JPH07501323A - 新規な鞘翅類活性バシラスチューリンゲンシス単離体及び鞘翅類活性毒素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　新規な鞘翅類活性バシラスチューリンゲンソス単離体及Ｕ＠翅類活 性毒素をコードする遺伝子関連出願へのクロスリファレンス 本出願は１９９１年１１月６日に出願された米国出願番号０７／７７８．０３８ 号の一部係属出願である。 」見立ＩＪ 土壌微生物バシルスチューリンゲンシス（Ｂ、Ｌ、）はグラム陽性の胞子形成性 ＩＩＭであって、バラ胞子性結晶性蛋白質封入物を有することによって特徴付け られる。これらは顕微鏡で一つ一つに区別された形状の結晶として見えることが 多い。この蛋白質は害虫に非常に毒性であり、それらの活性は特異的である。あ る種の８．ｔ、青紫遺伝子は単ｌｔ１され、配列が決定され、組替えＤＮＡに基 づ＜　ｅ、ｔ、生成物がつくられ認められている。ざらに遺伝子工学技術の使用 でＢ、ｔ、エントトキシシ（内毒′Ｒ）を農業ｒ＠境に送り込むための新方法が 現在開発中であり、これらには昆虫抵抗性を持たせるために内毒素遺伝子で遺伝 子工学処理された植物の使用、及び８．ｔ、内Ｓ素配達ビヒクルとして安定化さ れた無ＩＩのく細胞壁が破壊されていない）微生物細胞の使用が含まれろ（ガー ドナー、Ｆ、Ｈ，。 し、キム［１９８８］　ＴＩＢＴＥＣ）ｌ　Ｇ：５４−５７）　、　（尼って単 離された８゜ｔ、内！ｌ素遺伝子は商業的にｊｊ！なものとなりつつある。 バシルスチューリンゲンシスは感受性の昆虫宿主によって摂取されたときに毒性 である蛋白置注のバラ胞子又は結晶を製造する。過去３０年間にわた）てＢ、１ ．殺虫剤の商業的な使用は主として鱗翅ＸＪｍ（キャタピラ−）害虫の狭い範囲 に制限されてきた。バシルスチューリンゲンシス　５ｕｂｓｐ、クルスタキの胞 子と結晶の調製物がＩｌｌｌｌ畜類害虫業的な殺虫剤とし・て何年も使用されて いる０例えばＢ、チューリンゲンシス　Ｖａｌ’、クルスタキ　ｌｌＤ弓は数多 くの鱗翅類昆虫の幼虫に毒性であるデルタエンドトキシンと呼ばれる結晶を遣る 。 し・かし近年研究者等は、より広い範囲の害虫に対し特異性を有する８、ｔ、殺 虫剤を発見した０例えばＢ、ｔ、の池の１即ちイスラエレンシス及びサンジエゴ （ａ、に、ａ、　Ｂ、Ｌ。 テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ））がそれぞれ双翅目と鞘翅目の昆虫 をＩＷル１する為に商業的に使用されている（ガードナー、Ｆ、）１．　［ｒｕ ｑｌ　ｒ段虫蛋白質の細胞配達系：生きた及び生さていない微生物」コントロー ルＩ・　デリバリ−オブ　りロツブ　プロテクション　エージエンツ（Ｃ。 ｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ 　Ａｇｅｎｔｓ）中、Ｒ９阿、ウィルキンス編、ティラー及びフランシス、ニュ ーヨーク及びロンドン、１９９０．２４５−２５５頁）、またコーチ。 Ｔ、Ｌ、　（＋９８０）　ｒバシルスチューリンゲンシス　ｖａｒ　、イスラエ レンシスの蚊への病原性」デベロソブメンツ　インインダストリアル　マイクロ バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ｗｅｎｔｓｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　２２：Ｇ１−７６：ビーグル、Ｃ０Ｃ−、（１９７８ ）　ｒｇ業生態系における出生細菌の使用」デベロノプメンツ　イン　インダス トリアル　マイクロバイオロジ（ＤｅｂｅｌｏｐｓｃｎＬｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓ ｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ＞）　−２０：０７−１０４．クリーブＡ 、、　Ａ、ン１．ハンガー、Ｇ、Ａ、ラシゲンブルヒ、ｖ、シュネッター（１９ ８３）　Ｚ、　ａｎｇ、εｎＬ、　りＧ：５００−５０８はバシルスチスーリン ゲンシス　νａｒ、テネブリオニスと命名されるＢ、量、単ａｔｔを記載してお り、これは報告によると鞘翅目の２つの甲虫に対し活性である。これらはコロラ ドじゃがいｔ；よむしく（二ｏ　Ｉ　ｏ　ｒ　；＋　ｔｌ　ｏ　Ｈｒ　＋１　！ 　ａ　ｔ　ｏ　ｌ＋　ｅ　ｅ　ｔ　Ｉ　ｅ）レブチノタルサ　デ七ムリネアタ（ ＬｅｐＬｉｎｏＬａｒｓａ　ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）と７ゲラスチカ　アル コ（４；Ｂｌａｓｔｉｃａ　ａｌｎｉ）である。 最近多くの新しいＢ、１．のザブスピーシーズ（亜種）か同定されており、活性 の１）−エンドトキシン蛋白質を造る役目を持っている多くの遺伝子が単離され ている（ホフテ、　Ｈ，、１１，Ｒ１，カワｆ　）　Ｌ、　−［１９８９コマイ クロバイオロジカル　レビューズ（Ｍｉｃｒｏ）＋ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ ｉｅｗｓ）　５２（２）：２４２−２５５）　、ボッチ及びホワイトし−は！２ ＨのＳ、ｔ、結晶蛋白質遺伝子を１４の区別できる遺伝子に分類し・、アミノ酸 配列及び宿主範囲に基づいて４つの主要なりラスにグループ分けした。これらの クラスはＣｒｙｌ（Ｍ翅目特異性）　、　Ｃｒｙｌｌ’（Ｎｌ目及び双坦目特興 性）　、　Ｃｒｙｌｌｌ　（鞘翅目特異性）及び（ｒｙｌＶ　（双翅目特異性） である、原生ｇｌｕｆｆ病原菌、動物寄生性の肝吸虫（トレマトダ）又はダニ（ アカリ）に特異的に毒性の菌株の発見はさらに可能性あるＳ、ｔ、生成物スペク トラムを広げたくフエイテルソン　Ｊ、Ｓ、、Ｊ、パイン、し、キム［１９０２ ］　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：２７１・２７５を）１．独特の慝的 に対する活性を有することによってこれらの新規な菌株は非常に高い生物特異性 を侃持し、非凛的生物は影響を受けずにすむ、多くの多様なり、Ｌ、ｌ素の入手 可能なことは又、ａ家が、８．ｔ、抵抗性の害虫が生し・る危険性を最少にする 生成物使用戦略を援用することを可能２こし・得る。 大腸菌中でＢ、ｌ結晶蛋白質遺伝子のクローニング及び発現をすることは出版さ れた文献に記載されている（ｒｌ４えばシュネフ、Ｈ，Ｅ、、　）１．Ｒ，ホイ ットレー　［１９８１］　Ｐｒｏｃ。 Ｎａ１１．　Ａｃａ＋Ｊ、　５口、　ｌノＳＡ　７８：２８０３−２８９７をν 照）、米国特許４，４４８，８８５及び米国特許４，４Ｇ７．０３Ｇは両方とも 大腸菌におけるＢ、Ｌ、結晶蛋白質の発現を開示している。米国特許４．８５３ ，３３１は種々の環境に於いて鞘翅類害虫を抑制するのに使用できる８、チュー リンゲンシス　菌株サンジエゴ（ａ、に、ａ、　Ｂ、ｔ、テネブリオニス）を開 示している。 明の簡単なまとめ の既知の公に人手できる菌株が鞘翅類害虫に対し活性であることの発見に間する 。これらのＢ、　ｔ、　ｍ生物がどんな殺虫性も有するとは知られていないから 、このことは驚くべき発見である。 本発明の微生物はイリノイ州ベオリアのＮＲＲＬ培養基寄託所により筺たれてい るハワードダルマジコレクションから得られたものてあり、　Ｂ、ｔ、ＨＯ２目 、Ｂ、Ｌ、１ｌＤ８Ｇ？、及びＢ、ｔ、ＨＤＩＯｌｌと命名される。これらの微 生物、及びこれらの微生物の変異体、ｔＬびにそれから得られる遺伝子及びｌＩ ｌ素は、鞘翅類害虫を防除するのに使用できる。これらの微生物を使用する手順 は鞘翅類害虫を防除する為のＢ、　ｔ、微生物を使用する為の既知手順と類似す る。 本発明はまた例示された単離体ど同し殺虫性を実質的に有しているｅ、ｔ、ｖＩ ｌ生物の変異体も含んでいる。これらの変異体は、例えば突然度′Ａ体も含む、 突然変異体を造る手順は微生物技術で良く知られている。９外線光及びニトロソ グアニジンはこの目的のために広範囲に使用さ打ている。 更に本発明はまた、実質的に無傷の（Ｉｔ　Ｉｆ！壁が破壊されていない２ｉｌ 胞）Ｂ、ｔ、、ａ胞が標的害虫の環境に適用された時に殺虫活性を長門化させる ために本発明の遺伝子を酋有している実質的に無傷のＢ、Ｌ、細胞及び絽替えｍ ｌｌ！を処理することを含んでいる。そのような処理はこの技術が殺虫剤の性質 に悪影響をせず、また円虫剤を（ｉｉ！謹している細胞の能力を減少させない限 り１ヒ学的又は物理的手段、又は化学的及び物理的手段の組合せてあり得る。処 理された細胞は殺虫毒素の為の床上コートとして作用する。毒素は標的昆虫によ って摂取されるとそのまま作用するために利用できるようになる。 木切誓書に開示されているのは特定の毒素及び例示される単λＩ体から得ること が出来るこれらの毒素をコードするヌクレオチド配列である。有利なことにこれ らのヌクレオチド配列は殺虫組成物及び植物を造り出すために池のに生物又は植 物を形貢転１負するのに使用てさる。 配列の簡単な記載 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ＋’、１．１は毒素ＨＤ５１１をコードするヌクしオチト配列 である。 ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、２は毒素ＨＤ５１１のアミノ酸配列である。 ＳＥＱ　ＩＤ　１ｉ０．３はｉ素ＨＤ　８　Ｇ　７をコートするヌクレオチド配 列である。 ５ＥＣＩ　１口）ｉ＋〕、４は毒素ＨＤ８（３７のアミノ酸配列である。 発明の詳細な開示 本発明の８．チューリンゲンシス微生物の特徴のまとめを表１に示す。 表１．新規鞘翅類活性菌株とＢ、ｔ、、ｓ、ｒｌ、どの比較ＨＤ５１１　ハーイ ヒゝラミタール　１３０，１４３　１５．９−］り（ｄａｋｏｔａ）ＨＤＩＯＩ Ｉ　多数　舞定形　１３０．