JP2002500166A - ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓ）に対して活性な毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、非哺乳動物有害生物、特に植物害虫の防除に有用な材料および方法に関する。1つの特定の態様において、本発明は鱗翅目の防除に有用な新規バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）毒素を提供する。好ましい態様において、本毒素は、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（European Corn Borer）の防除のために用いられる。本発明はさらに、本発明の毒素をコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明のヌクレオチド配列は、本発明の殺虫性毒素を発現させることを目的として、植物などの宿主の形質転換を行うために用いることができる。本発明はさらに、害虫に対して有効な毒素をコードする遺伝子を同定するための新規ヌクレオチドプライマーに関する。本プライマーは、これらの毒素をコードする遺伝子の特徴である遺伝子断片を生成するためのPCR法において有用である。また、本プライマーは、毒素をコードする遺伝子を検出するためのプローブとしても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）(B.t.)
はグラム陽性の胞子形成性細菌である。多くのB.t.株は、毒素活性を示さない。
いくつかのB.t.株産物が、自己結晶化蛋白質封入体によって特徴づけられうる。
これらの「δ-エンドトキシン」は、非特異的宿主は荷を有するエンドトキシン とは異なっている。B.t.のこれらの封入体はしばしば顕微鏡下で特有の形態をと
る結晶として観察される。これらの蛋白質は害虫に対して非常に毒性であること
があり、それらの毒性活性には特異性があり得る。これまでにいくつかのB.t.毒
素遺伝子の単離、および配列の決定がなされ、組換えDNAを基にしたB.t.産物が 生産され実用化されている。それに加えて、遺伝子操作技術を用いて、B.t.毒素
を農業環境へ運び込む新しいアプローチが開発されつつあり、B.t.毒素遺伝子を
用いて遺伝的に改変し昆虫耐性を付与した植物への使用、およびB.t.毒素の輸送
担体として使用するための安定化した完全な微生物細胞に対する使用が含まれる
（Gaertner,F.H., L.Kim [1988] TIBTECH 6:S4-S7）。したがって、B.t.エンド トキシン単離遺伝子は、商業的に価値あるものになりつつある。

【０００２】 過去15年の間、B.t.殺虫剤の商業的使用は主として鱗翅目昆虫（イモムシ）に
属する害虫の狭い範囲に限られていた。鱗翅目害虫への商業的な殺虫剤としては
、長年にわたってB.チューリンギエンシス亜種クルスタキ（kurstaki）の胞子お
よび結晶の調製物が用いられてきた。例えば、B.チューリンギエンシス変種クル
スタキ（kurstaki）HD-1は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を有する、結
晶性-エンドトキシンを産生する。

【０００３】 しかしながら、近年研究者達はもっと広い害虫に対して特異性を持つB.t.殺虫
剤を発見した。例えば、B.t.の他の種、即ちイスラエレンシス（israelensis） およびモリソニ（morrisoni）(tenebrionis、B.t.M-7、san diegoとしても知ら れる)はそれぞれ、双翅目および鞘翅目に属する昆虫を制御するために商業的に 用いられている(Gaetner,F.H.[1989]「殺虫性蛋白質の細胞輸送システム：生お よび死微生物（Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Livin
g and Non-Living Microorganisms）」Controlled Delivery of Crop Protectio
n Agents, R.M.Wilkins編, Taylor and Fransis, New York and London, 1990,
pp.245-255)。さらにCouch,T.L.(1980)「バチルス・チューリンギエンシス変種 イスラエレンシスの蚊に対する病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus t
huringiensis var. israelensis）」Developments in Industrial Microbiology
22:61-76およびBeegle,C.C.(1978)「農業生態系における昆虫生産性細菌の使用
（Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）」Developments in Indu
strial Microbiology 20:97-104、Krieg A., A.M.Huger, G.A.Langenbruch, W.S
chunetter (1983) Z.ang.ent.96: 500-5083にはバチルス・チューリンギエンシ ス変種テネブリオニス（tenebrionis）が鞘翅目の２種の甲虫に対して有効であ ることを報告している。これらはコロラドポテトビートルのレプティノターサ・
デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）およびアゲラスティカ・アル ニ（Agelastica alni）である。

【０００４】 最近、B.t. の新しい亜種が同定され、活性のあるエンドトキシン蛋白質の遺 伝子が単離された(Hofte,H., H.R.Whiteley [1989] Microbiological Reviews 5
2(2):242-255)。HofteおよびWhiteleyはB.t.結晶蛋白質遺伝子を４つの主なクラ
スに分類した。このクラスはCryI(鱗翅目昆虫特異的)、CryII(鱗翅目昆虫および
双翅目昆虫特異的)、CryIII(鞘翅目昆虫特異的)、CryIV(双翅目昆虫特異的)であ
る。その他の害虫に対して特異的に毒性を持つ株の発見も報告されている(Feite
lson,J.S., J.Payne, L.Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275)。CryVは線虫 特異的な毒素遺伝子の一つのクラスを形成すると提唱されている。Lambertら（L
ambert,B., L.Buysse, C.Decock, S.Jansens, C.Piens, B.Saey, J/Seurinck, K
.van Andenhove, J.Van Rie, A.Van Vliet, M.Peferoen [1996] Appl.Environ.
Microbiol 62(1):80-86）およびShevelevら（[1993]FEBS Lett. 336:79-82）は 、鱗翅目に対して活性なCry9毒素の特徴を報告している。PCT公開公報第94/0577
1号および第94/24264号でもまた、鞘翅目害虫に対して活性のあるB.t.単離株が 報告されている。Gleaveら（[1991]JGM138:55-62）およびSmulevitchら（[1991]
FEBS Lett.293:25-26）にもまたB.t.毒素が記載されている。現在、他の多くの クラスのB.t.遺伝子が同定されている。

【０００５】 公表された文献の中で、B.t. の結晶蛋白質遺伝子をクローン化し、大腸菌で 発現させたものが記載されている(Schnepf, H.E., H.R.Whiteley [1981] Proc N
atl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897)。米国特許第4,448,885号および米国特許第
4,467,036号は共に大腸菌内でのB.t.の結晶蛋白質の発現について開示している 。米国特許第4,990,332号；第5,039,523号；第5,126,133号；第5,164,180号；お
よび第5,169,629号が、鱗翅目に対して活性をもつB.t.毒素を開示している。PCT
公開公報第96/05314号は、PS86W1、PS86V1、および鱗翅目害虫に対して活性をも
つ、その他のB.t単離菌株を開示している。国際公開公報第94/24264号および国 際公開公報第94/05771号として公開されたPCT出願は、鱗翅目害虫に対して活性 をもつB.t.単離菌株と毒素について説明している。ヤガ科の仲間に対して活性を
もつB.t.蛋白質が、ランバート（Lambert）ら、前記、によって説明されている 。米国特許第4,797,276号と第4,853,331号は、さまざまな環境において、鞘翅目
害虫を防除するために用いることができるB. チューリンギエンシス（B. thurin
giensis）の菌株テネブリオニス（tenebrionis）について開示している。米国特
許第4,918,006号により、B.t.毒素が双翅目に対して活性を持つことが開示され ている。米国特許第5,151,363号と米国特許第4,948,734号は、線虫に対する活性
をもつB.t.の、ある単離株を開示している。線虫に対して活性を開示している他
の米国特許としては、第5,093,120号；第5,236,843号；第5,262,399号；第5,270
,448号；第5,281,530号；第5,322,932号；第5,350,577号；第5,426,049号；およ
び第5,439,881号がある。広範な調査および物資投下の結果、新規B.t.単離株お よびB.t.単離株の新規の使用に関する特許が発行された。総説としては、ファイ
テルソン（Feitelson）ら、前記、を参照のこと。しかしながら、新規のB.t.単 離株の発見および既知のB.t.単離株の新規の使用は、依然として経験的で予測で
きない技術のままである。

【０００６】 原因となる毒素遺伝子の単離は、経験に基づく緩慢なプロセスに依る。カロッ
ツィー（Carozzi）ら（Carozzi, N.B., V.C. Kramer, G.W. Warren, S. Evola,
G. Koziel (1991) Appl. Env. Microbiol. 57 (11):3057〜3061）は、新規B.t. 単離株を同定するための方法を述べている。この報告では、鱗翅目活性型毒素遺
伝子における本発明の特異的プライマー、プローブ、毒素、および遺伝子の開示
または示唆は行われていない。米国特許第5,204,237号は、B.t.毒素遺伝子を単 離するための特異的プローブおよび普遍的プローブについて説明している。しか
し、この特許は、本発明のプローブとプライマーについては言及していない。

【０００７】 国際公開公報第94/21795号、国際公開公報第96/10083号、およびJ.J.エストル
ッチ（Estruch）ら、(1996) PNAS 93:5389〜5394は、バチルス属の微生物から得
られた毒素について説明している。これらの毒素は、栄養生殖の過程で産生され
ることが報告されており、このため栄養期殺虫性蛋白質（VIP）と名付けられた 。これらの毒素は、結晶を形成するδエンドトキシンとは別のものであることが
報告された。鱗翅目害虫に対するこれらの毒素の活性が報告されている。

【０００８】 タマナヤガ（black cutworm）（Agrotis ipsilon（Hufnagel）、鱗翅目：ヤガ
科）は、トウモロコシ、ワタ、アブラナ属農作物（Brassica、ブロッコリー、キ
ャベツ、白菜）および芝を含む、多くの農作物の重大な害虫である。二次性宿主
植物には、ビート根、トウガラシ属（コショウ属）、ヒヨコマメ、ソラマメ、レ
タス、ムラサキウマゴヤシ、タマネギ、ジャガイモ、ラディッシュ、セイヨウア
ブラナ（カノーラ）、イネ、ダイズ、イチゴ、テンサイ、タバコ、トマトおよび
森林樹が含まれる。北米において、アグロティス（Agrotis）属の害虫は、クロ ーバー、トウモロコシ（corn）、タバコ、アサ、タマネギ、イチゴ、クロイチゴ
、キイチゴ、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、キャベツ、カラスムギ
、エンドウマメ、ジャガイモ、サツマイモ、トマト、庭園用の花、牧草、ムラサ
キウマゴヤシ、トウモロコシ（maize）、アスパラガス、ブドウ、ほぼ全種類の 需葉作物（leaf）、雑草、ならびに他の多くの農作物および園芸植物を常食とす
る。アグロティニ（Agrotini）属のその他の幼虫、特にフェルティア（Feltia）
属（例えば、F. jaculifera（Guenee）、これはducens subgothicaと同じ）およ
びユーゾア（Euxoa）属（例えば、E. messoria（Harris）、E. scandens（Riley
）、E. auxiliaris Smith、E. detersa（Walker）、E. tessellata（Harris）、
E. ochrogaster（Guenee）に属するものも害虫である。宿主植物には、セイヨウ
アブラナを含む種々の農作物が含まれる。

【０００９】 ヤガ幼虫は北米以外でも害虫であり、ヒヨコマメ、コムギ、野菜類、テンサイ
、ムラサキウマゴヤシ、トウモロコシ、ジャガイモ、カブ、セイヨウアブラナ、
レタス、イチゴ、ローガンベリー、アマ、ワタ、ダイズ、タバコ、ビート根、ハ
クサイ、トマト、ナス、サトウキビ、牧草、キャベツ、ラッカセイ、カボチャ属
、カブラ、ヒマワリ、アブラナ属（Brassica）、タマネギ、セイヨウニラネギ、
セロリ、ゴマ、アスパラガス、ダイオウ、チコリ、温室農作物およびホウレンソ
ウに対して経済的にさらに重大な被害を及ぼす害虫である。タマナヤガ（A. ips
ilon）は、中央アメリカ、欧州、アジア、オーストラリア、アフリカ、インド、
台湾、メキシコ、エジプトおよびニュージーランドを含む北米以外でも害虫とし
て発生する。

