殺虫性δ−菌体内毒素をコードする菌株ＪＨＣＣ４８３５及びＪＨＣＣ　４ ３５３のいずれかに由来の遺伝子配列を含有する組換えＤＮＡ。
5. ５．添付の図５〜１０に示したＤＮＡ配列であって、分子量約８１．２キロダル トンの殺虫的に活性なδ−菌体内毒素をコードするＤＮＡ配列に棺同性の請求の 範囲第４項記載の組換えＤＮＡ。
6. ６．コードされた菌体内毒素が鱗翅目に特異的に有効なものである請求の範囲第 ４項記載の組換えＤＮＡ。
7. ７．ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリ ン・バクテリアに寄託番号４０２７８として寄託されてある大腸菌株ＭＣ１０２ ２／ｐＪ１２中の菌体内毒素遺伝子と相同性の請求の範囲第６項記載の組換えＤ ＮＡ。
8. ８．ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリ ン・バクテリアに寄託番号４０２７９として寄託されてあるバクテリオファージ λＥＭＢＬ４ベクター中の菌体内毒素遺伝子と相同性の請求の範囲第４項記載の 組換えＤＮＡ。
9. ９．ザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリ ン・バクテリアに寄託番号４０２７５として寄託されてある大腸菌株ＢＬ２１／ ｐＪＨ１１中の菌体内毒素遺伝子と棺同性の請求の範囲第５項記載の組換えＤＮ Ａ。
10. １０．甲虫目又は鱗翅目に属するδ−菌体内毒素感受性の害虫による虫害から植 物を保護する方法であって、前記の害虫を、請求の範囲第１項記載の菌株により 産生されたδ−菌体内毒素に暴露させることからなる甲虫目又は鱗翅目のδ−菌 体内毒素感受性の害虫による虫害から植物を保護する方法。
11. １１．前記の虫害を受ける前に又は虫害を受けている間に植物を請求の範囲第２ 項又は第３項のいずれかに記載の組成物の殺虫有効量で処理することからなる請 求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記のδ−菌体内毒素が、請求の範囲第１項記載の菌株から誘導される遺 伝子により植物体内で産生されるものである請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．前記の遺伝子が請求の範囲第４項〜第９項のいずれかに記載の組換えＤＮ Ａを含有してなるものである請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．前記の植物がトウモロコシである請求の範囲第１０項〜第１３項のいずれ かに記載の方法。
15. １５．前記の植物がジャガイモ類、トマト類、ワタ、タバコ又はウリ類である請 求の範囲第１０項〜第１３項のいずれかに記載の方法。
16. １６．前記の害虫がウェスタン・コーン・ルートウォーム、サザン・コーン・ル ートウォーム又はサザン・コーン・ルートウォームである範囲第１４項記載の方 法。
17. １７．前記の害虫がアワノメイチュウ又はオオタバコガである範囲第１４項記載 の方法。