１４０　２０ａ２０ｃ、ネ”１ｒ−（ケリ１シシス （ｐｏｎ＋ｌ１ｃｈｅｒ＋ｅｎｓｉｓ）ネ標準ポリアクリルアミドゲル上で示さ れるもの木出顧に開示される培養基はアメリカ合衆国６１６０４イリノイ州ベオ リア、ノースユニバーシティ−ストリート１８１５のノーザンリージョナルリサ ーチセンターの、アグリ力ルチュラルリサーチサービスパテント力ルチャーコレ クンヨン（ＮＲＲＬ）中に寄託されている。 好まし・い具体例中で、本明細書に提供されるヌクレオチド配列情報は、標準の ＰＣＲ手順を炉用したときに、所望の遺伝子を開示する単Ｒ体から得るのに使用 できるプライマーを造るのに使用できる。これらの手順は良く知られ、この分野 で一般的に使用されている。別の方法として合成遺伝子又はその蛋白質は遺伝子 機械及びそこに提供される配列清州を使用して造ることが出来る。 本発明は本明細書に例示される特定の遺伝子及び毒素のみならず、開示された単 離体の変異体から得ることが出来ろ遺伝子及び毒素にも間する。これらの変１４ 体は、本質的に例示された単離体と同じ鞘翅類活性を有している。更に、本明細 書に与えられたＤＮＡ及びアミノ酸配列を使用し・て、当業者は本明細書に開示 される遺伝子と毒素の断片又は突然変異体を容易に造ることが出来る。 これらの断片及び突然変異体は例示される毒素の鞘翅類活性を保持しているが、 本発明の主題の範囲内にある。 また遺伝子コードのレダンダンシー（縮１ｉ）の為に、本明細書に開示されるア ミノ酸配列を種々の異なるＤＮＡ配列がコード出来る。これらの同じ又は類似の 毒素をコードする別のＤＮＡ配列を造ることは当業者の技術の範凹円である。こ れらのＤＮＡ配列は本発明の範囲内にある。木切細雪で使用ずろ「本質的に同じ 」配列と述べるときは、鞘ｌＩｌ類活性に実質的に影響しないアミノ酸の置換、 欠失、１１加又は挿入を寵する配列をさしている。鞘翅２Ｎ活性を保持する断片 もこの定義に含まれる。 本発明の鞘翅類に活性な毒素は、既知の方法で単能出来、広範囲の微生物宿主へ 導入できる。ｌ＋［遺伝子の発現は、直接又は閏；寂；こ殺虫剤の＠胞内生産と 匡持をもたらす、適当な宿主、例えばシュードモナスの場合、微生物はＭ用類昆 虫発生１ΩＩｌ：こ施用さＪＬろと、そこで増殖し、昆虫に摂取される。その結 果、望んでいない昆虫を防除できる。その代わり；こ、冴票Ｉ！！伝子をもった 微生物を、細胞内てつくらハフろ毒素の活性を持続させるような条１キ下ｔこ処 理てきる。次ここ処＋ｔ！！細＠を目標害虫環たしこ施ｍてきる。生ずる生成物 は８，１．毒素の毒性を筺持し、ている。 Ｂ、　ｔ、毒′１ｇＬ；１１云子が適当な・＼フタ−を−１で微生物宿主へ導入 されて、この宿主が生きている状態で環境へ施用される場合−二、＋Ｒる宿主は 生物を使用すること力＋１要である。微生物宿主は、一つ以上の問題の作物の「 植物領域Ｊ（葉面、葉領域、擺頑域、Ｆ）、Ｕ’／ヌは恨表面）を占有すること が知られたものを選択する。これらの微生物は、特定環境（作物及び池の昆虫生 、！！、場所）中で野性型微生物とうまく競合できるように逼ばれ、ポリペプチ ド殺虫剤を発現さ仕るＪＪ１区子の安定な維持と発現を提供し、望ましくは殺虫 剤が環境的に分解及び不活性ＩＬ１″ることからの改良された保護を１昂洪する 。 広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）及び／又は根の領域（植物のＩＨの 虜囚の土壌）に生息する多数の微生物が知られている。これらの微生物はＩＩ前 、藻類及び菌Ｘ′Ｊｌを包含している。特に興味あるものは、細菌、例えばシュ ードモナス（Ｐｓｅ＋＋＋Ｊｏ＊ｏｎａｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ） 、七うティア（Ｓ　ｅ　ｒ　ｒ　ａ　ｆ、　ｉ　ａ　）、クレブシェラ（ｋｌｅ ｌ＋ｊｉｅｌｌａ）、午サン１゛モナス（＼ａｎ　ｆ　ｈｏｗｏｎａｓ　）、ス トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｔｓｙｃｅｓ＞−リゾビウム（ｌＩｌ＋ｉ２ｏ ｂｉｕｍ）、　ＣＩ−ドシュ−トモｆス（Ｒｈ　ｏ　ｄ　ｏ　ｐ　ｓ　ｅ　ｕ　 ｄ　ｏ　＊　ｏ　ｎ　ａ　ｓ　）、メチロフイリウス（Ｍｅ口＋ｙｌｏｐｌ＋１ ｌｉｕｓ）、アグロバクテリウム（ｌ＼Ｈｒｏｌ）ａｃｔｃｒｉｕｉ）、アセト バクタ−（ＡｃヒＬｏ１１ａｅｔｅｒ）、乳酸杆ｖＵ（ＬａｃＬｕｌ＋ａｃｉｌ 　Ｉｕｓ）、アースロバフタ−（Ａｒｔｂｒｃ＋ｌ＋ａｃＬｅｒ）、アゾトバク タ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロイコノストック（１，ｅｕｃｏｎｏｓｔｏ ｃ）、及びアルカリゲネス（Ａｌｃａｌ　１３ｅｎｅｓ）属の線菌；真ａｉｏ、 特に酵母１例えばサン力ロミ七ス（Ｓ　ａ　ｃ　ｃ　ｌ＋　ａ　ｒ　ｏ　ｗｉ　 ｙ　に　ｅ　ｓ　）、クリプトコツカス（Ｃｒ）ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クルイ ベロミセス（ｋｌｕｙｖｅｒｏＢｃｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏ 　ｆｏＩｌｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈ。 ｄｏＬｏｒｕｌａ）、及びオーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ）属なとの微生物である。特に重要なものは、シュードモナス−シリンガニ（Ｐ ｓｅｕｔｌｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒ　ｉｎｇａｅ）、シュードモナス・フルオレス センス、セラティア書マルケスケンス（ＳｅｒｒａＬｊａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎ ｓ＞、アセトバクター・キシリヌム（４ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　＼＞１ｉｎｕ＋ ｇ）、’：ｉ”／　Ｕ　Ｂ　’ｌ　’Ｔ　Ｕ　’７　Ｊａ　・ツ）ｌ　フｒ゛シ エごス（Ａ３ｒｏｂａｃｔｅｒｉｏ＋１＋、＋＋＋ｗｅｆａｃｉｅｎｓ）　ロー ドシュードモナス・スフエローｆデス（Ｒｌ＋　ｏ　ｄ　ｏ　ｐ　ｓ　ｅ　ｕ　 ｄ　ｏ　Ｗ　ＯＩＩ　ａ　ｓ　ｓ　ｐ　ｈ　ｅ　ｒ。 ｊ　ＩＩ　ｅ　ｓ　）、キサンＩ・モナス・カンペストリス（Ｘａ＋山１０１０ ｎａＳｃａ＊ｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム・メリオチ（Ｒ４＋１ｚｏｉ＋ｉｕ ＊　＊ｅｌｉ。 Ｌｉ）、７Ａ力＋）’ｊ＊ス・ｘン）　口７ス（ＡＩｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅ＋ ＋Ｌｒｏｐｈｕｓ）、及びアセトバクター・ヴインランディ（Ａｚｕｔｏｈａｃ ｔｅｒ　ｖｉｎｌａ＋＋＋Ｊｉｉ）のような植物ｍｌの細菌（；及ＵＯ−トド／ Ｌ　−７’　）Ｌｔ　７　ラ（ＲｈＯｄＯｔＯｒｌｌｌａ　Ｉ’ＬＩｂｒａ）、 Ｒ，グルチニス（Ｒ、３１ｕ　ｔ　ｉ　ｎ　ｉ　ｓ　）　、Ｒ、マ？ノーゴ″（ Ｒ，ｍａｒｉｎａ）、Ｒ，オーランディ７カ（Ｒ，ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ク リブトコ・ンプＪス拳アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｉ＋１ｕ ｓ）、Ｃ，ジフルエシス（（、ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、　Ｃ，ローしシティ（Ｃ ，１ａｕｒｅｎｔｉｉ）、サノカロミ七ス・ａゼイ（Ｓ、　ｒｏｓｃｉ）、５． １し）　’／　エンシフ、　（Ｓ、　ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、　Ｓ、セレ ビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヌボａ　、に１７ミ七ス・ａゼウス（ Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍ＞（ｅｓ　ｒｏｓｅｕｓ）、５・オドルス（Ｓ、　。 ｄ　（＋　ｒ　ｕ　ｓ　）、クルイベロミセス・つｘｒ３−すＬ　（ｋｌｕｙｖ ｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｏ＋１ａｅ）及びオーレオバシジウム、ホルランス（ Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｏｌｌ’ｕｌａｎｓ）のような植物領域の酵母 種である。 特に１ｉ要なのは′ｆｉ色素微生物である。 遺伝子の安定な維持及び発現を可能とするような条件下に、毒素光用Ｂ、　ｔ、 遺伝子を微生物宿主に導入するには、広範囲の方法が利用できる。毒素遺伝子発 現用の転写及び翻訳調節信号と、その調節制御下のＷｌ素遺伝子、及び組込みを 行なうた））の宿主生物内の配列と相同のＤＮＡ配列、及び／又は絽込みや安定 な保持が起こるための、宿主内で機能出来る復製系などを含んだＤ？ζ八構へ体 を用意することができる。 転写開始１８号はプロモータと転写開始１８号１を包含する。ある場合には、毒 素の調節的発現を提供して、毒素の発現がＴ′！境への放出後にのみ生ずるよう にするのが望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチベータやエンハ ンサに結合する領域によ７て達成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境 の変１ヒによって誘発てきる０例えば、温ｒＸ感受性調節領域を使用すると、生 物は毒素を発現せずに実験室で生育てき、環境へ放出されると発現が始まる。　 １１！！の手法は、実り高で毒素の発現を抑、ｖｌする特定栄ｉ　ｉａ地を使用 し、一方ＦＩＩＩｊｉ中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用できる 。