【００１０】 ヤガ幼虫は数回の齢（instar）を幼生として過ごす。最も顕著な損害および経
済的損失を生じるのは、より後期の齢の幼生による実生の切断であるが、トウモ
ロコシなどの農作物では葉の摂食も一般に収穫量の減少をもたらす。幼虫は第四
齢に達すると植物および植物の各部、特に実生を切断するようになる。この摂食
行動の変化のため、早期の危険信号がほとんどないままに、経済的損害をもたら
す集団が予想外に大量に出現する場合もある。幼虫が夜行性であり、地中に穴を
掘ってもぐり込むこともその発見を困難にする。大型のヤガ幼虫は1日にいくつ もの実生を破壊することができ、侵入が高度であれば農作物の一群がすべて一掃
される場合もある。

【００１１】 周辺の雑草防除などのタマナヤガに対する栽培上の防除策は、高度の侵入を予
防する上で一助となりうるが、このような方法は常に実行可能であるとは限らず
、有効であるとも限らない。侵入の発生は極めて散発的であり、栽培前または栽
培時に殺虫剤を用いることはこれまで有効でなかった。農作物におけるヤガ幼虫
の防除に用いうる毒入り餌もいくつかある。ベントグラスなどの芝草の防御には
合成殺虫剤が用いられてきた。芝生の場合には合成殺虫剤の使用には特に懸念が
あるが、これは処理した地域（例えば、ゴルフのグリーン、運動場、公園および
他のレクリエーション地域、専門的造園、家庭の芝生）に一般大衆が密に接触す
るためである。天然物（例えば、線虫、アザジラクチン）の成績は一般に好まし
くない。現時点では、タマナヤガ幼虫の防除にバチルス・チューリンギエンシス
（Bacillus thuringiensis）の産物は広く用いられているわけではないが、これ
は極めて有効な毒素が得られていないためである。

【００１２】発明の簡単な概要 本発明は、非哺乳動物に対する害虫、特に植物に対する害虫の駆除に有用な材
料および方法に関する。一つの態様において、本発明は、鱗翅目の駆除に対して
有用な新規のB.t.毒素を提供する。特に好ましい態様において、本発明の毒素は
、タマナヤガ（black cutworm）の駆除に対して有用である。本発明はさらに、 本発明の鱗翅目活性型毒素をコードする塩基配列を提供する。そして本発明はさ
らに、殺虫性毒素をコードする遺伝子の同定および特徴決定に有用な塩基配列お
よび方法を提供する。さらに、本発明は殺虫活性を有する新規のバチルス・チュ
ーリンギエンシス単離株を提供する。

【００１３】 一つの態様において、本発明は、PCR技術におけるプライマーとして有用な、 ユニークな塩基配列に関する。このプライマーは、特異的な毒素遺伝子の同定、
および単離に用い得る特徴的な遺伝子断片を製造する。本発明の塩基配列は、こ
れまでに述べられたδ-エンドトキシンとは別の毒素をコードしている。

【００１４】 本発明の一つの態様において、微生物に高度の増殖をもたらすような条件の下
で、B.t.単離株を培養することができる。一本鎖のゲノム核酸を提供するように
微生物を処理した後、このDNAを本発明のプライマーに接触させ、PCR増幅を行う
ことができる。この方法によって毒素をコードする遺伝子の特徴的な断片を増幅
し、毒素をコードする遺伝子の存在を同定する。

【００１５】 本発明のさらなる局面は、開示された塩基配列を、鱗翅目に対して活性のある
B.t.毒素をコードする遺伝子を検出、同定、および特徴付けをするためのプロー
ブとして使用する。

【００１６】 本発明の新たな殺虫性B.t.単離株には、PS31G1、PS185U2、PS11B、PS218G2、P
S213E5、PS28C、PS86BB1、PS89J3、PS94R1、PS27J2、PS101DDおよびPS202Sが含 まれる。

【００１７】 本明細書で説明する通り、本発明による有用な毒素は、複数の毒素の一部ずつ
を組み合わせることによって作製されるキメラ毒素であってよい。

【００１８】 1つの好ましい態様において、本発明は、標的害虫により消費される組織中で 形質転換植物細胞が殺虫性毒素を発現するように、本発明のポリヌクレオチド配
列の少なくとも1つによる形質転換がなされた植物細胞に関する。植物のこのよ うな形質転換は、当業者に周知の技法を用いて実現可能であり、典型的には、植
物における毒素の発現が最適化されるような遺伝子の改変を含む。

【００１９】 あるいは、本発明のB.t.単離株、または本明細書にて述べた毒素を発現する組
換え微生物を用いて、害虫を防除することができる。これに関して、本発明は、
実質的に無処理の細胞を標的害虫のいる環境に使用したときにその殺虫活性が長
引くように、実質的に無処理のB.t.細胞および/または本発明の発現毒素を含む 組換え細胞を処理することを含む。処理した細胞は、殺虫性毒素を保護するコー
トとして作用する。この毒素は、標的昆虫に摂食されると活性化される。

【００２０】配列の簡単な説明 配列番号：1は、本発明による有用なフォワードプライマーである。 配列番号：2は、本発明による有用なリバースプライマーである。 配列番号：3は、本発明による有用なフォワードプライマーである。 配列番号：4は、本発明による有用なリバースプライマーである。 配列番号：5は、本発明による有用なフォワードプライマーである。 配列番号：6は、本発明による有用なリバースプライマーである。 配列番号：7は、11B1ARと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：8は、毒素11B1ARのアミノ酸配列（配列番号：7）をコードするヌク
レオチド配列である。 配列番号：9は、11B1BRと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：10は、毒素11B1BRのアミノ酸配列（配列番号：9）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：11は、1291Aと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：12は、毒素1291Aのアミノ酸配列（配列番号：11）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：13は、1292Aと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：14は、毒素1292Aのアミノ酸配列（配列番号：13）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：15は、1292Bと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：16は、毒素1292Bのアミノ酸配列（配列番号：15）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：17は、31GAと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：18は、毒素31GAのアミノ酸配列（配列番号：17）をコードするヌク
レオチド配列である。 配列番号：19は、31GBRと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：20は、毒素31GBRのアミノ酸配列（配列番号：19）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：21は、本発明の方法によって同定され、85N1Rと命名された毒素の アミノ酸配列である。 配列番号：22は、毒素85N1Rのアミノ酸配列（配列番号：21）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：23は、85N2と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：24は、毒素85N2のアミノ酸配列（配列番号：23）をコードするヌク
レオチド配列である。 配列番号：25は85N3と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：26は、毒素85N3のアミノ酸配列（配列番号：25）をコードするヌク
レオチド配列である。 配列番号：27は、86V1C1と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：28は、毒素86V1C1のアミノ酸配列（配列番号：27）をコードするヌ
クレオチド配列である。 配列番号：29は、86V1C2と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：30は、毒素86V1C2のアミノ酸配列（配列番号：29）をコードするヌ
クレオチド配列である。 配列番号：31は、86V1C3Rと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：32は、毒素86V1C3Rのアミノ酸配列（配列番号：31）をコードする ヌクレオチド配列である。 配列番号：33は、F525Aと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：34は、毒素F252Aのアミノ酸配列（配列番号：33）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：35は、F525Bと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：36は、毒素F525Bのアミノ酸配列（配列番号：35）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：37は、F525Cと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：38は、毒素F525Cのアミノ酸配列（配列番号：37）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：39は、F573Aと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：40は、毒素F573Aのアミノ酸配列（配列番号：39）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：41は、F573Bと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：42は、毒素F573Bのアミノ酸配列（配列番号：41）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：43は、F573Cと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：44は毒素F573Cのアミノ酸配列（配列番号：43）をコードするヌク レオチド配列である。 配列番号：45は、FBB1Aと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：46は、毒素FBB1Aのアミノ酸配列（配列番号：45）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：47は、FBB1BRと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：48は、毒素EBB1BRのアミノ酸配列（配列番号：47）をコードするヌ
クレオチド配列である。 配列番号：49は、FBB1Cと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：50は、毒素FBB1Cのアミノ酸配列（配列番号：49）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：51は、FBB1Dと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：52は、毒素FBB1Dのアミノ酸配列（配列番号：51）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：53は、J31ARと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：54は、毒素J31ARのアミノ酸配列（配列番号：53）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：55は、J32ARと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：56は、毒素J32ARのアミノ酸配列（配列番号：55）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：57は、W1FARと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：58は、毒素W1FARのアミノ酸配列（配列番号：57）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：59は、W1FBRと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：60は、毒素W1FBRのアミノ酸配列（配列番号：59）をコードするヌ クレオチド配列である。 配列番号：61は、W1FCと命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：62は、毒素W1FCのアミノ酸配列（配列番号：61）をコードするヌク
レオチド配列である。 配列番号：63は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：64は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：65は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：66は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：67は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：68は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：69は、本発明によるPCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用なオリゴヌクレオチドである。 配列番号：70は、86BB1(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：71は、毒素86BB 1(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配 列である。 配列番号：72は、86BB1(b)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：73は、毒素86BB1(b)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
である。 配列番号：74は、31G1(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：75は、毒素31G1(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 である。 配列番号：76は、129HDキメラ体（chimeric）と命名された毒素のアミノ酸配 列である。 配列番号：77は、毒素129HDキメラ体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列である。 配列番号：78は、11B(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：79は、毒素11B(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で
ある。 配列番号：80は、31G1(b)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：81は、毒素31G1(b)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 である。 配列番号：82は、86BB1(c)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：83は、毒素86BB1(c)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
である。 配列番号：84は、86V1(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：85は、毒素86V1(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 である。 配列番号：86は、86W1(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：87は、毒素86W1(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 である。 配列番号：88は、94R1(a)と命名された毒素の部分アミノ酸配列である。 配列番号：89は、毒素94R1(a)のアミノ酸配列をコードする部分ヌクレオチド 配列である。 配列番号：90は、185U2(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：91は、毒素185U2(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
である。 配列番号：92は、202S(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：93は、毒素202S(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 である。 配列番号：94は、213E5(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：95は、毒素213E5(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
である。 配列番号：96は、218G2(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：97は、毒素218G2(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
である。 配列番号：98は、29HD(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：99は、毒素29HD(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 である。 配列番号：100は、110HD(a)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：101は、毒素110HD(a)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配 列である。 配列番号：102は、129HD(b)と命名された毒素のアミノ酸配列である。 配列番号：103は、毒素129HD(b)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配 列である。 配列番号：104は、573HD(a)と命名された毒素の部分アミノ酸配列である。 配列番号：105は、毒素573HD(a)のアミノ酸配列をコードする部分ヌクレオチ ド配列である。

【００２１】発明の詳細な開示 本発明は、非哺乳動物に対する害虫を駆除するための材料と方法に関する。具
体的な態様において、本発明は、鱗翅目に対して活性をもつ、バチルス・チュー
リンギエンシス（Bacillus thuringiensis）の新規の単離株および毒素に関する
。特に好ましい態様において、本明細書に記載の毒素および方法は、タマナヤガ
（black cutworm）の駆除に有用でありうる。本発明はさらに、殺虫性毒素をコ ードする新規の遺伝子および有用な特性をもつ毒素をコードするB.t.遺伝子を同
定して特徴を調べる新規の方法に関する。本発明は、これらの毒素をコードする
ポリヌクレオチド配列だけでなく、毒素を発現する組換え宿主を作出するための
、これらのポリヌクレオチド配列の使用にも関する。

【００２２】 本発明の蛋白質は、以前にバチルス・チューリンギエンシスから単離された結
晶蛋白質または「Cry」蛋白質とは別のものである。

【００２３】 本発明の1つのさらなる面は、新規単離株、ならびにこれらの単離株から入手 可能な毒素および遺伝子に関する。本発明の新規B.t.単離株は、PS31G1、PS185U
2、PS11B、PS218G2、PS213E5、PS28C、PS86BB1、PS89J3、PS94R1、PS202S、PS10
1DDおよびPS27J2と命名されている。

【００２４】 本明細書で提供される新規の毒素およびポリヌクレオチド配列は、いくつかの
パラメーターに従って定義される。本明細書に記載される毒素の極めて重要な特
徴は、殺虫活性である。1つの特定の態様において、これらの毒素は鱗翅目害虫 に対する殺虫活性を示す。本発明の毒素および遺伝子を、さらにそれらのアミノ
酸およびヌクレオチド配列によって定義することもできる。このような分子の配
列を、例示される特定の配列との相同性の点で定義することもでき、例示される
特定のプローブおよびプライマーとハイブリダイズしうる点、またはそれらによ
って増幅されうる点で定義することもできる。また、本明細書で提供される毒素
を特定の抗体との免疫反応性に基づいて同定することも可能である。

【００２５】 B.t.結晶性蛋白質の一部ずつを組み合わせることによって有用なキメラ毒素を
作製するための方法は開発されている。各部分の組み合わせによって殺虫性をも
つキメラ蛋白質が生じる限り、組み合わせる各部分はそれ自体が殺虫性をもつ必
要はない。これは制限酵素を用いて行うことができ、これは例えば、欧州特許第
0 228 838号；Ge, A.Z.、N.L. Shivarova、D.H. Dean（1989）Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 86：4037〜4041；Ge, A.Z.、D. Rivers、R. Milne、D.H. Dean（199
1）J. Biol. Chem. 266：17954〜17958；Schnepf, H.E.、K. Tomczak、J. P. Or
tega、H.R. Whiteley（1990）J. Biol. Chem. 265：20923〜20930；Honee, G.、
D. Convents、J. Van Rie、S. Jansens、M. Peferoen、B. Visser（1991）Mol.
Microbiol. 5：2799〜2806に記載されている。または、細胞の組換え機構を用い
る組換えを用いて、同様の結果を得ることもできる。例えば、カラモリ（Caramo
ri, T.）、アルバーチニ（A.M. Albertini）、ガリッチ（A. Galizzi）（1991）
Gene 98：37〜44；ウィドナー（Widner, W.R.）、ホワイトリー（H.R. Whiteley
）（1990）J. Bacteriol. 172：2826〜2832；ボッシュ（Bosch, D.）、シッパー
（B. Schipper）、ファンデル・クリージ（H. van der Kliej）、デマード（R.A
. de Maagd）、スティケマ（W.J. Stickema）（1994）Biotechnology 12：915〜
918を参照されたい。このようなキメラDNAを作製しうる方法が、当技術分野では
ほかにも数多く知られている。本発明は、本出願において同定された新規配列を
利用するキメラ蛋白質も含むものとする。

【００２６】 本明細書で提供される教示により、当業者は、本明細書に記載される種々の毒
素およびポリヌクレオチド配列を容易に作製および使用しうると考えられる。

【００２７】 本発明によって有用となるB.t.単離株は、アメリカ合衆国、イリノイ州61604 、ペオリア、ノースユニバーシティーストリート1815、北部研究センター（Nort
hern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ill
inois 61604, USA）にある農事試験場特許培養株コレクション（NRRL）（Agricu
ltural Research Service Patent Culture Collection (NRRL)）の永久コレクシ
ョンに寄託されている。B.t.菌株の培養寄託番号は以下の通りである。

【００２８】 本特許出願の目的で寄託された培養株は、特許庁長官および商標登録により、
37CFR1.14および35U.S.C.122に基づいて権限ありと決定された者に対して、特許
出願が係属中の間にも、この培養株を入手できる条件の下に寄託されている。寄
託物は、本出願に相当する出願、またはその後継出願が提出されている国の外国
特許法によって必要な場合には利用することができる。しかし、寄託物の利用可
能性は、行政行為によって付与される特許権を放棄して、本発明を実施する許可
を与えるものではないことと理解されるべきである。

【００２９】 さらに、本培養菌株寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約（Budape
st Treaty for the Deposit of Microoganisms）の規定にしたがって保存され、
一般に公開される。すなわち、最後に寄託物の具備を必要とされた時から少なく
とも5年間、およびいかなる場合でも、寄託した日付より少なくとも30年間、ま たは培養株の開示を公布する特許が強制力を保持する期間は、それを生存させ、
かつ汚染されないよう、細心の注意をもって保存する。寄託者は、寄託状態によ
り寄託機関がサンプルを具備できなくなったときには、要求に応じて寄託物を交
換する義務を承認する。本培養株寄託物の一般的な利用可能性に対する制限はす
べて、それを開示する特許が認可されるとともに、取り消されることなく排除さ
れる。

【００３０】 以下に示すものは、本発明によるいくつかの有用な単離株の特徴を示した表で
ある。

【表１】 鱗翅目に対して有毒なB.t.株の記載

【００３１】 一つの態様において、本発明は、鱗翅目害虫に対して活性のある蛋白質毒素を
コードするバチルス・チューリンギエンシス（B.t.）遺伝子の単離および同定に
用いるためのヌクレオチドプライマーおよびプローブを含めた材料および方法に
関する。本明細書にて述べた塩基配列を用いて、新規の殺虫性B.t.単離株を同定
できる。本発明はさらに、本明細書にて開示した方法および材料を用いて同定さ
れた遺伝子、単離株、および毒素に関する。

【００３２】 遺伝子および毒素 本発明に係る有用な遺伝子および毒素には、全長配列だけ
でなく、本明細書に特に例示された毒素の殺虫活性特性を保持している、これら
の配列の断片、変種、変異体および融合蛋白質も含まれる。複数のB.t.毒素また
は遺伝子からの部分を結合することにより作製されたキメラの遺伝子および毒素
も、本発明の開示に従い用いることができる。本明細書において用いられるよう
に、遺伝子の「異型」または「変異」という用語は、同じ毒素をコードするヌク
レオチド配列、または同等の殺虫活性を有する毒素をコードするヌクレオチド配
列を意味する。本明細書において用いられるように、「等価的毒素」という用語
は、標的害虫に対して、説明されている毒素と同じか、本質的に同じ生物学的活
性をもつ毒素を意味する。

【００３３】 いくつかの方法を用いて、有効な毒素をコードする遺伝子を同定し得ることが
できることは、当業者には明らかであると思われる。本発明に係る有用な特定の
遺伝子は、上記の培養細胞寄託機関に寄託されている菌株から得てもよい。また
、これらの遺伝子、またはその一部もしくは変異体を、例えば遺伝子合成機を用
いて合成して作成することもできる。遺伝子の変異体は、点突然変異を作出する
標準的な技術を用いて、容易に構築することができる。また、標準的な手順にし
たがって、市販のエクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、これ
らの遺伝子の断片を作成することもできる。例えば、Bal31のような酵素や部位 特異的突然変異誘発を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正
しく切り出すことができる。また、さまざまな制限酵素を用いて、活性断片をコ
ードする遺伝子を得ることもできる。これらの毒素の活性断片を直接的に得るた
めに、プロテアーゼを用いてもよい。

【００３４】 等価的毒素、および/または、これらの等価的毒素をコードする遺伝子は、B.t
.単離株および/またはDNAライブラリーから、本明細書によって提供される指示 に従って得ることができる。本発明の殺虫毒素を得るために、多くの方法がある
。例えば、本明細書において開示され、請求されている殺虫毒素に対する抗体を
用いて、蛋白質の混合物の中から別の毒素を同定、分離することができる。特に
、最も定常的で、他のB.t.毒素から最も異なった毒素部位に対して抗体を作製す
ることができると思われる。そして、これらの抗体を用いて、免疫沈殿や酵素結
合免疫測定法(ELISA)、あるいは、ウエスタン・ブロッティングによって、特徴 的な活性をもつ等価的毒素を特異的に同定することができる。本明細書において
開示される毒素、あるいは、等価的毒素、あるいは、これらの毒素の断片に対す
る抗体は、当業における標準的な手法を用いて容易に調製することができる。そ
して、これらの毒素をコードする遺伝子を微生物から得ることができる。

【００３５】 例示された毒素の殺虫効果を保持している断片および等価物も、本発明の範囲
内にあると思われる。また、遺伝子コードの縮重のため、さまざまに異なったDN
A配列が、本明細書に開示されたアミノ酸配列をコードすることができる。同じ 毒素、または本質的に同じ毒素をコードする代替DNA配列を作成することは、当 業者の技術の範囲内に当然含まれる。これらの変異DNA配列は、本発明の範囲内 にある。本明細書において用いられるように「本質的に同じ」配列という語は、
アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入を有し、殺虫効果に実質的に影響しな
い配列を意味する。殺虫活性を保持する断片もまた、この定義に含まれる。

【００３６】 本発明の毒素および遺伝子を同定するための、さらに別の方法は、オリゴヌク
レオチドプローブを用いることによる。これらのプローブは、検出可能な塩基配
列である。プローブにより、本発明の毒素をコードする遺伝子を迅速に同定でき
る。本発明によりプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、DNA合 成機および標準的方法を用いて合成することができる。

【００３７】 本発明において特定の毒素が、本明細書において特に例示されてきた。これら
の毒素は、本発明の毒素を例示したものにすぎないので、本発明には、例示され
ている毒素の殺虫効果と同じ、または同様の効果をもつ変異体毒素または等価的
毒素(および等価的毒素をコードするヌクレオチド配列)が含まれることは明白で
あろう。等価的毒素は、例示されている毒素とアミノ酸相同性を有する。このア
ミノ酸同一性は、典型的には60％よりも高く、好ましくは75％よりも高く、より
好ましくは80％よりも高く、さらに好ましくは90％よりも高く、95％より高いこ
ともありうる。生物学的活性の原因となるか、または最終的に生物学的活性に関
係する三次元構造の決定に関与する重要な毒素領域では、アミノ酸の相同性が最
も高い。この点に関し、活性に対して重要ではない領域に起きた置換であるか、
分子の三次元構造に影響しないような保存的アミノ酸の置換である場合には、一
定のアミノ酸置換は認められ、予想されうる。例えば、アミノ酸は、次のように
分類できよう。すなわち、非極性、非荷電性、塩基性、および酸性。同じ分類の
別のアミノ酸で置換される保存的置換は、置換によって化合物の生物学的活性が
実質的に変化しない限り、本発明の範囲に含まれる。表２に、それぞれの分類に
属するアミノ酸の例を列挙する。

【表２】

【００３８】 場合によっては、非保存的な置換が行われることもある。重要な要素は、これ
らの置換によって、毒素の生物学的活性が有意に損なわれてはならないというこ
とである。

【００３９】 本発明の毒素は、また、上述したような毒素封入体の形状や局在位置によって
特徴づけることもできる。

【００４０】 本明細書において、「単離された」ポリヌクレオチド、および/または「精製 された」毒素とは、天然に存在する別の分子と結合していないときのこれらの分
子を意味する。したがって、「精製された」毒素とは、例えば、植物内で発現す
る本発明の毒素を含む。したがって、「単離精製された」とは、本明細書にて述
べた「人の手」が関与していることを示す。キメラ毒素および遺伝子も、「人の
手」が関与する。

【００４１】 組換え宿主 本発明の単離株に存在する毒素コード遺伝子を、広い範囲の微生
物宿主や植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子を発現させると、殺虫因
子が直接的または間接的に細胞内に産生され維持される。例えば、シュードモナ
スなどの適当な微生物宿主を用いて、該微生物を害虫のいる場所に散布し、そこ
で増殖させ摂取させることができる。その結果、害虫を制御できる。あるいは、
毒素遺伝子をもつ微生物を、毒素活性を持続させ、細胞を安定させる条件の下で
処理することができる。処理した細胞は、毒素活性を維持しているため、標的害
虫の周囲に散布することができる。