ａ訳開始には、リポソーム結合位置と開始コドンが存在する。 特に活性プロモータを使用し、並びにメツセンジャーＲＮＡの安定性を強１ヒす る配列を使用することによ７て、メツセンジャーの発現を強化するために種々の 操作を使用できる。開始及び翻訳終結領域は浮止コドン、ターミネータ−領域を 包含し、任意付加的にポリアデニル化信号を包含してもよい。 転写の方向、すなわちコーデイシグ又はセンス配列の５１ｂ）ら３′への方向で 、構造体は、もしあれば転写ＴＩ４節領域とプロモータ（制御領域はプロモータ の５°又は３°のいずれかにある〉、リボゾーム結合位置、開始コドン、開始コ ドンと相が合っているオーブンリーディングフレームをもった構造ｓｌ伝子、滲 出コドン、もしあればポリアデニル化信号配列、及びターミネータ−ｗ４域を含 み１得る。 二本鎖としてのこの配列はそれ自体で微生物宿主の形質転換に使用できるが１通 常マーカーを伴うＤＮＡ配列を含み、その場合この第二のＤＮＡ配列を宿主への ＤＮＡ導入中に青票発現構造体に結合させることができる。 マーカーとは、変更又は形質転換された宿主の選定を１テなうためのｔｉ構造遺 伝子ことである。マーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物 質や重金属への耐性なとの殺生物耐性や、栄養素要求宿主に原栄養性を与える相 補性″Ｊを提供する。変更された宿主が選定されるだけでなく、野外で競合的で あるように、相補性を使用するのが好ましい、？ＩＩ造体の開発に、また宿主の 変更に、一つ以上のマーカーを使用できる。野外で曲の野性型微生物に対する競 合的利点をＬｌ洪することによって、生物を更に変更できる０例えば、金属キレ ート剤、例えばシデロフォア項の発現遺伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と一緒 に宿主へ導入できる。この方法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産宿 主に競合的利点を提供するため、宿主は野性型微生物と効果的に競合し、環境中 で安定した生態的地位を占めろようになる。 安定なエピゾーム匡持又は聞込１＾を望む場合は、宿主中で機能出来ろ？１［製 糸をも−〕たプラスミドが使用される。 復製系は染色１本、その宿主又は異なる宿主内に通常存在するエピゾーム要素か ら、又は宿主内で安定なウィルスの複製系から誘導されろ、　ｐＢＲ３２２、ｐ 　、Ｉ　ＣＶ　Ｃ＋　８４、ｌｌ５ＦＩＯＩＯ１ｐ　Ｒｌ）　ｌ　Ｇ　１４等の ような多数のプラスミドが人手てきる０例として、オルソン（Ｏｌｓｕｎ）ら、 （１９８２年）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ！。 １５０巻Ｇ０６０頁、及びハグダサリ７ン（ＢａＨｄａｓａｒ　ｔ＆ｎ）ら、（ １９８１年）　Ｇｅｎｅ　１０巻２３７頁、及び米国特許第４．３５（ｉ、２７ ０号、第４，３６２．８１７号、及び第４，３７１．０２Ｓ号を舎照のこと。 機能出来る復製系が存在し・ない場合、構造体は宿主内の配列と相同な、少なく とも５０塩基対（ｂｐ）、好ましくは約１００　ｈｐ、ぞして通常約１．０００ １月）を越えない２．列も含む。 こうし・て合法的な組換えのｆｉ墨が高められるため、遺伝子は宿主へ和み込ま れ、宿主によって安定にＳ持される。 毒素遺伝子が相補性を１１供する遺伝子並びに競争的利点を提供する遺伝子に近 接しているのが望ましい、１にっで、毒素遺凹子が失われる場合、生ずる生１η は相補性遺伝子及び／又は競争的利点を提供する遺伝子も失う可能性が強く、こ のためそのままの構造体を作詩している遺伝子と環境中で競合できなくなる。 ａ菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、真菌類等のような広範囲 の微生物宿主から多数の転写調子、Ｉａｃｌ法子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び 右プロモータ、ｔａｃプロモータ、及び宿主中で機能出来る場合は毒素遺伝子と 間違した天然プロモータと間違する領域を含む。 ｍとｂ’ｒ米国特工’ｆ　第４．３３２．８９８号、＊　４．３４２，８３２４ ｔ、及Ｕ１４．３５６．２７０号を参照のこと、ターミネーション（終止）領域 は、普通はその転写開始領域と関連づけられたターミネーション領域か、又は二 つのＭ域が宿主内で適合性で機能出来る限りにおいて異なる転写開始ｗＩ域と関 連づけられたターミネーション領域でありうる。 Ｂ、ｔ、遺伝子は開始領域の調ｉ！１制御下にあるように、転写翻訳開始領域と 転写翻訳終結領域との間に導入できる。 この構造体はプラスミドに含められ、プラスミドは少なくとも一つの７Ｊ［製糸 を包含するが、一つを越える複製系を包含でき、その場合一つの複製系はプラス ミドの開発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最終宿主での機能発 揮に必要である。更に、すてに述べた一つ以上のマーカーが存在できる０組込み を望む場合は、プラスミドは宿主ゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。 形質転換体は、通常、未変更生物や、存在する場合の運搬生物に対して所望生物 の選定を可能にする慣用の方法に淀う選定技術を用いて単離できる０次に形質転 換体を殺虫活性のために試験できる。 処理！Ｉ胞を目標害虫環境に施用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるよう に殺虫剤含有細胞を処理する場合の適した宿主細胞は、原核生物及びＪＩｃ咳生 物を包含するが、通常、哺乳類のような高等動物に有毒な物質を生しない細胞に 限定されろ。し・かじ、毒素が不安定か、哺乳類宿主への毒性の可能性を回避す るのに十分な低い施用水準であ一５場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生 物も使用できる。宿主とし・て特に興味あるものは、原核生物と、ｌｌｃ菌頚の ような低級真核生物である。ゲノム陰性・１性の双方の原核生物の例は、　エシ ェリキア（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉ　ａン、エルウィニア　（Ｅｒｗｉｎｉａ ）、　シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｓｕｎｅｌｌａ）−及 びプロテウス（１’ｒｏＬｅｕｓ）のような腿肉１１ｉＩｌ科（ＥｎＬｅｒｏｂ ａｃＬｅｒｉａｃｅａｅ）　：バシラスｆ４（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　Ｉａｃｅａｐ） 　：リゾビウム（ＲＩ＋１ｚｏｂｉｏｓ）のようなりゾビウム科（Ｒ１目Ｚ＋＋ ｌＩ！ａｃｅａ＋り　：発光細菌、ジモモナス（Ｚｙｉ＋ｏｍｏｎａｓ）、七う テ？ア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（Ａ　ｅ　ｒ　ｏ　ｍ　ｏ　ｎ　ａ 　ｓ　）、ビブリオ（Ｎｉ　ｂ　ｒ　ｉ　ｏ　）、　デスルホビブリオ（Ｄｅｓ ｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌ　Ｉ＋＋＋＊）のようなら せん画材（Ｓｐｉｒｉ　ｌ１ａｃｅａｅ）　；　乳散かん菌ｆ’ｉ　（Ｌａｃ　 ｔｏｂａｃｉ　ｌ　Ｉａｃｅａｅ）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｃｌｏａ＋ｎｎ ａｓ）及びアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のようなシュードモナス 科（１”　ｓ　ｅ　ｕ　ｄ　ｏ　ｍ　ｏ　ｎ　ａ　ｄ　ａ　ｃｅａｅ）；アセト バクター１４　（Ａｚｏｔｏｂａｃｔ、ｅｒａｃｅａｅ）及びニトロバクタ−科 （Ｎｉ１．ｒ＋＋Ｉ＋ａｃＬｅｒａｃｅａｅ）＆包含する。真核生物には藻菌ｆ １４　（Ｐｈｙｃｏ＋ｅｙｃｅｔｅｓ）と子嚢菌Ｈ（Ａｓｃｕｓ＞ｃｅｔｅｓ） のような真菌類があり、これはサツカロミセス（Ｓ　ａ　ｃ　ｔ：　ｈ　ａ　ｒ 　ｏ、ｍ　ｙｃｅｓ）とシゾサ・ソカロミセス（Ｓｃｌ＋ｉｚｏｓａｃｃｈａｒ ｏｇ＋ｙｃｅｓ）の様な酵母、ロードトルラ（ＲＩ＋ｏｄｏＬｏｒｕｌａ）、オ ーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｇ＋）、スポロボロミセス（Ｓｐ ｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）のような担子ｉｆｆ　Ｘｌ（Ｂａｓｉｄｉｏｉ＋ｙ ｃｅＬｅｓ）酵母を包含する。 細胞は通常、ｊ！ｊ湛であフて、処理時に胞子型よりも実質的に増Ｍ盟にあ、る が、ある場合には胞子も使用できる。 微生物細胞、例えば８．ｔ、毒素遺伝子を含有する微生物の処理は、毒素の性状 に悪影響を及ぼさないか、又は毒素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化 学的又は物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の組合わせによる。化 学的試薬の例はハロゲン化剤、特に原子番号ｌ７−８０のハロゲンである。もつ と特定的には、ヨウ素を温和な条は下に、所望の結果を達成するのに十分な時間 に使用できる。＊の適当な手法は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのよ うなアルデヒド類；塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤 ；イソプロピルアルコール及びエタノールのようなアルコール類；ブアン固定剤 、及びヘリ−固定剤（フマソン（Ｈｕｗ＋ａｓｏｎ）、ブレ・ソチェン・エル（ ＧｒｅＬｃｈｅｎ＋　Ｌ、）＾ｎ１ｓａｌＴｉｓｓｕｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ 動物組織手法）ダブリュー・エッチ・フリーマン社、１９６７年、を参照）のよ うな種々の組織学的固定剤等での処理；又は宿主動物に細胞を投与する時に細胞 中に造られる毒素の活性を保持し、持続させるような物理的処理（加熱）と化学 薬剤処理との組合わせを包含する。物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のよ うな短波長放射線、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥等である。 一般に細胞は、環境条１牛°に対する耐性を強化するような１強化されたｔｉｌ 造安定性をもってあろう、殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫＠Ｊｌｉ！体によ る殺虫剤のプロ型から成熟型への処理を抑制し・ないように、不活性化方法を選 定すべきである。ｒＡえばホルムアルデヒドはタンパクを１ｔ＃Ｌ・、プロ型ポ リペプチド段虫剤の加工を抑ル１しうろ、不活性化ないし・の虫方法は、毒素の 少なくとも大賀鳳の生物利用性又は生物活性ｆｉ：保持する。 生産目的のために宿主細胞を選択する上で特に重要な特性は、　ｅ、ｔ、遺伝子 の宿主への導入の容易さ、発現系の人手性、発現効率、宿主中の殺虫剤の安定性 、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。ａ主剤ミクロカプセルとして使用する のに興味ある特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケージング又は封入 体の形成のような殺虫剤深謹性；葉親和性二対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂取さ せるための誘引カニ毒素に損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。ｌｌ ！！の考慮としては、処方と取扱いの容易さ、経済性、■存安定性等がある。 特に重要な宿主生物は、ロードトルラの種、オーレオバシディウムの［す・・ノ カロミセスの種、スポロボロミセスの種のような酵母：シュードモナスの種、エ ルウィニアの種、Ｔ）、Ｕフラボバクテリウムの種のような葉面に生息する生物 ：又はエシェリキア、乳酸杆菌の種、バシブスの種等の池の生物を包含する。特 定的な生物は、シュードモナス−７工ルギノ号（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｕａｓ　ａｅ ｒｕｇ　１ｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ、ｆ　１ｕｏｒ ｅｓｃｅｎｓ）。 サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）、バシラス・チューりンゲンシス、大１１１１．枯草１１　（Ｂ。 ５ｕｂｔｉｌｉｓ）等を包含する。 ８、ｔ、鱗翅類遺伝子を含有する細胞宿主は任意慣用の栄羨培地で生育てきるが 、ＤＮＡ構造体が選択的利点を提供するときは、細胞の全部又は実質的に全部が ８．ｔ、遺伝子を保持するように選択培地を与える０次にこれらの細胞を慣用方 法に１にって収穫する。その代わりに、細胞を収穫前に処理することもてきる。 ｅ、ｔ、細胞を種々の方法で処方できる。これらを種々の不活性）オ料、例えば 、無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又はＩ１１物ｉ才料（ 粉末トウモロコシ穂軸、米もみ殻、クルミ殻等）と混合することにより、水和剤 、粒剤又は粉剤として使用できろ、処方剤は眉粘着助剤。 安定化剤、その他殺虫添加物、又は表面活性剤を包含できる。液体処方剤は水性 基盤又は非水性基盤のもので、フオーム、ゲル、懸ｉｌ　液、乳剤等として使用 できる。成分はレオロジー剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含で きる。 口虫剤濃度は特定第方剤の性質、特に濃縮液か直接使用されるかによって、広範 囲にわたる、毒素は少なくとも約１重量２で存在し、約ｌｏｏｍ　ｉｔ　Ｘであ りうる。乾燥処方剤は約１−９５重重量の毒素をもつが、液体処方剤は一般に約 １・００１１　＄の固体を液相中にもつであろう、処方剤は概してｍｇ当たり約 １０１ないし約１０’ｌｌの細胞をもつであろう、これらの処方剤はへクタール 当たり約５０　Ｂ（液体又は乾燥）ないしＩ　ｋｇ以上で投与されよう。 処方剤は鱗翅類害虫の環境１例えば植物、土壌、又は水に劃り散布、散水等によ って施用できる。 以下は本発明実施の最蕾のａ様を含めた手順を例示した実施例である。これらの 例は限定的に考えられてはならない、池に注意がなければ、百分率はすべて重量 、溶媒混合物割合はすべて容量による。 実施例Ｉ　Ｂ、ｔ、微生物の培養 本明細書で間示し・たＳ、ｔ、微生物のサブカルチャーを次の培地、ペプトン・ ブドウ糖・塩培地に接種するのに使用で１する。 バクト・・凡プトン　７．５　ｇ／ｌ ブドウ１１　１．０　ｇ／ｌ にＨａＰＯ４３，４ｇ／ｌ にａＨＰＯａ　４．３５８／１ 塩ｆ８液　５．０■ｌ／ｌ ＣａＣｌ□ｉｌ　渣　５．Ｏｍｌノｌ 塩溶液（１００ｍｌ） ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｑ　２．４６１Ｅ ＭｎＳＯ４’８２０　０．０４　ｇ ＺｎＳθｍ’７１１２０　０．２８　ｇＦｅＳＯａ７Ｈ２００，４０１Ｂ ＣａＣ，Ｉ　２ｉｉｉ　Ｉα（１００ａｔ）Ｃａｔ−，１２・２１１２０　３． ６０　３ｐＨ７，２ 塩溶液と＋、’　ａ　Ｃｌ□溶Ｉ１１過滅菌し・、オートクレーブ処理し調理し たフロスニこ、ｔ！種時に添加する。　２０Ｏｒｐ膳で運転の回転娠ｉｊｉ機で 、フラスコを３０’（、Ｇ−１時間ｉ＆　ｌする。 土の手順は、この技術て周知の手順；こより、大Ｓ！！酵装置まで容易に規ｔ！ 拡大できろ。 上のｉＱＲで得られるＢ　、　ｔ、　、　Ｉｔと子及び結晶とよ、このＩ支所て 周知の手順により単ｉできる。しばしζＸ用Ｌｌ　１′：ＩｊＬろ手順は、取り 入れた醗酵イはを分離手順、例λζＸ遠、Ｃ・分離ζこｂ）けることである。 １１肛２　ｅ、ｔ、ｆＭＩ！１すＬムしＬ隻盈旦旦ｊＢ、シ菌株をコロラトホテ トビートノしくコロラドじやｈ＋いもハムシ）であるレブチノタルサ　し七ム１ ノネアタ（１コ２ｔｉｎｏｔ、ａｒｓａ　ｄｅｃｅ＊１ｉｎｅａｆ、ａ）に対す る代用品であるレブチノタルサ　ルヒギノサ（Ｌｅいい旧＋　ｔ　ａ　ｒ　ｓ　 ａ　ｒ　ｕ堕士上拉ｐζこヌ櫨して試験した。バイオアラ七イを二つの異なるｌ （ジノしスチューリンゲンシス製剤に対して実施した。（１）Ｉｆ！子／ふき晶 ベレットヲ水中に懸濁した。（２）胞子／結晶ベレ７）を、０．５χの２−メル カプトエタノールを有する０、１ＭのＮ　ａ２ＣＯ３、ｐ）ｌ　１１．５で２時 間室温で処理した。調製物＃２は０．１Ｍ）リス、ｐＨ８に刻し・３時間透析し 、試料容量の１５培て３回文代させた。ｖ４製物＃ｌ及びｙ４製物＃２は等し・ い量の活性成分を含有していた。幼虫をＢ、ｔ、ｉ！剤中に浸し、第１齢の幼虫 を葉の上に置いた。この幼虫を２５℃で四日間培養してから致死率を測定し・た 。 ＨＤ５１１　５２％　９２％ ＨＤ８６７　９２％　１００％ ＨＤＩＯＩＩ　３Ｇ％　９２％ 本発明の一つの面Ｉｉ　ｈｉ物を鞘翅類毒素をコードする遺伝子て形質転換する 二とである。形質転換された植物は鞘翅類による攻撃に対し・抵抗性である。 本明細書に開示されるＭ　ｍ　１Ｍ活性毒素をコードする遺伝子はこの分野で良 く知られた種々の技術を使用して植物細胞に挿入できる０例えば大腸菌中の複製 系及び形質転ＩＩ　ｍ胞の選択を可能とするマーカーを含んでいる数多くのクロ ーニングベクターが外来遺伝子を高等植物に挿入するために１肯するために入手 できる。このベクターは例えばｐＢＲ：１２２、ｐ（）（ソリーズ、ＭＩ３ｍｐ シリーズ、ｐＡｃＹｃＩ８４などを含む、泥ってＢ、ｔ、毒素をコートし・た配 列は適当な制限場所で・ベクターに挿入てきる。生しろプラスミドは大Ｍｌ菌へ の形質転換に使用される。大腸菌細胞は適当な栄養培ＩＦ！＋中で培養され、次 に収ＩＸされ溶菌される。プラスミドは回収される。配列分析、制限分析、電気 泳動及び曲の生化学−分子生物学方法は一般に分析方法として実施される。各々 の操作の後、使用されたＤＮＡ配列は解裂され、改のＤＮ、へ配列に接合される 。各プラスミド配列は同し又は異なるプラスミド中にクローン化できる。所望の 遺伝子を植物に挿入する方法に広存してＩｌｌ！のＤＮＡ配列が必要かもしれな い１例えばもし・、Ｔｉ又はＲニブラスミドを植物細胞の形質転１９に使用する ときはＴ１又はＲ１プラスミド’Ｔ−ＤＮ、入の少なくとも右ボーダー、そして 多くの場合右及び左のボーダーが挿入されるべき遺伝子のフランキングＶ４域と し、て連結されなければならない。 植物細胞の形質転換の為のＴ−ＤＮ）＼の使用は、　ＥＰＩ２０５１６：ボエケ マ（１り　８５　）　’！　バイナリ−プラント　・−フタ−システムズ（ＴＩ ＋ｅＢｉｎａｒ５ＰｌａｎＬ〜〆ｅｃｌｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）、オフセット　ド ルツケリジ　カンタース　８．〜１、フルプラソサーダムｖ、５章：フラリー等 、Ｃｒ１ｔ、、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ。 ４：１−４６：及びアシ等（１０８３）　ｆ：、ン１８１′ＪＪ　、　４　：２ ７７−２８７中に広範囲に研究され、十分に記載されている。 一旦挿入ＤＮＡがゲノム中に統合１ヒされたなら、これはそこで比較的安定であ り、当然再び出ることはない。 通常はなかでもカナマイシン、Ｇ　４１８．プレオマイシン、ヒグロマイシン又 はクロラムフェニコール等の段生物剤又は抗生物質に対し形質転換されたｔｔｉ 物！