【００４２】 B.t.毒素遺伝子が、適切なベクターによって微生物宿主の中に導入されており
、該宿主が生きた状態で環境中に施用されるとき、ある特定の宿主微生物を用い
ることが必須である。微生物宿主は、1種以上の目的とする作物の「植物圏」（ 葉面、葉圏、根圏、および/または根面）を占有するものを選ぶ。これらの微生 物は、特定の環境（作物および他の昆虫の棲息圏）において、野生型の微生物と
有利に競争できるものを選び、ポリペプチド性殺虫物質を発現する遺伝子が安定
して保持および発現されるように備え、ならびに望ましくは、より一層、環境に
よる分解および不活性化から殺虫物質を保護するようにする。

【００４３】 多数の微生物が、様々な重要な作物の葉の平面（phylloplane）（平坦な葉の 表面）および／または根圏（植物根の周囲の土壌）に住んでいることが知られて
いる。これらの微生物には、細菌、藻類、および菌類が含まれる。特に興味深い
微生物は、例えば細菌では、シュードモナス（Pseudomomas）属、エルウィニア （Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キ サントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、リ ゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチ ロフィリウス（Methylophilius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属 、アセトバクター（Acetobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ア
ースロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイ コノストック（Leuconostoc）属、およびアルカリジェネス（Alcaligenes）属、
また菌類、特に酵母では、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ク リプトコッカス（Cryptococcus）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、 スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、およ びオウレオバシディウム（Aureobasidium）属である。特に興味深い植物圏の（p
hytosphere）細菌の種は、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas Syringae）
、シュードモナス・フローレセンス（Pseudomonas Fluorescens）、セラチア・ マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetoba
cter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroid
es）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウ
ム・メリオチ（Rhizobium melioti）、アルカリジェネス・エントロファス（Alc
aligenes entrophus）、およびアゾトバクター・ビンランディ（Azotobacter vi
nlandii）であり、植物圏の（phytosphere）酵母の種は、ロドトルラ・ルブラ（
Rhodotorula rubra）、R.グルチニス（R. glutinis）、R.マリナ（R. marina） 、R.アウランチアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Crypt
ococcus albidus）、C.ディフルエンス（C. diffluens）、C.ラウレンティ（C.
laurentii）、サッカロミセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、S.プレトリエ
ンシス（S. pretoriensis）、S.セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロミセ
ス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、S.オドラス（S. odorus）、クルイベ
ロミセス・ベロネ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシディウム・ ポルランス（Aureobasidium pollulans）である。特に重要なのは、色素性細菌 である。

【００４４】 遺伝子の維持と発現を安定させる条件の下で、毒素をコードするB.t.遺伝子を
、微生物の宿主の中に導入するために、さまざまな方法が利用できる。これらの
方法は、当業者によく知られており、例えば米国特許第5,135,867号に開示され ており、これは本明細書に参照として組み入れられる。

【００４５】 本発明の単離株、毒素および遺伝子の使用によるタマナヤガ幼虫を含む鱗翅目
害虫の防除は、当業者に知られた種々の方法によって行いうる。これらの方法に
は、例えば、害虫（またはその場所）に対するB.t.単離株の適用、害虫（または
その場所）に対する組換え微生物の適用、および本発明の殺虫性毒素をコードす
る遺伝子による植物の形質転換が含まれる。組換え微生物としては、例えば、B.
t.、大腸菌またはシュードモナスが可能である。形質転換は当業者により、標準
的な技法を用いて行うことができる。これらの形質転換に必要な材料は、本明細
書に開示されるか、または当業者にとって容易に入手可能である。

【００４６】 本発明の毒素と機能的に等価な合成遺伝子を用いて、宿主を形質転換すること
もできる。合成遺伝子を作出するための方法は、例えば米国特許第5,380,831号 に見られる。

【００４７】 細胞の処理 上述したように、毒素活性の持続期間を延ばし、細胞を安定化さ
せるために、バチルスまたはB.t.毒素を発現する組換え細胞を処理することがで
きる。生成される殺虫因子の微小カプセルは、細胞構造内にB.t.毒素を含む。細
胞構造は、安定化され、微小カプセルが標的害虫の周囲に散布されたとき毒素を
保護する。適した宿主細胞には原核細胞および真核細胞のいずれも含まれるが、
通常は哺乳動物などの高等生物に対する毒素を産生しないような細胞に限定され
る。しかし、有毒物質が不安定であるか、哺乳動物宿主に対する毒性がすべて回
避される程度に適用レベルが十分に低い場合には、高等生物に対して有毒な物質
を産生する生物体を用いることも可能と思われる。宿主として特に関心がもたれ
るのは、原核生物、および真菌などの下等な真核生物である。

【００４８】 細胞は通常は無傷（intact）であって処理される際には芽胞型ではなく実質的
に増殖型にあると考えられるが、場合によっては胞子を用いてもよい。

【００４９】 B.t.毒素遺伝子を含む微生物などの微生物細胞の処理は、その技法が毒素の特
性に有害な影響を及ぼさず、しかも細胞による毒素の保護能を低下させない限り
、化学的もしくは物理的手段によって行ってもよく、化学的および／または物理
的手段の組み合わせによって行ってもよい。化学試薬の例には、ハロゲン化剤、
特に原子番号17〜80番のハロゲンがある。より詳細には、ヨウ素を穏やかな条件
下で、望ましい結果が達成されるのに十分な時間にわたって用いることができる
。その他の適した技法には、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、塩化ゼフィ
ランおよび塩化セチルピリジニウムなどの抗感染薬、イソプロピルアルコールお
よびエタノールなどのアルコール、ルゴールヨウ素（Lugol iodine）、ブワン固
定液などの種々の組織固定液、種々の酸ならびにヘリー固定液（Humason、Gretc
hen L.、動物組織の技法（Animal Tissue Techniques）、W.H. Freeman and Com
pany、1967を参照のこと）、または細胞が宿主環境に対して投与された際に細胞
内で産生される毒素の活性を保持および延長させる物理的（熱）および化学的因
子の組み合わせによる処理が含まれる。物理的手段の例には、γ線照射およびX 線照射などの短波長照射、凍結、UV照射、凍結乾燥などがある。微生物細胞の処
理のための方法は米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されており
、これらは参照として本明細書に組み入れられる。

【００５０】 細胞は一般に、環境条件に対する抵抗性が高まるように構造的安定性が増強さ
れていると考えられる。殺虫薬が前駆形態（proform）にある場合には、細胞処 理の方法は、標的病原体による殺虫薬の前駆形態から成熟形態へのプロセシング
を阻害しないように選択される必要がある。例えば、ホルムアルデヒドは蛋白質
を架橋し、ポリペプチド殺虫薬の前駆形態のプロセシングを阻害しうると考えら
れる。処理の方法は、毒素の生物学的利用能または生理活性の実質的に一部を保
持させる必要がある。

【００５１】 産生のための宿主細胞の選択において特に関心がもたれる特性には、宿主にB.
t.遺伝子を導入する容易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主内での殺虫薬
の安定性、および補助的な遺伝的能力の存在が含まれる。殺虫性マイクロカプセ
ルとしての使用に関して関心がもたれる特徴には、厚い細胞壁、色素沈着および
細胞内パッケージングまたは封入体形成などの殺虫薬に対する保護特性、水性環
境における生存性、哺乳動物毒性がないこと、害虫が摂取するような誘引性、毒
素に障害を及ぼさずに殺菌および固定を行える容易さなどが含まれる。考慮すべ
きその他の事項には、製剤化および取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性など
が含まれる。

【００５２】 細胞の増殖 B.t.殺虫性遺伝子を含む細胞宿主は、実質的にすべてまたはすべ
ての細胞がB.t.遺伝子を保持するような選択的培地であるような、そのDNA構築 物が選択的な利益を提供する任意の好都合な栄養培地中で増殖させることができ
る。続いてこれらの細胞を従来の方式に従って回収してもよい。または、回収の
前に細胞を処理することも可能である。

【００５３】 本発明のB.t.細胞は、標準的な技術である培地および発酵法を用いて培養する
ことができる。発酵サイクルが完了した時点で、当技術分野で周知の手段により
、まずB.t.芽胞および結晶を発酵培地から分離することによって細菌を回収する
ことができる。回収したB.t.芽胞および結晶は、界面活性剤、分散剤、不活性担
体ならびに特定の標的に対する取り扱いおよび適用を容易にするためのその他の
成分を添加することにより、水和剤、原液、顆粒またはその他の製剤として製剤
化することができる。これらの製剤および適用手順は当技術分野で周知である。

【００５４】 害虫を駆除するための方法および処方 本発明の単離株、毒素、および遺伝子
を用いた鱗翅目の駆除は、当業者に既知のさまざまな方法によって行うことがで
きる。これらの方法には、例えばB.t.単離株を害虫（またはそれらの居住場所）
に施用すること、組換え微生物を害虫（またはそれらの居住場所）に施用するこ
と、および本発明の殺虫性毒素をコードする遺伝子によって植物を形質転換する
ことが含まれる。形質転換微生物は、例えば、B.t.、大腸菌、またはシュードモ
ナスであってもよい。形質転換は、標準的な技術を用いて当業者が行うことがで
きる。これらの形質転換に必要な材料は、本明細書において開示されており、あ
るいは当業者に容易に入手することができる。

【００５５】 誘引剤およびB.t.単離株の胞子および結晶を含むよう処方された飼料用顆粒剤
、または本明細書で開示されてB.t.単離株から得られる遺伝子を含む組換え微生
物は、土壌に施用することができる。処方製剤は、種子コートとして、または作
物の周期の後期段階での根処理剤もしくは植物体全体の処理剤として施用するこ
ともできる。B.t.細胞の植物処理剤および土壌処理剤は、無機性鉱物（フィロケ
イ酸、炭酸、硫酸、リン酸など）、または植物性材料（粉末のトウモロコシ穂軸
、籾殻、クルミの殻など）のようなさまざまな不活性物質と混合することによっ
て、可溶性の粉末、顆粒、または粉粒として用いることができる。この処方剤は
、展着補助剤、安定化剤、別の殺虫添加剤、または界面活性剤を含み得る。液体
処方剤は、水様または非水様で、泡剤、ゲル剤、懸濁剤、乳化濃縮剤などとして
用いることができる。成分には、流動化剤、界面活性剤、乳化剤、拡散剤、また
はポリマーを含み得る。

【００５６】 当業者には理解されるであろうが、殺虫剤の濃度は各処方剤の性質によって非
常に多様であり、特に濃縮液であるか、直接用いられるかによって異なる。殺虫
剤は、重量にして少なくとも1％は含まれ、100％含まれることもある。乾燥処方
剤では殺虫剤の重量の約1〜95％である一方、液体処方剤では一般的に、液相中 の固体重量にして約1〜60％である。処方剤では、一般的に約10²〜約10⁴細胞/ m
gを有する。これらの処方剤は、1ヘクタール当り、約50 mg（液体処方剤または 乾燥処方剤）から1 kg以上が投与される。

【００５７】 処方剤は、スプレーや空中散布、振りかけることなどにより、害虫のいる環境
、例えば土壌および葉に投与することができる。

【００５８】 変異株 本発明の単離株の変異株は、当技術分野で周知の手順によって作製す
ることができる。例えば、エチルメタンスルホン酸（EMS）による単離株の変異 誘発により、無芽胞変異株を得ることができる。当技術分野で周知の手順により
、紫外光およびニトロソグアニジンを用いて変異株を作製することも可能である
。

【００５９】 無芽胞変異株の比較的わずかな割合は無傷のままであり、長期間の発酵によっ
ても溶解されないと考えられ、これらの菌株を溶解陰性株(-)と命名する。溶解 陰性株は、振盪フラスコ培地中で無芽胞変異体のスクリーニングを行い、発酵終
了時に無傷のままであって毒素結晶を含む変異株を選択することによって同定し
うる。溶解陰性変異株は、保護された被包性の毒素蛋白質を得るための細胞処理
過程に適する。

【００６０】 前記の無芽胞変異株のファージ耐性変異株を調製するためには、ファージ可溶
化物のアリコートを栄養寒天培地に塗布し、乾燥させる。続いて、乾燥させた可
溶化物の上にファージ感受性細菌株のアリコートを直接播き、乾燥させる。プレ
ートを30℃でインキュベートする。プレートを2日間インキュベートすると、そ の時点で寒天培地上に多数のコロニーが増殖しているのが認められるはずである
。これらのコロニーの一部を摘出し、栄養寒天培地への継代培養を行う。ファー
ジ可溶化物との交差画線培養により、これらの見かけ上の耐性培養物を耐性に関
して検討する。ファージ可溶化物の画線をプレート上に描き、乾燥させる。続い
て、耐性培養物と推定されるものの画線を、このファージ画線と交差するように
描く。30℃で一晩インキュベートした後も、耐性菌培養物はファージ画線と交差
するいかなる位置でも溶菌を示さない。さらに、耐性培養物を栄養寒天培地に播
くことによって、ファージに対する耐性を再確認する。陽性対照として用いるた
めに感受性株も同じ様式で播く。乾燥させた後、プレートの中央部にファージ可
溶化物を一滴滴下し、乾燥させる。30℃で24時間インキュベートした後に、耐性
培養物はファージ可溶化物を滴下した領域で全く溶菌を示さなかった。

【００６１】 ポリヌクレオチドプローブ DNAが、塩基相補性と呼ばれる基本的性質をもつ ことはよく知られている。天然には、DNAは通常逆向きの平行鎖が対合した形で 存在し、各鎖の塩基が一方の鎖から反対側の鎖に向かって突き出している。一方
の鎖上のアデニン塩基（A）は、常に反対鎖上のチミン塩基（T）と向かい合って
おり、またグアニン塩基（G）は、シトシン塩基（C）と向かい合っている。これ
らの塩基は、このように特異的に水素結合できることによって並置される。各別
の結合は比較的弱いが、隣り合う水素結合した多くの塩基の総じた効果は、塩基
が重なり合う効果とともに、二本の相補鎖を安定して結合させる。これらの結合
は、高いpHまたは高温などの処理によって破壊されるために、これらの処理は、
二本鎖の解離、または「変性」をもたらす。そしてDNAは、塩基の水素結合が熱 力学的に適した条件に置かれると、DNA鎖は、アニールまたは「ハイブリダイズ 」して、本来の二本鎖DNAを再形成する。適切な条件下で行えば、このハイブリ ダイゼーションは高度に特異的である。すなわち、非常に高度な塩基相補性をも
つ鎖のみが、安定した二本鎖構造を形成し得る。ハイブリダイゼーションの特異
性と反応条件との関係は、よく知られている。したがって、ハイブリダイゼーシ
ョンを用いて、二片のDNAが塩基配列において相補的であるか否かを調べること ができる。このハイブリダイゼーション機構により、目的とするDNA鎖の検出お よび特徴づけを容易に行うための、本発明のプローブの使用が促される。

【００６２】 プローブは、RNAもしくはDNAである。このプローブは、通常は少なくとも約10
塩基であり、より一般的には少なくとも約18塩基であり、約50塩基以上でもよく
、合成的に作製される場合、通常は約200塩基以下である。しかしながら、これ よりも長いプローブを容易に用いることができ、そのようなプローブは例えば数
キロ塩基長でもよい。プローブの配列は、少なくとも目的の毒素をコードする遺
伝子に、実質的に相補的であるように設計する。このプローブは、ハイブリダイ
ズする配列に対して完全に相補的である必要はない。プローブは、当業者に周知
の技術を用いて標識することができる。

【００６３】 本発明をプローブとして用いる方法の一つでは、まずB.t.単離株の遺伝子バン
クのサザンブロット解析によって、開示されている塩基配列に相同的なDNAセグ メントをすべて同定する必要がある。したがって、生物学的な解析による助けを
受けずに、多くの新規B.t.単離株および、あるB.ｔ.単離株によって発現される 各エンドトキシン遺伝子産物の考えられる活性を予め知ることが可能である。こ
のようなプローブ解析により、さまざまなB.t.の亜種に含まれる、商業的価値を
もつ可能性のある殺虫性エンドトキシン遺伝子を迅速に同定することができる。

【００６４】 本発明に係る有用なハイブリダイゼーション法の一つは、典型的にはまず初め
に、目的のDNAサンプルを単離して、化学的に精製する。溶菌した微生物、また は微生物から単離した全分画核酸のいずれかを用いることができる。細胞のDNA （および/またはRNA）を解離させる既知の技術を用いて、細胞を処理する。DNA サンプルは、適切な制限酵素によって断片に切断する。この断片は通常、アガロ
ースまたはアクリルアミドのゲル電気泳動によって、大きさにより分離する。目
的とする断片を、固定化用膜に移す。関心対象の断片は、断片の幾何学的配置が
保持されるような様式で固定用膜に移行させることができる。続いて膜を乾燥さ
せ、プレハイブリダイゼーションを行うことにより、後にハイブリダイゼーショ
ン溶液中に浸漬することを目的としてそれを平衡化することが可能である。核酸
が固体支持物に固定される様式はさまざまでありうる。後に処理を行うためのこ
のDNAの固定には、この技法を検査施設とは離れた実地調査に用いうるという大 きな意義がある。

【００６５】 本発明には、特別のハイブリダイゼーション技術が必須というわけではない。
ハイブリダイゼーション技術は、改良されて、容易に応用できるようになる。

【００６６】 当技術分野において周知のとおり、プローブ分子および核酸サンプルが、両分
子間で強い非共有結合を形成してハイブリダイズすれば、このプローブおよびサ
ンプルは、本質的に同一であると合理的に推定することができる。プローブの標
識が検出可能なため、ハイブリダイゼーションが起きたか否かを既知の方法によ
り判定できる。

【００６７】 プローブとして用いられる本発明のヌクレオチドセグメントは、標準的な手順
を用いてDNA合成装置を用いることによって合成しうる。ヌクレオチドセグメン トをプローブとして用いる場合には、放射性および非放射性標識を含む当技術分
野で知られた任意の適した標識により、特定のプローブを標識する。典型的な放
射性標識には^３２P、^３５Sなどが含まれる。放射性同位元素により標識されたプ
ローブは、DNアーゼおよびDNAポリメラーゼを用いる通常のニックトランスレー ション反応により、DNA試料に対して相補的なヌクレオチド配列から作製するこ とができる。続いてプローブおよび試料をハイブリダイゼーション緩衝溶液中で
混ぜ合わせ、アニーリングが起こるまで適切な温度に保つことが可能である。そ
の後で、膜を洗浄して異物を除き、残った試料および結合したプローブ分子を、
典型的にはオートラジオグラフィーおよび／または液体シンチレーション計数に
より検出および定量化する。合成プローブの場合には、プローブとして用いる目
的でDNAを末端標識するためにポリヌクレオチドキナーゼまたはターミナルトラ ンスフェラーゼなどの酵素を用いることが最も望ましいと思われる。

【００６８】 非放射性標識には、例えば、ビオチンもしくはチロキシンなどのリガンドのほ
か、加水分解酵素もしくはペルオキシダーゼなどの酵素、またはルシフェリンな
どの化学発光物質、またはフルオロセインおよびその誘導体などの蛍光性化合物
が含まれる。国際公開公報第93／16094号に記載されたように、蛍光性を内在す るようなプローブを作製してもよい。また、分離を容易にするために、例えば、
一方の端に上記の同位体標識を用い、他方の端にビオチン標識を用いるというよ
うに、プローブの両端を異なる種類の標識で標識してもよい。

【００６９】 ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、
フィルターと適度に結合しうる標識プローブの量、およびハイブリダイゼーショ
ンのストリンジェンシーに応じて大きく異なると考えられる。一般には、プロー
ブの固定されたDNAとの結合速度を高めるために、実質的な過剰量のプローブが 用いられる。

【００７０】 さまざまな程度のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることが
できる。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。ス
トリンジェンシーは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間
などによって調節することができる。好ましくは、例えばケラー（Keller）、G.
H., M.M. マナク（Manak）（1987）DNAプローブ（DNA Probes）、ストックトン プレス（Stockton Press）、ニューヨーク、NY., pp. 169〜170において説明さ れているような当技術分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条
件の下でハイブリダイゼーションを行う。

【００７１】 本明細書で用いられる場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな
」条件とは、本出願人によって用いられた条件と同一、またはほぼ同一のハイブ
リダイゼーションの特異性の程度を達成する条件を意味する。具体的には、標準
的方法（Maniatis, T.、E.F. Fritsch、J. Sambrook［1982］分子クローニング ．実験室マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual）、Cold Sprin
g Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY）により、サザンブロットにて 固定したDNAを、³²Pで標識した遺伝子特異的プローブにてハイブリダイズさせた
。一般的に、例示した毒素遺伝子と相同性をもつ標的配列の検出を可能にするス
トリンジェントな条件の下で、ハイブリダイゼーション、続いて洗浄を行った。
二本鎖DNA遺伝子プローブについては、6×SSPE、5×デンハルト溶液、0.1% SDS 、0.1 mg/ml変性DNA中で、DNAハイブリッドの融解温度（Tm）よりも20〜25℃低 い温度で、一晩ハイブリダイゼーションを行った。融解温度は、次の公式で示さ
れる（Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas,およびF.C. K
afatos [1983] 酵素学の方法（Methods of Enzymology）、R. Wu, L. Grossman 、およびK. Moldave [編] アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨー
ク、100:266〜285）。 Tm = 81.5℃ + 16.6 Log[Na+] + 0.41(%G+C) - 0.61(%ホルムアミド) - 600/二 本鎖の塩基対の長さ。

【００７２】 洗浄は、典型的には次のようにして行われる： （1）1×SSPE、0.1% SDS中、室温で15分間を2回（低ストリンジェントな洗浄 ）。 （2）0.2×SSPE、0.1% SDS中、Tm-20℃で15分間を1回（中ストリンジェントな
洗浄）。

【００７３】 オリゴヌクレオチドプローブについては、6×SSPE、5×デンハルト溶液、0.1% SDS、0.1 mg/mlの変性DNAの中で、ハイブリッドの融解温度（Tm）よりも10〜20
℃低い温度で一晩ハイブリダイゼーションを行った。オリゴヌクレオチドプロー
ブのTmは、次の公式によって決定される： Tm (℃)= 2(T/A塩基対の数) + 4(G/C塩基対の数) （Suggs, S.V., T. Miyake, E
.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura、およびR.B. Wallace [1981] ICN-U
CLAシンポジウム・精製遺伝子を用いた発生生物学（ICN-UCLA Symp. Dev. Biol.
Using Purified Genes）、D.D. Brown[編]、 アカデミックプレス（Academic P
ress）、ニューヨーク、23:683〜693）。

【００７４】 洗浄は、典型的には次のようにして行われる： （1）1×SSPE、0.1% SDS中、室温で15分間を2回（低ストリンジェントな洗浄 ）。 （2）0.2×SSPE、0.1% SDS中、Tmよりも10〜20℃低い温度で15分間を1回（中 ストリンジェントな洗浄）。

【００７５】 二本鎖の形成および安定性は、ハイブリッド二本鎖の間の実質的な相補性に依
存し、前記のように、ある程度のミスマッチは許容されうる。したがって、本発
明のヌクレオチド配列には、突然変異（1箇所および複数）、欠失、記載の配列 の挿入、およびこれらを組み合わせたもので、該突然変異、挿入、および欠失に
よっても、目的とする標的ポリヌクレオチドと安定したハイブリッドの形成が可
能なものが含まれる。多くの方法により、突然変異、挿入、および欠失を、所定
のポリヌクレオチド配列の中に作出することができ、これらの方法は、通常の技
術をもつ当業者にも知られている。別の方法も、将来的には知られるようになる
と思われる。