Ｉ胞に抵抗性を与える一Ａ沢ママ−カー含有し・ている、四々に用いられた マーカーは１にって挿入ＤＮＡを含有していない細胞よりも形質転換された細胞 を選択を通訳できるようにする。 ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために数多くの技術が利用できる。これらの技 術は形質転換剤とし・てアグロバクテリウムッネファシエンス又はアクロバクテ リウムリゾゲネスを使用するＴ−Ｄ　Ｎ　Ａての形質転換、融合、注入又は電気 穿孔法（エレクトロボし−ション）並びに他の可能な方法を含んでいる。形質転 換のためにもしアゲロバクチリアが（支）用されるならば、挿入されるへきＤＮ Ａは特定のプラスミド、即ち中間体・ベクター又はバイナリ−・ベクターの何れ かにクローン化されなければならない。 申開１木ヘクター；よＴ−ＤＮ、へ中の配列に対する相同性を有する配列のため ここ、相同の組替え；こよってＴｉ又はＲｉプラスミド中に統合１ヒてきるｅ　 Ｔ＋又はＲｉニブラスミドＴ−ＤＮＡの運搬に必要なりｔｒ領領域含んでいる。 中間体ベクターはアグロバクテリウム中でそれら自体複製できない。 中間体・ベクターは・＼ルバープラスミドによってアグロバクテリウムツメファ シェンス中に移されることが出来る（コンジュゲーション）、バイナリ−ベクタ ーは大腸菌てもアゲロバクチリア中でもそれら自体複製できる。これらは退択マ ーカー遺伝子及び右及び左Ｔ−ＤＮＡボーダー領域によりてフし一ムされるリン カ−又はポリリンカーを含んでいろ。これらは直接アゲロバクチリア中に形質転 換できる（ホルスタ−等［１９７８］　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。 １６３：１Ｂ＋−１８７）。宿主細胞として使用されるアグロバクテリウムはＶ ｌｒｌ域を持っているプラスミドを含むはずである。ν１ｒ領域はＴ−Ｄ　Ｎ　 Ａを植物細胞に８すのに必要である。追加のＴ−ＤＮＡが含有され得る。そのよ うに形質転換されたＩＩ菌は植物細胞を形質転換するのに使用される。ＩＩＩ物 の外植片はＤＮＡを植物細胞に移す為にアグロバクテリウムツメファシェンス又 はアグロバクテリウムリソゲネスと共に培養されるのが有利てあり１！＃る。全 植物を次ここ適当な培地中−区７感染した植物物！（例えば葉の一片、茎、根の セグメント、但しそれらに限らず原形質体又は懸Ａ壌Ｉ＃細胞）から再生でき、 上記適当な培地は選沢のための抗生物質又は殺生物１！？４を含有し得る。その ようにして得たｌｔＩ物を次に挿入されたＤＮＡの存在について試験できる。注 入と電気穿孔法（エレクトロポレーション）の場合には、プラスミドに特別な要 求がなされない１例えばｐＵｃ誘導体等の通常のプラスミドを使用することが可 能である。 形質転換された細胞は通阜の方法で植物内で生育する。 これらは生Ｍ’Ａ胞を形成し、そして子孫植物に対し形質転換された性質を伝達 する。そのような植物は通常の方法で生育でき、同じ形賞転＋６された遺伝因子 を有する植物又は他の遺伝因子を有する植物とかけ合わせることができる。生じ るハイブリットｌｉＫは対応する衷現盟性質を有している。 ＬＬＬ４　Ｉ７ｉ規なｓ、ｔ、遺−子の　ウィルスへのクローニング 数多くのウィルスが昆虫に感染することが知られている。これらのウィルスには 例えばバクロウィルス及びエンドモボックスウーｒルスが含まれる０本発明の一 興体例に於いて、本明細書で開示される鞘翅類に活性の遺伝子は昆虫ウィルスの ゲノムと一緒にすることが出来、従ってウィルスの病原性を強めることができる 。　Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含んでいる昆虫ウィルスを造る方法は良く知られ、当 業者に容易に実施され得る。これらの手順は例えばメリウエザー等（メリウエザ ー、Ａ、Ｔ、、Ｕ、ウニイヤー、Ｍ　、Ｐ。 ６、ハリス、ト１．ヒルスト、Ｔ、ブース、　Ｒ，Ｄ、ポジー［１９９０］　Ｊ 。 Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　７１：ｌ５３５−１５４４）中に、そしてマルテシス 等（マルテシス、　、ｌ　、　Ｖ　、　Ｍ　、、６．ホネー、０．ズイデマ、Ｊ 、ν９Ｍ。 バンレント、Ｂ、ピッセル、Ｊ、Ｍ、プラク［１９９０］＾９ｐ１．　Ｅｎｖｉ ｒｏｎ＊ｅｎｔａｌ旧ｃｒｏｌ＋ｉｏ１．５６（９Ｃ２７８４−２７７０）中に 記載されている。 配列リスト 配列リスト （り一般情報 （ｉ）出願人：ベイン、シュウエル　Ｍ。 フ、ジエニー　Ｍ。 （ｉｉ）　発明の名称：鞘翅類活性毒素をコードする新規なバシルスチューリン ゲンシス遺伝子 （ｉｉｉ）配列数＝４ （ｉｖ）通Ｉ！住所 （Ａ）宛先：デビツド　Ｒ，サリワンチツク（８）街路：　２４２Ｉ　Ｎ、ν、 　４１ｓｔ　ストリート、スウイ−）Ａ−１ （Ｃ）シティ−名ニゲインスピル ＣＤ）州名：フロリダ州 （Ｅ）国名＝アメリカ合衆国 （Ｆ）郵匣番号：　３２６０６ （Ｖ）次のコンピューターから読取り可能（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣとコンパチブルのもの （Ｃ）　オヘ０レーテインク゛システム：　Ｐ（−００５／ＭＳ−００５（Ｄ） 　ソフトウｘ７　：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　レリース−ｓｔ、ｏ、バーーシ”３シ Ｈ，２５（ｖｉ）現時点の出願データ （Ａ）出ＷＡ＠号：ＵＳ （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： くｖｌ）前の出願データ （Ａ）出ｗＡ＠号：　ＵＳ　０７／７８８．６３８（Ｂ）出順日：　１９９１年 １１月６日（Ｃ）分Ｕ： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報 （ｉｘ）テレコミュニケーション情報 （Ａ）電話：　９０４−３７５−８１００（Ｂ）　フックス：　９０４−３７２ −５８００（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｌ）：Ｉ：に関する情報（１）配列の特徴 ： （Ａ）長さ：３４１４塩基対 （Ｂ）種ｎ：核酸 （Ｃ）鎖の数二二木鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　Ｅ列の種ＸＩ　（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　丁ＹＰＥ）　：　Ｇｅｎｏｍｉ ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｉｉｉ）ハイボセテイカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二 Ｎ０ （ｖｌ）起［（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　５ＯＵＲＣＥ）　：（Ａ）生物（ＯＲＧＡＮ ＩＳＭ）　：バシラス・チューリンゲンシス （Ｂ）株名（ＳＴＲ＾ＩＮ）；ダコタ （Ｃ）明体・単離クローン名（ＩＮＯＩＶＩＤＵＡＬ　ｌ５ＯＬＡＴＥ）：ＨＤ ５１１ （ｖ口）直接の起Ｒ（団ＭＥＤＩＡＴＥ　５ＯＵＲＣＥ）　：（Ａ）ライブラリ 名：　、１　、　Ｍ、フのラムダゲム（Ｌａ、ａｄａ２ｅｍ）　（ＴＭ）ｉｔラ イブラ１ノ（８）クローン名：５１１ （ｘｉ）　５？、列（ＳＥＱＵＥＮＣε［ＩＥＳＣＲＩＩ’Ｔｌ０Ｎ）：　ＳＥ Ｑ　１０　ＮＯ：Ｉ：τ（：ＡＧＴＴＧＴＡＧ　ＴＴ’ＴＡＴＣＣＧＴＡ　ＴＡ ＣＴＣＡＧ入ＡＴ　ｍｒｃｃｒｃＴｃｃｉ　ＡＧ（ＪＡＧＴＴＧＡ　ＧＴ？ＴＴ ＡbＧＧＴ　１λ６Ｑ ＧでＣＣ入入τＣ入八へＡＩＩＪ７ＣＣＡＡＧＴ　ＧＴＡＴ五ＴＧτＣλ％ＴＴ ＾τＣτＧ’１ｌＴＧでＴＣＣ入ＧＧ　ＴＧＴλ入入ＴＣ入メ@２９４０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：に関する情報（１）配列の特６＆： （Ａ）長さ：１１３８アミノ酸 （８）種類二アミノ酸 （１ｍ）鎖の数；一本鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の１寥１１（Ｍｌ＞１．Ｅｔ二ＩＩＬＥ　ＴＹＰＥ）　：タンバク 質（ｉｉｉ）ハイボセテイカルロシ列：　）’　ｅ　５（１ｖ）アンチセンス； ＮＯ （ν１）起Ｒ（Ｑ　ＲＩ　Ｇ　Ｉ　Ｎ　Ａ　Ｌ　Ｓ　ＯＵ　ＲＣＥ　）　’（Ａ ）生物名：バシラス・チューリンゲンシス（Ｂ）株名：ダコタ （Ｃ）個体・単離クローン名：ＨＤ５１１（ｖｉｉ）直接の起１１１（ｌＨＨＥ ［１ｌＡＴＥ　５ＯＵＲＣε）：（・＼）ライブラリ名：　、Ｊ　、　Ｍ　、フ のラムダゲム（Ｌａｍｄａｇｅｓ）　（ＴＭ）−１１ライブラリ（Ｂ）クローン 名：５１１ （ｘｉ）配列（ＳＥＱＵεＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　ＩＤ 　１１０：２：Ｍｅｔ　ＡｊＣＩ　Ｌａｕ　Ａ１１ｔｌ　ＡＪｎ　Ｌｍｕ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　丁ｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｍｐ　ｓｉｒ　入ａｎ　入ｒ７　Ｔｂｘ　s− ｏｎ ｌ　５　１０　１５ 人ｊｎ　Ａｊｎ　５ｔｉｒ　Ｌｓｕ　λＩＩ（１’ｒｙｒ　ｐｒｏ　丁ｈｒ　Ｇ ｉｎ　Ｌ７ａ　＾１ｈ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ：　Ｐｒｏ　ｓｅｒ@Ｌａｕ ２０　２５　３Ｇ Ｌｙｓ　Ａｎｔｉ　ＮｅｔＡｍｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　入ｓｐ　Ｐｈｓ　！