【００７６】 既知の方法には、以下のものが非制限的に含まれる： （1）化学的または他の方法による、既知の配列の変異体、挿入体または欠失体 である人工配列の合成、 （2）ハイブリダイゼーションによって新規配列またはプローブ配列の変異体、 挿入体または欠失体を得るためのプローブとしての本発明のヌクレオチド配列の
使用、および （3）インビトロまたはインビボでの被験配列に対する変異、挿入または欠失。

【００７７】 任意のプローブから作製された変異性、挿入性、欠失性変形物は、本来のプロ
ーブよりも幾分効率的であると思われることに留意することは重要である。効率
にこのような差はあるものの、これらの変形物は本発明の範囲に含まれる。

【００７８】 このように、開示した塩基配列の突然変異配列、挿入変異配列、欠失変異配列
は、当業者に周知の方法によって、容易に調製することができる。これらの変異
配列は、変異配列が本来の配列と実質的な配列相同性をもつ限り、例示されてい
るプライマー配列と同じように用いることができる。本明細書にて用いられる場
合、実質的な配列相同性とは、変異が本来のプローブと同じ能力で機能すること
が十分に可能な相同性ということを意味する。好ましくは、この相同性は50％よ
りも高く、より好ましくは、この相同性は75％よりも高く、また最も好ましくは
、この相同性は90％よりも高い。変異配列が、意図した能力で機能するために必
要とされる相同性の程度は、配列の使用目的に依存する。配列の機能が向上する
よう、または方法論的な利点を提供するように設計された突然変異、挿入変異、
および欠失変異を作出することは、当技術分野の通常の技術を有する当業者の技
術範囲の中に十分含まれる。

【００７９】 PCR技術 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、繰り返し酵素的に開始される核酸
配列の合成である。この手順はよく知られており、当業者によって一般的に用い
られている（Mullis、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号 ；Saiki, Randall k., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn
T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985] 「β-グロビンのゲノム 配列の酵素的増幅および鎌状血球貧血の診断のための制限酵素部位解析（Enzyma
tic Amplification of β-Globin Genomic Sequence and Restriction Site Ana
lysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia）」 Science 230:1350-1354を参
照のこと）。PCRは、標的配列の反対鎖にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレ
オチドプライマーにはさまれる、目的のDNA断片の酵素的な増幅に基づいている 。プライマーは、お互いに向かった3'末端を持つように方向が決められている。
鋳型の熱変性、それらの相補配列へのプライマーのアニーリング、およびDNAポ リメラーゼによる、アニールしたプライマーの伸長というサイクルを繰り返すこ
とによって、PCRプライマーの5'末端によって区切られたセグメントが増幅され る。各プライマーの伸長産物が、もう一方のプライマーの鋳型として働くので、
各サイクルにおいて実質的に、その前のサイクルで産生されたDNA断片の量の倍 になる。この結果、特異的な標的断片が、数時間の内に数百万倍まで、指数関数
的に蓄積する。好熱細菌サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から 単離されたTaqポリメラーゼなどの熱安定性DNAポリメラーゼを用いることにより
、増殖処理を完全に自動化することができる。

【００８０】 本発明のDNA配列は、PCR増幅用のプライマーとして用いることができる。PCR 増幅を行うとき、プライマーと鋳型との間における、ある程度のミスマッチは許
容することができる。したがって、例示したプライマーの突然変異、欠失、およ
び挿入（特に、5'末端へのヌクレオチドの付加）は、本発明の範囲内に含まれる
。通常の技術をもつ当業者に公知の方法によって、所定のプライマーに突然変異
、欠失、および挿入を作出することができる。任意のプローブから作製された変
異性、挿入性、欠失性変形物は、本来のプローブよりも幾分効率的であると思わ
れることに留意することは重要である。効率にこのような差はあるものの、これ
らの変形物は本発明の範囲に含まれる。

【００８１】 以下は、本発明を実施するための処理手順を示した実施例である。これらの実
施例は、制約的なものと考えるべきではない。別途記載がないかぎり、百分率は
すべて重量により、溶媒の混合比率はすべて容量による。

【００８２】実施例1 本発明に係る有用なB.t.単離株の培養 B.t.単離株、またはそれらの変異株の二次培養を用いて、次のペプトン、グル
コース、塩類培地に接種することができる： バクトペプトン 7.5 g/l グルコース 1.0 g/l KH_２PO_４ 3.4 g/l K_２HPO_４ 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl_２溶液 5.0 ml/l pH 7.2 塩溶液(100ml) MgSO_４・7H_２O 2.46 g MnSO_４・H_２O 0.04 g ZnSO_４・7H_２O 0.28 g FeSO_４・7H_２O 0.40 g CaCl_２溶液(100ml) CaCl_２・2H_２O 3.66 g

【００８３】 塩溶液およびCaCl_２溶液は濾過滅菌し、接種する際にオートクレーブし調製し
た培地に加える。フラスコは30℃、200 rpmの回転振とう機で64時間培養する。

【００８４】 上記の手順は当技術分野において周知の手順により、大きな発酵槽へ容易に拡
大することができる。

【００８５】 上記発酵槽で得られたB.t.胞子および／または結晶は、当技術分野において周
知の手順により単離することができる。一つのよく用いられる手順は、回収した
発酵槽の培地を遠心分離などの分離技術に供するものである。

【００８６】 または、B.t.単離株、またはそれらの変異株の二次培養を、TB培地として知ら
れている、以下の培地に接種することができる： トリプトン 12 g/l 酵母抽出物 24 g/l グリセリン 4 g/l KH₂PO₄ 2.1 g/l K₂HPO₄ 14.7 g/l pH 7.4

【００８７】 リン酸カリウムは、オートクレーブした培地を冷ました後に加えた。フラスコ
は、ロータリーシェーカー上で、250rpmで24〜36時間、30℃にてインキュベート
した。

【００８８】 上記の処理は、当技術分野において周知の手順によって容易に、大きな発酵容
器へとスケールアップすることができる。

【００８９】 上記の発酵によって得られたB.t.を、当技術分野において周知の処理手順によ
って単離することができる。頻繁に用いられる処理手順は、回収した発酵培地に
、分離技術、例えば遠心分離を施すことである。特異的な態様において、本発明
に係る有用なB.t.蛋白質を上清から得ることができる。活性のある蛋白質を含む
培養上清を後述するように、バイオアッセイ法に用いることができる。

【００９０】実施例2 鱗翅目に対して有効な新規バチルス・チューリンギエンシス毒素をコ ードする遺伝子の同定 B.t.毒素遺伝子の3'末端付近の多型性DNA断片のPCR増幅による新規毒素遺伝子
の同定および分類のために有用な2組のプライマー対を設計した。これらのオリ ゴヌクレオチドプライマーにより、増幅されたDNAのサイズの差に基づいて、Cry
7、Cry8またはCry9サブファミリーに属する毒素をコードする遺伝子を、鱗翅目 に対して有効なより一般的なCryIサブファミリーの毒素に関する遺伝子から区別
することが可能になる。これらのプライマーの配列は以下の通りである： フォワード1 5' CGTGGCTATATCCTTCGTGTYAC 3'（配列番号：1） リバース1 5' ACRATRAATGTTCCTTCYGTTTC 3'（配列番号：2） フォワード2 5' GGATATGTMTTACGTGTAACWGC 3'（配列番号：3） リバース2 5' CTACACTTTCTATRTTGAATRYACCTTC 3'（配列番号：4）

【００９１】 本発明の対1（配列番号：1および2）を用いる標準的なPCR増幅（Perkin Elmer
、Foster City、CA）により、cry1サブファミリーに関連するB.t.毒素遺伝子か ら長さがほぼ415〜440塩基対のDNA断片が得られる。

【００９２】 本発明の対2（配列番号：3および4）を用いるPCR増幅により、cry7、cry8また
はcry9サブファミリー毒素遺伝子から長さがほぼ230〜290塩基対のDNA断片が得 られる。

【００９３】 これらのプライマーは、本発明に従って、新規毒素をコードする遺伝子を同定
するために用いることができる。PCRのための粗（crude）DNAテンプレートはB.t
.株から調製した。一晩培養したバチルス・チューリンギエンシスの平板培養物 から白金耳で細胞をかき取り、300mlのTE緩衝液（10mM Tris-Cl、1mM EDTA、pH
8.0）中に再懸濁させた。プロテイナーゼKを0.1mg／mlとなるように添加し、細 胞懸濁液を15分間にわたり55℃に加熱した。続いて懸濁液を15分間煮沸した。微
量遠心によって細胞残渣をペレット化し、DNAを含む上清を新たなチューブに移 した。

【００９４】 上記のフォワード2（配列番号：3）およびリバース2（配列番号：4）オリゴヌ
クレオチドからなるプライマー対を用いてPCRを行った。長さがほぼ230〜290bp のDNA断片が増幅されることを特徴とする遺伝子を含む菌株が同定された。続い て、これらの菌株から得た芽胞結晶調製物を、タマナヤガ（Agrotis ipsilon） および別の鱗翅目標的生物に対する生理活性に関して検討した。

【００９５】 PS185U2の検討には、プライマー対1および2（それぞれ配列番号：1および2、 ならびに配列番号：3および4）の両方を用いた。この菌株では、プライマー対1 （配列番号：1および2）により、cry1サブファミリーに関連する毒素遺伝子に関
して予想されるサイズのDNAバンドが得られた。

【００９６】実施例3 鱗翅目に対して有効な菌株に存在するバチルス・チューリンギエンシ ス毒素遺伝子の制限断片長多型（RFLP）分析 600nmでの光学濃度が1.0になるまで増殖させたバチルス・チューリンギエンシ
ス（B.t.）株から全細胞DNAを調製した。遠心処理によって細胞をペレット化し 、プロトプラスト緩衝液（20mg／mlリゾチーム、0.3Mスクロース、25mM Tris-Cl
［pH 8.0］、25mM EDTA）中に再懸濁させた。37℃で1時間インキュベートした後
、凍結-乾燥を2サイクル行うことによってプロトプラストを可溶化した。0.1M N
aCl、0.1％SDS、0.1M Tris-Clからなる溶液9倍量を添加することにより、可溶化
を完全に行わせた。清澄化した可溶化物をフェノール：クロロホルム（1：1）で
2回抽出した。2倍量のエタノールを添加して核酸を沈殿させ、遠心処理によって
ペレット化した。ペレットをTE緩衝液中に再懸濁させ、RNアーゼを最終濃度が50
g／mlとなるように添加した。37℃で1時間インキュベートした後、溶液をフェノ
ール：クロロホルム（1：1）およびTE飽和クロロホルムでそれぞれ1回抽出した 。1／10量の3M NaOAcおよび2倍量のエタノールを添加することにより、水相から
DNAを沈殿させた。遠心処理によってDNAをペレット化し、70％エタノールで洗浄
して乾燥させた後に、TE緩衝液中に再懸濁させた。

【００９７】 毒素遺伝子の特徴をRFLPによって調べるために、PCRで増幅した2種類の^３２P 標識DNAプローブを、全細胞B.t.DNAの標準的なサザンハイブリダイゼーションに
用いた。第1のプローブ（A）は、以下のプライマーを用いて増幅したDNA断片で ある： フォワード3：5' CCAGWTTTAYAGGAGG 3'（配列番号：5） リバース3：5' GTAAACAAGCTCGCCACCGC 3'（配列番号：6）

【００９８】 第2のプローブ（B）は、前の実施例で記載したプライマーを用いて増幅した23
0〜290bpまたは415〜440bpのDNA断片のいずれかとした。

【００９９】 標準的方法（Maniatis, T.、E.F. Fritsch、J. Sambrook［1982］分子クロー ニング．実験室マニュアル（Molecular Cloning. A Laboratory Manual）、Cold
Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY）により、サザンブロッ トにて固定したDNAを、³²P標識プローブにてハイブリダイズさせた。一般的に、
中度のストリンジェントな条件の下で、ハイブリダイゼーション、続いて洗浄を
行った。二本鎖DNA遺伝子プローブについては、6×SSPE、5×デンハルト溶液、0
.1% SDS、0.1 mg/ml変性DNA中で、DNAハイブリッドの融解温度（Tm）よりも20〜
25℃低い温度で、一晩ハイブリダイゼーションを行った。融解温度は、次の公式
で示される（Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas,および
F.C. Kafatos [1983] 酵素学の方法（Methods of Enzymology）、R. Wu, L. Gro
ssman、およびK. Moldave [編] アカデミックプレス（Academic Press）、ニュ ーヨーク、100:266〜285）。 Tm = 81.5℃ + 16.6 Log[Na+] + 0.41(%G+C) - 0.61(%ホルムアミド) - 600/二 本鎖の塩基対の長さ。

【０１００】 洗浄は、典型的には次のようにして行われる： （1）1×SSPE、0.1% SDS中、室温で15分間を2回（低ストリンジェンシー洗浄 ）。 （2）0.2×SSPE、0.1% SDS中、Tm-20℃で15分間を1回（中ストリンジェンシー
洗浄）。

【０１０１】 タマナヤガに対する有効性が最も高かった10菌株に関するRFLPデータを得た（
表3および表4）。ここに記載されたハイブリダイズ性DNAバンドは、検討中の新 規毒素遺伝子の全体または一部を含む。

【表３】 プローブAを用いて得られたバチルス・チューリンギエンシス株のRFL
Pデータ

【表４】 プローブBを用いて得られたバチルス・チューリンギエンシス株のRFL
Pデータ

【０１０２】実施例4 毒素遺伝子のDNAシークエンシング タマナヤガに対して有効なB.t.株に存在する毒素遺伝子のPCR増幅セグメント のシークエンシングを行った。これを行うために、フォワード3（配列番号：5）
プライマーおよびリバース3（配列番号：6）プライマーを用いて得られた増幅DN
A断片をまずPCR DNA TAクローニングプラスミドベクターであるpCRII中に、製造
者（Invitrogen、San Diego、CA）による記載の通りにクローニングした。各B.t
.株からの増幅DNA断片の混合物から得られたいくつかの個々のpCRIIクローンを シークエンシング用に選択した。コロニーを煮沸によって可溶化し、粗プラスミ
ドDNAを遊離させた。自動シークエンシングのためのDNAテンプレートは、プラス
ミドのポリクローニング部位に隣接するベクター特異的プライマーを用いるPCR によって増幅した。これらのDNAテンプレートのシークエンシングは、アプライ ドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社（Foster City、CA）の自動シー クエンシング法を用いて行った。この方法により、以下に記載する（配列番号：
7から配列番号：62まで）、毒素遺伝子配列およびそれらの対応するヌクレオチ ド配列を同定した。これらの配列の一覧を表5に示す。これらのヌクレオチド配 列から推定されるポリペプチド配列も示す。

【０１０３】 これらの部分遺伝子配列から、PCRプライマーまたはハイブリダイゼーション プローブとして有用な7つのオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌ クレオチドの配列は以下の通りである： 5' GTTCATTGGTATAAGAGTTGGTG 3'（配列番号：63） 5' CCACTGCAAGTCCGGACCAAATTCG 3'（配列番号：64） 5' GAATATATTCCCGTCYATCTCTGG 3'（配列番号：65） 5' GCACGAATTACTGTAGCGATAGG 3'（配列番号：66） 5' GCTGGTAACTTTGGAGATATGCGTG 3'（配列番号：67） 5' GATTTCTTTGTAACACGTGGAGG 3'（配列番号：68） 5' CACTACTAATCAGAGCGATCTG 3'（配列番号：69）

【０１０４】 特異的遺伝子毒素配列、および上記のリバース3プライマーとの併用によりハ イブリダイゼーションまたはPCRによるこれらの遺伝子の同定を可能とするオリ ゴヌクレオチドプローブの一覧を表5に示す。

【表５】 配列番号の参照番号

【０１０５】実施例5 完全長毒素遺伝子の単離およびDNAシークエンシング 当技術分野で知られた標準的な手順を用いて、B.t.株から全細胞DNAを抽出し た。例えば、上記の実施例3を参照されたい。全細胞DNAのサイズ分画を行ったSa
u3A部分制限断片の遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージベクターLambda-
Gem11中に構築した。組換えファージのパッケージングを行い、大腸菌KW251細胞
上に播いた。配列番号：5および6のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR 増幅を行ったDNA断片に由来する放射標識遺伝子特異的プローブとのハイブリダ イゼーションにより、プラークのスクリーニングを行った。ハイブリダイズ性フ
ァージのプラーク精製を行い、標準的手順（Maniatis, T.、E.F. Fritsch、J. S
ambrook［1982］分子クローニング．実験室マニュアル（Molecular Cloning. A
Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、
NY）によってDNAを単離するために、これを用いて大腸菌KW251細胞の液体培養物
を感染させた。その後に、DNA配列解析のために毒素遺伝子をpBluesciptベクタ ー（Stratagene）中にサブクローニングした。

【０１０６】 以下に一覧を示す完全長毒素遺伝子のシークエンシングは、アプライドバイオ
システムズ（Applied Biosystems）社（Foster City、CA）の自動シークエンシ ング法を用いて行った。毒素遺伝子配列およびそれぞれの推定ポリペプチド配列
の一覧を以下に示す。 これらの毒素をコードするこれらのプラスミドを含む組換え大腸菌NM522株を、1
997年6月27日に寄託した。

【０１０７】実施例6 蛍光菌（P.f.）における新規B.t.毒素の異種性発現 標準的なDNAクローニング法によって完全長毒素遺伝子をプラスミドベクター 中に導入し、発現のために蛍光菌の形質転換に用いた。発現および種々の鱗翅目
害虫に対する定量的バイオアッセイを目的として毒素を産生させるために、組換
え細菌株（表6）を振盪フラスコ中で増殖させた。

【表６】 新規毒素の異種性発現のための組換え蛍光菌株

【０１０８】実施例7 トリプシンによるエンドトキシンの処理 蛍光菌培養物を標準的手順に従って48時間増殖させた。遠心処理によって細胞
ペレットを回収し、水で3回洗い、-70℃で保存した。分画遠心法により、リゾチ
ームで処理した細胞から細胞エンドトキシン封入体を単離した。この様式で単離
された毒素を、ペプチド制限のためにトリプシン分解による処理にかけ、続いて
鱗翅目害虫に対するバイオアッセイに用いた。

【０１０９】 詳細な手順は以下の通りである。毒素封入体は、洗浄した粗細胞ペレットから
以下の通りに調製した： 可溶化緩衝液（使用日に調製）4L トリス塩基 24.22g NaCl 46.75g グリセリン 252g ジチオトレイトール 0.62g EDTA二ナトリウム塩 29.78g トリトン（Triton）X-100 20ml

【０１１０】 HClでpHを7.5に調整し、蒸留水を加えて最終容積（4L）にする。 1．凍結した細胞ペレットを37℃の水浴で解凍する。 2．容量500mlのポリカーボネート製遠心ボトルに全容積がほぼ400mlとなるよう に可溶化緩衝液を加える。ボトルの反転またはポリトロン（Polytron）を低rpm で用いることによって分散させる。 3．4℃で遠心処理（10,000×g）を20分間行う。 4．デカントし、上清を捨てる。 5．ペレットを分散させるためにポリトロンを低rpmで用いて、ペレット1g当たり
5mlの可溶化緩衝液中でペレットを再懸濁させる。 6．25mg／mlリゾチーム溶液を最終濃度が0.6mg／mlとなるように懸濁液に添加す
る。 7．37℃で4分間インキュベートする。30秒毎に反転させる。 8．懸濁液を氷上に1時間置く。 9．2.5M MgCl・6H_２Oを最終濃度が60mMとなるようにチューブに添加する。40mg ／mlデオキシリボヌクレアーゼI（Sigma）溶液を最終濃度が0.5mg／mlとなるよ うに添加する。 10．4℃で一晩インキュベートする。 11．ポリトロンを低rpmで用いて可溶化物をホモジネート化する。 12．10,000g、4℃で20分間遠心処理を行う。デカントし、上清を捨てる。 13．封入体ペレットを可溶化緩衝液中に再懸濁させる。細胞の可溶化が完全に行
われたことを顕微鏡下で確認する。 14．可溶化緩衝液で封入体ペレットを5回洗浄する（段階2〜5を繰り返す）。 15．10mM Tris-Cl pH 7.5、0.1mM PMSFの懸濁液として保存し、1.5mlエッピチュ
ーブ（Eppitube）中にて-70℃で保存する。

【０１１１】 トリプシンによる封入体の消化は、以下の通りに行う： 消化溶液： 1．1M NaCAPS（pH 10.5） 2ml 2．封入体調製物（蛋白質100mg程度） 3．切断しようとする蛋白質との比が1：100となるトリプシン（手順の間に添加 ） 4．最終容積を10mlとするためのH_２O

【０１１２】 トリプシン処理は以下の通りに行う： 1．トリプシンを含まない消化溶液を37℃で15分間インキュベートする。 2．1：100（トリプシン：毒素蛋白質の重量／重量比）のトリプシンを添加する 。 3．溶液を時々反転させながら37℃で2時間インキュベートする。 4．消化溶液に15,000g、4℃で15分間の遠心処理を行う。 5．上清を採取し、保管する。 6．上清をSDS-PAGEによって分析し、下記の通りにバイオアッセイ法に用いる。

【０１１３】実施例8 キメラ作製物におけるB.t.HD129株由来の遺伝子の発現 B.t.HD129株から遺伝子を1つ単離した。この遺伝子は、明白な翻訳開始コドン
をもたない偽遺伝子と思われる。この遺伝子をHD129から発現させるために、本 発明者らは、cry1Acの最初の28個のコドンとの遺伝子融合物を設計し、シュード
モナス発現系中に構築した。このキメラ毒素のヌクレオチドおよびペプチド配列
は配列番号：76および77に示されている。誘導を行うことにより、この新規キメ
ラ毒素を含む組換え蛍光菌は予想されたサイズのポリペプチドを発現した。

【０１１４】実施例9 毒素遺伝子のさらなるシークエンシング 表7に一覧を示した単離株から得た可溶性毒素のDNAのシークエンシングを行っ
た。表7には、このようにして得られた配列の配列番号も記載している。

【表７】

【０１１５】実施例10 タマナヤガのバイオアッセイ 適度な量の粉末を蒸留水と混合し、激しく攪拌することにより、B.t.単離株を
含む粉末の懸濁液を調製した。この懸濁液を、完成飼料1リットル当たり28gのア
ルファルファ粉末（BioServ）および1.2mlのホルマリンを加えて改変したタマナ
ヤガ幼虫用人工餌（BioServ、Frenchtown、NJ）と混合した。懸濁液は、懸濁液3
mlに対して飼料27mlを加えるという比率で完成飼料と混合した。ボルテックス処
理の後、区分された3mlのウェルを有するプラスチック製トレー（Nutrend Conta
iner Corporation、Jacksonville、FL）にこの混合物を注いだ。B.t.を含まない
水を対照として用いた。第一齢初期のタマナヤガ幼生（French Agricultural Se
rvices、Lamberton、MN）を1匹ずつ飼料混合物の上に置いた。続いて、仮付け用
鉄こて（tacking iron）を用いてウェルを「MYLAR」シート（ClearLam Packagin
g、IL）で密封し、ガス交換を行えるように各ウェルにいくつか針穴を開けた。 幼生は14：10（明：暗）照明下にある保育室にて29℃で4日間保育した。4日後に
死亡率を記録した。