：ａｕ 　５ｅｒ　ｒｌ囃　Ｔ）ｌｒ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　ａｌｕ　ａ撃窒■ ｐｒｏ　ｇｇｕ　入１ａ　Ｌｓｕ　入１ａ　ｓａｙ：　ＧＡＹ　入ａｎ　？：ｈ ｒ　入１・　工ｉｓ　Ｈｇｎ　′ｒｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　唐≠■ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｆ　Ｌｅｕ　ｇｓｒ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　 Ｇｌｙ　ｖａｌ　ＰＴｏ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｂｒａｔ　ｐｈ■ 工ｉｓ　Ｔｈｒ　ｘｎｎ　ｐｂｍ　Ｔ　ｍｕ、　ｒｌ＋ｙ廖工１ａ　Ｔｈｒ　Ｇ Ａｙ　ｒ、ｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　髭ｍλ１ｎＬＹ＠　Ｍｏ　ＺＬ＠Ｔ ｒｇ　Ａｊｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　）ｌｅｔ　Ｔ）ｌｒ　Ｇｌｌ！　Ｖａｌ　Ｇｌ ｕτｈ、ｒ　Ｌ？：　Ｉｌｅ　Ｇｌ■ Ｇｉｎ　Ｌｙｊ　ＸＬ：　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　’ｒｙｒ　Ａ１１ｌ　憫入ｔｒｎ　 ＬＹＭ　入１ａ　Ｌｅｕ　↑９　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ａｌｕＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｙλｓｏ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　ｒｈｒ工１ｅ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　 Ｌａｕ　ＧｌｕλｊＰ　Ｔｆ’Ｐ号ｎ入ｆｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　↑Ｅ ｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　１１ｍ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　入ｓ ｐ　ＡｒｇＰｈｏ　Ａｒｇ　Ｉｌ＠Ｌ＠ｕ　Ａｓｇ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｐｈｓ　 ａＬｕ　荒Ｔｙｒ　Ｍｔ　Ｐｒｏ　５ｏｔ　Ｐｈａ　ＡｒｇＶａｔ　Ａｌａ　０ １７　Ｔｉｒ　ＧＬｕ　Ｘ１＠　Ｐｒｏ　Ｉｔ＠ｕ　ｒ、ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＡｌａλｌE Ｌａ５ Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｒ４ｓ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　！ａｕ　Ｗ　Ａｓｐ　ｓｅ ｒ　ｒｋｕ：　ｕｕ　ｎｒ　Ｇｌｙ　Ａｍｐ　Ｌｙｓｒｒｐ　ｃｌＭ　ｐｈ＠ｒ ｈｒ　ａｌｎ　Ａｍｎ　ｘｓｎ　ｘｉｓ　ａｌｕ　ａｌｕ　ｈｓｎ　Ｔ　ｘｓｎ 　ｍｇ　ａｌｎ　、ＬｙｓＬＨＩｕｓ　Ｉｌｅ　ＢｍＩ　Ｇｌｕ　Ｔ　ｓｅｒ　 Ａｓｎ　ＩＩｆｓ＋　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｅ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｇｏ　５ｕ ｒＧｌｙ　Ｌａｕ　１！＠ｒ　Ｊ″″ｑ　Ｌａｕ　Ａｇ″Ｇｌｙ　ｓｏｘ　ｒｈ ｒ　’ｐ、ｇ°ｌｕ　ａｌｎ　ｒｒｐ　ｘｉｓ　ｘｇｎ　ｑ＋■ Ａｊｕ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧｌｕ　Ｍｅｔ　ＩｌｅＬｓｕ　Ｍｅ ｔ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｊｐ　””　Ａｌａ　ＡｌａＶａｌ　Ｐｈｅ　ｐｒｏ　 ＸＬ＠　’ｒｙｒ　Ａ１１ｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｎｓｔ　Ｑｒ　ＢｍＩ：　Ｍｅ ｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　５＠ｒ　Ｔ■■ ａｌｎ　ＴｉＨｇ　′ｒｈｒ　Ｊｕ−ｑａｌｕ　ｖａｌ　Ｈｇ　Ｔｂｘ　Ａ″ｐ 　ｔｗｏ　ｘｉｓ　ｓａｇ　ｒ−ｇｓｒｓ　ｓｓｒ　Ｉｌｅ@Ｓｉｒ Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　工ｌ＠　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｐｈａ　Ｓｉｒ　 Ｇｉｎ　Ｍｔ　ａｌｕ　ｈｅｎ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｐｈ５３０５　、、　３３． ０　３１５　３２０Ａｒ９　Ｔｈｒ　ｐｒｏ　ｕｉｓ　”ｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　 Ｔｙｒ　ｒｌａｕ　Ａｌｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒｐｒｏ　Ｉｇ　τｈｒ５０ ″＝Ｌｙ″ＴＹ！？　ＬＸＷ　Ａｌａ　ｐｈｏｓｅｘ：　ｍｉｓ　霜ｘｉｓ　ａ ｌｎ　ｐｒｏ　Ａｎｐ　ｒ、兆ｐｈｅ　゛宿ｒｒｐ　ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｂｉ、ｉ 　ｒ−ｙｓ　ｖａｌ　ｓｉｒ　ＰｈａＬＹＩＩ　ｒ、ｙｓ　ｓｕｒ：　ａｌｕ　 ａｌｎ　ｓｅｒ　ｈｅｎ@Ｌ酋ｕ Ｔｙｌ：　ＴｊＭ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｘ１ｍ　Ｔｙｒ　ＧｊＮ　Ｌｙｓ　Ｔｈｘ 　Ｓ・ｒ　ＧＩＹ　７１１ｅ　Ｓｅｒ　ｓ・ｒ　ａｎｙＡｌａ　’ｒｙｒ　ｓｅ ｒ　Ｐｈａ　）ｒｑ　ＧＩＸ　Ａｊｌｎ　Ａｊｐ工１ｅ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈ ｒ　Ｌａｕ　ｘｌａ　Ａｌａ　ＰｒB Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　ＶａＬ　’Ｉｇ　ＰｆＯ’ｒｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇ１．ｎ 　Ａｓｎ　７ｙｒ　ＧＬｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　：ｌｎ　Ｖａ■ ｃｌｕ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｇ３Ｋ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｂｉｔ　’ｆｆ！ 　Ｈｌｓ　ｒｙｒ　Ａｒ９　ＧＩＹ　Ａｓｇ　Ａｏｎ　ｚｙ■ Ｔ７ｒ　Ａ１１ｐ　ｒ、ｓｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｉｂ＋　Ａｓ ｐ　Ｇｉｎ　１Ｌｓｕ　ｐｒｏ　ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　fｌｕ Ｐｒ：ＯＩｌａ　Ｒｌｍ　Ｇｌｕ　ｒ、ｙｓ　’ｒｙｒ　Ｔｈｒ　ｍｉｓ　Ａｒ ９　Ｌａｕ　Ｃｙｇ　ｓｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　入１ａ　ｘfＪ、５ ４５０　４５５　４６Ｇ ｓｅｒ　ｌ、ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ｈｓｇ　ｑｒ：　ｈｓｐ　ｍｎ　 ｘｌａ　ｔｈｒ　ｘｉｓ　ｐｒｏ　ｘｉｓ　ｐｈｓ　ｓｅｒτｒｐτｈｒ　１ｌ ｉｓ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒＡｌａ　ｃｌｕ　ｑｒ　ｑｔ　ｘｓｎ　Ｍｇ１１ｍ　ｑｒ 　ｐｒｏ　ｘｓｎ　ｚｙｓ４ａＳ　４９０　４９５ 工ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ｐｒｏ　入Ｌａ　ＶＩＩＬ　Ｌｙｌｌ　Ｍｅ ｔ　Ｔ′ｙｒ　Ｌ７ｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ｘｓｇ　Ｌａｕ　Tｉｒ ｒｈｒ　Ｖａｌｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠τｈｒ　ａｌ ｙ　ｃｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　ｖａｌ　Ｌｙｓ　ｍｇｃｌｙ　ｓｅｒ　ｘｓｎ　 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＩｌａｃｉＭ　ＬＩＰ　ＩｌａＬＹＩＩ　ｘｌａ　ｒｈｒ　ｖ ａｔ　ｘｓｎ　ｓｓｒ　ｐｒ。 坪ｓａｒ　ａｌｎ　ＬＹＷ　Ｔｙｒ　ｐｇ　Ｖｏｌ　ｋＫｑ　ＶｏＩ　ＡＪ−９ ＮＫｒ　ｘｌａ　ｒｈｒ　ｓｉｒ　ｖａｌ　５ｅｒａｌｙ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　ｋ ｓｎ　＝　Ｐｈ＠ＩＩｓ　Ａａｎ　ｋｓｐ　渭！ｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ａｌｎ 　Ｔ、６　ｈｅｎＰｈｅ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 １１６　ＧＡＭ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＬＹＷ　Ａｓｐ　ｚｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒａ ｌｙ　ｓｅｒ　ｐｈｅ　ａｎｙ　Ｔｙｒ工ｉ＠ａｌｕ　Ｉｇ　Ｓｅｒ　ｒｈｒ　 Ｔｈｒ　ｘｉｓ　７１ｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏ　ｘｓｎＧＬｕ　日１ｅ　Ｐｒｏ　ｒ 、ｙｓ　工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ａ＋＋ｎ　ｍｉｓ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｘ：　Ａｓｎ　八ｓｌｎ@５ａｒ ｐｒｏ　Ｐｈ＠Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ｓｅｒ　ＩｌａＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｘ１ ７ＰｒＱ　ＶＪＩＩ　ｋＢｐ　ＶａｌＡｏｎ　’９ｇＡｓｐ　ａｌｕ　Ｌｙｓ　 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０二）ｋ？４の数；二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｆｌ）配列の橿Ｈ（ＭＯＬＥＣＬＩＬＥ　丁ＹＰＥ）　：　Ｇｅｎｏ＊ｉｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａ（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（１〜）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｌ）起Ｒ（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　５ＯＵＲＣＥ）　：（Ａ）生物（ＯＲＧＡＮ ＩＳＭ）　：バシラス・チューリンゲ（Ｂ）法名（ＳＴＲＡＩＮ）　：クマモト エンシス（Ｃ）個体・単離クローン名（ＩＮＤＩ〜ＩＤＬＩＡＬ　ｌ５ＯＬＡＴ Ｅ）（ｖｉｉ）直接の起ｉ（ＩＭＭεＤＩＡＴＥ　５ＯｔＪＲＣＥ）　：（Ａ） ライブラリ名：、１．Ｍ、フのラムダゲム（Ｌａ＋ｗｄａＨｅｍ）　（ＴＭ）− １１ライブラリＣＢ）クローン名：８６７ （ｘｌ）配列（ＳＥＱＬＩＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ＋３：入ＴＧＡＡＴＴτ入Ａ入Ｔ入ＡＴＴτＡＧＧ　ＴＧＧＡＴ八ＴＧ 入へＣ入Ｔ入ＧτＡＡＴＡ　ＧＡ入Ｃ入Ｔ丁入入ｋ　ＴＡＡＴＴＣＴＣ？ＣU０ ＣＣＡＧＣＴＧ？ＡＡ　ＡＡＡＴＧＴＡＴＡＡ　ＡＣＴＡＧＧＴＧＡで　ＡＣＡ ＴＣＴ入Ｃ入Ｇ　ＴＴＧＴＣ入ＡＡＧＧ　ＧＣＣＴＧＧＡＴsτ　１５６０ ＧＴＡＴＴＡＣＡＡＡ　ＡＣＧＴＡＡＡＡＣ’ｌ’　ＣＴＡＴＣＪｕＧＡＣＣＧ ＴＧＧＧｒＡＴＡ　ＴＣＴＴＡＣＧＴＧＴ　ｋＡｃＡＧｃＧモfｃ　３１１１０ ＋　（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：４：ニ閏ｔ　ルｔＮ　１ｊ（１）配タリの特 徴： （Ａ）長さ：１１３８アミノ酸 （Ｂ）積項二アミノ酸 （に）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄント／＋でロジー　；直鎖状 （ｉｉ）　Ｅｌｌｊ（１）ＦｍＸＢ＜ＭＯＬＥＣＩＪＬ、Ｅ　Ｔ”ｖＰＥ）：　 ９　ンハク質（１目）ハイボセティカル配列：ｙｅ。 （ｉｖ）　７ンチセンス：Ｎ。 （ν１）起Ｒ（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　５ＯｔＪＲＣＥ）　：（旬生物名：バシラス ・チューリンゲンシス（８）法名：クマモトエンシス ＜ｃ＞叫１本・単Ｍクローン名：　ＨＤ８（３７（ｖｉｉ）直接の起叶（１を団 ＥＤＩＡＴＥ　５ＯＬＩＲ（Ｃ）　：（＾）ライブラリ名：　Ｊ、Ｍ。フのラム ダゲム（Ｌａｓ＋Ｊａｚｅ＋ｗ）　（ＴＭン−Ｉｆライブラリ（８）クローン名 ：８６７ （＼ｉ）　０２　Ｊ’ｌ　（ＳＥ（ＩＬＩＥＮＣＥ　［１ＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ）　：　ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：４：ｇｅｔ　Ａｓｎ　Ｌｏｕ　Ａｌｎ　Ａｓｎ　 Ｌｏｕ　Ｇｌｙ　ＧＩＹ　Ｔ’ｆｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＢＲｒ　Ａａｎ　八ｒｑ 　丁ｈｒ　Ｌａ■ ｌ　５　１０　１５ ｈｓｎ　ｘｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａａｎ　Ｔｙｒ　ｐｒｏ　ＴＦｕ＝　ａｌ、 ｎ　ＬＹＩＩ　Ａ１１ｌ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ＋Ｐｒｏ　ｓｅｒ@Ｌｅｕ ２ａ　２５　コ０ ＬＹＩＩ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　ＡｌＩｎ　’ｒｙｒ　Ｇｉｎ　Ａ１１ｐ　Ｐｈｅ　 ｒｔｅｕ　ｓｅｒ　工Ｊ、ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｑ　Ｇ撃普@Ｇｉｎ コ５　４０　４５ ｉ’ｒｏ　１ｉｉＡｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＧｊｙＡｓｎ　Ｔｈ ｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　２ｇｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓ盾■ ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ、　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ、　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｐｒｏ　ｃｌｙ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　ｒ■B ６５　フＯ７５８０ 工１ｅ　Ｔｈｒ　ＡｌＩｎ　７ｈａ　ｇｌｒ　Ｌｅｕ　Ｉ、Ｙ９工１＠Ｔｈｘ　 ｃＰ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　ｐｒｏ　Ｍｉｓ　ｋｓｎＬｙｓ　Ａｇｎ　ｘｌ ｏＴｒｇ−Ａｆｌｐ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｍｔ　Ｔｈｒ　ａｌｕ　ｖａｌ　ｃｌｕ 　ｒｈｒ　Ｌ（！ｋｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌ■ Ｇｉｎ　ＬＹＩＩ　Ｉｔ（Ｉ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　搦Ａ１１ｌ　 ＬＹＩ！　Ａ１１ｌ　Ｌｅｕ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　ｒａｅｕ　fｌｕ ＧＩＹ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＡｆＩｎ　Ａｓｒｘ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　工１ｅ　Ｔｙ ｒ　ｃｌｎ　ｃｌｎ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＡＪｐ　Ｔ窒■ Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ↑ｓｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａ ｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　ＡｒｇＰｈｅ　Ａｒｇｒｌｅ 　ｒ、ｅｕ　”Ｗ　ｕａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｉ　Ｇｌｕ　’？”″：ＪＫ：　Ｍａｔ 　ｐｒｏ　ｓａｒ　Ｐｈｅ　ＡＬ’９ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＴＭｇ　Ｇｌｕ 　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｏｕ　Ｌｅｇ　Ｔｂｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　？ｉｎ 　ｘｌａ　ＡＩＪk ｘｓｎ　Ｌｅｕ　９ｙ、ｚｅｕ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｉｔｕ　Ａｒｇ　ＡｌＩＰ 　Ｓｅｒ　Ｔｌ１ｒ　Ｌｅｕ　７　ｃｌｙ　入ｌｉｐ　ＬＹr Ｔｒｐ　ａｌｇ　Ｐｈ＠Ｔｂｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｒｘ　ｘｓｎ　Ｘｉｓ　Ｇｌｕ　 Ｇ１．ｕ　Ａｓｎ　ＴＮｒ　Ａｓｎ　ｘｒｇ　ｄｉｎ　Ｌｙ■ ｌ−”ｆ、８　Ｂｉｇ　ｒｈｏ　ｓａｒ　ＧＬｕ　Ｔ　５ｔａＸ：　Ａｇｎ　Ｅ 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Ｃ１２Ｒ１：４１） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０７） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：４６５） （ＣＩ　２　Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０２） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０５） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） Ｉ （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｎ　１５１０ ９ Ｃ１２Ｒ１：０７） Ｉ （Ｃｌ２Ｎ　１５１００　Ａ Ｃ１２Ｒ１：０７）