【０１１６】 以下のB.t.単離株が、タマナヤガ幼虫に対する有効性を示すことが明らかにな
った：PS185U2、PS11B、PS218G2、PS213E5、PS86W1、PS28C、PS86BB1、PS89J3、
PS86V1、PS94R1、HD525、HD573、PS27J2、HD110、HD10、PS202S、HD29、PS101DD
、HD129およびPS31G1。バイオアッセイの結果を表8に示す。

【表８】 B.t.単離株に伴うタマナヤガ幼虫の死亡率

【０１１７】実施例11 タマナヤガに対するB.t.単離株の活性 菌株は上清培養物として検討した。試料をタマナヤガ幼虫用人工餌（BioServ 、Frenchtown、NJ）に対して適用し、風乾させた後に幼生に与えた。B.t.を含ま
ない水を対照として用いた。処理した各ウェルに卵を入れ、仮付け用鉄こてを用
いてウェルを「MYLAR」シート（ClearLam Packaging、IL）で密封し、ガス交換 を行えるように各ウェルにいくつか針穴を開けた。バイオアッセイは14：10（明
：暗）照明下にある保育室にて29℃で7日間行った。7日後に死亡率を記録した。
タマナヤガに対する致死性（水対照よりも強いもの）が認められた菌株を表9に 示す。

【表９】 新生タマナヤガに対するトップローディング式バイオアッセイ法にお
けるB.t.濃縮上清の殺幼生活性（larvacidal activity）

【０１１８】実施例12 ヘリオティス・ビレセンス（Heliothis virescens）（Fabricius）お よびヘリコベルパ・ゼア（Helicoverva zea）（Boddie）に対するB.t.単離株、 蛍光菌クローンの活性 菌株は凍結蛍光菌クローンまたはB.t.上清培養試料のいずれかとして検討した
。クローンの懸濁液は、試料を蒸留水と混合し、激しく攪拌することによって調
製した。飼料取り込みバイオアッセイ法に関しては、懸濁液を懸濁液6mlに対し て飼料54mlを加えるという比率で人工飼料と混合した。ボルテックス処理の後、
区分された3mlのウェルを有するプラスチック製トレー（Nutrend Container Cor
poration、Jacksonville、FL）にこの混合物を注いだ。上清飼料は先に概要を述
べた通り、3〜6mlの比率で飼料と混合した。トップローディング式バイオアッセ
イ法では、懸濁液または上清を人工飼料の最上部に適用し、風乾させた後に幼生
に与えた。何も含まない水を対照として用いた。第一齢幼生（USDA-ARS、Stonev
ille、MS）を1匹ずつ飼料混合物の上に置いた。続いて、仮付け用鉄こてを用い てウェルを「MYLAR」シート（ClearLam Packaging、IL）で密封し、ガス交換を 行えるように各ウェルにいくつか針穴を開けた。幼生は14：10（明：暗）照明下
にある保育室にて25℃で6日間保育した。6日後に死亡率を記録した。

【０１１９】 結果は以下の通りである：

【表１０】 トップローディング式バイオアッセイ法におけるB.t.濃縮上清の殺
幼生活性

【表１１】 H.ビレセンスおよびH.ゼアに対する飼料取り込みバイオアッセイ法
によって検討した菌株

【表１２】 凍結芽胞結晶調製物を用いた飼料取り込みバイオアッセイ法におけ
るH.ビレセンスの用量反応

【０１２０】実施例13 ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（European Corn Bo rer）に対する活性 本発明の単離株および毒素は、ヨーロッパアワノメイガ（European Corn Bore
r）（ECB）の防除に用いうる。ECBに対する有効性は、例えば、第一齢幼生など を用いる標準的な人工餌取り込み昆虫バイオアッセイ手順により、容易に確認す
ることができる。1つの特定の態様では、31G1(a)遺伝子を発現するトリプシン処
理クローンのLC50値は0.284（μg／ml）であることが明らかになった。

【０１２１】実施例14 植物への毒素遺伝子の挿入 本発明の一つの局面は、殺虫性毒素をコードする遺伝子によって植物を形質転
換することである。形質転換された植物は、標的害虫による攻撃に対して抵抗性
である。

【０１２２】 当技術分野において周知のさまざまな技術を用いて、本明細書で開示されてい
る殺虫性毒素をコードする遺伝子を植物細胞に挿入することができる。例えば、
大腸菌の複製システム、および形質転換した細胞を選択できるマーカーを含む、
多数のクローニングベクターを、高等植物の中に外来遺伝子を挿入したものを調
製するために利用することができる。このベクターは、例えば、pBR322、pUCシ リーズ、M13mpシリーズ、pACYC184などを含む。したがって、B.t.毒素をコード する配列を、ベクターの適切な制限酵素部位に挿入することができる。この結果
できたプラスミドを用いて、大腸菌を形質転換させる。適当な栄養培地で大腸菌
を培養してから、回収して溶菌する。プラスミドを回収する。解析方法として、
配列解析、制限解析、電気泳動、およびその他の生化学的、分子生物学的手法が
、一般的に用いられる。各操作の後、用いたDNA配列を切断して、次のDNA配列に
連結させることができる。各プラスミドの配列は、同一の、または別のプラスミ
ドにクローニングすることができる。望ましい遺伝子を植物の中に挿入する方法
によっては、別のDNA配列が必要となろう。例えば、もし、TiまたはRiプラスミ ドが、植物細胞の形質転換に用られる場合、挿入する遺伝子の隣接領域として、
TiまたはRiプラスミドのT-DNAの少なくとも右側の境界配列、多くは左右の境界 配列を連結させる必要がある。

【０１２３】 植物細胞の形質転換のためにT-DNAを使用することが、盛んに研究されており 、欧州特許第120 516号；Hoekema (1985) ：バイナリ植物ベクターシステム（Th
e Binary Plant Vector System）、Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasser
dam, 第5章；Fraleyら、Crit. Rev. Plant. Sci. 4:1〜46；およびAnら、(1985)
EMBO J. 4: 277〜287で十分に説明されている。

【０１２４】 挿入DNAが、一旦ゲノムに組み込まれると、そこで比較的安定し、原則として 再び出てくることはない。挿入されるDNAは通常、形質転換された植物細胞に殺 生物剤または抗生物質に対する抵抗性を付与する選抜マーカーを含んでおり、こ
れらにはとりわけ、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、
またはクロラムフェニコールなどがある。したがって、それぞれに用いられるマ
ーカーは、挿入DNAを含まない細胞を選抜するのではなく、形質転換された細胞 の選抜を可能にするものでなければならない。

【０１２５】 非常に多くの技術が、植物宿主細胞の中にDNAを挿入するために利用すること ができる。これらの技術には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium
rhizogenes）を形質転換因子として用いた、T-DNAによる形質転換、融合、イン
ジェクション、バイオリスティクス（マイクロパーティクルガン）、またはエレ
クトロポレーション、その他に可能な方法が含まれる。形質転換にアグロバクテ
リウムを用いるときには、挿入するDNAを特別のプラスミド、すなわち、中間ベ クター、またはバイナリベクター中にクローニングしておかなければならない。
T-DNA中の配列に相同な配列による相同的組換えによって、TiまたはRiプラスミ ドの中に、中間ベクターが組み込まれる。TiまたはRiプラスミドは、T-DNAの移 行に必要なvir領域も含んでいる。中間ベクターは、アグロバクテリウムの中で 自己複製することはできない。中間ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）と
いう手段によって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tu
mefaciens）中に移行させることができる。バイナリベクターは、大腸菌の中で も、アグロバクテリウムの中でも自己複製することができる。それらは、右側お
よび左側のT-DNA境界領域によって仕切られた、選択マーカー遺伝子およびリン カーもしくはポリリンカーを含んでいる。これらは、直接アグロバクテリウムの
中に形質転換することができる（Holstersら、[1978] Mol. Gen. Genet. 163:18
1〜187）。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、vir領域をもつプ ラスミドを含んでいる。vir領域は、T-DNAを植物細胞の中に移行させるのに必要
である。付加的なT-DNAを含んでいてもよい。このようにして形質転換したバク テリアを、植物細胞の形質転換に用いる。植物細胞の中にDNAを移行させるため に、植物の外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tu
mefacies）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes
）とともに、都合よく培養することができる。そして、選抜のための抗生物質ま
たは殺生物剤を含む適当な培地の中で、感染した植物材料（例えば、葉片、茎の
分節、根、ならびにプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から全植物体を再生さ
せることができる。そして、このようにして得られた植物を、挿入DNAが存在す るかどうか調べることができる。インジェクションおよびエレクトロポレーショ
ンの場合には、プラスミドに特別に必要とされるものはない。例えば、pUC誘導 体などの通常のプラスミドを用いることが可能である。

【０１２６】 形質転換された細胞を、通常の方式で植物内部で増殖する。 これらの細胞によって生殖細胞を形成され、形質転換された形質が後代の植物に
伝達される。このような植物は、正常な方式で成長させることができ、形質転換
されたものと同じ遺伝的因子、またはその他の遺伝的因子をもつ植物と交配させ
ることができる。この結果できる雑種個体は、対応する表現型特性を有する。

【０１２７】 本発明の好ましい態様において、植物に最適なコドンが使用されている遺伝子
により、植物を形質転換する。例えば、本明細書に参照として組み入れられる米
国特許第5,380,831号を参照のこと。また、更には、一部を欠失した毒素をコー ドする植物を用いる。一部を欠失した毒素は、典型的には、毒素の全長の約55％
から約80％をコードする。植物に用いるための、B.t.合成遺伝子を作出する方法
が、当技術分野において知られている。

【０１２８】 本明細書にて述べた実施例および態様は、例示する目的のためだけのものであ
り、この観点からのさまざまな修正あるいは変更が当業者に示唆され、本出願の
趣旨および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると理解され
るべきである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナーバ ケネス イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン ディエゴ カミニト ミラ デル マー 12123 (72)発明者 ワルツ マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ポー ウェイ シンチュリング ドライブ 14940 (72)発明者 ストックホフ ブライアン エー． アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン ディエゴ ラムスデル コート 11771 (72)発明者 ミュラー−コーン ジュディー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 デル マー ヴィア ドナダ 12744 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA08 BA38 CA03 CA07 CA09 CA20 DA01 DA05 EA04 GA11 HA03 4H011 AC01 BA01 BB21 BC18 DA15 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 DA83 EA06 FA74 GA01 GA15

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヨーロッパアワノメイガ（European Corn Borer）（Ostrini
   a nubilalis）の防除のための方法であって、該害虫を殺虫量のバチルス・チュ ーリンギエンシス毒素と接触させる段階を含む、該毒素が以下のものからなる群
   より選択される特徴を有する方法： (a)該毒素が、配列番号：70、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、 配列番号：78、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：84、配列番号：86、配
   列番号：88、配列番号：90、配列番号：92、配列番号：94、配列番号：96、配列
   番号：98、配列番号：100、配列番号：102および配列番号：104からなる群より 選択される配列との相同性が少なくとも約75％であるアミノ酸を含む； (b)該毒素が、配列番号：70、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、 配列番号：78、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：84、配列番号：86、配
   列番号：88、配列番号：90、配列番号：92、配列番号：94、配列番号：96、配列
   番号：98、配列番号：100、配列番号：102および配列番号：104からなる群より 選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌ
   クレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む；ならびに (c)該毒素が、配列番号：70、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、 配列番号：78、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：84、配列番号：86、配
   列番号：88、配列番号：90、配列番号：92、配列番号：94、配列番号：96、配列
   番号：98、配列番号：100、配列番号：102および配列番号：104からなる群より 選択される毒素に対する抗体と免疫反応を示す。
2. 【請求項２】 該毒素が配列番号：74に示されたアミノ酸配列またはその殺
   虫性断片を有する、請求項1記載の方法。