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．鞘翅類昆虫の害虫を、Ｂ．ｔＨＤ５１１、Ｂ．ｔ．　ＨＤ８６７及びＢ．ｔ ．ＨＤ１０１１又はそれらの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、及びこれらの微生物か ら得ることが出来る毒素から選択される、バシルスチューリンゲンシス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物又は毒素の昆虫抑制有効量と 接触させることからなる、鞘翅類昆虫の害虫を抑制する方法。
2. ２．微生物がＢ．ｔ．ＨＤ５１１である請求項１に記載の方法。
3. ３．微生物がＢ．ｔ．ＨＤ８６７である請求項１に記載の方法。
4. ４．微生物がＢ．ｔ．ＨＤ１０１１である請求項１に記載の方法。
5. ５．該鞘翅類害虫がコロラトボチトビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　ｐｏｔａｔｏ 　ｂｅｅｔｌｅ）である請求項１に記載の方法。
6. ６．Ｂ．ｔ．ＨＤ５１１、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７及びＢ．ｔ．ＨＤ１０１１、それ らの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、及びこれらの微生物から得ることが出来る毒素 から選択される、バシルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物又は毒素を殺虫剤担体と組合せて含んでいる組成物。
7. ７．該担体が甲虫の食欲刺激剤又は誘引剤を含んでいる請求項６に記載の組成物 。
8. ８．Ｂ．ｔ．ＨＤ５１１、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７、及ひＢ．ｔ．ＨＤ１０１１及び これらの変異体からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物から得られるか、又は本質的 に、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．２又はＳＥＱＩＤＮＯ．４であるアミノ酸配 列を含んでいる、鞘翅類害虫に対し活性である毒素。
9. ９．木質的にＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を 含んでいる請求項８に記載の毒素。
10. １０．本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．４に示されるアミノ酸配列であるアミノ酸配列 を含んでいる請求項８に記載の毒素。
11. １１．Ｂ．ｔ．ＨＤ５１１、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７、及びＢ．ｔ．ＨＤ１０１１及 びこれらの変異体からなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物から得られるＤＮＡである が、又は本質的に、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．　２又はＳＥＱＩＤＮＯ．４ であるアミノ酸配列を含んでいる毒素をコートしているＤＮＡであって、鞘翅類 害虫に対し活性なバシルスチューリンゲンシス毒素をコードしているＤＮＡを含 んでいるヌクレオチド配列。
12. １２．該ＤＮＡが、本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列を有す るバシルスチューリンゲンシス毒素をコードしている請求項１１に記載のヌクレ オチド配列。
13. １３．該ＤＮＡが、本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．１に示される配列を有している請 求項１２に記載のヌクレオチド配列。
14. １４．該ＤＮＡが、本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．４に示されるアミノ酸配列を有し ているバシルスチューリンゲンシス毒素をコードしている請求項１１に記載のヌ クレオチド配列。
15. １５．該ＤＮＡが、本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．３に示される配列を有している請 求項１２に記載のヌクレオチド配列。
16. １６．Ｂ．ｔ．ＨＤ５１１、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７、及びＢ．ｔ．ＨＤ１０１１及 びこれらの変異体からなる詳から選択されるバシルスチューリンゲンシス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物から得られるＤＮＡか、又 は本質的に、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ．　２又はＳＥＱＩＤＮＯ．４である アミノ酸配列を含んでいる毒素をコードしているＤＮＡによりコードされる、鞘 翅類害虫に対し活性であるバシルスチューリンゲンシス毒素を発現するように形 質転換された、細菌又は植物宿主。
17. １７．シュードモナス、アゾトバクター，エルウィニア、セラチア、クレブシェ ラ、リゾビウム、バシラス、ストレプトマイセス、ロドシュードモナス、メチロ フィラス、アグロバクテリウム、アセトバクター、又はアルカリゲネスの種であ る請求項１６に記載の細菌宿主。
18. １８．該細菌が有色素性であり、葉面付着性である請求項１７に記載の細菌宿主 。
19. １９．該宿主が、本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されるアミノ酸配列であるア ミノ酸配列を有する毒素をコードするＤＮＡを含んでいるヌクレオチド配列で形 質転換されている請求項１６に記載の細菌又は植物宿主。
20. ２０．該宿主が、本質的にＳＥＱＩＤＮＯ．４に示されるアミノ酸配列であるア ミノ酸配列を有する毒素をコードするＤＮＡを含んでいるヌクレオチド配列で形 質転換されている請求項１６に記載の細菌又は植物宿主。
21. ２１．標的害虫の環境に適用された時に、長期化された殺虫活性を有している、 実質的に無傷の処理された細胞を含有している殺虫剤を含んでいる殺虫組成物で あって、該殺虫剤は、鞘翅類昆虫に対し毒素のポリペプチドであり、鞘翅類害虫 に対し活性のバシルスチューリンゲンシス毒素を発現することの出来る形質転換 された微生物の発現の結果として造られ、ここで該毒素は、Ｂ．ｔ．ＨＤ５１１ 、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７、及びＢ．ｔ．ＨＤ１０１１及びこれらの変異体からなる 詳から選択されるバシルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物から得られるか、又は本質的に、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤＮＯ．２又はＳＥＯＩＤＮＯ．４であるアミノ酸配列を含んでいる、毒素を コードしているヌクレオチド配列によってコードされるものである、殺虫組成物 。
22. ２２．該処理された細胞が環境中で殺虫活性を長期化させる為に化学的又は物理 的手段で処理される請求項２１に記載の殺虫組成物。
23. ２３．細胞内毒素を含有している処理された実質的に無優な単一細胞の微生物細 胞であって、該毒素は鞘翅類害虫に対し活性のポリペプチドをコードしているヌ クレオチド配列の発現の結果であり、ここで該ヌクレオチド配列はＢ．ｔ．ＨＤ ５１１、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７、及びＢ．ｔ．ＨＤ１０１１及びこれらの変異体か らなる群から選択されるバシルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）微生物から得られるか、又は本質的に、アミノ酸配列 ＳＥＱＩＤＮＯ．２又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４であるアミノ酸配列を含んでい る、毒素をコードしているヌクレオチド配列であり、ここで該細胞は、該細胞が 標的昆虫の環境に適用されたときに殺虫活性を長期化させる条件下で処理されて いる微生物細胞。
24. ２４．鞘翅類に対し活性のバシルスチューリンゲンシス毒素をコードするＤＮＡ を含んでいるヌクレオチド配列によって形質転換された植物に対し鞘翅類昆虫の 害虫を暴露することを含む、鞘翅類昆虫の害虫を抑制する方法であって、該ヌク レオチド配列が、Ｂ．ｔ．ＨＤ５１１、Ｂ．ｔ．ＨＤ８６７、及びＢ．ｔ．ＨＤ １０１１及びそれらの変異体からなる群から選択されるバシルスチューリンゲン シス単離体から得ることが出来るか、又は本質的にアミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ ．２又はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１であるアミノ酸配列を含む毒素をコードしてい る、上記方法。